1. Datos del subproyecto 1.

a Ttulo del Subproyecto: Fortalecimiento del Programa de Monitoreo de Floraciones Algales Nocivas (FANs), Calidad de Agua y Biotoxinas en aguas costeras de la provincia de Chubut (Patagonia). 1.b Resumen: Este subproyecto, contribuir significativamente al fortalecimiento del Plan de Prevencin y Control de Mareas Rojas de la provincia del Chubut. La mayor comprensin de las FANs y la incorporacin de nuevas tecnologas para la identificacin y determinacin cuantitativa de biotoxinas marinas, es sumamente importante desde el punto de vista de la salud pblica, la economa de los sectores productivos, del turismo y de la proteccin de la biodiversidad en la zona costera patagnica. Adems permitir utilizar los resultados de este subproyecto como una herramienta de gestin de recursos pesqueros y una herramienta educativa y de desarrollo de recursos humanos. Brindar tambin un panorama general del estado trfico de la zona costera, aportando datos sobre la situacin de la contaminacin por actividades urbanas y productivas en los sitios donde se efecta el Monitoreo.

2. Descripcin del Subproyecto 2.a. Objetivos: 1) Mejorar el conocimiento sobre las ocurrencias de las floraciones algales nocivas (FANs) en las costas de la provincia del Chubut. 1a) Analizar la dinmica espacio-temporal de las FANs. 1b) Analizar los parmetros ambientales asociados a la dinmica de las FANs. 2) Desarrollar e implementar nuevas tcnicas analticas que permitan la identificacin y cuantificacin de biotoxinas, fortaleciendo los mtodos biolgicos ya establecidos por la Legislacin vigente en la provincia. 2a) Lograr la formacin de recursos humanos con capacidad de implementar las tcnicas analticas cualitativas y cuantitativas de identificacin de biotoxinas utilizando HPLC. 2b) Investigar la presencia de Veneno Amnsico de Moluscos (VAM) y Veneno Diarreico de Moluscos (VDM) por Cromatografa Lquida de Alta Performance (HPLC), ante la deteccin de especies potenciales productoras de estas biotoxinas en el plancton. 3) Organizar una base de datos georreferenciada para alimentar al Sistema de Informacin Ambiental de la DGPA, sobre la evolucin del fenmeno en las costas de la provincia y brindar datos de calidad de agua en funcin de parmetros fsicos, qumicos y biolgicos de las diferentes zonas de la costa donde se realizar el monitoreo. 4) Elaborar y ejecutar un plan de Educacin Ambiental referido a esta problemtica, dirigido a diferentes sectores de la comunidad (salud, pesca, turismo, comunidades educativas, etc.).

2.b. Antecedentes: Introduccin Las mareas rojas son causadas por organismos fitoplanctnicos, es decir algas unicelulares microscpicas, que pueblan las capas superficiales de todos los cuerpos de agua, tanto dulce como marina. Diversos procesos fsicos tales como descargas de ros, surgencias costeras, inestabilidad en los bordes del talud, mareas y fuerzas originadas en la rotacin terrestre, producen modificaciones locales en la abundancia de nutrientes y en la estabilidad vertical del mar. En ciertos casos, la perturbacin origina un ambiente peculiar en el que se combinan abundancia de nutrientes, elevada estabilidad vertical y disponibilidad de luz. La evolucin ha diseado formas de vida capaces de explotar estos ambientes y de llegar a producir en ellos florecimientos excepcionales, las as llamadas mareas rojas. Las mareas rojas son florecimientos caracterizados por la escasa diversidad de la comunidad fitoplanctnica y las excepcionalmente elevadas concentraciones celulares que alcanzan (de un milln a mil millones de clulas por litro de agua). Se produce as un cambio en la coloracin de la superficie del mar que puede tomar distintos matices (amarillo, naranja, rojo, pardo, etc.) de acuerdo con la naturaleza y concentracin de los organismos presentes, sobre todo segn la cantidad y tipo de pigmentos que contienen (Carreto, 1989). La expresin marea roja, aunque no la ms apropiada para describir estos fenmenos, es un trmino popular que ha sido adoptado por la mayora de los cientficos. Son sus sinnimos los trminos discoloracin, floracin, aguaje, hemotalasia, etc. Entre los diversos organismos responsables de mareas rojas, los dinoflagelados capaces de sintetizar potentes toxinas, son los agentes causales ms comunes. Estas toxinas son acumuladas en las glndulas y tejidos de sus principales consumidores, moluscos bivalvos que son extremadamente resistentes a ellas, y afectan a los niveles trficos superiores, incluyendo al hombre. Los moluscos afectados por marea roja txica no sufren ningn tipo de alteracin de sus caractersticas organolpticas, de manera que, a simple vista, no es posible detectar su toxicidad. Es conveniente aclarar, que no siempre debe producirse una proliferacin masiva de algas y un consecuente cambio de color en el agua, para que exista toxicidad, sino que hay casos en que a bajas densidades celulares, igualmente se produce contaminacin de moluscos u otros organismos marinos. Otras veces sucede lo contrario, ocurren florecimientos sin produccin de toxinas; sin embargo pueden ocasionar graves daos a la fauna marina por mecanismos de tipo fsico, por ejemplo obstruccin de las branquias en los peces; consumo total del oxgeno en la columna de agua, debido a la respiracin y a la descomposicin final de grandes densidades de algas, que desencadenan la muerte de otros organismos por anoxia, etc. Se conocen aproximadamente 80 especies txicas de fitoplancton, de las cuales alrededor de 50, pertenecen al grupo de los dinoflagelados. Estudios recientes, realizados a nivel mundial por distintos especialistas en Biologa, Qumica, Sistemtica, Ecologa, Toxicologa, etc., pusieron en evidencia en los ltimos Simposios Internacionales: 1) El incremento a nivel mundial de nuevos episodios de toxicidad, en lugares donde stos no haban sido registrados anteriormente. Se requeriran monitoreos de cinco a diez aos como mnimo para determinar la frecuencia e intensidad de este incremento (Smayda, 1990). 2) Nuevas causas probables de la aparicin del fenmeno. Una est asociada al transporte de esporas y quistes de reposo, en las sentinas de los barcos que descargan agua de lastre conteniendo dichos elementos, con la consecuente colonizacin en reas no contaminadas (Halleegraef, 1990). Otro factor de importancia es el aporte antrpico en zonas costeras, con asentamientos poblacionales e industriales, a travs de descargas de elementos nutrientes, que producen un aumento de la eutrofizacin. El incremento en el contenido de nutrientes, como nitrgeno y fsforo, y la disminucin de la slice, llevaran a cambios en la estructura de la comunidad de fitoplancton, al producirse el reemplazo de especies silceas por otras que no necesitan slice para su metabolismo. Otros medios posibles de expansin algal son el transporte de mariscos portadores de clulas de resistencia de una regin a otra en las actividades de acuicultura (Smayda, 1990).

