Las interacciones tisulares en la organognesis del pulmn.

John M. Shannon, Phd, Brian A. Hyatt, Phd.

La carga metablica de la respiracin celular en el aire respirado por los mamferos y anfibios requiere de una manera eficiente para proveer de oxgeno sistmico que se rena por los pulmones, los cuales proporcionan una gran rea de superficie (estimado entre los 70 a 100 m2 en el humano adulto) para el intercambio de gases. El pulmn es un rgano complejo que cuenta con ms de 40 tipos de clulas distintas, cada una de las cuales juega un rol importante en las funciones pulmonares normales, tales como el mantenimiento de la permeabilidad alveolar, la proteccin contra las partculas inhaladas y las toxinas, y la innata inmunidad del husped. A pesar de su eventual complejidad, el pulmn tiene un simple comienzo, derivada desde el piso endodrmico del intestino anterior como el par sptimo de las bolsas farngeas. En humanos, la primera evidencia del desarrollo de los pulmones es la formacin del surco laringotraqueal, que se bifurca en su extremo posterior para formar el bronquio primario y los rudimentos pulmonares. La iniciacin del desarrollo de los pulmones en los roedores es un poco diferente, como que los rudimentos del pulmn surgen desde el par endodrmico fruto del mesnquima derivado desde el mesodermo esplcnico. En ambos casos, sin embargo, el endodermo inducido sufre una serie de dicotomizaciones y ramificaciones laterales para dar lugar al rbol pulmonar, un proceso clsicamente denominado morfognesis de la ramificacin. La alveolarizacin comienza hacia el final de la gestacin y contina despus del nacimiento. La arborizacin extensa del epitelio pulmonar est acompaada en paralelo al desarrollo de la vasculatura pulmonar ordenado. Este desarrollo paralelo del epitelio pulmonar distal y de la vasculatura en el embrin y el feto generaran despus del nacimiento convertirse en el funcional sistema de intercambio de gas. Concomitante con la morfognesis de la ramificacin es la especificacin de los diversos tipos de clulas en todo el pulmn que constituye el rgano maduro. El patrn de la formacin y de la diferenciacin correcta espacialmente de los diferentes tipos de clulas en el desarrollo pulmonar requiere de la expresin coordinada de mltiples genes en el lugar correcto para el momento adecuado. La elucidacin de los genes que controlando el desarrollo de los pulmones apenas est comenzando, pero un principio ha surgido: la morfognesis epitelial especifico del mesnquima y la citodiferenciacin es dada por medio de una induccin prxima.

Interacciones del tejido en el desarrollo de pulmn

Los estudios tanto en mamferos como en aves han establecido que la morfognesis epitelial de la ramificacin y la diferenciacin en el pulmn requieren una interaccin entre el epitelio endodrmico y su mesnquima subyacente. Este no es sino un ejemplo de un nmero de principios secundarios a corto plazo que es conocido comnmente como las interacciones epitelio-mesnquima, los cuales han sido descritos en los pulmones, glndulas salivales, pncreas, glndulas mamarias, riones, dientes, miembro, tracto urogenital y otros rganos. En el pulmn, la primera revisin de un requerimiento de mesnquima para la morfognesis del pulmn se hizo hace 65 aos atrs por Rudnick, quien observo que los rudimentos pulmones de los embriones de pollo se ramifican cuando se implanta en la membrana corioalantoidea en el huevo, pero todo el desarrollo ceso cuando el mesnquima fue removido. El desarrollo de tcnicas in vitro para rudimentos pulmonares embrionarios permitieron estas observaciones siendo confirmadas y ampliadas tanto en aves y en mamferos. Incluso los primeros eventos de la organognesis del pulmn pueden ocurrir in vitro: los brotes pulmonares primarios se

