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Replicacin y recombinacin del DNA Entre las propiedades de ADN, destaca la de duplicarse en forma idntica. Se ha establecido que este proceso de la molcula trenzada sigue un modelo llamado semiconservador, que requiere inicialmente una separacin de ambas cadenas de nucletidos para permitir el apareamiento de sus bases con nucletidos nuevos. Este mecanismo se ha aclarado ampliamente con los estudios de Kornberg, quien extrajo una enzima de cultivos de E. coli, denominada ADN-polimerasa. Esta enzima, utilizando el ADN como molde, y en presencia de los iones de magnesio y de los cuatro nucletidos, trifosfatados fundamentales, es capaz de catalizar in vitro y hasta un mximo de 20 veces la cantidad inicial, de sntesis de ADN. Durante el proceso de polimerizacin se liberan grupos de pirofofatos y se establecen enlaces covalentes entre los fosfatos y los carbonos 3 de los azucares. El ADN as sintetizado es una cadena helicoidal alargada de polinucletidos con un gran peso molecular, que contrariamente al ADN natural, se desnaturaliza rpidamente al calentarlo y enfriarlo en forma rpida y no parece tener actividad gentica, al menos en experimentos de transformacin bacteriana. Este ADN sinttico posee un contenido total de bases y una relacin A+T/G+C, similar al ADN nativo que le sirvi de molde, se ha demostrado con esto que la sntesis de ADN en presencia de una sola cadena de polinucletidos se lleva a cabo en forma estrictamente complementaria a la secuencia de bases de la cadena sencilla que le sirve como molde. De acuerdo a la concepcin original de Watson y Crick, que establece una polaridad opuesta a ambas cadenas helicoidales con respecto a los enlaces de los fosfatos con los carbonos 3 y 5 de las pentosas, la sntesis de ADN tambin debe llevarse a cabo en forma antiparalela, es decir en direccin contraria a los largo de las dos cadenas. Las pruebas experimentales parecen apoyar plenamente este hecho. Se sabe que en organismos superiores, la sntesis de ADN no es igual en ambas ramas de la doble cadena; la iniciacin de la sntesis se efecta por medio de la inserccion de una cadena corta de ARN primario o iniciador sobre una zona especifica llamada coja o zona de OKASAKI, para que posteriormente, en una rama se integre la polimerasa ADN en sentido 5-3, y se produzca en forma continua la sntesis del polinucletidos complementario. Por otra parte, en la otra rama se efecta la sntesis con la particin del ARN primarios en forma segmentaria as como de otras enzimas como la polimerasa ADN II y una ligasa. Las porciones del ADN que no se expresan en el mensajero se llaman intrones o secuencias interventivas del ADN, mientras que las partes de la molcula que se transcriben finalmente se llaman exones. Duplicar fielmente el DNA de un solo cromosoma requiere un mecanismo de extremada precisin. Incluso una tasa de error de tan solo 1 en un milln, creara 3,000 errores en cada ciclo de replicacin del genoma lo que obviamente es un numero excesivo. Lo que se ha descubierto al paso de los aos es que se necesitan numerosas enzimas y otras protenas para copiar una hlice de DNA.

