Universidad Nacional de San Luis Facultad de Qumica, Bioqumica y Farmacia Departamento de Farmacia Bromatologa

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS DE LABORATORIO

Carreras: Farmacia, Bioqumica, Ing. en Alimentos, Analista Biolgico y Lic. en Qumica

Anexo Miel

Ao 2011

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MIEL
Temas del trabajo prctico: Miel. Definicin. Composicin. Toma de muestra. Determinacin de acidez. Mtodo de Bianchi Determinacin de la actividad glucoxidasa. Mtodo de Bianchi. Determinacin de la actividad diastsica. Mtodo de Bianchi. Determinacin de humedad. Mtodo refractomtrico (normas IRAM). Reaccin cromtica de Fihe.
Definicin

Segn el Cdigo Alimentario Argentino (Art. 782 Cap. X): Con la denominacin de Miel o miel de abeja, se entiende el producto dulce elaborado por las abejas obreras a partir del nctar de las flores o de exudaciones de otras partes vivas de las plantas o presentes en ellas, que dichas abejas recogen, transforman y combinan con sustancias especficas propias, almacenndolas en panales, donde madura hasta completar su formacin. La miel es un alimento que no ha sido sometido a transformaciones, modificaciones, purificaciones y mejoras, ni a ningn tipo de manipulaciones industriales, siendo entonces la miel un alimento natural ideal no refinado, que conserva todos sus componentes.
Composicin

La miel es bromatolgicamente, un jarabe formado casi totalmente por azcar invertido. Est compuesta por azcares, principalmente azcares simples, como glucosa y fructosa y otras sustancias indispensables para el organismo como: vitaminas del grupo B y C, enzimas (facilitan la digestin), sales de calcio, hierro y fsforo; protenas, cidos orgnicos y pigmentos vegetales, etc.
Toma de muestra

En general, para llevar a cabo el anlisis en el laboratorio, si la muestra presenta cristales, se debe calentar suavemente (alrededor de 50 C) para disolver los mismos y poder obtener un producto homogneo. Mieles fluidas: si la muestra no est granulada, agtese bien antes de tomar la alcuota para llevar a cabo los anlisis posteriores. Si su aspecto es granuloso, colocar el recipiente (hermticamente cerrado) en un bao de agua (sin sumergirlo) y calentarlo durante 30min a 60 C, hasta que se licue, agitando de vez en cuando. Mezclar bien, enfriar rpidamente y pesar. Si contiene material extrao como cera, palos, trozos de panal, calentar a 40 C en un bao de agua y filtrar antes de realizar la pesada. Miel de panal: cortar la parte superior del panal y separar bien la miel por filtracin. Si, una vez filtrada, an quedan restos de panal o cera, calentar la muestra como en el caso anterior y filtrar nuevamente.
Anlisis de la miel

En el anlisis de la miel interesa determinar el contenido acuoso, del que depende notablemente su conservabilidad, las cenizas, los hidratos de carbono reductores y la sacarosa, cuyas proporciones guardan cierta constancia en los productos normales. La acidez y el tenor en dextrinas son tambin datos tiles para dictaminar sobre su calidad, y reacciones como las de Lund, Fihe y las de actividad diastsica sirven para verificar si se trata de un producto natural o adulterado.

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DETERMINACIN DE ACIDEZ (mtodo de bianchi) La acidez de la miel genuina se debe a la presencia de cido frmico y otros cidos (mlico, ctrico, glucnico y, en algunos casos, succnico). Las mieles deben estar libres de cido actico debido a que dicho cido se produce durante el proceso de agriado. La tcnica se basa en una simple titulacin cido-base. Importancia: Esta tcnica nos da idea de si las mieles son frescas o estn envejecidas, pues suele haber una variacin de la acidez original debido a la formacin de cido glucnico por accin de la glucoxidasa sobre la glucosa. MATERIAL 1 vaso de precipitacin de 100ml. 1 probeta de 100ml. 1 varilla de vidrio. 1 bureta. 1 Erlenmeyer de 250ml. REACTIVOS NaOH 0,1N (libre de CO3=). H2O destilada libre de CO2. Fenolftalena al 1% en etanol neutralizado. PROCEDIMIENTO Se pesan 10g de miel en un vaso de precipitacin de 100ml y se disuelven con 75ml de H2O destilada libre de CO2. Se agregan unas gotas de fenolftalena y se titula con NaOH 0,1N (libre de CO3=) agitando constantemente hasta que el color rosado persista durante 10seg. Los resultados se pueden expresar en gramos de cido frmico por 100g de muestra.

