Ejemplo de un Trabajo prctico para la determinacin cuantitativa de protenas(1)

Objetivos.
Al trmino de la prctica el alumno ha de ser capaz de: 1. Conocer los principales mtodos de valoracin de las protenas. 2. Recordar las leyes bsicas de absorcin de luz para la determinacin cuantitativa de compuestos coloreados. 3. Definir los componentes de un comprender el manejo del mismo. espectrofotmetro que permita

4. Construir una recta de calibracin con una solucin de albmina de suero bovino como protena patrn para cada una de los mtodos colorimtricos del Biuret y de Lowry. 5. Establecer el desarrollo de los mtodos determinando la linealidad, la sensibilidad, el lmite de deteccin y el rango de cada uno de los mtodos ensayados.

1. Cules son los mtodos ms usuales de valoracin de las protenas?

Existen diversos mtodos que permiten cuantificar la concentracin de protena presente en las muestras biolgicas, basados en las propiedades que muestran las protenas en solucin. Los mtodos ms usuales son: - Reaccin del Biuret. - Mtodo de Lowry. - Mtodo de Bradford. - Mtodo del cido Bicincnico. - Absorcin en el ultravioleta. - Mtodos inmunolgicos.

Este apunte fue tomado como ejemplo de la Universidad de Madrid, Facultad de Qumica pgina web: (http://www.um.es/bbmbi/).

En la prctica se van a ensayar los dos primeros mtodos colorimtricos de Biuret y Lowry.

En qu consiste la reaccin del Biuret?

El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco.

H 2N H 2N

CO CO Urea

NH 2 NH 2

H 2N

CO

NH CO NH 2

Biuret

Reaccin del Biuret Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se aade a una solucin de protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo de absorcin a 540 nm. Las caractersticas ms importantes de la reaccin son: La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y protenas. Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composicin de aminocidos. Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.
O C NH RC H O C NH RC H Cu2+ HN H CR C HN H CR O C O

Violeta-prpura Complejo protena-Cu(II)

Cul es el fundamento del mtodo de Lowry?

Para aumentar la sensibilidad de la reaccin del biuret, el complejo protenaCu2+ se hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus, dando una coloracin azul, con un mximo de absorcin a 650 nm. Esta coloracin se atribuye a la reduccin del cido fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de heteropolimolibdeno de composicin no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las protenas que forman el complejo con el Cu2+. Las caractersticas del mtodo son: La intensidad de la coloracin vara con la composicin de aminocidos de la protena. Es ms sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml. La modificacin de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15 mg/ml. Presenta muchas interferencias.

Complejo Protena-Cu 2+ AA red.

Complejo Protena-Cu 2+ AA oxid.

Reactivo Folin oxid. AMARILLO

Reactivo Folin red. AZUL

Esquema de la reaccin de Lowry

Qu caractersticas poseen otros mtodos de valoracin de protenas?

Mtodo de Bradford: Consiste en la formacin de un compuesto de adsorcin de coloracin azul entre los residuos de aminocidos bsicos de las protenas y el colorante Azul Coomassie. Absorbe luz a 595 nm. El rango de determinacin de protena es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estndar).

 La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y aromticos.

Mtodo del cido Bicincnico. Est basado en la reduccin en medio alcalino de Cu(II) a Cu(I) en medio alcalino y la formacin de un complejo cido bicincnico:Cu(I), con un mximo de absorbancia a 562 nm. El rango de concentracin de protena es de 0,5-30 mg/ml. Ms rpido que el mtodo de Lowry. Altamente preciso y sensible.

Absorcin en el ultravioleta: Las protenas poseen una banda de absorcin a 280 nm como consecuencia de la absorcin de los residuos de tirosilo y triptofanilo en esta regin del espectro. Es un mtodo no destructivo. El rango de concentracin que se puede determinar depende del contenido de los aminocidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml. La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.