forman en el cultivo de intestinos tomado de embriones ya en la etapa Somatica 2. Ocurre la ramificacin extensiva, sin embargo, slo si los intestinos se toman de embriones en la etapa Somatica 25, cuando las invaginaciones pulmonares primarias surgen desde el piso del tubo intestinal El desarrollo de tcnicas de recombinacin de tejidos ha adelantado el estudio de las interacciones epitelio-mesnquima. En determinadas etapas del desarrollo, los rganos rudimentarios embrionarios son tratados con la incubacin de enzimas proteolticas seguido por la diseccin mecnica pudiendo ser separados en epitelio purificado y en mesnquima. Entonces, los tejidos son recombinados y cultivados in vitro. Particularmente, los estudios informativos han comparado la respuesta de un epitelio a su propia mesnquima (homotipica recombinante) frente a una mesnquima no relacionada (heterotpica recombinante). Un nmero de estudios involucrados con la separacin, la recombinacin y el cultivo de rudimentos de pulmn embrionario han producido varias observaciones coherentes sobre el papel de las interacciones epitelio-mesnquima en el desarrollo pulmonar. En primer lugar, el epitelio del pulmn embrionario no puede sobrevivir durante un perodo prolongado en la ausencia del mesnquima. Maestros han demostrado que los rudimentos epiteliales del pulmn de un ratn embrionario sufren necrosis por 72 horas cuando son cultivadas en ausencia de mesnquima, una cantidad mnima de mesnquima se requiere para la supervivencia epitelial in vitro, y el grado de diferenciacin epitelial est relacionado con la cantidad presente de mesnquima en los recombinantes del tejido. En segundo lugar, la morfognesis de la ramificacin del epitelio pulmonar embrionario requiere de una interaccin especfica con el mesnquima pulmonar. El epitelio pulmonar embrionario puede sobrevivir en un mesnquima heterotpico, a pesar de que una mayor proliferacin y as como la ramificacin del pulmn sea detenida. Dameron ha demostrado que los rudimentos epiteliales del pulmon del pollo sobreviven cuando se recombina con el mesonfrico, los somticos, o con la mesnquima corioalantoica, pero solo ramificado normalmente en presencia de la mesnquima del pulmn; la ramificacin limitada puede ser inducida por el mesnquima metanfrico. Spooner y Wessells mostraron que cultivos de Somito 25 (noveno da de gestacin) del endodermo intestinal del ratn forman los brotes pulmonares en respuesta al mesnquima de la glndula salival, pero las ramas slo en presencia de mesnquima pulmonar. La respuesta del epitelio pulmonar embrionario al mesnquima de la glndula salival es variable y depende de la etapa en la cual se aisl el epitelio: los rudimentos pulmonares epiteliales son aislados a partir de da 12 en ratones o el da 13 en las ratas y no muestran ninguna respuesta cuando se recombina con mesnquima de la glndula salival, mientras que los rudimentos del epitelio aislado desde los pulmones slo con 1 da mas (cuando las ramificaciones secundarias se han formado) muestran en respuesta un nmero limitado de ramificaciones. Resultados similares fueron observados en recombinaciones de mesnquima de glndula salival al da 15 en ratas versus el epitelio pulmonar de las ratas al da 12. El patrn de ramificacin en estas recombinantes se especifica por el mesnquima, como en este caso la glndula salival. El fenotipo citodiferenciado de las clulas epiteliales del pulmn que respondieron a la recombinacin con mesnquima glndula salival no fueron determinados. Si la mesnquima de la glndula salival fue permisivamente apoyada en la citodiferenciacin de las clulas epiteliales del pulmn o si se reprogramo instructivamente la expresin de un nuevo fenotipo, se desconoce. Otro sistema que ha demostrado las capacidades instructivas del mesnquima pulmonar y que tambin ha servido como modelo para los eventos tempranos en el desarrollo pulmonar fue originalmente descrito por Alescio y Cassini. En estos estudios, una parte del mesnquima se extirpa quirrgicamente desde el da 11 al 12 de la traquea del ratn y

