Introduccin Entre las aleaciones de mdicos ms interesantes desarrollados en los ltimos aos son las aleaciones NiTi, con

el nquel casi equiatomic y distribucin de titanio. Esto les proporciona varias ventajas. Los ms importantes son (i) su efecto memoria de forma, (ii) su superelasticidad y (iii) una buena biocompatibilidad [1-4]. Estas aleaciones se aplican con xito en la ciruga ortopdica [5], donde la propiedad superelstica de NiTi produce un estrs constante que acelera la cicatrizacin de heridas. El efecto memoria de forma es una de las mayores ventajas para los alambres de ortodoncia y arcos, que constituyen el motor de cambio dental [6], y para la autoexpandible stents vasculares [4,7]. La propiedad de memoria de forma en la prctica diaria reduce significativamente el tiempo de tratamiento.

El objetivo de este trabajo es determinar los posibles efectos in vitro lado biolgico de las aleaciones de nquel-titanio, con un alto ndice de contenido de nquel: toxicidad, alergenicidad y carcinogenicidad [8-12]. Este trabajo consiste en evaluar las caractersticas de aleacin de NiTielectroqumica en condiciones biolgicas en relacin con sus componentes de nquel y titanio. Por lo tanto, los ensayos de corrosin se llevaron a cabo con la saliva artificial convencional [13] y sobre todo con un medio de cultivo con o sin una lnea de clulas humanas en cultivo en suspensin linfoide. Los parmetros biolgicos fueron evaluados por medio de la proliferacin y la evaluacin de la citotoxicidad con las lneas de clulas humanas en contacto directo con NiTi. Que se completaron con los estudios sobre la adhesin celular y la morfologa y con una prueba de efectos inflamatorios [9]. La liberacin de nquel y titanio se evalu en diferentes sistemas de cultivos celulares.

Materiales y mtodos Las muestras y los polvos NiTi de aleacin (49% Ni, 51% Ti), de nquel de alta pureza (CV-Ni), comercialmentetitanio puro (cp-Ti), Ti6Al4V y de acero inoxidable 316L se utilizaron para este trabajo.Las aleaciones fueron lanzados en los cilindros de 12 y 15 mm de dimetro utilizando las tcnicas estndar de laboratorio y se cortaron en discos de 1,2 mm de espesor.Las muestras fueron pulidas de forma automtica en el grado 1200 con carburo desilicio de papel. La limpieza superficial se evalu mediante SEM. Rugosidad se caracteriz por microscopa lser confocal, las diferencias Ra de todas las muestrasfue de entre 1,7 y 2,1 lm. Despus del pulido, las muestras se limpiaron en un bao deetanol por ultrasonidos, secado al aire, y se esteriliza. Todos los polvos de metalfueron producidas por el proceso de deshidrogenacin de hidrogenacin (HDH).Tamizado y suspensiones de etanol permite obtener partculas con un tamao inferior a 10 lm.

Pruebas Electroqumica El dispositivo electroqumico era un biorreactor desarrollado dentro de una Accin Concertada Europea BioMed [14] por nuestro laboratorio y la Compaa Inceltech SGI-Francia (Toulouse). Se compone de una celda electroqumica y un entorno potentiokinetic. Se basa en un fermentador clsica organizado especficamente para mltiples investigaciones sobre el comportamiento a la corrosin de biomateriales metlicos, en particular, a darse cuenta de las culturas al mismo tiempo las bacterias o las clulas y ensayos electroqumicos. Una lmina de paladio se utiliza como electrodo contador y los potenciales son controlados con respecto a un electrodo de Ag / AgCl conectados a travs de un puente de sal y un Luggin ajustable capilar. El electrodo de trabajo, con una superficie de alrededor de 0,5 cm2 se une por medio de un conjunto de anillo O-deslizante para que su superficie hacia arriba en paralelo con el electrodo contador (KMS1, Sensortechnik Meinsberg Gmbh, Waldheim, Alemania). La distancia entre los dos electrodos es de aproximadamente 1 cm. El biorreactor tiene un volumen de trabajo de 650 ml. El control potenciodinmica del electrodo de trabajo fue proporcionado por un potenciostato (PGP-201 Rodiometer Tacussel, Copenhague, Dinamarca). El sistema en general controla mediante un microprocesador compatible con PC con un software de VoltaMaster Rodiometer-Tacussel. Electroqumica procedimientos de ensayo: Una primera serie de pruebas se llev a cabo con la saliva sinttica de acuerdo con la NF S 91-141 estndar de referencia de electrolitos [2]. Recin preparadas las muestras de prueba (12 mm) se introdujeron de inmediato a la celda de corrosin. El electrolito de la serie de la segunda prueba fue el medio de cultivo RPMI (Gibco BRL) complementado con 10% de suero fetal bovino (FCS) (Eurobio). Todos los ensayos se realizaron con cada aleacin o metal en el medio de cultivo con o sin clulas CEM, una lnea de clulas linfoides humanas (ATCC-TIB95). La concentracin celular aplicada fue de 10.000 clulas / ml. La siguiente secuencia de mediciones se utiliz a lo largo de todo el estudio [15]: (i) la determinacin del potencial de circuito abierto durante un perodo de 24 horas, el valor obtenido despus de la estabilizacin de la curva que se llama el resto potencial, (ii) catdica para fregar del electrodo de trabajo a) 800 mV / SCE durante 10 minutos para reducir la superficie de las pelculas, (iii) la evaluacin de las curvas de polarizacin mundial entre) 800 y 1000 mV, con una velocidad de barrido de 60 mV / min.