(V.N)

Peq ac. formico 100 = g ac. formico/100g muesta 1000 g muestra

Valor Normal (CAA): como mximo 40 mEq/kg. DETERMINACIN DE la actividad glucoxidasa (mtodo de bianchi) Entre las enzimas naturales presentes en la miel se encuentran la glucoxidasa, enzima que sufre una destruccin por el calentamiento o envejecimiento. Dicha enzima es ms sensible al calor que la diastasa de la miel, lo que constituye una prueba importante para reconocer mieles calentadas o envejecidas. La glucoxidasa acta sobre un sustrato, la glucosa, con produccin de H2O2

Glucosa glucoxidasa, Gluconolactona H 2 O 2 H Ac. glucnico O 2 2O

El H2O2 proveniente de la reaccin ya descripta, por accin sobre una solucin de IK produce I2, que se revela con solucin de almidn desarrollando color azul. Cabe destacar que la acumulacin de H2O2 en la miel diluida es una de las causas de los efectos antibacterianos no osmticos de la miel.

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MATERIAL 1 vaso de precipitacin de 50ml. 1 varilla de vidrio. Bao Mara a 37 C. 7 tubos de ensayo. 1 pipeta graduada de 10ml. 1 pipeta graduada de 1ml. REACTIVOS IK 1%. Solucin de almidn 0,1%. HCl 50%. Glucosa 8%. H2O2 3%. Buffer fosfato pH 6,5 preparado de la siguiente forma: Sol A: pesar 27,6g de NaH2PO4.H2O y diluir a 1L con H2Od (solucin 0,2M). Sol B: pesar 28,36g de Na2HPO4 o NaH2PO4.7H2O y diluir a 1L con H2Od (solucin 0,2M). Se mezclan 58,6ml de la Solucin A con 31,5ml de la Solucin B en un matraz aforado de 200ml y se completa a volumen con agua destilada. PROCEDIMIENTO a) Preparacin de la muestra: en un vaso de precipitacin de 50ml pesar 1,2g de muestra, agregar 1ml de buffer pH 6,5 y disolver con varilla de vidrio, sin calentar. Agregar 9ml de agua destilada, mezclar y trasvasar a un tubo de ensayo. Incubar 30min a 37 C. b) En una gradilla, colocar 5 tubos de ensayo y agregar a cada uno de ellos las siguientes cantidades: ml de H2O destilada ml de muestra ml de IK 1% gotas de HCl 50% gotas sol. almidn 0,1% TUBO 1 0,00 1 1 1 2 TUBO 2 0,20 0,80 1 1 2 TUBO 3 0,40 0,60 1 1 2 TUBO 4 0,60 0,40 1 1 2 TUBO 5 0,80 0,20 1 1 2

c) Preparar un tubo testigo (para comparar siguiente forma: - Solucin de glucosa 8%: - IK 1%: - Solucin de almidn 0,1%: - H2O2 3%: Dicho testigo es estable por 10 min. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

la intensidad del color desarrollado en los tubos) de la 3ml 1ml 2 gotas 1 gota

Nmero de tubos de intensidad de color superior al testigo 45 3 2 1 0

Cantidad de glucoxidasa elevada regular escasa vestigios nula

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Valor Normal: no menos de regular cantidad. Cantidades menores pueden corresponder a mieles viejas, calentadas o adulteradas con materiales que contengan sustancias capaces de inhibir la enzima. DETERMINACIN DE la actividad diastsica (mtodo de bianchi) La diastasa es una enzima de origen vegetal, contenida en ciertas semillas germinadas y otras partes de las plantas. Dicha enzima cataliza la hidrlisis del almidn transformndolo en glucosa. La diastasa es una enzima muy inestable al calor y se deteriora con el tiempo, por ello, su determinacin es un ndice importante para la evaluacin de la calidad de la miel (sobrecalentamiento o envejecimiento). En este mtodo el sustrato almidn se incuba con la muestra producindose la hidrlisis enzimtica del mismo, el cual es determinado por el agregado del reactivo de yodo que produce coloracin con el remanente del almidn no hidrolizado. MTODO CUALITATIVO MATERIAL 1 bao de agua termostatizado. 2 pipetas graduadas de 1 ml. 1 pipeta doble aforo de 1 ml. 1 pipeta doble aforo de 10 ml. 1 tubo de ensayo. 1 vaso de precipitado de 100ml. 1 vaso de precipitado de 250 ml. REACTIVOS Yodo en Yoduro de potasio (1g de yodo, 2g de yoduro de potasio y 200 ml de agua destilada). Almidn soluble al 1% (recin preparada y lmpida). PROCEDIMIENTO Se disuelven 100g de miel en 200 ml de agua destilada previamente hervida y enfriada a 40 C. En un tubo de ensayo, lavado con agua hervida, se vierten 10 ml de la solucin de miel (sin filtrar) y se agregan exactamente medidos 1 ml de la solucin de almidn. Se agita bien y se sumerge el tubo en un bao de agua a 40 C, durante 1h exactamente. Luego, se agregan 4 a 5 gotas de solucin de yodo en ioduro de potasio (lugol) y se observa la coloracin que toma el lquido en el momento en el que cae el reactivo. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Si el color del lquido es un poco ms oscuro que el de la solucin de miel original, del amarillo al amarillo verdoso o parduzco, todo el almidn se ha sacarificado por la presencia en la miel de fermentos diastsicos. Si el lquido toma un color azul ms o menos intenso, la sacarificacin no se ha realizado debido a la ausencia o destruccin de los fermentos diastsicos. Si el color va del rojo al rojo violceo, significa un debilitamiento del poder diastsico, que ha transformado el almidn slo en dextrina. Esto suele ocurrir con mieles centrifugadas o mieles calentas, o mezcla de miel artificial y natural.