se sustituye por la mesnquima pulmonar heterotpica. Cuando la mesnquima pulmonar distal se implanta como el mesnquima de reemplazo, este induce la formacin de un supernumerario brote desde la pared del epitelio traqueal que sigue a la rama de un modo similar al pulmn (Figura 6-1). Estos datos fueron extendidos por Wessells, quien demostrando que la mesnquima de varios tejidos no relacionados, tambin pueden inducir la formacin de un brote supernumerario, cuando es implantado en el epitelio traqueal desnudo. Es importante destacar, sin embargo, que slo la mesnquima pulmonar apoya la ramificacin posterior a la formacin del brote inicial. Adems, Wessells mostr que la mesnquima traqueal inhibe la ramificacin del epitelio pulmonar cuando se implanta en el epitelio traqueal desnudo. Por lo tanto, existen claramente diferencias importantes entre la mesnquima pulmonar y la mesnquima traqueal, aunque ambos tienen un origen espacial similar dentro del embrin. En tercer lugar, el fenotipo de las clulas epiteliales es dependiente del tipo de mesnquima desde el cual reciba seales inductivas. Una pregunta que se plantea desde el estudio de la implantacin traqueal es que se trate el fenotipo celular del epitelio traqueal inducido. Hemos tratado esta pregunta por la implantacin distal del mesnquima pulmonar embrionario en el mismo escenario del epitelio traqueal que fue extrado de su propia mesnquima. Idntico a las observaciones anteriores en el ratn, la mesnquima pulmonar embrionario distal de la rata fue implantada en el epitelio traqueal que induce un brote supernumerario de las ramificaciones en un patrn similar al de pulmn. El anlisis histolgico y ultraestructural indica que el epitelio traqueal ha sido reprogramado para expresar un fenotipo epitelial pulmonar distal. Tambin nos favorecemos de la observacin que la protena C surfactante (SP-C) es una clula especifica epitelial alveolar tipo II marcada en roedores fetales (Figura 6-2), y las clulas epiteliales de la trquea roedor nunca se ha mostrado expresar SP-C en cualquier punto en el desarrollo. Las estructuras de la ramificacin inducidas en el epitelio traqueal por la mesnquima pulmonar distal exhibe clulas intensamente positivas para el acido ribonucleico mensajero del SP-C en el aspecto mas distal, y la expresin del ARNm del SP-C se detecta tan pronto como a las 24 horas despus de la recombinacin (Figura 6-3). El patrn distal de la expresin del ARNm del SP-C es idntico al que se observo en los cultivos de control de los explantes pulmonares intactos desde el mismo animal, lo que sugiere que la mesnquima pulmonar induce al epitelio traqueal a seguir un desarrollo del patrn correcto espacialmente. A partir de estos datos moleculares, histoqumicos y ultraestructurales, se concluy que el mesnquima pulmonar est actuando instructivamente sobre el epitelio traqueal, es decir, las clulas se han reprogramado para expresar un nuevo fenotipo que no habra ocurrido en ausencia de mesnquima pulmonar. La capacidad del epitelio traqueal para responder al mesnquima pulmonar est temporalmente restringida, sin embargo, desde el da 16 el epitelio no es competente para responder al da 13 de la mesnquima. Adems, la mesnquima pulmonar fue incapaz de inducir una respuesta en otro intestino derivado del endodermo como el esfago y el intestino, indicando que estos epitelios son ya restringidos en este punto del tiempo. Como se discutir ms adelante, la conservacin de los mecanismos bsicos de subyacentes a ramificacin del sistema respiratorio puede extenderse evolutivamente tras la Drosophila. La conservacin de la induccin permisiva por la mesnquima pulmonar de diferentes especies, tambin es vlido para citodiferenciacin epitelial: cuando el epitelio pulmonar del ratn al da 16 es directamente recombinado con el mesnquima pulmonar del pollo, las ramas del epitelio, cultivados durante 2 a 5 das, dando que las clulas epiteliales resultantes contienen numerosas copias de cuerpos lamelares, indicando que la diferenciacin de la clula tipo II ha ocurrido.

