Ctedra: Qumica y Bioqumica de los Alimentos.

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TRABAJO PRCTICO PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTENAS: DESNATURALIZACIN E HIDRATACIN Objetivo: Evaluar la sensibilidad de las protenas a la desnaturalizacin trmica y el efecto de diversos factores sobre la misma. Evaluar propiedades de hidratacin de las protenas mediante el empleo de diferentes mtodos.

1. Desnaturalizacin La desnaturalizacin proteica puede definirse como cualquier modificacin de su conformacin a nivel de la estructura secundaria, terciara y cuaternaria que no vaya acompaada por la ruptura de los enlaces peptdicos implicados en la estructura primaria. Da lugar a cambios en las propiedades qumicas, fsicas y biolgicas. Puede ocurrir por accin del calor, congelacin, fuerzas mecnicas, agentes qumicos (sales, cidos, bases, metales), etc. Durante la desnaturalizacin las molculas plegadas y enrolladas de las protenas, se desdoblan y en esta forma puede tener lugar la coagulacin (o agregacin) de las molculas y formar entonces un gel. Por ejemplo por el calentamiento prolongado, etc., la protena puede precipitar separndose completamente del lquido donde se encuentra disuelta. Esto puede ocurrir a diferentes velocidades, dependiendo de las caractersticas de cada protena y de los efectos de los agentes desnaturalizantes sobre las mismas. La sensibilidad de las protenas a la desnaturalizacin trmica, depende de numerosos factores tales como la naturaleza y concentracin de la protena, actividad del agua, pH, fuerza inica, naturaleza de los iones presentes. 1.1. Determinacin de las temperaturas de desnaturalizacin (coagulacin) de las protenas del huevo. Separar la clara y la yema de un huevo en dos vasos pequeos de precipitado. Poner una pequea cantidad de clara de huevo en un tubo de ensayo y calentar el tubo suavemente dentro de un vaso de precipitado con agua sobre un mechero de bunsen (bao mara, con la precaucin de no llevar a ebullicin). Sujetar un termmetro dentro del tubo de ensayo. Anotar la temperatura en la cual la albmina de huevo se pone opaca, es decir coagula (aproximadamente a los 60 C). Repetir lo anterior utilizando yema de huevo y encontrar la temperatura de coagulacin para esta protena. El cambio se reconoce ms difcilmente (aproximadamente a los 65 -70 C). 1.2. Efecto de distintos factores sobre la temperatura de desnaturalizacin de las protenas del huevo. a).- Efecto de la concentracin de protena (dilucin): Diluir con agua destilada al medio las muestras de clara y de yema de huevo. Mezclar muy suavemente. Repetir la prueba anterior y registrar las temperaturas de coagulacin. Se notar una temperatura de coagulacin ms elevada. b).- Efecto de la adicin de azcares (sacarosa): Aadir 3 ml de una solucin de sacarosa disuelta en de agua al 50 % p/v a 10 ml de albmina de huevo y mezclar suavemente. Realizar un testigo reemplazando la solucin de sacarosa por agua. Determinar la temperatura de

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desnaturalizacin en ambos casos y comparar. La adicin de azcar causar elevacin de la temperatura de coagulacin. c).- Efecto de la adicin de cidos y bases (influencia de pH): Medir el pH de la clara de huevo y anotar su temperatura de coagulacin. Aadir a 5 ml de albmina unas gotas de cido ( 3 gotas de cido ctrico al 40%) hasta pH = 4,8 (pI) y a otros 5 ml de albmina agregar gotas OHNa 2N hasta conseguir una muestra alcalina. Repetir las experiencias y anotar las temperaturas de coagulacin. Valores extremos de pH pueden causar coagulacin, por lo que el ensayo no se debe realizar bajo esas condiciones. En el punto isoelctrico una protena es menos soluble, por lo que coagular ms rpidamente. El punto isoelctrico para la albmina de huevo es de un pH de 4,8. Con valores de pH ms cercanos a 4,8, la temperatura de coagulacin ser ms baja. Muestra T de desnaturalizacin (C) Albmina de huevo Yema de huevo Albmina de huevo diluida al 1/2 Dilucin Yema de huevo diluida al 1/2 Albmina + sacarosa Sacarosa Testigo Albmina: pH = Albmina + cido: pH = pH Albmina + base: pH = Factores