De cultivo celular Las pruebas de la proliferacin de clulas: las clulas epiteliales humanas embrionarias (lnea celular L132, ATCC CCL5), las clulas de embriones humanos palatina mesenquimales (clulas-line HEPM, ATCC CRL 1486) y NIH3T3 fibroblastos de ratn del tejido conectivo (ATCC CRL 1658) se utilizaron para esta prueba. Las clulas fueron incubadas a 37 C en una atmsfera de CO2 al 5% con 100% de humedad relativa. El medio de cultivo celular consisti en medio esencial mnimo de Earl (MEM) que contena Lglutamine (Gibco BRL), estreptomicina (0,1 g / l) y penicilina (100 UI / ml), y se complementa con 5% de suero fetal bovino (Eurobio).Los discos de cada aleacin o metal fueron colocados en la parte inferior de una placa de 15,5 mm mltiples (Costar). Las suspensiones celulares (105 clulas / ml para L132 y NIH3T3, 6? 104 clulas / ml para HEPM) se colocaron suavemente en cada disco. Cmaras de vaco cultura llena slo con la suspensin de clulas sirvieron como controles negativos. Setenta y dos horas ms tarde, el recuento de clulas se realiz mediante un contador Coulter Z1 celular. La tasa de proliferacin celular se calcul como el nmero de clulas cultivadas en las muestras, dividido por el nmero de clulas control. Los datos fueron expresados como el porcentaje de media desviacin estndar con respecto a los cultivos de control (100%). Los ensayos se realizaron por triplicado en cada prueba y la prueba se repiti cinco veces. Pruebas de viabilidad se realizaron utilizando el mtodo de formacin de colonias de clulas epiteliales humanas (L132) en la cultura [10,16,17]. Las clulas fueron expuestas continuamente a concentraciones crecientes (0, 25, 50, 100, 200 y 400 ug / ml) de polvos de metales y aleaciones sin renovacin del medio de cultivo durante los experimentos. Al menos seis repetidos experimentos se llevaron a cabo para cada concentracin. La prueba de las reacciones inflamatorias consisti en la cuantificacin de las clulas gigantes multinucleadas (MGC) en cultivos celulares en monocapa de L132 en la presencia de los polvos de metal o aleacin [17]. Esta prueba revela cambios morfolgicos en un cultivo celular por la aparicin de clulas gigantes multinucleadas, que estn directamente relacionados con la fisiolgica, es decir, alteraciones funcionales, a las clulas [18,19]. La concentracin de Ni-polvo utilizado para esta prueba fue la concentracin letal 50% (LC50) dada por la prueba colonia mtodo de formacin. Para cp-Ti, NiTi, Ti6Al4 y 316 se les aplic la mayor concentracin, que se utiliz para la prueba de viabilidad (400 ug / ml). El tiempo de exposicin fue de 5 das. Despus de la tincin y secado, las clulas gigantes multinucleadas fueron contados: al menos 10 reas de 800 a 1,000 clulas. El resultado final se expresa como el porcentaje medio de MGC con respecto al nmero total de clulas [17]. La liberacin de iones se midi en el medio de cultivo de clulas L132 despus de la 3 - y 6-das los ensayos de proliferacin de las aleaciones experimentales y los metales. Los medios de comunicacin se analizaron, despus de la mineralizacin, por plasma acoplado inductivamente atmica espectroscopia de emisin (ICP-AES). Ni y Ti fueron considerados como elementos a analizar.