Los efectos de la ramificacin del epitelio del pulmn estimulando el mesnquima pulmonar parecen ser de corto alcance y mediada por un factor o factores difusible(s). Esto qued demostrado en las recombinaciones del tejido transfiltrado realizados usando las pioneras tcnicas de Grobstein en sus estudios de referencia en el rin y en el desarrollo del rin y la glndula salival. Usando este sistema de modelo, Taderera aslo el epitelio pulmonar y los rudimentos mesenquimales y cultivados puestos estos el uno al otro, con el filtro Milipore interpuesto a 0,45 mm interpuesto entre ellos. Estos filtros permiten el paso de macromolculas entre los dos tejidos, pero no permiten el contacto clula a clula directo en virtud de las vas tortuosas que atraviesan estos filtros tipo malla. Los resultados mostraron que el epitelio no se ramifica en ausencia de mesnquima sino distribuido sobre la superficie del sustrato del cogulo del plasma. Sin embargo, en presencia del mesnquima pulmonar, sobreviene la ramificacin del pulmn tipo. Una importante observacin adicional en estos experimentos fue que la mesnquima pulmonar del pollo es tan efectiva como la mesnquima pulmonar del ratn al apoyar la ramificacin, sugiriendo una vez ms que las molculas inductivas requeridas para la morfognesis de la ramificacin estn conservadas evolutivamente. La reciprocidad en las interacciones epitelio-mesnquima tambin ocurren en el desarrollo pulmonar. Como se ha indicado anteriormente, Taderera ha demostrado que la capacidad de mesnquima pulmonar a apoyar la ramificacin epitelial es mantenida cuando un filtro se interpone entre los dos tejidos, y el contacto directo entre el epitelio y el mesnquima no es perceptible. Las observaciones adicionales hechas en estos experimentos interesados en los efectos del epitelio en el mesnquima: las clulas vasculares y las clulas del estroma se desarrollan slo en el mesnquima cuando es transfiltrado del cultivo al epitelio pulmonar. En ausencia de epitelio, la mesnquima pulmonar no expresa el tipo de clulas del tejido conectivo pulmonar. Por otra parte, la mdula espinal y el epitelio salival dejan de influir en la histognesis del mesnquima pulmonar, sugiriendo que la contribucin del epitelio a la histogenesis de la mesnquima es especfica. Si el desarrollo de los tipos de clulas especializadas en el compartimiento no epitelial del pulmn es dependiente de la presencia de epitelio pulmonar, la reciprocidad existira: la proliferacin epitelial y la diferenciacin son inducidas por una -an sin identificar- poblacin de clulas mesenquimales. Entonces, el epitelio inducido, podra a su vez, producir factores que induzcan la proliferacin celular, la diferenciacin celular y la organizacin celular. En resumen, el epitelio pulmonar tiene una alta especificidad, y la interaccin conservada evolutivamente con la mesnquima del pulmn es requerida para que la proliferacin normal y la ramificacin se produzcan. Los factores necesarios son difusibles y no requieren el contacto directo de clula a clula. La mesnquima pulmonar puede actuar ya sea instructivamente, como en el reprogramacin de epitelio traqueal, o permisiva, como en el apoyo de la citodiferenciacin epitelial de la glndula salival. Si el mesnquima heterotipico permisivamente puede apoyar la diferenciacin de las clulas epiteliales de pulmn en ausencia de la proliferacin celular y de la ramificacin es desconocida.

Los mediadores de las interacciones tisulares en el desarrollo pulmonar

La lista de las hormonas, factores de crecimiento, y otras seales moleculares, y los componentes de la matriz extracelular que se ha demostrado que afectan al desarrollo de pulmn es extensa. Las limitaciones de espacio impiden una discusin de todos estos factores, los cuales han sido objeto de varias revisiones recientes. En su lugar, vamos a limitar nuestra discusin a dos familias de molculas que actan como mediadores crticos de las interacciones tisulares durante la morfognesis pulmonar temprana: la

familia de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el erizo de Sonic (la protena Shh). Estos dos ejemplos ilustran la complejidad de los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones tisulares en el desarrollo pulmonar.

Factores de crecimiento de fibroblastos y sus receptores

La familia de FGF comprende por lo menos 21 ligandos afines. Todos los miembros conocidos de la familia FGF comparten una identidad de secuencia de protenas importantes dentro de un ncleo aproximado de 120 aminocidos que es responsable de una caracterstica de esta familia: la capacidad de unirse a la heparina. Los FGF cidos y bsicos (de ahora en adelante FGF1 y FGF2, respectivamente) fueron los primeros miembros de la familia de FGF en ser identificados y, junto con FGF9, difieren de los otros FGF en que ellos no contienen una seal pptido para la secrecin de la protena clsico. Las seales de los Factores de crecimiento de fibroblastos son a travs de receptores de la alta afinidad de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGFRs), los cuales son uno de las nueve subclases de los receptores de tirosina quinasa. Cuatro de los FGFR han sido identificados, y todos estos encontrados en el pulmn, y todos comparten una estructura general en comn. Una secuencia de seal secretora en el extremo Nterminal es seguida por dos o tres inmunoglobulina (Ig)-como asas de disulfuro que constituyen el dominio extracelular. Un dominio transmembrana se ancla en los receptores de la membrana plasmtica, as definiendo la FGFR como los receptores de superficie de la clula. La porcin intracelular de la FGFR consta de dos dominios de tirosina quinasa, los cuales se dividen por un dominio interquinasa corto. La complejidad de la familia FGFR se incrementada significativamente por el empalme del ARN alternativo. Una variante importante funcionalmente se produce en la porcin C-terminal del la tercera ancla Ig, el cual afecta la especificidad y la afinidad al ligando. La unin alternativa de los aminocidos 49 en la mitad del C-terminal de la tercera ancla del Ig en el resultado del FGFR2 en lo que se han denominado las variantes de empalme IIIB y IIIC de este receptor. Esta variacin individual tiene un profundo efecto sobre la funcin del receptor. La variante IIIb se une al FGF1, FGF3, FGF7, y FGF10 con gran afinidad y al FGF2 con una menor afinidad, mientras que la unin de la variante IIIC se une al FGF1, FGF2, FGF4, FGF6 y FGF9. El uso de esta variante de empalme nica tiene implicaciones importantes para el desarrollo pulmonar. La interaccin relevante de los FGF con la heparina se produce a travs de su baja afinidad de unin de la molcula relacionada a esta, heparan sulfato. El heparan sulfato se encuentra en las superficies celulares y en la matriz extracelular en la forma de proteoglicanos heparan sulfato (HSPG). Actualmente, se cree que las HSPGs se une al FGF e induce o estabiliza la formacin de dmeros de FGF o compone un complejo ternario formado de ligando receptores de alta y baja afinidad. Ms all de actuar como co-receptores para el FGF en la superficie celular, la HSPG que existe en la matriz extracelular puede unirse a los FGF y por esto puede actuar como un reservorio para las FGF en el espacio extracelular.