2. Propiedades de hidratacin Las propiedades de hidratacin estn vinculadas a la interaccin de las protenas con el agua e influyen en aspectos relacionados a la formulacin, procesamiento y almacenamiento de alimentos. Para utilizar los concentrados y aislados secos de protenas, hay que hidratarlos, por eso es de gran inters prctico estudiar las propiedades de hidratacin y rehidratacin de las protenas alimenticias. Figura 1.

H2O (Vapor)

ADSORCIN

PROTENA DESHIDRATADA
H2O (Lquida)

HINCHAMIENTO

ABSORCIN
H2O

SOLUBILIDAD

Figura 1. Representacin esquemtica de las interacciones protena agua que se producen durante el proceso de hidratacin de un polvo proteico.

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2.1. Capacidad de adsorcin Indica la aptitud de un material a adsorber agua en forma espontnea cuando se lo expone a una atmsfera de humedad relativa constante. En principio es un fenmeno superficial. Si la extensin de la hidratacin es muy importante, puede ocurrir absorcin en el interior, hinchamiento y eventualmente solubilizacin. Mediante las isotermas de sorcin o desorcin se pueden describir grficamente la cantidad de agua adsorbida o perdida, de acuerdo a que si el material esta seco o hmedo, en funcin de la humedad relativa de la atmsfera circundante al material o actividad de agua del material. Las isotermas de sorcin se obtienen principalmente a travs de dos grupos diferentes de mtodos de medicin: el mtodo gravimtrico y los basados en la determinacin de la actividad de agua o presin de vapor de agua. 2.1.1. Mtodo gravimtrico: En este mtodo se mide el cambio de peso de la muestra en funcin de una determinada presin de vapor de agua de la atmsfera circundante y se asume que en el equilibrio el material tiene la misma presin de vapor que la atmsfera circundante. El mtodo gravimtrico esttico es el ms utilizado y ha sido estandarizado por European Cooperative Project Cost 90. Equipo: Se utiliza un desecador que contiene un soporte perforado sobre el cual se apoyan los pesafiltros o frascos con tapas conteniendo la muestra. En la base del desecador se coloca un recipiente conteniendo aproximadamente 150 ml de una solucin de humedad relativa conocida constante. El desecador se debe colocar en una cmara de temperatura constante. Metodologa: Se utiliza un desecador para cada humedad relativa. La humedad relativa de la atmsfera dentro de cada desecador se ajusta utilizando soluciones de presin de vapor de agua conocida. Tabla 1. I. Colocar dentro del desecador un recipiente con la solucin de humedad relativa conocida. II. Tarar cada pesafiltro III. Colocar una cantidad de muestra (0,5 2 g) de tal forma que la altura no supere los 0,3 cm para evitar largos periodos de equilibracin. IV. Colocar los pesafiltros en el desecador por duplicado, se hace vaco parcial y se almacenan a temperatura constante. V. Pesar las muestras tapadas a diferentes tiempos y seguir la evolucin hasta pesada constante (diferencia entre dos pesadas sucesivas < 0,1 mg). VI. Determinar el contenido de humedad de las muestras, una vez alcanzado el equilibrio. Contenido de humedad =
g H2O 100 g masa seca

Los tiempos para llegar al equilibrio son por lo general entre 7 y 14 das para AW < 0,65 y hasta de 4 5 semanas para AW > 0,80. Mtodos para determinar el contenido de humedad Calentamiento en estufa con vaco (100 C) hasta constancia de peso ( 0,1 mg). Titulacin por Kart Fischer. Secado infrarrojo.

Aplicaciones El mtodo gravimtrico es el ms utilizado por su sencillez y porque no requiere equipos costosos. Se puede aplicar a cualquier tipo de producto y rango de humedad relativa.