3) La aparicin de especies de fitoplancton productoras de toxinas, que hasta ahora no haban sido identificadas como responsables de toxicidad. El nmero de especies txicas se ha elevado a otros grupos, adems de dinoflagelados, como crisofceas, haptofceas, diatomeas, etc (White, 1990; Granelli et al., 1993). 4) El descubrimiento de nuevos tipos de toxinas. Pueden citarse adems del Veneno Paralizante de Moluscos (VPM), el Veneno Diarreico de Moluscos (VDM), el Veneno Neurotxico de Moluscos (VNM), el Veneno Amnsico de Moluscos (VAM), etc (Viviani, 1992). Veneno Paralizante de Moluscos Uno de los venenos ms poderosos es el VPM, tal su nombre genrico, aunque actualmente se conoce la existencia de diecisiete toxinas de este grupo. Estas toxinas son poderosos venenos que bloquean el sistema nervioso central (centro respiratorio y vasomotor) y el sistema nervioso perifrico (unin neuromuscular, terminaciones cutneas, tctiles, etc.) produciendo una depresin respiratoria que puede causar la muerte por anoxia y el colapso cardiovascular por depresin del miocardio (Andrinolo et al 1999b). La ms conocida es la saxitoxina, una tetrahidropurina cuya estructura fuera dilucidada en 1975, luego de su aislamiento y purificacin de la almeja gigante de Alaska (Saxidomus giganteus). Est constituida por compuestos orgnicos solubles en cido y agua, termo resistentes. El mecanismo de accin de las toxinas del VPM est muy bien descrito a nivel molecular. Su receptor farmacolgico es la protena intrnseca de membrana conocida como el Canal de Sodio dependiente de voltaje, que es el que inicia la despolarizacin en las clulas excitables. Las toxinas del VPM actan unindose reversiblemente, con altsima afinidad (en concentraciones de 1 10-9 M), a su sitio de unin en el canal de sodio, bloqueando el paso de iones sodio hacia el interior de la clula (Henderson et al., 1973). Es cincuenta veces ms activa y cien veces ms potente que la estricnina. Se caracteriza por su alta especificidad, la instalacin precoz de los sntomas y por ser efectiva a dosis pequeas. En casos extremos, basta la ingestin de dos o tres ejemplares del molusco portador, para producir una intoxicacin fatal. El consumo simultneo de alcohol aumenta su absorcin, no se inactiva con la coccin y su actividad se incrementa con el agregado de medios cidos (jugo de limn, vinagre, etc.). Los vertebrados son particularmente sensibles a estas toxinas. Los moluscos que contienen ms de 400 U.R. (unidades ratn por cada 100g de carne) u 80 g STX eq (saxitoxina equivalente por cada 100g de carne, son considerados no aptos para el consumo humano, por lo que se recomienda su veda cuando superan este nivel. Costa norte de la provincia del Chubut: Organismo productor de toxinas: Alexandrium tamarense. 1980 frente a Pennsula Valds: Toxicidad por VPM: 173.360 U.R./100g de tejido de mejilln. Muerte de dos pescadores del B/P Constanza (Elbusto y col., 1981; Carreto y col., 1981). Diciembre/1984-Enero/1985 en Baha Engao: Toxicidad por VPM: 173.000 U.R./100g de tejido de mejilln. Dieciocho personas intoxicadas, siete demandaron internacin de las cuales cuatro fallecieron (Vecchio y col., 1986). Enero/1988 en Baha Nueva (frente a Puerto Madryn): Toxicidad por VPM: 66.150 U.R./100g de tejido de cholga. Cuatro personas intoxicadas graves que requirieron hospitalizacin (Esteves y col., 1992). Entre 1985 y 1997 la toxicidad mxima por VPM vari entre 1.524 y 151.465 U.R./100g de tejido. en primavera y/o verano (Datos del Departamento de Bromatologa de la Direccin de Salud Ambiental de la Provincia del Chubut). Costa sur de la provincia del Chubut: no se ha identificado el organismo productor. Entre 1985 y 2000 no se registraron intoxicados en la zona sur de la provincia. Diciembre/2000 en Comodoro Rivadavia: Toxicidad por VPM: entre 7.284 y 10.095 U.R./100g de tejido de mejilln. Dos personas sufrieron intoxicacin moderada (Andrade y col., 2001). Octubre/2002 en Camarones: Toxicidad por VPM: 12. 623 U.R./100g de tejido de mejilln. Un intoxicado moderado (Andrade y col., 2004). Costa sur de la Patagonia. Organismo productor de toxinas: Alexandrium catenella.

1991/92 en el canal de Beagle: pico extremadamente alto de toxicidad por VPM: 636.000 U.R./100g de tejido de mejilln. La floracin comenz en el Estrecho de Magallanes, luego se expandi en latitud y fueron afectados todos los canales entre los 49 20 S y 54 55 S, causando la muerte de once personas y ms de trescientos intoxicados. En este caso el fenmeno se atribuy en parte, al incremento de las radiaciones ultravioletas debido al decrecimiento de la capa de ozono en esta regin austral (Benavides y col, 1995). 1994-1996: Toxicidad por VPM con picos en verano de hasta 134.407 U.R./100g de tejido de mejilln.