Factores de crecimiento fibroblstico como mediadores de las interacciones tisulares en el desarrollo pulmonar
La evidencia de muchos sistemas ha demostrado que los FGF juegan un papel fundamental en el desarrollo de los rganos, afectan a las clulas desde todas las tres capas germinales. Los miembros de la familia del factor de crecimiento fibroblstico causan cambios en la proliferacin celular, la morfologa, diferenciacin y la migracin durante la organognesis. Todas estas respuestas efectuadas por los FGF han sido

demostradas en el desarrollo del pulmn. Los factores de crecimiento fibroblsticos 1, 2, 7, 9, 10 y 18 todos se han localizado en el desarrollo pulmonar. La informacin sobre algunos de estos ligandos es incompleta, mientras que otros ligandos han sido investigados en un gran detalle. De estos FGF, slo el FGF10 ha demostrado ser absolutamente esencial para el desarrollo pulmonar. La expresin de FGF10 ha sido demostrada en los pulmones de humanos y roedores donde se han localizado alrededor de las clulas mesenquimales en las puntas del epitelio pulmonar distal. Desde que el receptor principal para el FGF10 (FGFR2IIIb) es encontrado en el epitelio pulmonar, es que el FGF10 ha sido considerado como un candidato principal de las interacciones epitelio-mesenquima de la molcula efectora. El factor de crecimiento de fibroblastos 10 parece ser la homologa conservada evolutivamente del gen de Drosophila sin ramas, el cual interacta con su receptor jadeante para guiar los brotes epiteliales traqueales a sitios especficos dentro del larva, por lo tanto juega un papel fundamental en la morfognesis del sistema respiratorio del Drosophila. Igualmente, la gota humedecida con FGF10 induce a la quimiotaxis dramtica del epitelio pulmonar embrionario, apoyando su papel en la determinacin de las coordenadas espaciales del pulmn en etapas tempranas. La importancia de FGF10 al desarrollo de los pulmones fue lo ms sorprendente demostrado en FGF10 de ratones invlidos, los cuales no muestran desarrollo pulmonar por debajo de la traquea. As, el FGF10 juega un nico papel en la induccin de los patrones de pulmn que no puede ser compensada por los otros ligandos del FGF. El factor de crecimiento fibroblstico 7 (factor de crecimiento de queratinocitos) no tiene efectos demostrados sobre los fibroblastos y en cambio, es un potente mitgeno y factor de la diferenciacin para las clulas epiteliales. Al igual que el FGF10, el FGF7 slo est presente en las celulas mesenquimales del desarrollo pulmonar, aunque su distribucin est ms generalizada. Adems, como el FGF10, el FGF7 se une y activa FGFR2IIIb. El factor de crecimiento de fibroblastos 7 tiene potentes efectos tanto en el pulmn pre y post natal. La sobreexpresin especificada del FGF7 al epitelio pulmonar desarrollado usando los resultados del promotor de SP-C resulta en un desarrollo anormal parecido a la malformacin adenomatoidea qustica pulmonar. Igualmente, aumentando los niveles del FGF7 en el pulmn postnatal, ya sea por instilacin o condicionalmente por sobreexpresin especificada, conduce a la hiperplasia epitelial. El factor de crecimiento de fibroblastos 7 tambin tiene efectos potentes in vitro. Los explantes de pulmn tratados con FGF7 muestran hiperplasia epitelial y dilatacin. El epitelio pulmonar embrionario purificado tratado con FGF7 presenta una proliferacin extensa y una expresin generalizada de SP-C cuando se administra con otros factores competentes. Por otra parte, el FGF7 es necesario (pero no suficiente por s mismo) para reprogramar el epitelio embrionario traqueal para expresar un fenotipo celular alveolar tipo II. Es importante destacar, sin embargo, que los ratones con una delecin selectiva de FGF7 no presentan anomalas pulmonar aparente, en compensacin funcional sugerida por otro(s) ligando(s) del FGF. Los datos demuestran diferencias funcionales entre el FGF7 y FGF10 presentndose una paradoja, puesto que ambos se unen predominantemente al mismo receptor (FGFR2IIIb) variando el empalme en el epitelio pulmonar. As, los efectos de los FGF sobre los patrones morfogenticos y la diferenciacin celular pueden ser procesos separables en el pulmn. El factor de crecimiento fibroblastico 1, el cual se une a los cuatro FGFR, es detectado en ambos, en el epitelio y el mesnquima del pulmn embrionario. El papel de FGF1 en el desarrollo del pulmn ha sido sugerido por la observacin de que el FGF1 provoca el crecimiento y el florecimiento del epitelio pulmonar de ratn en el da E11 en un cultivo sin mesnquima. Es importante destacar que, los FGF1 de ratones invalidos no