Mtodos inmunolgicos: Son mtodos altamente especficos, basados en la reaccin antgenoanticuerpo. Pueden ser de difusin radial, electrodifusin, precipitacin y radioinmunolgicos. Pueden alcanzar sensibilidades del orden de ng/ml.

2. Cules son las leyes cuantitativas de la absorcin de luz?

Cuando la luz atraviesa o se refleja en una muestra, la cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiacin incidente (Io) y la transmitida (I). La

cantidad de luz absorbida se expresa normalmente como transmitancia o absorbancia. La transmitancia normalmente se da en trminos de una fraccin de 1 o como porcentaje, y se define como se indica a continuacin:

I T = ------I0

I %T =--------- x 100 I0

La absorbancia A, se define por:

A = log 1/T La transmitancia T, se expresa normalmente en el rango de 0-100 %, pero la absorbancia no tiene unidades y vara de 0 a .

Si 100 fotones de luz atraviesan una cubeta y salen por el extremo de la misma slo 50, la transmitancia es = 0,5 o del 50 %. Si los 50 fotones atraviesan una cubeta de las mismas dimensiones, slo saldrn 25, y as sucesivamente. Este efecto fue formulado como ecuacin matemtica por Bouguer (1729) y Lambert (1760) segn: I -k b T = ----- = e I0

Ley de Bouguer-Lambert

donde k es una constante y b es el paso ptico, normalmente en centmetros. La ley de Beer es idntica a la de Bouguer, excepto que est expresada en trminos de concentracin. Establece que la absorbancia es proporcional al nmero de molculas absorbentes por las que pasa la luz. Combinando las dos leyes se obtiene la ley de Beer-Bouguer-Lambert.

Ley de Buoguer-Lambert

Ley de Beer-Bouguer-Lambert

T = I/I0 = e

-k b c

donde c es la concentracin de las especies absorbentes, expresada normalmente en gramos por litro o miligramos por litro. Esta ecuacin puede transformarse en una expresin lineal tomando el logaritmo, que se expresa en la forma: A = -log T = -log(I/I0) = log(I0/I) = e b c donde e es la absortividad molar o coeficiente de extincin para la sustancia absorbente. El coeficiente de extincin molar (e): Es caracterstico de una sustancia en condiciones definidas de longitud de onda, solvente y temperatura. Tiene las unidades de M-1 x cm-1. A veces, este coeficiente tambin se suele expresar como la extincin de una muestra cuyo camino ptico es de 1 cm y cuya concentracin es del 1 % o de 1 mg/mL. Tambin depende de las caractersticas del instrumento utilizado. Por esta razn, normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de extincin para anlisis cuantitativo. En su lugar, se construye una curva de calibracin para la sustancia a analizar, utilizando una solucin patrn con concentraciones conocidas de analito.

3. Qu instrumentacin se utiliza para construir la curva de calibracin?

Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la transmitancia o absorbancia de una muestra, en funcin de la longitud de onda de la radiacin electromagntica. Un espectrofotmetro consta de los siguientes componentes clave: Una fuente que genera una banda ancha de radiacin electromagntica: Puede ser una lmpara halgena o de volframio que suministra la luz de la zona visible del espectro (400-700 nm), o de nen, argn o de hidrgeno, para la zona ultravioleta (200-400 nm). Un dispositivo de dispersin que selecciona una longitud de onda particular de la radiacin de la fuente. Comnmente, se utilizan prismas y redes hologrficas de difraccin, que junto a una rendija de entrada y otra de salida configuran el monocromador. Un rea de muestra: Clula transparente a la radiacin incidente monocromtica que contiene el material bajo estudio disuelto en un solvente adecuado. Suele ser de 1 cm de espesor. Uno o ms detectores para medir la intensidad de la radiacin: Normalmente, es un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo. Los espectrofotmetros pueden ser de distintos tipos: De haz simple. De doble haz. Con divisin de haz. De doble longitud de onda. El espectrofotmetro que se va a manejar en la prctica es del tipo convencional de haz simple. Un esquema del mismo se presenta a continuacin:

Esquema de un espectrofotmetro convencional de haz simple El camino de la radiacin electromagntica es el siguiente: La luz policromtica de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un monocromador. Este transmite selectivamente una estrecha banda de luz a travs de la rendija de salida. Esta luz atraviesa el rea de muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el detector cuando no hay muestra (el blanco de reactivo, que contiene todos los reactivos menos la sustancia a determinar) y se

compara con la intensidad de la luz que alcanza el detector despus de atravesar la muestra.

4. Cmo se construye una recta de calibracin?

Antes de comenzar a construir la recta de calibracin es imprescindible: Conocer la composicin y naturaleza qumica de los reactivos que se manejan. Se debe poner atencin a su carcter cido, bsico, oxidante, reductor, etc., y especialmente a su toxicidad. Practicar la medida de volmenes con las micropipetas. Para ello, en primer lugar, se leen las normas de uso de las micropipetas automticas. A continuacin, la mejor manera de conseguir una seguridad y confianza en s mismo en el uso de las micropipetas es la de ensayar previamente la medida de distintos volmenes de agua destilada. Las curvas de calibracin que se obtengan confirmarn si ha alcanzado la prctica necesaria. Saber utilizar un agitatubos. Todas las reacciones qumicas se producen cuando las molculas entran en contacto, cuestin que se consigue mezclando perfectamente los reactantes mediante agitacin. El agitatubos realiza esa funcin con un movimiento vibratorio del tubo de ensayo en el que se vierten las soluciones. El movimiento puede o no regularse en intensidad, y activarse o no por contacto directo del tubo con el adapta-tubos del agitador. Un par de segundos de agitacin con un buen torbellino es suficiente para mezclar bien las soluciones. Las precauciones a tener en cuenta son: * Controlar la intensidad de agitacin. Si el volumen de lquido en el tubo supera ms de la mitad de su capacidad, su contenido puede proyectarse al exterior. * No dirigir el tubo hacia las personas. Si el lquido es corrosivo, inflamable. txico, etc., puede provocar un accidente. Manejar el espectrofotmetro: Las etapas son: 1) El espectrofotmetro debe de encenderse al menos media hora antes de hacer una medicin. Se comprueba que el aparato da una seal estable de ajuste del cero de absorbancia. 2) Se selecciona la longitud de onda del mximo de absorcin del compuesto a medir con el mando correspondiente. 3) Se selecciona la opcin de medir en absorbancia. 4) Se toma una cubeta de plstico de 3 ml, procurando cogerla de manera que no se manchen las paredes de la cubeta que se expongan al haz de luz del espectrofotmetro.

5) Se vierte en la cubeta un volumen de la solucin del blanco reactivo tal que ocupe las tres cuartas partes del volumen de la cubeta (~ 2,5 ml). 6) Se coloca la cubeta en el compartimento de cubetas del espectrofotmetro, procurando que las paredes lisas de la misma se coloquen en la direccin del haz de luz del espectrofotmetro. 7) Se realiza el ajuste del cero de absorbancia. Este mando no se debe de tocar en las posteriores etapas. 8) Se saca la cubeta y se devuelve la solucin blanco a su correspondiente tubo de ensayo, procurando que en la cubeta no queden gotas (no es necesario secarla). 9) Se vierte en la misma cubeta la solucin que contenga la muestra problema. 10) Se introduce la cubeta en el compartimento de muestra del espectrofotmetro. 11) Se mide la absorbancia de la solucin de muestra problema. Obtencin de la recta de calibracin de la reaccin del Biuret. Se colocan en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de estar limpios y secos. Se numeran del 1 al 8 con un rotulador permanente al agua.

Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona a cada uno de ellos los volmenes de la disolucin patrn de albmina de suero bovino (BSA) y de agua destilada que se indican en la siguiente Tabla:

Tubo (n) 1 2 3 4 5 6 7 8

Albmina patrn (mL) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Agua (mL) 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6

Se agita bien cada uno de los tubos de ensayo con el agitatubos.

A cada uno de los tubos de ensayo se aaden 3 mL de reactivo de Biuret. Se vuelven a agitar con el agitatubos cada uno de los tubos de ensayo. Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el bao de agua termostatizado a 37 C, dejndose que se desarrolle el color durante 15 min.

Se enfran los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura ambiente contenida en el vaso del fregador. Un par de minutos es suficiente.

 Se sacan del fregador y se procede a medir en el espectrofotmetro siguiendo las normas expresadas anteriormente.

Se ajusta el mando de seleccin de la longitud de onda del espectrofotmetro a 540 nm. Se ajusta el cero de absorbancia con la solucin blanco exenta de protena (tubo 1). Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 8. Siempre que se realicen las medidas desde la solucin menos concentrada (tubo 2) a la ms concentrada (tubo 8), se cometer el mismo error de medida, por lo que no ser necesario enjuagar y secar la cubeta despus de cada medicin. Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio.

 Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de ensayo con escobilla y jabn. Las marcas de rotulador se eliminan fcilmente por frotacin con el estropajo. Se lava con abundante agua del grifo y se enjuagan los tubos con agua destilada. Se dejan en la gradilla boca abajo hasta el da siguiente para que se sequen. Obtencin de la recta de calibracin del mtodo de Lowry. Puesto que el mtodo de Lowry es ms sensible que la reaccin del Biuret, lo primero que hay que realizar es la preparacin de una solucin de protena patrn ms diluida. A partir de la solucin de BSA de 10 mg/ml, que se ha utilizado en la reaccin del Biuret hay que preparar una solucin de BSA de 0,2 mg/ml en agua. Para ello se siguen la siguientes etapas: 1. Se rotula un tubo de ensayo de 10 ml con BSA 0,2. 2. Con una micropipeta se miden 200 ml de la solucin de BSA de 10 mg/mL y se vierten en el tubo de ensayo rotulado. 3. Con una pipeta de 10 ml, se aaden 9,8 mL de agua destilada al tubo de ensayo. 4. Se toma una porcin de papel de Parafilm, se quita el plstico que la recubre y por la parte que estaba protegida, se tapa el tubo de ensayo, agitndose varias veces por inversin suave del tubo. Es importante que se consiga una dilucin homognea de la solucin proteica.

Para obtener la recta de calibracin del mtodo de Lowry se siguen los siguientes pasos:

Se colocan en una gradilla siete tubos de ensayo que deben de estar limpios y secos. Se numeran del 1 al 7 con un rotulador permanente al agua. Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona a cada uno de ellos los volmenes de la solucin patrn de BSA 0,2 y de agua destilada que se indican en la siguiente Tabla:

Tubo (n) 1 2 3 4 5 6 7

BSA 0,2 (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,5 0,7 0,9

Agua (mL) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,5 0,3 0,1

Se agita bien cada uno de los tubos de ensayo con el agitatubos. A cada uno de los tubos de ensayo se aaden 0,9 mL de reactivo A. Se vuelven a agitar con el agitatubos cada uno de los tubos de ensayo. Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el bao de agua termostatizado a 50 C, dejndose en el bao durante 15 min. Se enfran los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura ambiente contenida en el vaso del fregador. Unos tres minutos es suficiente. Se sacan del fregador y se adicionan 0,1 mL de reactivo B. Se vuelven a agitar con el agitatubos cada uno de los tubos de ensayo. Se introduce la gradilla con los tubos de ensayo en el bao de agua termostatizado a 37 C y se dejan reaccionar durante 5 min. A continuacin, se aaden 3 mL de reactivo C. Se vuelven a agitar con el agitatubos cada uno de los tubos de ensayo. Se calientan los tubos de ensayo a 50 C durante 10 min. Se enfran los tubos de ensayo antes de proceder a medir en el espectrofot-metro siguiendo las normas expresadas anteriormente.