Veneno Diarreico de Moluscos Aunque los organismos productores de VDM no se renen en grandes poblaciones, los moluscos bivalvos tienen la capacidad de concentrar las toxinas y su ingestin produce desrdenes gastrointestinales que generalmente cesan luego de uno o dos das. Sus principales compuestos son el cido okadaico y sus derivados. El cido okadaico es un cido graso complejo de 35 carbonos, conocido promotor de tumores aun consumido en dosis que no se expresan clnicamente ni son detectadas por el bioensayo ratn. Estas toxinas a nivel intracelular inhiben a las Protenas Fosfatasas 1 y 2A (PP1 y PP2A) ambas claves en procesos celulares como divisin celular, matenimiento de la estructura del citoesqueleto, metabolismo interno, regulacin de canales inicos y regulacin de la expresin gnica. Su sintomatologa se manifiesta a travs de vmitos y diarreas, que pueden producir la deshidratacin de las personas. La falta de mtodos adecuados (sensibles y especficos como el HPLC) de deteccin de estas toxinas es uno de los impedimentos para la vigilancia epidemiolgica de los casos clnicos sospechosos asi como del monitoreo de su presencia en el ambiente Golfos Norpatagnicos (norte de la provincia del Chubut): Organismo productor de toxinas: Prorocentrum lima. Un evento de intoxicaciones de cuarenta personas que mostraron los sntomas de intoxicacin con estas toxinas, ocurri en Marzo del 2001. Los moluscos en este caso fueron analizados y los resultados fueron positivos para toxinas diarreicas en mejilln y cholga intoxicadas (Gayoso y Ciocco, 2001). Las conclusiones de la Jornada sobre Biotoxinas y su impacto en la Salud Humana realizada recientemente en nuestra provincia, resalta la necesidad de realizar un monitoreo al mismo tiempo que estudios epidemiolgicos, con el fin de determinar la presencia de estas toxinas, su dinmica en el ambiente as como los efectos sobre la salud de la poblacin indicando reas de mayor riesgo que puedan ser comparadas por ejemplo con la prevalencia de tumores gastrointestinales. Veneno Amnsico de Moluscos El VAM est compuesto principalmente por el aminocido excitatorio secundario, cido domoico y sus ismeros. Los moluscos o peces que contienen ms de 20 g de cido domoico por gramo de carne, son considerados no aptos para el consumo humano, por lo que se recomienda su veda cuando superan este nivel. En Patagonia si bien estn presentes especies de diatomeas descritas como productoras de toxinas amnsicas, no se ha detectado las toxinas, por lo que un monitoreo de carcter preventivo es necesario. Los sntomas incluyen nuseas, vmitos, dolor de cabeza, diarrea, calambres abdominales, confusin, desorientacin y prdida de la memoria retrgada (amnesia) y otros signos neurolgicos serios y de caracter permanete incluso llegando a estado de coma y muerte. El cido domoico acta sobre receptores glutamatrgicos abundantes en el Sistema Nerviosos Central (Zona de hipocampo fundamentalmente) y sistema digestivo produciendo neuropatas diversas y muerte nerunal por aumentoi incontrolado de la concentracin intracelular de iones Ca++. Costa de la provincia de Buenos Aires: Organismo productor de toxinas: Pseudonitzschia australis.

Julio/2000. Toxicidad por VAM: 76,7 g/g de tejido en vsceras de anchota, no se registraron intoxicados (Carreto y Montoya, 2000). El valor lmite de seguridad para el consumo humano es de 20 g/g de tejido. Conclusiones

El impacto de biotoxinas marinas, es de tal magnitud a nivel provincial, que no es imaginable una situacin en la que su monitoreo, vigilancia y control de las FANs, tendiente a reducir su efectos negativos sobre la salud pblica y actividades econmicas claves de de la regin como la explotacin del recurso molusco, la pesca y el turismo no sea de importancia fundamental. Es por esto que este proyecto propone fortalecer el Plan Provincial de Prevencin y Control de Mareas Rojas para su mejoramiento en sus aspectos cientficos y tcnicos. Este proyecto sigue los lineamientos cientficos recomendados The Global Ecology and Oceanography of Harmful Algal Blooms (GEOHAB) Programme realizado bajo el auspicio del Scientific Committee on Oceanic Research (SCOR) del International Council for Science (ICSU) y de la Intergovernmental Oceanographic Commission (IOC) de la UNESCO. (Intergovernmental Oceanographic Commission -IOC) de la UNESCO. Este plan propone 5 temas de estudio (GEOHAB, 2003) Biodiversidad y Biogeografia Nutrientes y Eutroficacin. Estrategias adaptativas. Ecosistemas comparativos Observacin, Modelos y Prediccin. El desarrollo de estos temas se ha adaptado a la realidad de Patagonia y particularmente la Provincia de Chubut que ha considerado a la investigacin sobre mareas rojas como lneas prioritaria de desarrollo. Por tanto, en base a los conocimientos actuales proponemos avanzar la adquisicin de equipamientos y la formacin de recursos humanos necesarios para dar una respuesta a la presencia de marea roja y su impacto ambiental, sanitario, social y econmico. Este proyecto sentar las bases para la preparacin de un Plan cientfico para la Patagonia que sea respaldado por la UNESCO y que permita la insercin de las investigacin locales en un marco internacional para la comprensin de un fenmeno global como lo son las FANs. Parmetros ambientales asociados a la presencia de especies nocivas Alexandrium tamarense, es una especie productora de toxinas, con una amplia distribucin geogrfica y localizada en la zona costera patagnica responsable de episodios txicos, algunos de los cuales con graves consecuencias ocasionando muertes en seres humanos y vedas del recurso marisquero. Esta especie se presenta de manera estacional en los golfos norpatagnicos a fines de la primavera y verano como un componente normal del fitoplancton. Sin embargo se manifiesta en forma de floracin bajo determinadas condiciones de la masa de agua y condiciones meteorolgicas, sumado esto a su particular ciclo de vida, con la existencia de formas de quistes de reposo que se depositan en el bentos que al ser reinoculados en la columna de agua, si las condiciones son favorables se produce su desarrollo en forma de floracin. Un hecho significativo es que las mximas densidades celulares y su manifestacin en forma de bloom se han detectado en los ambientes costeros con impacto antrpico, tal el caso de la Baha Nueva y de la Baha Engao, con graves consecuencias para la salud humana. En el primer caso se registr un florecimiento txico asociado a fenmeno de surgencia predominancia de fuertes vientos del sudoeste (v > 20 km/h) durante 16 das en diciembre de 1987enero de 1988. En el estuario del ro Chubut entre los aos 1985 y 1991 la especie txica evidencia el carcter estacional de la fase vegetativa desde finales de la primavera hasta principios del otoo, presentando una correlacin positiva con la temperatura, las concentraciones de nitrato y la salinidad (Santinelli y Esteves, 1993). Se detectan quistes de reposo en concentraciones

importantes en la columna de agua durante el perodo 2002-2003 coincidente con la ejecucin de las obras de dragado de la zona portuaria en dicho estuario (Santinelli, com.pers. ) Este subproyecto podr sentar las bases para la confeccin de un modelo matemtico predictivo de la aparicin de floraciones algales nocivas. Podrn adems, vincularse los resultados de las investigaciones in situ con imgenes satelitales.