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MTODO CUANTITATIVO MATERIAL Bao Mara. Gradilla para tubos. Varilla de vidrio. 10 tubos de ensayo. 4 pipetas graduadas de 1 ml. 1 vaso de precipitado de 50 ml. REACTIVOS Buffer acetato pH 5,3 (1,59M) (87g de acetato de sodio, 10,5ml de cido actico glacial, 500ml de agua destilada). Solucin de cloruro de sodio al 1%. Solucin de almidn al 0,05% (recin preparada y lmpida) Solucin de trabajo de yodo 0,01N: 1 parte de solucin de yodo 0,1N (12,7g de yodo, 20g de yoduro de potasio y 1L agua destilada). 9 partes de solucin acuosa de fluoruro de sodio al 2%. PROCEDIMIENTO Pesar 2g de miel en un vaso de precipitado de 50ml y aadir 1ml de buffer pH 5,3. Mezclar con varilla de vidrio. Colocar en una gradilla 10 tubos de ensayo y agregarle a cada uno 1ml de solucin de cloruro de sodio al 1%. En el primer tubo adicionar 1ml de la muestra y mezclar por aspiracin y expiracin con una pipeta. Luego, pasar 1ml del primer tubo al segundo. Mezclar y continuar as hasta el noveno tubo, desechando el ltimo mililitro. El dcimo tubo sirve de testigo. A cada tubo adicionar 1ml de la solucin de almidn al 0,05% e incubar por 30min a 37 C. Pasado ese tiempo, enfriar rpidamente y colocar una gota de solucin de trabajo de yodo a cada tubo y agitar. Observar la coloracin. CLCULO Y EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Los resultados se expresan en unidades de diastasa (UD). Se observa la coloracin de los tubos y a la dilucin mayor que permanece incolora se la multiplica por 2. Diluciones: Tubo N 1: dilucin1/2 Tubo N 2: dilucin1/4 Tubo N 3: dilucin1/8 Tubo N 4: dilucin1/16 Tubo N 5: dilucin1/32 Tubo N 6: dilucin1/64 Tubo N 7: dilucin1/128 Tubo N 8: dilucin1/256 Tubo N 9: dilucin1/512

Ej: Si el tubo 5 es el ltimo incoloro:

32 x 2 = 64 UD

Valor normal: el valor normal oscila entre 64 y 128 UD. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Cantidades menores de 64 UD corresponden a una miel vieja, calentada, mal procesada o adulterada. 99