Se ajusta el mando de seleccin de la longitud de onda del espectrofotmetro a 650 nm. Se ajusta el cero de absorbancia con la solucin blanco exenta de protena (tubo 1). Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 7. Siempre que se realicen las medidas desde la solucin menos concentrada (tubo 2) a la ms concentrada (tubo 7), se cometer el mismo error de medida, por lo que no ser necesario enjuagar y secar la cubeta despus de cada medicin. Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio. Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de ensayo con escobilla y jabn. Las marcas de rotulador se eliminan

fcilmente por frotacin con el estropajo. Se lava con abundante agua del grifo y se enjuagan los tubos con agua destilada. Se dejan en la gradilla boca abajo hasta el da siguiente para que se sequen.

5. Qu es desarrollar un mtodo cuantitativo?

Una vez determinados los valores de absorbancia para cada concentracin de protena patrn para los mtodos establecidos de Biuret y Lowry, el desarrollo de los mismos pasa por optimizar una serie de parmetros, tales como, linealidad, sensibilidad, precisin, exactitud, rango, selectividad y robustez, mediante el uso de herramientas estadsticas. Veamos los parmetros que se van a determinar en la prctica. Qu es la Linealidad? La linealidad es la capacidad del mtodo para producir resultados proporcionales, directamente o mediante una transformacin matemtica, a la concentracin del analito en las muestras, dentro de un determinado rango. En las medidas de UV-visible, la relacin ms usual es la ley de Ley de Beer-Bouguer-Lambert. Una curva de calibracin lineal que relacione la absorbancia con la concentracin debe de tener la forma: A=kC

donde A es la absorbancia, C es la concentracin y k es el factor de calibracin (la pendiente de la curva de calibracin).

Absorbancia (A)

Rango de linealidad

A C

Concentracin (C)

Recta de calibrado Absorbancia vs. Concentracin de analito. Tericamente solo se requiere la medida de absorbancia de un patrn de concentracin conocida, como calibrado para la cuantificacin.

 Sin embargo, en la prctica se pueden causar desviaciones de la Ley de Beer en funcin de parmetros instrumentales y de la muestra, y que pueden resultar en errores cuantitativos significativos si la curva de calibracin no est caracterizada con exactitud.

Errores de una calibracin inadecuada Para construir una curva de calibracin, las concentraciones de los patrones deben de abarcar el rango de concentracin esperado de las muestras de anlisis. Todos los valores patrn medidos deben estar sobre una lnea recta, pero en la prctica, los valores siempre presentan cierta dispersin. Se debe de aplicar un mtodo estadstico para encontrar el mejor ajuste de los datos a la curva de calibracin. El mtodo estadstico ms frecuente es la regresin lineal, conocido como el mtodo de mnimos cuadrados.

Curvas de calibracin Para comparar dos curvas de calibracin, se requiere medir la bondad del ajuste de los patrones, De los valores estadsticos el coeficiente de correlacin es el ms popular. Un valor de +1 indica una relacin lineal perfecta entre la absorbancia y la concentracin. Qu es la Sensibilidad?

La sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad de analito. Se puede determinar por la pendiente de la recta de calibracin ajustada por mnimos cuadrados. Coincide con el valor del coeficiente de extincin: e = A/c. Tambin se indica mediante dos factores analticos: El lmite de deteccin (LOD). El lmite de cuantificacin (LOQ). Qu es el Lmite de Deteccin (LOD)? El LOD es la concentracin ms baja del analito que se puede detectar pero no necesariamente cuantificar. En general, el LOD es el punto al que la seal del analito es igual a tres veces el ruido de la medida. Para algunos espectrofotmetros se puede establecer que el LOD es, aproximadamente, tres veces la desviacin estndar.