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Limitaciones - Largo tiempo necesario para lograr el equilibrio - Puede haber crecimiento de microorganismos a humedades relativas superiores a 65%. Para solucionarlo se puede utilizar UV, acetato fenilmercrico, fungicidas, timol o sorbato de potasio. 1: Tabla 1: Humedad relativa de soluciones saturadas salinas a diferentes temperaturas.
Soluciones salinas Cloruro de litio (a) Cloruro de magnesio (a) Nitrato de magnesio (a) Bromuro de sodio (a) Ioduro de potasio (a) Cloruro de sodio (b) Sulfato de amonio (b) Cloruro de potasio (b) Cloruro de bario (b) Nitrato de potasio (a) Sulfato de potasio (b) Temperatura (C) 20 11,31 33,07 54,38 59,14 69,90 75,20 81,34 85,05 90,65 94,62 97,59 25 11,30 32,78 52,89 57,57 68,86 75,10 80,99 84,20 90,30 93,58 97,30 30 11,28 32,44 51,40 56,03 67,89 75,00 80,63 83,60 90,00 92,31 97,00 35 11,25 32,05 49,91 54,55 66,96 74,90 80,27 82,70 89,50 90,79 96,71 40 11,21 31,60 48,42 53,17 66,09 74,68 79,91 81,80 89,03 96,41 50 11,10 30,54 45,44 50,93 64,49 74,43 79,20 80,20 84,78 95,82

Fuente:(a) Greenspan (1976); (b) Kitic et al. (1986). 2.1.2. Mtodos basados en la determinacin de la presin de vapor de agua y/o AW. El material se humidifica ya sea por el agregado de agua o por exposicin a una atmsfera de alta humedad relativa. El contenido de agua se determina mediante algunos de los mtodos descriptos anteriormente y se determina la actividad de agua. Determinacin de la actividad de agua - Mtodo directo: Mtodo manomtrico permite determinar en forma directa la presin de vapor de agua. - Mtodos indirectos: Determinan la presin de vapor de agua como una funcin de una propiedad fsica que vara con la humedad relativa de la atmsfera circundante. El mtodo ms importante es la higrometra elctrica. Los higrmetros elctricos son precisos y rpidos (3 - 4 horas) pero son costosos y los elementos sensores estn sujetos a contaminacin con glicoles, cidos, lcalis, etc. 2.2. Capacidad de absorcin de agua Indica la aptitud de un material a embeber agua en su estructura en forma espontnea cuando se lo pone en contacto con el agua a travs de una superficie que se la mantiene hmeda o por inmersin. 2.2.1. Determinacin de la capacidad de absorcin de agua: Se puede realizar utilizando - Aparato de Baumann (1966). - Aparato de Baumann modificado (Torgersen y Toledo, 1977). Equipo: Las medidas se llevarn a cabo utilizando un equipo de Baumann modificado, a temperatura ambiente cuidando que no existan corrientes de aire en el lugar de las medidas. Consiste en un filtro bacteriolgico Millipore de 4 cm de dimetro, o un filtro de Buchner en el cual se coloca un papel de filtro (tipo Whatman o similar). El filtro est conectado mediante una manguera flexible a una pipeta graduada de 1 a 2 ml, sostenida en posicin horizontal y al mismo nivel que el papel de filtro. Figura 2.