Existen mieles con bajo contenido natural de diastasa, como es el caso de mieles de citrus. reaccin cromtica de fihe (mtodo de bianchi) La miel recin extrada contiene muy pequea cantidad de hidroximetilfurfural (HMF). En cambio, si se la almacena a elevadas temperaturas o se la entibia o se la calienta, ello da lugar a que los azcares contenidos en la miel, especialmente fructosa, se transformen en HMF por deshidratacin. En este mtodo cualitativo, el hidroximetilfurfural originado por el calentamiento de la miel o de glucosa comercial o del azcar invertido comercial, reacciona con el resorcinol en medio cido dando un color rojo cereza. MATERIAL 1 ampolla de decantacin de 100ml. 1 cpsula de porcelana de 6cm de dimetro. 1 vaso de precipitacin de 50ml. 1 embudo. Papel de filtro (poro medio). REACTIVOS Resorcinol al 1% en cido clorhdrico concentrado. ter etlico. PROCEDIMIENTO Tomar aproximadamente 10g de miel, disolver con 10ml de agua destilada. Agitar esta disolucin con 10ml de ter etlico en ampolla de decantacin. Filtrar el lquido etreo por papel de poro medio, recogindolo en cpsula de porcelana y dejar evaporar espontneamente. El residuo se trata con 1 o 2 gotas de resorcinol en medio cido. INTERPRETACIN En presencia de azcar invertido artificial aparece coloracin roja intensa que persiste 3h como mnimo. Esto se debe a la reaccin entre el hidroximetilfurfural con el resorcinol en medio cido, el primero de los cuales se forma durante la inversin cida, en la fabricacin de azcar invertido artificial. Cuando se obtiene azcar invertido artificial por accin enzimtica, no se produce el derivado furfreo, entonces la reaccin es negativa. La coloracin ser rosada si existe pequea proporcin de adulterante o el calentamiento fue muy suave y ser marrn claro si no hay hidroximetilfurfural presente, lo que corresponde a mieles genuinas no calentadas. DETERMINACIN DE humedad La determinacin del contenido de humedad es uno de los procedimientos ms importantes de investigacin. Su determinacin puede ser directa (desecamiento de la miel y posterior comparacin entre el peso de la misma, antes y despus de desecada) o indirecta (relacionada con otras propiedades, tales como peso especfico o ndice de refraccin). Mtodo Indirecto refractomtrico (Norma IRAM 15931: 1994) Fundamento: el ndice de refraccin de una miel depende de su densidad que, a su vez, est ntimamente relacionada con su contenido acuoso. El mtodo consiste en la medicin del ndice de refraccin de la miel a 20 C. El valor ledo se transforma luego en % de humedad utilizando la Tabla de Chataway.

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MATERIAL Recipiente con cierre hermtico de aproximadamente 10g de capacidad. Bao de agua a 60 C. Refractmetro de Abbe. Varilla de vidrio. PREPARACIN DE LA MUESTRA Mieles lquidas transparentes: se mide directamente. Mieles total o parcialmente cristalizadas: se coloca una cantidad pequea de miel en un recipiente hermtico y se calienta en bao de agua (o en estufa) a temperatura menor de 60 C hasta que se produzca la disolucin de los cristales. La temperatura no debe sobrepasar los 60 C para evitar la descomposicin de los azcares presentes. Luego de eliminar los cristales en el recipiente de ensayo, se lo invierte tres o cuatro veces suavemente ya que as la miel enjuaga las superficies libres de las paredes y recoge el agua de condensacin que haya podido depositarse all y se deja enfriar a temperatura ambiente en el recipiente tapado. PROCEDIMIENTO Se coloca con una varilla de vidrio, limpia y seca, unas gotas de la muestra de miel entre los prismas limpios y secos del refractmetro. Luego, se realiza las lecturas a 20 C. Si la lectura en el polarmetro se lleva a cabo a una temperatura diferente a 20 C, se convierte a esa temperatura utilizando las siguientes correcciones: Temperaturas > 20 C: al valor del ndice de refraccin ledo en el polarmetro se le suma 0,00023 por cada grado Celsius. Temperaturas < 20 C: al valor del ndice de refraccin ledo en el polarmetro se le resta 0,00023 por cada grado Celsius. Tabla de Chataway (1932, completada por Wedmore, 1955) para la determinacin de humedad
ndice de Refraccin 20C 1,5044 1,5038 1,5033 1,5028 1,5023 1,5018 1,5012 1,5007 1,5002 1,4997 1,4992 1,4987 1,4982 1,4976 1,4971 1,4966 1,4961 1,4956 1,4951 1,4946 Contenido de Humedad (%) 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0 14.2 14.4 14.6 14.8 15.0 15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 ndice de Refraccin 20C 1,4940 1,4935 1,4930 1,4925 1,4920 1,4915 1,4910 1,4905 1,4900 1,4895 1,4890 1,4885 1,4880 1,4875 1,4870 1,4865 1,4860 1,4855 1,4850 1,4845 Contenido de Humedad (%) 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 20.6 20.8 ndice de Refraccin 20C 1,4840 1,4835 1,4830 1,4825 1,4820 1,4815 1,4810 1,4805 1,4800 1,4795 1,4790 1,4785 1,4780 1,4775 1,4770 1,4765 1,4760 1,4755 1,4750 1,4745 1,4740 Contenido de Humedad (%) 21.0 21.2 21.4 21.6 21.8 22.0 22.2 22.4 22.6 22.8 23.0 23.2 23.4 23.6 23.8 24.0 24.2 24.4 24.6 24.8 25.0

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