Control, Prevencin e Investigacin desarrolladas en la provincia de Chubut que sern reforzadas con este proyecto Entre 1980 y 1984 se realizan en el Centro Nacional Patagnico las determinaciones de VPM por bioensayos. En el ao 1985 se firma un Decreto Provincial que pone en marcha el Plan Provincial de Prevencin y Control de Mareas Rojas y comienza en la costa de la provincia del Chubut, el control de VPM mediante bioensayos que realiza la Direccin Provincial de Salud Ambiental. En funcin de estos resultados, cuando se superan las 400 U.R./100g de tejido, la Direccin de Pesca establece vedas a la captura de moluscos. A partir de 1994 se implementa en la costa de la provincia del Chubut, el monitoreo mensual de fitoplancton nocivo y parmetros ambientales asociados que complementa la determinacin de biotoxinas. En 1998 y 1999 se obtiene el perfil de las toxinas de VPM en muestras de la costa del Chubut. (Reyero y col. 1998; Andrinolo y col. 1999). El Laboratorio de Hidrobiologa en colaboracin con el rea de Oceanografa Qumica y Contaminacin del CENPAT se realizaron los siguientes proyectos de investigacin relacionados con esta problemtica: * Estudio de las Diatomeas y los Dinoflagelados del Estuario del Ro Chubut con Especial nfasis en las Especies Potencialmente Txicas. * Estructura Ecolgica del Sistema Caleta Valds-Laguna Punta Cero. * Aspectos biolgicos y dinmica de nutrientes en dos ecosistemas costeros perturbados (Baha Nueva y Baha Engao). * Plan de Manejo Integrado de la Zona Costera Patagnica. Consultora para la Fundacin Patagonia Natural. * Plan de Monitoreo de fitoplancton txico y toxicidad en moluscos. * Parmetros oceanogrficos y fitoplancton nocivo en la zona costera patagnica. * Estudios ambientales en ecosistemas costeros perturbados. Golfo Nuevo, Chubut. 2.c. Justificacin y beneficios: Existencia del problema: Presencia de FANs en las costas de la regin con impactos ambientales, sanitarios, econmicos y sociales. Ausencia de un centro de monitoreo y vigilancia de FANS Si bien en la actualidad existen programas de monitoreo de fitoplancton txico y un programa de vigilancia epidemiolgica de intoxicaciones con VPM, no existe en la Republica Argentina un centro de monitoreo de las FANs que de una respuesta cientfica global, completa e integrada a los problemas derivados de su presencia. Es necesario entonces conformar dicho centro que permita en primera instancia: - Detectar, identificar y cuantificar las toxinas de los venenos Paralizantes, Diarreico y Amnsico - Dar respuesta rpida ante la aparicin de otras toxinas - Fortalecer los programas de monitoreo existentes amplindolos y completndolos - Desarrollar las bases de la epidemiologa y la determinacin de los impactos sobre la salud de la poblacin.

Presencia de nuevas toxinas. Es regla general que la presencia de nuevas toxinas en una regin sea detectada a partir de intoxicaciones humanas Un sistema de alerta temprana y el uso combinada de tcnicas anliticas especficas y sensibles para las distintas toxinas (HPLC) y el bioensayo ratn permitirn detectar la aparicin de nuevas toxinas precozmente y tomar los recaudos necesarios. Presencia de especies nocivas En las costas del Chubut, est presente la especie productora de VPM, Alexandrium tamarense, desde el golfo San Matas hasta el golfo San Jorge (Carreto y col., 1981; Esteves y col., 1992; Santinelli y Esteves, 1993; Sastre y col., 1997). Las especies potenciales productoras de VAM, Pseudo-nitzschia australis, P. multiseries, P. pungens, P. fraudulenta y P. pseudodelicatissima han sido registradas en los golfos San Matas, San Jos y Nuevo (Esteves y col, 1996; Esteves y col., 1997; Ferrario y col., 1999; Sastre y col., 2002). Sin embargo la presencia de la toxina no ha sido comprobada en la regin. Las productoras de VDM, Prorocentrum lima, Dinophysis acuminata y D. fortii, adems de estar presentes en los golfos, han sido detectadas tambin en la baha Engao, siendo algunas de ellas componentes permanentes del fitoplancton (Gil y col., 1989; Santinelli y col., 1995; Gayoso y Ciocco, 2001). En este caso se ha determinado la presencia de cido okadaico, estas toxinas no se monitorean dentro del programa epidemiolgico de la provincia por falta de equipamiento y formacin de recursos humanos.