presentan anormalidades en el desarrollo pulmonar, sugiriendo que su prdida puede ser compensada por otros FGF. La localizacin del FGF2 en el desarrollo pulmonar por inmunohistoqumica ha dado resultados variados, con algunos investigadores buscando la expresin en el epitelio, mientras que otros no lo hacen. El desarrollo del epitelio en el pulmn humano, sin embargo, contiene el ARNm del FGF2. El factor de crecimiento fibroblastico 2 ha mostrado afectar a la diferenciacin celular del epitelio pulmonar, induciendo aumentos significativos en la expresin de ARNm de la SP-A, SP-B, y SP-C en mitad de la gestacin fetales de las celulares epiteliales del pulmn de la rata. Estos datos sugieren un posible papel autocrino para el FGF2, pero la confirmacin de esto espera una descripcin ms detallada de la expresin del FGF2 en el desarrollo del pulmn. Cmo estos efectos del FGF2 sobre el epitelio pulmonar son mediadas por estos sin quedar claro que los receptores de alta afinidad para el FGF2 se encuentran en el mesnquima pulmonar; esto debera sealar, sin embargo, que el FGF2 ha sido demostrado que se une al FGFR2IIIb pero a una afinidad mucho ms baja que el FGF7 o el FGF10. Si el FGF2 juega un papel en el desarrollo pulmonar, puede ser compensada por otros FGF desde el ratn con una delecin selectiva para el FGF2 o nula, tanto para el FGF1 y el FGF2 que tienen pulmones completamente normales. Ms all del hecho de que han sido localizados en el desarrollo pulmonar, poco se sabe acerca de cmo el FGF9 y el FGF18 afectan a la morfognesis y a la diferenciacin del pulmn. Los datos ms convincentes sugieren un papel primordial para el FGF en el desarrollo pulmonar proveniente desde estudios en los cuales las vas de sealizacin son afectadas por la alteracin o eliminacin de los receptores FGF. Usando el promotor de la SP-C para seleccionar la sobreexpresin de un dominante negativo del FGFR2IIIb a la superficie de las clulas epiteliales del pulmn, Peters y colaboradores han demostrado que el desarrollo pulmonar no progresa ms all de la generacin de la trquea y de dos bronquios no ramificados. Celli y colaboradores utilizaron el promotor de la metalotionena para expresar un FGFR2IIIb dominante negativo soluble a lo largo de todo el desarrollo del embrin y tambin observado en la iniciacin de los brotes del pulmn pero no hay morfognesis ramificada. La delecin selectiva de los genes del FGFR2 resulta en letalidad embrionaria, poco despus de la implantacin debido a defectos tropectodermicos. Cuando estos defectos fueron eludidos mediante el uso de quimeras de fusin tetraploide, el FGFR2 de ratones invlidos no mostraron desarrollo del rbol respiratorio por debajo de la traquea. Usando el sistema de recombinacin Cre-loxP, De Moerlooze et colaboradores demostraron que la agenesia pulmonar se produce cuando el ADN que codifica para el exn IIIb es borrado. Esto sugiere un papel fundamental para los ligandos del FGF que se unen al FGFR2IIIb en el desarrollo de pulmn en estadios precoces. El factor de crecimiento fibroblastico 2 no es el nico sistema de sealizacin para el receptor del FGF usado en el desarrollo pulmonar. Aunque los FGFR3 o FGFR4 en ratones invlidos, no tengan un fenotipo pulmonar anormal, los ratones invlidos tanto en el FGFR3 y FGFR4 muestran defectos de tabicacin alveolar y anormalmente contenidos de elastina elevados. El papel de la sealizacin mediada por el FGFR1 en el desarrollo del pulmn es actualmente desconocido desde los animales invlidos por FGFR1 muertos tempranamente en el desarrollo.