Maria Fernanda Mena Castell

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Modos de replicacin del DNA. La complementariedad de debe a los puentes de hidrogeno que pueden formarse. Cada molcula de DNA replicada consistira en una cadena vieja y una cadena nueva, de aqu el nombre de replicacin semiconservativa. Otras dos posibles formas de replicacin: Replicacin conservativa: La sntesis de las cadenas polinucleotidicas se producira como se ha descrito, despus de la sntesis, las cadenas parentales se reasociarian. Replicacin dispersiva: Las cadenas parentales se dispersaran entre las dos nuevas hlices dobles depues de la replicacin. Es mas compleja, por lo tanto menos probable pero no debe descartarse como modelo experimental. El experimento de Meselson Stahl Meselson y Stahl probaron la hiptesis de la replicacin del ADN. Ellos cultivaron bacterias en un medio 15N. El 15N es un istopo pesado de nitrgeno, por lo tanto el ADN sintetizado es de densidad pesada. Ellos entonces cambiaron las bacterias al medio 14N. El ADN se aisl diferentes veces que corresponden a los ciclos de replicacin 0, 1, y 2. Despus de un ciclo de replicacin, el ADN fue todo de densidad intermedia. Esto descarta el modelo conservador de la replicacin, que predice que ambos ADN (pesado y liviano) estarn presentes, pero ninguno de densidad intermedia estar presente. Este resultado es consistente con el modelo semiconservativo de replicacin, que predice que todas las molculas de ADN consistirn de una cadena 15N de ADN y una cadena 14N de ADN. El resultado no descarta el modelo dispersivo de replicacin, que tambin predice que todo el ADN ser de densidad intermedia, consistiendo de segmentos intercalados de doble cadena 15N y 14N. Despus de dos ciclos de replicacin, se ven dos bandas de ADN, una de densidad intermedia y una de densidad liviana. Este resultado es exactamente lo que el modelo semiconservativo predice: la mitad debera ser densidad intermedia 15N-14N la intermedia y la mitad de densidad liviana 14N-14N. Proporciono en bacterias un resultado muy concluyente de la replicacin semiconservativa y contribuyo a descartar los otros dos modelos. Orgenes, horquillas y unidades de replicacin. Al punto real del cromosoma en el que se esta realizando la replicacin, en este punto, las cadenas de la hlice deben estar desenrolladas formando lo que se denomina horquilla de replicacin. Esta horquilla aparecer inicialmente en el punto de origen de la sntesis. Entonces a medida que avance la replicacin, la horquilla de replicacin se mover a lo
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largo del DNA dplex. Si la replicacin es bidireccional habr dos horquillas migrando en direcciones opuestas a partir del origen. La longitud del fragmento de DNA que se replica en cada suceso de replicacin dado en un solo origen es la unidad denominada replicon. En las bacterias y en la mayora de los virus bacterianos, que tienen un nico cromosoma circular, hay solo una regin en la que se inicia la replicacin. Cuando se completa la replicacin semiconservativa de todo el cromosoma estas horquillas convergen en una regin terminadora denominada ter. En eucariotas existe un diferencia importante en cuanto a la replicacin, si se compara con la descrita para bacterias. Aunque la replicacin es bidireccional, formando dos horquillas de replicacin y una burbuja de replicacin en cada ciclo de replicacin, hay multiples orgenes en el cromosoma. En consecuencia, durante la fase S o interfase, se producen numerosos sucesos de replicacin a los largo de cada cromosoma. Finalmente las numerosas horquillas de replicacin se fusionan completando la replicacin de todo el cromosoma. La presencia de numerosos replicones esta indudablemente relacionada con la mayor longitud y complejidad de un cromosoma eucariota comparado con un cromosoma bacteriano. Sntesis de DNA biolgicamente activo. No todos los investigadores estaban convencidos de que la DNA-polimerasa I fuese la enzima que replicase en DNA en el interior de la clula (in vivo). La prueba esencial de actividad biolgica se realizo utilizando el proceso de transfeccion. Se aadieron las nuevas cadenas (+) sintetizadas a protoplastos bacterianos (clulas bacterianas sin su pared). Despus de la infeccin con el DNA sinttico, se produjeron fagos maduros. De esta manera, el DNA haba dirigido con xito la reproduccin. Esta demostracin de actividad biolgica se interpreto como una prueba precisa de la fidelidad de copia. Las DNA polimerasas II y III Peter DeLucia y John Cairns publicaron el descubrimiento de una cepa de E. coli que era deficiente para la actividad de la DNA polimerasa I ( mutacin llamada polA1). Caractersticas de la mutacin los condujeron a concluir que en ausencia de DNA polimerasa I, estas clulas eran muy deficientes en su habilidad de reparar el DNA. Por ejemplo la cepa mutante era muy sensible a la luz ultravioleta y a la radiacin de daan el DNA y son mutagenicas.