Problemas Sanitarios La epidemiologa relacionada con los distintos venenos de origen algal es escasa, incompleta y parcial. Las mejores registradas, por su graves y evidentes consecuencias, son las toxinas del VPM que ha cobrado varias vctimas, y cientos de intoxicados, aunque slo se han registrado 35 en todo el pas. Esta toxina se ha presentado como un problema sanitario identificado como una ETA (enfermedad transmitida por alimentos) de denuncia obligatoria. En el caso de VDM sus expresin clnica hace que la vinculacin de la diarrea o dolores abdominales no se vinculen con el consumo de mariscos con VDM. Se suma a esto la imposibilidad de determinar, identificar y cuantificar su presencia en moluscos y en muestras biolgicas de los pacientes. Dado que estas toxinas tienen un fuerte impacto en la salud de los consumidores del recurso molusco, la implementacin de su deteccin y cuantificacin cobra una importancia de primer orden. En Chile, ms precisamente en la Isla de Chiloe se ha correlacionado positivamente el consumo de moluscos con bajos niveles de cido okadaico con una alta incidencia de cncer gastrointestinal (Andrinolo, comunicacin personal). Necesidades Tcnicas Mtodos de identificacin y medicin de las toxinas. En nuestro pas, desde 1980, cuando se registr el primer caso de intoxicacin por VPM, y hasta 1984, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) y el Centro Nacional Patagnico (CENPAT) asumieron el control de la presencia de toxicidad en los moluscos de la costa chubutense. Con posterioridad, el Departamento de Bromatologa de la Direccin de Salud Ambiental de la Secretara de Salud, de la provincia del Chubut, continu con esta tarea, asignada segn el Decreto Provincial 1654/85. Estos controles se han realizado y continan realizndose en la actualidad mediante el mtodo del bioensayo en ratn de la AOAC (Asociacin de Qumicos Analticos Oficiales) (AOAC, 1995), que fue desarrollado originalmente por Sommer y Meyer en 1937 (Sommer y Meyer, 1937). Este ensayo se ha aplicado con xito durante dcadas y es el nico mtodo reconocido internacionalmente para determinar las toxinas del VPM, VNM con fines regulatorios (Fernndez y col., 2002), no as para VDM y VAM. Sin embargo, este mtodo, de indiscutible valor para el control sanitario y la proteccin de los consumidores (ya que estudia la respuesta en un ser vivo), es poco especfico, tiene baja sensibilidad, mala reproducibilidad

interlaboratorios, es semicuantitativo y requiere del mantenimiento de grandes reservas de ratones. Adems, es un mtodo que requiere el sacrificio de animales, lo que despierta la oposicin de sociedades protectoras de animales (Lagos, 2002). Entre las tcnicas analticas avanzadas, la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC = High Performance Liquid Chromatography), aplicada a la identificacin y cuantificacin de las ficotoxinas, es una tecnologa de gran sensibilidad, precisin y reproducibilidad, que permite obtener informacin sobre la composicin cualitativa y cuantitativa (perfil) de los complejos txicos. Esta tcnica es de amplio uso en la separacin, purificacin y aislamiento de compuestos qumicos y bioqumicos, y es la que presenta mayor cantidad de aplicaciones para el ms amplio espectro de anlisis cuantitativos de productos naturales, frmacos, compuestos qumicos y bioqumicos, y por supuesto, de todo tipo de toxinas. Debido a la gran variedad de detectores desarrollados por la industria fabricante de estos equipos, es posible detectar cualquier sustancia, incluso las que son opacas en el espectro visible y ultravioleta, como es el caso de las toxinas del VPM y VDM. Adems con esta tcnica se tiene a disposicin la gran cantidad de aplicaciones, ya desarrolladas, de la cromatografa lquida, lo que permite separar prcticamente cualquier compuesto, a partir de diferentes mezclas y cuantificarlo, en una corrida de no ms de 25 minutos (Lagos, 2002). Problemas Econmicos y Sociales Recursos naturales afectados por el fenmeno. Extraccin de moluscos de bancos naturales. Adems de constituir un problema sanitario, la marea roja afecta a sectores econmicos importantes de la provincia. Teniendo en cuenta que en la zona costera patagnica existe una gran diversidad de actividades econmicas, como pesca, acuicultura, turismo y recreacin, y una importante cantidad de reas de asentamiento de colonias de aves y mamferos marinos, es necesario intensificar los estudios y controles de la presencia de microalgas toxignicas y de las distintas ficotoxinas producidas. La pesca de bivalvos en la costa chubutense se ha concentrado durante ms de 30 aos casi exclusivamente en el golfo San Jos. La marisquera mediante buceo es relevante para la economa regional. Salvo altibajos, alrededor de 20 equipos marisqueros han operado regularmente en los ltimos aos, lo que significa una captura anual generalmente cercana a 700-1000 toneladas, procesada casi en su totalidad en 4-6 plantas de Puerto Madryn. Esto representa 1,0-2,5 millones de pesos anuales y 150-200 puestos de trabajo en los equipos marisqueros (Ciocco, 1995), que sumados a los 2000 trabajadores en la industrializacin del producto y a los puestos de trabajo indirectamente relacionadas con la actividad (2000 personas) hacen un total aproximado de 4200 familias o 16800 personas vinculadas a la actividad. La vieira tehuelche (Aequipecten tehuelchus) ha representado histricamente la especie sostn de la pesquera. Especies tradicionales capturadas en menor proporcin son la cholga (Aulacomya atra), la almeja rayada (Ameghinomya antiqua) y el mejilln (Mytilus edulis platensis). Recientemente, la navaja (Ensis macha) y sobre todo la almeja panopea (Panopea abbreviata), se han incorporado como promisorias especies alternativas. Otros moluscos de menor inters en la actualidad son la cholga paleta (Atrina seminuda), la falsa ostra (Pododesmus rudis), la ostra nativa (Ostrea puelchana) y caracoles de diversas especies (Ciocco, 2000a, b, c, d, e). Cultivo de moluscos. Actualmente existen algunos emprendimientos a pequea escala de cultivo de mejillones, realizndose la captacin de semilla en los golfos San Matias y San Jos y el engorde en el golfo Nuevo y en la zona sur (Camarones y Caleta Malaspina). Pesca Recursos pesqueros de importancia econmica pueden ser afectados por la presencia de FAN ya sea limitando su supervivencia en estadios larvales y por tanto su tasa de reproduccin como por poder ser bioacumuladas por estos y por tantos convertirse en vectores de la intoxicacin. Turismo Los ecosistemas de las costas patagnicas son nicos en el mundo y albergan una importante biodiversidad, siendo lugar de asentamiento de aves y mamferos marinos de gran atraccin turstica. Sin duda, la presencia de especies fitoplanctnicas productoras de toxinas, que se acumulan y afectan a todos los eslabones de la cadena trfica, afectan la diversidad biolgica.