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Figura 2. Aparato de Baumann modificado Metodologa: Se llena el equipo, toda la tubera y la pipeta, con agua termostatizada a temperatura ambiente evitando la incorporacin de burbujas y se coloca el papel de filtro dejando que embeba agua aproximadamente 5 min. Con un papel absorbente se elimina el exceso de agua sobre el papel de filtro hasta lograr enrasar en cero la columna de agua de la pipeta. Se deja 5 10 min para verificar la nivelacin del equipo (en este tiempo no debe variar la posicin del menisco de agua). Colocar el polvo exactamente pesado distribuyndolo uniformemente sobre el papel de filtro. Si se observa poca uniformidad en el tamao de partcula, el polvo ser previamente tamizado, de modo de asegurar que todas las partculas que se utilicen posean un tamao menor que el corte del tamiz. Se dispara el cronmetro. Se registra el retroceso de la columna de agua en la pipeta (cantidad de agua absorbida) en funcin del tiempo hasta que esta no vare ms. El tiempo para llegar al valor de equilibrio puede variar entre 5 minutos y 2 horas, dependiendo del tipo de protena y granulometra de la muestra. Se puede determinar a la vez la velocidad y la extensin de la hidratacin. Muestras: Gelatina, aislados proteicos de soja. Pesar alrededor de 50 60 mg para cada medida. Expresin de los resultados: La cantidad de agua absorbida (q) a cada tiempo se expresa como: ml de agua/g masa seca (MS) y se grafica en funcin del tiempo en minutos obtenindose las curvas de absorcin de agua (Figura 3). El mximo valor que se obtiene en la curva corresponde al parmetro conocido como capacidad de absorcin de agua o WIC (Water Imbibing Capacity). A partir de las curvas de cintica de absorcin, y, calculando la pendiente en la porcin lineal inicial de la curva se puede obtener la velocidad inicial de absorcin de agua. Curva de absorcin de agua q = Q t / (B + t) q = cantidad de agua absorbida en el tiempo t. Q = mxima capacidad de absorcin de agua. B = tiempo necesario para absorber la mitad de la cantidad mxima de agua (Q/2).

La velocidad de absorcin = dq / dt = [1/BQ] (Q q)2

Figura 3. Curva de absorcin de agua

(Q q) = cantidad de agua que debe ser absorbida para alcanzar el equilibrio. (BQ)-1 = constante especfica de velocidad K.

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Aplicaciones - Sirve para determinar la absorcin espontnea de agua de cualquier material proteico en polvo. - Permite determinar la capacidad de absorcin de agua y velocidad de hidratacin. Es un parmetro muy importante desde el punto de vista tecnolgico, vinculado a la prctica de rehidratacin que normalmente se realiza antes de la utilizacin de cualquier ingrediente proteico. - Permite estudiar el efecto de la temperatura, pH y de la presencia de solutos en el agua de hidratacin. - Es importante en productos de bajo contenido de agua y en procesos de secado y almacenamiento. Limitaciones - Cuando las protenas son muy solubles y dan soluciones de baja viscosidad, se observa de que luego de llegar al mximo en la curva de absorcin de agua, esta comienza a decrecer. En estos casos no se puede definir una mxima capacidad de absorcin de agua. 2.3. Solubilidad. La solubilidad de un material proteico describe la capacidad de formar soluciones coloidales. Se define como la porcin de nitrgeno que se solubiliza luego de un determinado y especfico procedimiento. 2.3.1. Determinacin de la solubilidad. Efecto del tratamiento trmico Preparar dispersiones acuosas de protenas de suero que contengan 0,5, 1 y 3% de protenas. Tratar las muestras durante 0, 10, 30 y 60 minutos a 90 Centrifugar a 14000g durante 15 C. minutos y determinar la solubilidad en cada condicin de temperatura como: Solubilidad (%) = Protena soluble Protena total

Para medir protena soluble se utilizar el mtodo de Bradford Mtodo de Bradford para la determinacin de protenas. (Rango: 0,1 a 1 mg/ml) Reactivos: Solucin colorante: Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o Coomassie Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de cido fosfrico 85% y 50 ml de etanol 95%. Una vez que el colorante se disolvi completamente, llevar a 1 litro con agua destilada fra. Agregar NaOH 1M en una relacin de 50 l por cada ml de reactivo. Determinacin: Prender el espectrofotmetro 15 min. antes de usarlo, para que se estabilice la lmpara. Poner 40 l de muestra en un tubo de hemlisis. Agregar 2 ml de reactivo de color e incubar 5 min. Medir la absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o poliestireno. Nota: Alternativamente el NaOH 1M puede agregarse sobre la muestra si no hubiera sido incorporado previamente al reactivo. Aplicaciones: - Seleccin de las condiciones optimas de extraccin, purificacin y separacin de fracciones proteicas. - Conocimiento de las aplicaciones potenciales de la protena. - Optimizar las condiciones de procesamiento. - Indicar el grado de tratamiento trmico por calor.