Qu es el Lmite de Cuantificacin (LOQ)? El LOQ es la concentracin ms baja del analito que se puede determinar con una precisin y exactitud aceptables. Para calcular el LOQ se deben de definir por tanto los lmites aceptables de precisin y exactitud. Se puede aproximar a la relacin entre la precisin de la medida analtica y la sensibilidad del mtodo.

Qu es el Rango? Rango es el intervalo entre los niveles superior e inferior del analito, que se han calculado con la precisin, exactitud y linealidad requeridos. Rango de linealidad ser por tanto el intervalo entre las concentraciones ms baja y ms alta de analito determinadas, para las cuales se cumple la ley de Beer-Lambert.

Qu hay que realizar para desarrollar los mtodos de Biuret y Lowry?

Las etapas recomendables que hay que realizar para cada uno de los mtodos son: Se calcula la concentracin de protena que se ha colocado en cada uno de los tubos de ensayo. Como ejemplo: en el ensayo de Biuret, en el tubo 2 se han colocado 0,2 mL de BSA 10 mg/mL y se han diluido a un volumen de 2 mL con agua. Por tanto la concentracin de protena en el tubo ser: (0,2 mL x 10 mg/mL) : 2 mL = 1 mg/mL En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de absorbancia obtenidos frente a la concentracin de protena estndar calculada de cada uno de los tubos, para cada mtodo ensayado. Se ajustan los puntos obtenidos por el mtodo de mnimos cuadrados a una recta, incluyendo el punto 0,0. Se representan las rectas ajustadas en el papel milimetrado. Se desprecian los puntos que se desven de la linealidad en un 5 % (intervalo de confianza del 95%). Para ello, la absorbancia experimental correspondiente a una determinada concentracin se compara con el valor de absorbancia calculado mediante la ecuacin de la recta ajustada, y si posee un valor superior al 5 % de desviacin se desprecia. Si se ha despreciado algn punto, se repite el proceso de ajuste, representacin y desviacin para cada recta. En el cuaderno de Prcticas debe de quedar reflejada la representacin grfica de todos los puntos experimentales obtenidos, junto con los de la recta final ajustada por mnimos cuadrados, indicando los puntos despreciados. Igualmente se deben de expresar las ecuaciones de las rectas ajustadas junto con los valores de los coeficientes de correlacin con cuatro dgitos como mximo. Las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada uno de los mtodos, y sus valores tambin son los correspondientes coeficientes de absorcin de los complejos protena-reactivo. Se determinan los lmites de deteccin y de cuantificacin para cada uno de los mtodos, teniendo en cuenta que en los espectrofotmetros con lectura digital, las medidas de absorbancia se realizan con una precisin de 0,001.
Igualmente, los rangos de linealidad, en el cual la respuesta de cada uno de

los mtodos es lineal, vendrn dados por los intervalos comprendidos entre el lmite de cuantificacin y el valor de concentracin ms alta que cumple la ley de Beer.

Qu protocolo habra que utilizar para determinar la concentracin de protena de una muestra desconocida? Una vez obtenida la recta de calibrado, si se deseara conocer la concentracin de protena de una muestra problema, se debe seguir el mismo procedimiento descrito en el apartado 4 para cada uno de los mtodos, pero tomando 2 mL de la muestra problema en el caso del mtodo del Biuret, 1 mL para el mtodo de Lowry. Si la absorbancia de la muestra est dentro del rango de medida del mtodo seleccionado, mediante la ecuacin de la recta de calibrado se puede calcular la concentracin de protena de la disolucin problema. Si la absorbancia es mayor al lmite superior del rango de medida, siempre se puede realizar la dilucin correspondiente para introducirla en el rango del mtodo. Pero si es inferior al lmite de cuantificacin del mtodo seleccionado, hay que emplear un mtodo ms sensible.