Pennsula Valds es rea protegida y fue declarada Patrimonio Mundial de la Humanidad en 1999. Especies de mamferos, sujetas a regulaciones internacionales, como la ballena franca,. llegan todos lo aos a reproducirse y utilizan esa zona por sus caractersticas ambientales favorables. Es evidente que la presencia de fitoplancton txico es un problema que puede afectar la supervivencia de esta especie. En el caso de las toxinas paralizantes se propone que poseen un fuerte impacto sobre las larvas de invertebrados marinos que integran el zooplancton afectando su distribucin y reproduccin y por tanto la biodiversidad. Esta actividad, una de las principales generadoras de divisas, podra verse afectada por esta problemtica ocasionando cuantiosas prdidas por la declinacin del turismo. Adems, la intoxicacin de turistas por consumo de moluscos en la zona, ocasionara un perjuicio a esta actividad. Impacto Ambiental Una de las causas que potencian la presencia de FANs es el impacto sobre el ambiente marino de los desechos urbanos. Es importante estudiar entonces el efecto de las poblaciones humanas de la regin y el grado de eutrofizacin de los ambientes en estudio, sobre estos fenmenos. Beneficios que traer aparejados este subproyecto. La ejecucin de este subproyecto, contribuir significativamente al mejoramiento del Plan Provincial de Prevencin y Control de Mareas Rojas establecido en el ao 1985. La posibilidad de realizar la identificacin y determinacin cuantitativa de VPM, VDM y VAM es sumamente importante para la salud pblica de los potenciales consumidores de los productos pesqueros de la regin (habitantes de la provincia, turistas y tripulantes de flotas pesqueras). Otros beneficios que traer aparejados la ejecucin de este subproyecto sern: - Proveer de informacin ambiental necesaria para establecer con mayor precisin reas de veda. - Obtener conocimientos que ayuden a la comprensin del fenmeno de la marea roja. - Incorporar tecnologa de modo de constituir un laboratorio de referencia para toda la zona patagnica, con recursos humanos capacitados. - Posibilitar la certificacin analtica de la calidad de origen para productos destinados a mercados externos (demanda actual no cubierta). - Viabilizar la expansin de la actividad marisquera extractiva y el desarrollo de cultivos. Asi como de la actividad pesquera garantizando la ausencia de toxinas calidad en los productos y proponiendo formas de manejo que minimicen los impactos negativos derivados de los FAN. - Aportar herramientas de manejo de un fenmeno que dentro de sus impactos ambientales puede alterar la biodiversidad de la zona costera provincial. Cobra aqu particular relevancia la zona de pennsula Valds por ser patrimonio mundial de la humanidad. Con presencia de especies nicas que pueden ser afectadas por este fenmeno. - Proteccin de la industria del turismo entregando la informacin necesaria y el control de los FAN que impidan eventos de intoxicacin de personas. 2.d. Metodologa propuesta: 2.d.1 Estaciones y frecuencia de muestreo Las estaciones de muestreo sern las actualmente incluidas en el Plan Provincial de prevencin y Control de Marea Roja. De esta manera se muestrearn 18 estaciones divididas dos zonas (Norte; 11 y Sur; 7).

Estaciones Zona Norte Puerto Lobos (S42.00057 W65.05866) La Tapera (S42.33302 W64.55076) Riacho San Jos (S42.41269 W64.60081) Larralde (S42.40727 W64.33246) Fracaso (S42.39754 W64.19199) Bengoa (S42.25607 W64.10464) Srom-L.Galpones (S42.24595 W64.22658) Pardelas (S42.62081 W64.25893) Baha Nueva (S42.73657 W65.02441) Cerro avanzado (S42.85751 W64.77188) Magagna (S43.36458 W65.03003)

Estaciones Zona Sur Camarones (S44.83503 W65.71794) Caleta del Paton (S44.88692 W65.62450) Baha Solano (S45.02605 W65.89432) Baha Bustamante (S45.13463 W66.52014) Caleta Malaspina (S45.16248 W66.57089) Comodoro Rivadavia (S45.87179 W67.47423) Rada Tilly (S45.96941 W67.55753)

En cada estacin se registrar fecha, hora, direccin y velocidad del viento, porcentaje de nubosidad, temperatura de superficie, temperatura de fondo y transparencia con disco de Secchi. Las muestras de agua se tomarn con botella hidrogrfica diseada para tomar muestras integradas de la columna de agua para anlisis de nutrientes, salinidad, metales pesados,

clorofila y fitoplancton cuantitativo. La temperatura y el oxgeno disuelto se medirn in situ con sonda multiparmetro. Para la obtencin de muestras de fitoplancton cualitativo se colectarn con arrastres oblicuos con red de 25 m. Una submuestra de red se conservar viva y otra ser fijada con formol al 4% en envases plsticos. Las muestras cuantitativas se fijarn in situ con solucin de Lugol. Mediante buceo autnomo se colectarn las muestras necesarias para obtener de 100 a 200 gs de pulpa de moluscos y gasterpodos de inters comercial y de recoleccin costera. 2.d.2 Anlisis cuali cuantitativo de fitoplancton En laboratorio, las determinaciones sistemticas de dinoflagelados se realizarn mediante la separacin de placas usando hipoclorito de sodio. La limpieza de los frstulos de diatomeas se realizar segn Hasle y Syvertsen (1980) o Round y col. (1990). Las especies se medirn y se tomarn fotomicrografas en los casos de inters. Para la identificacin de especies de Pseudo-nitzschia las muestras sern enviadas a la Divisin Ficologa de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo de La Plata, donde se observarn con Microscopio Electrnico de Barrido. Los anlisis cuantitativos se realizarn con Microcopio Invertido, siguiendo la tcnica de termohl (Lund et al., 1958). Para la deteccin de quistes de dinoflagelados, se extraern sedimentos mediante dispositivo manual tipo Corer, los que sern sonicados y lavados para su observacin microscpica siguiendo la tcnica de Dale (1979). 2.d.3 Anlisis de los parmetros ambientales. Los parmetros ambientales a determinar sern la temperatura del agua, el oxgeno disuelto, la salinidad, nutrientes (nitrato+nitrito), amonio, fosfato, silicato, clorofila a y metales traza (hierro, cobre y cobalto). Parte del volumen de muestra extrada se filtrar por GF/F y el filtrado se conservar a 20 C para la determinacin de nutrientes. El filtro hmedo se conservar refrigerado y protegido de la luz hasta la determinacin de clorofila a. El resto de la muestra sin filtrar se destinar a la medicin de salinidad. La medicin de salinidad se efectuar mediante un salinmetro Plessey Autoportable Modelo 6230N, calibrado con agua de mar estndar. Los anlisis de nutrientes y de clorofila ase efectuarn segn Strickland y Parsons (1972). Para el anlisis de nutrientes se emplear un autoanalizador Technicon AA-II de dos canales y un espectrofotmetro Hewlett-Packard Modelo 8452A . Para la determinacin de clorofila a se utilizar un fluormetro Turner. Los metales traza se determinarn mediante absorcin atmica en el laboratorio de la DGPA. 2.d.4 Determinacin de biotoxinas mediante HPLC. Instrumentos e Infraestructura La Direccin de Salud Ambiental (DSA) se encuentra actualmente desarrollando el Proyecto PMT FL 3/48 (FONTAR-BID) Complementacin del laboratorio de CromatografaEspectrometra de Masa, previendo concluir en noviembre de 2004 la construccin de un laboratorio cuya infraestructura se desarroll con el objeto de cumplir con los requisitos mnimos necesarios para la instalacin y correcto funcionamiento de los cromatgrafos (instalacin elctrica independiente, acondicionamiento de temperatura y humedad, sectorizacin de las tareas de preparacin de muestras, campanas de extraccin de gases, provisin de vaco y gas inerte, etc.). En el marco del proyecto anteriormente citado, la DSA adquiri un equipo HPLC modular equipado con inyector automtico y detector de arreglo de diodos para ser destinado principalmente a dar repuesta a la normativa provincial de Biocidas y Agroqumicos (Ley N 4073), deteccin y cuantificacin de plaguicidas, hidrocarburos aromticos, compuestos orgnicos voltiles, aditivos alimentarios, etc. La demanda prevista para este equipo alcanza el 80 % de su disponibilidad funcional, por lo cual en la primera etapa