El erizo de Sonic, parcheado, y los GLI.

El erizo de Sonic, el mamfero homologo del gen del Drosophila erizo, es una protena secretada involucrada en muchos de los procesos del desarrollo tempranos. Durante el desarrollo pulmonar en etapas tempranas, el Shh es expresado en el epitelio del rbol respiratorio, pero no con un patrn uniforme: la expresin se incrementa notablemente en

el epitelio mas distal, donde las interacciones epitelio-mesnquima estn activamente en curso (ver Figura 6-2). Mientras tanto el Shh es expresado por el epitelio pulmonar en desarrollo, su predominio receptor, parcheado-1 (Ptc), se expresa en el mesnquima pulmonar y refleja el patrn de expresin del Shh, siendo mayor en los puntos ms distales del pulmn embrionario. Estas observaciones apoyan el papel del Shh en la sealizacin del epitelio-mesnquima. Uniendo el Ptc al Shh derreprime los 7 pasos de la protena transmembrana lisa, lo que conduce a la activacin de la familia Gli de los factores de transcripcin del dedo de zinc. Los genes seleccionados al final de la lnea de los transactivadores gli no han sido todava dilucidados. Los ratones invalidados para la expresin del Shh exhiben anomalas en el desarrollo en una variedad de rganos, incluyendo los pulmones. El erizo de Sonic eliminado por los ratones han retrasado la iniciacin de los brotes pulmonares del endodermo del intestino anterior, el crecimiento y la ramificacin son un retraso grave. De izquierda a derecha la asimetra del pulmn est totalmente ausente, y la separacin de la traquea y del esofgico no se produce. Aunque la falta de sealizacin del Shh conduce a defectos en el patrn del rbol respiratorio, la diferenciacin epitelial al parecer, no se ve afectada ya que la protena de las clulas secretoras Clara y SP-C, los marcadores del epitelio proximal y distal, respectivamente, se expresan en un patrn adecuado espacialmente. Aunque estos datos demuestran que la expresin del Shh es necesaria para el desarrollo normal pulmonar, la cantidad y la distribucin espacial de la expresin de Shh tambin juegan un papel importante en la morfognesis. Esto fue demostrado en experimentos en los cuales la SP-C humana promotora fue utilizada para conducir la sobreexpresin del Shh en ratones transgnicos. Estos animales mueren al nacer por falla respiratoria, y a la examinacin de sus pulmones revelan una cantidad anormal de mesnquima y una falta de formacin alveolar normal. Considerando que la cantidad anormal y la distribucin del Shh en estos animales puede explicar la perturbacin en el desarrollo pulmonar, tambin es posible que los factores temporales tambin estn involucrados ya que la SP-C promotora sostenida al Shh con alto nivel de expresin para las etapas del desarrollo es cuando el Shh es normalmente disminuido. Los tres miembros de la familia Gli de los factores de transcripcin se expresan en reas distintas pero superpuestas del mesnquima pulmonar. Los ratones con supresin de la seleccin individual de Gli2 o Gli3 muestran un tamao pulmonar reducido y los cambios en la segmentacin. Los ratones invlidos de Gli2 y Gli3, sin embargo, tienen un fenotipo mucho ms grave, que carecen por completo de ambos pulmones y la traquea. Este resultado es mucho ms grave que el observado en ratones eliminados del Shh, en el cual es iniciado el desarrollo pulmonar. Esto sugiere que los miembros de la familia Gli pueden ser parte de una sealizacin o sealizaciones cascada que no implique aun al Shh es crucial para los eventos iniciales del desarrollo pulmonar. Como se seal anteriormente, la morfognesis pulmonar y la diferenciacin estn influenciadas por un gran nmero de hormonas, factores de crecimiento, citoquinas y otras molculas de sealizacin. La complejidad generada por esta matriz se incrementa an ms por el hecho de que estas cascadas de sealizacin interactan. Tal interaccin es entre un miembro de la familia de FGF, el FGF10, y el Shh. La protena surfactante C promotora e impulsora de la sobreexpresin del Shh en el pulmn del ratn lleva a la expresin disminuida del FGF10 y al aumento de la proliferacin de las clulas mesenquimales, y las clulas mesenquimales pulmonares tratadas con Shh recombinante in vitro retardan la expresin del FGF10. Adems, la expresin del FGF10 en Shh eliminados por los ratones se extiende a travs del mesnquima pulmonar oponiendose a su localizacin discreta normal para el mesnquima subtendiendo el brote pulmonar