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Estas observaciones llevaron a dos conclusiones: 1. Debe haber al menos otra enzima presente en las clulas de E. coli que pueda replicar el DNA in vivo. 2. La DNA polimerasa I debe tener una funcin secundaria in vivo. Esta funcin es esencial para la fidelidad de la sntesis del DNA, pero esta enzima no es la que realmente sintetiza la cadena complementaria. Las tres polimerasas comparten varias caractersticas. Mientras que ninguna puede iniciar la sntesis del DNA a partir de un molde, todas pueden alargar una cadena existente de DNA denominada cebador. Adems del DNA, tambin el RNA es un cebador adecuado y de hecho es el que se utiliza inicialmente. Todas las enzimas con funcin DNA polimerasa son protenas grandes y complejas. Las tres poseen actividad exonucleasa 3-5: Pueden polimerizar en una direccin y luego escindir los nucletidos que acaban de aadir, proporcionan capacidad de correccin de pruebas de DNA recin sintetizado quitando los nucletidos incorrectos para que puedan ser reemplazados. La DNA polimerasa I muestra actividad exonucleasa 5-3; permite escindir nucletidos empezando por el extremo donde se inicio la sntesis y continuando en la misma direccin que la sntesis, tiene la capacidad de eliminar el cebador de RNA. Otras dos observaciones podran explicar porque Kornberg aisl la polimerasa I y no la III, hay mucha mas cantidad de polimerasa I y es mucho mas estable. Polimerasa III es la enzima imprescindible responsable de la polimerizacin esencial para la replicacin. Polimerasa I es la responsable de eliminar el cebador y de la sntesis que rellena los huecos que normalmente se forman al eliminarse los cebadores. Su actividad exonucleasa tambin permite la correccin de prueba durante este proceso. Se ha descubierto una RNasa que alternativamente, puede eliminar el cebador antes de la que polimerasa I dirija la sntesis. La polimerasa II parece estar implicada en la sntesis reparadora del DNA daado por agentes externos. Esta codificada por un gen que puede activarse al interrumpirse la sntesis de DNA en la horquilla de replicacin. La DNA polimerasa III, en su forma activa, llamada holoenzima esta formada por dos juegos (un dimero) de diez cadenas polipeptidicas distintas, y su peso molecular excede los 600,000 daltons. La subunidad mayor, que tiene un peso molecular de 140,000 daltons, junto con otras dos subunidades forma el ncleo enzimtico responsable de la actividad polimerizadora de la holoenzima. La subunidad a es la responsable de la polimerizacin de los nucletidos sobre las cadenas de molde, mientras que la subunidad e del ncleo enzimtico en la que posee la actividad exonucleasa 3-5. Un segundo grupo de cinco subunidades forma el denominado complejo y, que esta implicado en cargar la enzima sobre el monde de la horquilla de replicacin.
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Todas las subunidades, junto con otras protenas presentes en la horquilla de replicacin, forman un complejo casi tan grande como un ribosoma. Toda esa entidad molecular recibe el nombre de replisoma. Iniciacin de la sntesis Esta puede ocurrir una vez desenrollada una pequea porcin de la hlice. La DNA polimerasa III necesita un extremo 3 libre en el cebador para alargar la cadena polinucleotidica. Esto impulso a los cientficos a investigar como se puede aadir el primer nucletido, ya que inicialmente no hay ningn grupo 3-hidroxil presente. Actualmente hay pruebas de que el RNA participa como cebador para inicial la sntesis de DNA. Se cree que, inicialmente se sintetiza un segmento corto de RNA complementario al DNA de la cadena molde. El RNA, de 5 a 15 nucleotidos de longitud, se sintetiza bajo la direccin de un tipo de RNA polimerasa denominada primasa. La RNA polimerasa no precisa un extremo 3 libre para iniciar la sntesis. Es a este corto segmento de RNA al que el DNA polimerasa empieza a aadir 5 desoxiribonucleotidos. Despues de la sntesis del DNA se produce en al area adyacente al cebador RNA, se corta el segmento de RNA y se reemplaza con DNA. Se cree que ambos pasos los realiza de DNA polimerasa I. Los cebadores de RNA se han encontrado en virus, bacterias y varios organismos eucariotas. Sntesis continua y discontinua de DNA Reconsideremos ahora el hecho de que las dos cadenas de DNA de una doble hlice son antiparalelas entre si. Una discurre en direccin 5 3, mientras que la otra tiene la polaridad opuesta. Debido a que la DNA polimerasa III sintetiza DNA solo en direccin 5 3, la sntesis simultanea de cadenas antiparalelas durante el avanza de la horquilla de replicacin ocurre en un sentido en una cadenas y opuesto en la otra. Al desarrollarse la cadenas y avanzar la horquilla de replicacin por la hlice solo una cadenas puede servir de molde para la sntesis continua de DNA (cadenas libre). Al avanzar la horquilla se necesita muchos puntos de iniciacin en la cadena opuesta o cadenas retrasada, dando lugar a una sntesis de DNA. Son pequeos fragmentos de 1.000 a 2.000 nucletidos cebadores de DNA forman parte de todos esos fragmentos. Estas piezas denominadas fragmentos de Okasaki, deben unirse enzimticamente. Al proseguir la sntesis lo fragmentos debajo del peso molecular con convertidas en cadenas de DNA de longitud y peso molecular creciente.

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Sntesis simultanea de la cadena lder y de la retrasada. Se cree que existe un mecanismo que permite la sntesis simultaneas de las dos cadenas en la horquilla de replicacin, ocurriendo la polimerizacin de los nucletidos sobre cada cadena, molde, bajo le direccin de uno de los dos monmeros que forman en dimero de la holoenzima. Si la cadenas retrasada forma un bucle, es posible que ocurra sntesis simultnea.

Bibliografa 1.Hector Marquez Monter, Principios de Gentica humana Editorial La prensa Medica Mexicana S.A. de C.V. Primera edicin 1992, pag 61-63 2.William S. Klug, Conceptos de Gentica Editorial Pearson, Quinta edicin. Pag 278, 315-320, 329-333

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