del presente subproyecto se adquirirn los mdulos necesarios (detector de fluorescencia, modulo derivatizador) de modo que, acoplados a los mdulos del equipo HPLC existente, se tendr conformado el equipamiento con los requisitos mnimos para la determinacin de las biotoxinas derivadas del VAM, VPM y VDM. As, el personal afectado contar con los recursos y equipamiento para realizar el adiestramiento correspondiente al primer perodo del subproyecto (18 meses) con la asistencia tcnica prevista. El segundo desembolso previsto en el subproyecto posibilitar la adquisicin de los restantes mdulos del sistema, los cuales en complemento con los mdulos adquiridos con el primer desembolso permitirn la constitucin de un sistema HPLC independiente y exclusivo para la implementacin de las tcnicas de identificacin cuantitativa de las biotoxinas. Esto implicar contar con el equipamiento y recursos humanos necesarios para incluir las determinaciones de VAM, VPM y VDM en el marco del Plan Provincial de Prevencin y Control de Marea Roja. Tcnicas a implementar. Deteccin de las Toxinas del VAM La cuantificacin del cido domoico y sus ismeros en muestras de fitoplancton se realizar de acuerdo a la tcnica de Pocklington et al., 1990 utilizando un sistema HPLC con derivatizacin pre-columna y detector fluorescente en lnea. Como cromforo se utilizar 9fluorenylmethoxycarbonyl chloride (FMOC-Cl). Para moluscos se emplear un detector UV con arreglo de diodos de acuerdo a AOAC, 1991. Deteccin de las Toxinas del VDM

Las toxinas del VDM presentan una mayor dificultad de deteccin y cuantificacin por su carcter hidrofbico, obligando al uso de solventes orgnicos y tratamientos qumicos ms complejos. La determinacin analtica se realizar de acuerdo a Quillam (1995) con las modificaciones indicadas por Lagos (2002). La tcnica incluye la necesidad de realizar derivatizacin pre-columna de estndares, extractos de moluscos y fitoplancton, empleando como reactivo derivatizador el 9-antrildiazometano (ADAM), limpieza posterior del extracto utilizando cartuchos de fase slida y solventes orgnicos. Se requiere utilizar el sistema HPLC en modo isocrtico, con derivatizacin pre-columna y detector de fluorescencia en lnea. La alta sensibilidad del mtodo posibilitar cuantificar las toxinas y determinar el perfil toxicolgico de muestras de fitoplancton, sean stas colectadas en ambientes naturales o provenientes de cultivos en condiciones controladas de laboratorio. Esta tcnica es la nica que permite conocer la composicin de las toxinas presentes en el VDM. Deteccin de las Toxinas del VPM

La deteccin mediante HPLC se realizar segn Oshima, (1995), requieriendo la derivatizacin postcolumna y detector de fluorescencia en lnea. Para ello se contar con una bomba de dos cabezales, coil de reaccin y cmara calefactora de columna. En la preparacin de muestra se utilizarn microtubos filtro (peso molecular de exclusin de 5000 daltons) y centrfugacin a 8000 rpm. 2.d.5 Determinacin de VPM mediante bioensayo. La determinacin de VPM mediante la tcnica del bioensayo se realizar segn AOACAssociation of Official Chemists(1984). El bioensayo en ratn permite la determinacin de la toxicidad global producida por las toxinas VPM presentes en la muestra. Se basa en el efecto txico causado por un extracto acdico de la muestra analtica, inoculado intraperitonealmente en ratones albinos de

aproximadamente 20 g de peso. Las VPM se extraen en caliente mediante una maceracin acuosa en medio cido de toda la carne del bivalvo previamente triturada. Posteriormente se inyecta 1 ml de extracto a cada uno de 3 ratones y se registra el tiempo de muerte (Tm). Con los datos del peso del ratn, dilucin del extracto y tiempo transcurrido hasta su muerte se calcula la toxicidad en unidades ratn (UR). Se define la UR como la cantidad de toxina que produce la muerte de un ratn de 20 g en 15 min. Para la aplicacin de este mtodo biolgico se utiliza una lnea pura del ratn Mus musculus, identificadas como CF1, ncleo principal SENASA. 2.d.6. Confeccin de una base de datos. Confeccin de una base de datos de informacin previa y obtenida durante el proyecto para alimentar al Sistema Provincial de Informacin Ambiental de la Direccin General de Proteccin Ambiental (SPIA). 2.d.7.Elaboracin de un programa de educacin ambiental. Delimitacin del problema. Definicin de los objetivos generales y especficos. Determinacin de los resultados esperados. Identificacin del pblico meta. Identificacin del mensaje a emitir. Seleccin de la/s estrategia/s educativas a implementar para el logro de los objetivos planteados y elaboracin del cronograma de ejecucin. Evaluacin de proceso y final de los resultados obtenidos. Elaborar un Programa de Educacin Ambiental en Educacin Formal sobre Floraciones Algales Nocivas y su Impacto en la Salud y los Recursos destinado a docentes de la zona. Elaborar un Programa de Educacin Ambiental en Educacin No Formal sobre Floraciones Algales Nocivas y su Impacto en la Salud y los Recursos destinado a los pobladores locales y visitantes, mediante la implementacin de las estrategias educativas que se consideren oportunas. Incluir la participacin de todos los actores involucrados con embarcaciones pesqueras, deportivas y/o recreativas para que acten como agentes multiplicadores Elaborar Folletos Informativos para ser distribuidos a los visitantes y turistas referidos a la problemtica en cuestin. Presentar ante las autoridades provinciales que posean injerencia en el ANP los resultados de la evaluacin del proyecto.