distal. Estas observaciones han conducido a un modelo en el cual el Shh producido en las clulas epiteliales del pulmn distal acta sobre las clulas mesenquimales para extinguir la expresin del FGF10, limitando as el consecuente brote dirigido por el FGF10 y su expansin. La regulacin de este "centro de sealizacin" se complica an ms por su interaccin con dos otros factores, la protena morfogentica sea 4 y el factor de crecimiento transformante -1. Las tcnicas clsicas de la embriologa han demostrado que la organognesis pulmonar normal requiere de las interacciones de los tejidos que son altamente especficos en tiempo y espacio. La aplicacin de la biologa molecular para el estudio del desarrollo pulmonar ha iniciado la elucidacin de la base molecular de estas interacciones, de los cuales la familia de los FGF y de los Shh son slo dos de muchos actores. El advenimiento de las nuevas tecnologas, tales como la genmica funcional y protemica, dar lugar a una gran expansin de nuestra comprensin respecto de lo crecimiento pulmonar y la diferenciacin, el cual, a su vez, debera producir nuevas estrategias para la prevencin y tratamiento de patologas resultantes del desarrollo pulmonar anormal. Anexo

FIGURA 6-1. La mesnquima pulmonar especifica de la morfognesis epitelial. (A), Un complejo pulmn-trquea tomado de un embrin de rata al da 13 de la gestacin en el cual el mesnquima se ha extirpado quirrgicamente desde la trquea y es reemplazado con la misma etapa del mesnquima pulmonar distal (punta de flecha). B, Despus de 24 horas de cultivo, el mesnquima pulmonar se ha

inducido a un brote supernumerario (flecha) desde la pared del epitelio traqueal. C, Despus de 48 horas, el brote inducido (flecha) se ha alargado y ampliado. D Despus de 72 horas, el brote inducido ha comenzado a ramificarse (flecha de dos puntas) en un patrn idntico al tejido pulmonar no tratado (aumento original x 18,5).

FIGURA 6-2. La expresin de la SP-C y el erizo de Sonic (Shh) en el desarrollo pulmonar. El complejo trquea-pulmn fue tomado de embriones de ratones en el da 13 de gestacin (izquierda) y 12 (derecho) y se hibrid con sondas de ARN antisensible digoxigenina-etiquetada o bien a la SP-C o el Shh. Tener en cuenta que la SP-C se expresa (manchas oscuras) slo en los brotes ms distales del pulmn (puntas de flecha), que son los precursores del epitelio alveolar. En contraste, la Shh se expresa (manchas oscuras) en todo el epitelio respiratorio, pero es ms intensa en los brotes pulmonares distales (flechas), que sirven como centros de sealizacin en el desarrollo pulmonar (aumento original 5,5).

FIGURA 6-3. Fenotipo diferenciado epitelial especifico de la mesnquima pulmonar. A, Este panel representa un brote supernumerario (flecha) que ha sido inducida al mesnquima pulmonar distal por un injerto sobre el epitelio traqueal que ha tenido una porcin de su mesnquima extirpada quirrgicamente. B y C, La seccin del tejido autorradiografa del brote supernumerario muestra en el panel A, que se ha hibridizado con una sonda de ARN antisensible radiomarcada a la SP-C. La protena surfactante-C es un marcador molecular especfico para el epitelio distal y no est presente en la trquea. El brote inducido (circunscrita por las puntas de la flecha) se compone de varias capas de clulas (B). ptica de campo oscuro del autorradiograma (C) demuestran que la SP-C ha sido inducida en el brote supernumerario, indicando que el epitelio traqueal ha sido reprogramado para expresar un fenotipo pulmonar distal. Ntese que el epitelio traqueal es totalmente negativo para la expresin de la SP-C.