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2.4. Capacidad de retencin de agua Es la cantidad de agua que un material proteico puede retener bajo la accin de una fuerza centrfuga, depende de las condiciones de centrifugacin, tiempo de centrifugado y temperatura. Estandarizando la fase de centrifugacin es posible reducir los efectos de las condiciones de operacin. 2.4.1. Mtodo propuesto por Piva et al. (1981): (Ver esquema 1)

Esquema 1: Mtodo de Piva et al. Los resultados pueden expresarse de la siguiente manera: WHC (retencin de agua o Water Holding Capacity) = W2/R (g H2O/g residuo seco) HW (agua retenida o Held Water) % = [W2/(W1+W2)] x 100 (g H2O /H2O inicial) Fraccin soluble = [S/R+S)] x 100 Aplicaciones: - El clculo de agua retenida es ms recomendable como expresin de la capacidad de retencin de agua ya que se independiza de la fraccin de protena solubilizada. - En el caso de no disponer de un liofilizador se puede utilizar secado en estufa (100 C hasta peso constante) del residuo (R + W2) y calcular W1 como diferencia entre el agua agregada y W2. Limitaciones: - Si la protena es totalmente soluble no puede utilizarse este mtodo. Referencias bibliogrficas Pilosof A. M. R. y Bartholomai G. B. (2000). Caracterizacin funcional y estructural de protenas. Editorial Eudeba, Bs. As. Argentina. Salfield J. R. (1977). Prcticas de ciencias de los alimentos. Editorial Acribia, Zaragoza, Espaa. Cheftel J. C., Cuq j. L. y Loient D. (1989). Protenas alimentarias. Bioqumica. Propiedades funcionales. Valor nutritivo. Modificaciones qumicas. Editorial Acribia, Zaragoza, Espaa. Gua de trabajos prcticos: Propiedades funcionales (2007). Ctedra de propiedades fsicas y qumicas de los alimentos ll. Facultad de Ciencias Exactas. UNLP. rd Fennema, O., Food Chemistry, 3 . ed., Marcel Dekker Inc., New York, 1996.

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DESARROLLO PRCTICO PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTENAS: DESNATURALIZACIN E HIDRATACIN Desnaturalizacin - Se determinaran las temperaturas de desnaturalizacin de las protenas del huevo (1.1). - Se evaluar el efecto de los factores: dilucin, presencia de sacarosa y pH sobre la temperatura de desnaturalizacin de las protenas del huevo [1.2. (a, b y c)]. Muestra: - Clara y yema de huevo Materiales: - Vaso de precipitado - Tubos de ensayos y pipetas - Mechero de bunsen y trpode Reactivos: Equipos: - Termmetro - Medidor de pH - Bao termostatizado Propiedades de hidratacin Se determinar: - La capacidad de absorcin de agua de una muestra proteica en polvo utilizando el aparato de Baumann modificado (2.2.1). Registrar el tiempo cada 5 seg. hasta 1 minuto, luego cada 30 seg. hasta los 5 minutos, cada 1 minuto hasta los 10 minutos y cada 5 minutos hasta los 30 minutos. Realizar una lectura final a las 2 horas. - La capacidad de retencin de agua de una muestra proteica en polvo mediante el mtodo propuesto por Piva et al. (2.4.1). Muestra: - Aislados proteicos de soja, gelatina, etc. Materiales: Reactivos: - Agua destilada a temperatura ambiente Equipos: Balanza Cronmetro Centrfuga Estufa a 100 C Equipo de Baumann modificado: Filtro bacteriolgico Millipore de 4 cm de dimetro o filtro de Buchner Papel de filtro tipo Watman Manguera flexible Pipeta de 1 a 2 ml Soportes con abrazaderas Papel absorbente Tubos para centrfuga Pipetas Cpsula de evaporacin pequea Esptula Agua destilada Sacarosa Acido ctrico al 40 % OHNa 2 N