2.e Actividades: 2.e.1 Actividades relacionadas con el cumplimiento del Objetivo 1 1. Muestreos de agua, sedimentos, fitoplancton y moluscos en las estaciones definidas en el Acuerdo de Trabajo firmado entre la Secretara de Pesca de la Pcia del Chubut y la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. A cargo de la Secretara de Pesca y la Direccin General de Proteccin Ambiental. 2. Determinaciones cualitativas y cuantitativas del fitoplancton en el Laboratorio de Hidrobiologa de la Facultad de Ciencias Naturales de la UNPSJB. 3. Determinacin de nutrientes, salinidad y clorofila a en el Laboratorio de Oceanografa Qumica y Contaminacin de Aguas Unidad de Investigacin de Oceanografa y Meteorologa del CENPAT (CONICET) . 4. Determinacin de metales pesados en el Laboratorio de Proteccin Ambiental. 5. Correlacin entre los resultados fitoplanctnicos y los parmetros ambientales obtenidos.

2.e.2 Actividades relacionadas con el cumplimiento del Objetivo 2 6. Capacitacin y Entrenamiento de recursos humanos en el desarrollo y puesta a punto de las tcnicas de identificacin y cuantificacin anlitica de biotoxinas (VAM, VDM y VPM) empleando Cromatografa Lquida de Alta Performance. 7. Implementacin de las tcnicas cromatogrficas desarrolladas para el anlisis de las biotoxinas en el Laboratorio de la Direccin de Salud Ambiental. 8. Determinacin de VPM por bioensayo en el Departamento de Bromatologa de la Direccin de Salud Ambiental. 9. Correlacin de los resultados obtenidos en las determinaciones de biotoxinas con el anlisis fitoplanctnico. 2.e.3 Actividades relacionadas con el cumplimiento del Objetivo 3 10. Confeccin de una base de datos de informacin previa y obtenida durante el proyecto para alimentar al Sistema Provincial de Informacin Ambiental de la Direccin General de Proteccin Ambiental (SPIA). 2.e.4 Actividades relacionadas con el cumplimiento del Objetivo 4 11. Realizar acciones de educacin formal y no formal destinadas a docentes y alumnos de la EGB3 y polimodal pertenecientes a escuelas de la provincia; sectores con injerencia en la zona costera (Prefectura Naval Argentina, Pescadores Artesanales, Guardafaunas, Guas de turismo, etc.); mdicos y agentes sanitarios. Realizar campaas de educacin informal mediante acciones de difusin masiva de la problemtica (mensajes y cortos publicitarios en medios de comunicacin social, carteles sobre rutas y caminos, folletos y cartillas informativas), tareas estas que sern coordinadas por el Centro de Educacin Ambiental de la Direccin General de Proteccin Ambiental de la provincia del Chubut 2.f. Resultados esperados: La ejecucin de este subproyecto, contribuir significativamente a: Fortalecer el Programa de Monitoreo de fitoplancton nocivo y parmetros ambientales relacionados implementado segn acuerdo de trabajo entre la Secretara de Pesca y la Facultad de Ciencias Naturales de la U.N.P. Identificar condiciones ambientales que puedan asociarse con la produccin de las FANs en los sitios de estudio. Fortalecer el Plan Provincial de Prevencin y Control de Mareas Rojas, establecido por Decreto Provincial 1865/85, mediante la identificacin y determinacin cuantitativa de VPM, VDM y VAM. Obtener conocimientos que ayuden a la comprensin del fenmeno de la marea roja. Incorporar tecnologa de modo de constituir un laboratorio de referencia para toda la zona patagnica, con recursos humanos capacitados. Implementar efectivamente la determinacin cromatogrfica de las biotoxinas como parte de las tareas de vigilancia, control y evaluacin de efectos producidos por la intoxicacin por biotoxinas marinas sobre la salud humana, que lleva adelante el estado provincial. Disponer de una base de datos sistematizada que contenga informacin georreferenciada respecto a la evolucin del fenmeno en las costas del Chubut, parmetros ambientales, concentracin de biotoxinas y otros resultados originados en las actividades del proyecto. Brindar informacin de base de datos de calidad de agua a la DGPA, como herramienta de manejo y gestin ambiental. Promover actitudes de comportamiento en la poblacin que conlleven a valorar la importancia de no comercializar ni consumir moluscos en pocas donde se impone la veda por parte de las autoridades de aplicacin.

Lograr la efectiva participacin interinstitucional de todos los actores involucrados en la problemtica de marea roja, con el objetivo de mantener en el tiempo las tareas de monitoreo, vigilancia, prevencin y control de la marea roja.

2.g. Vinculacin con programas y/o proyectos en ejecucin: El subproyecto estar directamente vinculado con el Programa de Monitoreo de Fitoplancton Nocivo en los bancos de moluscos bivalvos y gasterpodos de inters comercial y de recoleccin costera, en la Provincia del Chubut, que se realiza mediante acuerdo de trabajo entre la Facultad de Ciencias Naturales y la Secretara de Pesca (Renovado en septiembre 2004 por el trmino de 2 aos). Se vincular adems con el Proyecto de Investigacin Estudios ambientales de ecosistemas costeros perturbados: Bahas de Ushuaia - FONCYT PICTR 2002-00090 Proyecto tipo C Redes Responsable Nodo1: Dr. Jos Luis Esteves (Cenpat CONICET) Fecha de alta: abril 2004 (En curso).

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