La organizacin del citoesqueleto: filamentos de actina en las clulas se marcaron HEPM con 1,2 lg / ml FITC-phalloidin (Sigma) [20]. Despus se lava en una solucin tampn, las muestras se insertan en PBS-glicerol-DABCO (1.1) (Sigma) medio de montaje y se examina en un microscopio de epifluorescencia Zeiss o en una Leica TCS NT microscopio confocal de barrido lser.

Resultados pruebas Electroqumica Las curvas de potencial en funcin del tiempo obtenidos en el presente estudio permitir determinar el potencial de reposo de las muestras de ensayo, su valor se obtiene cuando el potencial se mantiene constante. Las pruebas se llevaron a cabo a 37 C y con un pH estabilizado a las 7. Manejo se repiti tres veces, los resultados medios estn representados en la Tabla 1. El potencial de reposo medido de todas las aleaciones y los metales se ajustan a los que generalmente se indica en mltiples investigaciones. Ti6Al4V y cp-Ti, presente lgicamente el mayor potencial de reposo, lo que incrementa significativamente por primera vez en el electrolito orgnico (RPMI) y an ms en la presencia de clulas CEM. Un comportamiento similar se observa para HP-Ni. Los valores de NiTi se mantienen estables y las de disminucin de 316 que los potenciales resto significativamente ms andico. La evaluacin de la polarizacin mundial (Figuras 1 y 2) permite la determinacin del potencial de ruptura. Su valor se corresponde con el potencial, de la cual se altera la capa de pasivacin o rotas y la corrosin del material se acelera posteriormente.Aunque la densidad de corriente es relativamente estable antes de la breakdownpotential, aumenta abruptamente despus de ella. Un notable influencia de las clulas orgnicas y electrolitos vida se ha observado para HP-Ni y el acero inoxidable 316L, donde la ruptura potencial aumentado de manera significativa.Aunque el potencial colapso de las disminuciones de NiTi, esta aleacin an permanece pasivo a valores superiores a 500 mV / SCE. Por el contrario, ningn aumento de la corriente en el intervalo estudiado se observa para Ti6Al4V y cp-Ti. Permanecen pasivos hasta 1000 mV / SCE, lo que indica que ambos materiales tienen las pelculas de pasivacin de alta resistencia. La corriente pasiva es un punto importante. Es la densidad de corriente en su dominio de pasivacin de una aleacin. CV-Ni se ha produce importantes corrientes pasivas entre 800 y 13.000 lA/cm2. Similares valores altos se miden por 316, en particular en la presencia de clulas vivas. La corriente pasiva de NiTi, Ti-cp y Ti6Al4V es muy baja. Una influencia significativa de las clulas vivas se observa para NiTi.

Las pruebas biolgicas Los resultados promedio de las pruebas de la proliferacin celular estn representados en la figura. 3. Para todos los tipos celulares menores tasas de proliferacin se observ con respecto al control. NiTi y Ti6Al4V son los materiales ms citocompatible, inducen la proliferacin de las tasas cercanas a las de CP-Ti.CV-Ni produce tasas de proliferacin muy bajo con clulas HEPM (34%), NIH3T3 (16%) y las clulas L132 (11%). As, su potencia txica parece depender del tipo de clula, es decir, Ni es ms txico para las clulas L132 que para las clulas HEPM.Las tasas de proliferacin en el 316 se sitan entre 24% y 35%. Un efecto similar txicos de Ni (1 0,2%) es revelado por la prueba de la viabilidad celular realizado con los polvos metlicos diversos. La tasa de supervivencia en presencia de NiTi y cp Ties de 79 3,9% y 81 4,1%, respectivamente, para las ms altas concentraciones utilizadas (400 ug / ml). Ti6Al4V produce la mejor viabilidad con una tasa de supervivencia de 96 5,8%. 316 tambin induce la muerte celular slo poco (76 4,5%). La aparicin de MGC revela una respuesta inflamatoria a una sustancia qumica (Fig. 4). Las clulas de las zonas caractersticas se cuentan despus de la coloracin de las placas de cultivo. El nmero total de MGC se informa que el nmero total de clulas normales. La frecuencia de la aparicin MGC es de aproximadamente 1,3% de NiTi, Ti6Al4V y cp-Ti. No hubo diferencias significativas podra decirse con respecto a los cultivos de control: 1,5%, mientras que para 316, y en particular para la CV-Ni, la frecuencia de MGC es significativamente mayor: 2,9% y 5,1%, respectivamente. Actina en las clulas de etiquetado HEPM revel un citoesqueleto compuesto por filamentos intracelulares (fibras de estrs) alineado con el eje longitudinal en el control de las clulas y en las clulas cultivadas en cp-Ti y Ti6Al4V. NiTi y 316 inducidos por la propagacin de clulas con un fuerte desarrollo, el citoesqueleto es decir, casi sobrecargado (Fig. 5). Las fibras de actina se redujeron fuertemente en las clulas en HP-Ni (Fig. 5b), que en su mayora se han retractado de las formas con una superficie citoplasmtica reducido. La liberacin de iones se ha determinado para una explicacin ms detallada de cualquier reaccin biolgica. Ni las concentraciones son significativamente diferentes a los de los cultivos de control (Tabla 2). El nquel contenido en el medio de control no supere el 0,01 ppm (normalmente contenida en el suero fetal bovino aadido al medio de cultivo), el Ni-liberacin de la NiTi es muy baja (valor medio de 0,1 ppm), pero en lugar de alta pureza muestras de nquel: 6,6 y 11,4 ppm despus de 3 - y 6 das de las culturas, respectivamente. El titanio no es detectable en el medio de control. Su lanzamiento es extremadamente bajo de la CP-Ti (lmite de deteccin) y aumenta ligeramente a partir de muestras de NiTi. No hubo diferencias significativas se puede afirmar despus de 3 - y las culturas de 6 das.

Discusin Nquel y compuestos de nquel en particular, se reconoce que tienen ms o menos txicos y / o efectos cancergenos en animales y seres humanos [21,22]. Estos efectos puede ser inducida por la exposicin ocupacional y tambin - pero en una escala limitada - de larga duracin de exposicin a los implantes y prtesis [11]. Desde el nquel representa el 49% de la composicin de NiTi, es interesante para evaluar si esta gran cantidad tiene un efecto secundario no deseado biolgica y comparar los resultados de la electroqumica y ensayos biolgicos con la aleacin y sus dos componentes puros. Esta comparacin permite confirmar que la CV-Ni no es muy resistente a la corrosin. NiTi, Ti6Al4V y cp Ti-, sin embargo, son resistentes a la corrosin, y su pelcula de pasivacin tiene una muy buena estabilidad. Al comparar los potenciales resto de los materiales con los de otras aleaciones examinado [15,23,24], observamos que todos los materiales testedin el presente estudio tienen potenciales resto francamente negativos. Esto indica una alta susceptibilidad a la corrosin, el cual se examina, de hecho, para HP-Ni y 316 por la evaluacin de la polarizacin global. El NiTi, Ti6Al4V y cp Ti-han puesto de manifiesto en los ensayos idnticos, sin embargo, una resistencia a la corrosin muy buena con las corrientes pasivas muy bajas y los potenciales de degradacin muy alto, CV-Ni la presentacin de una 1000 veces ms alta de corriente pasiva. La actual baja pasivo de NiTi y cp Ti-indican una velocidad ms lenta la corrosin y, posteriormente, una menor liberacin de iones en electrolitos o fluidos biolgicos [25]. Esto es de gran importancia para la biocompatibilidad de cualquier aleacin [9,26]. El nquel puro no slo tiene un comportamiento a la corrosin poco propicio, pero tambin induce respuestas biolgicas desfavorables como se desprenda de todas las pruebas de cultivo celular aplicada. CV-Ni muestra una tasa de proliferacin dbil con los dos tipos de clulas, pero parece ser menos txico para las clulas HEPM que para el L132 clulas. En contraste, las clulas NIH3T3 en lugar de clulas HPEM una mejor tasa de crecimiento en el cp-Ti, Ti6Al4V y NiTi, el segundo mejor inducir el crecimiento celular. Es importante tener en cuenta las diferencias de los tipos de clulas para las investigaciones futuras en este campo. La prueba de la proliferacin celular es un mtodo de prueba de rutina da resultados reproducibles y cuantitativos. Con el fin de obtener resultados ms relevantes, otras pruebas cytocompatibility muy especficos se han realizado. Uno de ellos es la determinacin cuantitativa de la citotoxicidad mediante el mtodo de formacin de colonias [16,19], que mide slo un criterio de reaccin de la clula que es la muerte celular o la supervivencia celular [10]. Una prueba especfica segunda es la evaluacin cuantitativa de las reacciones inflamatorias por la aparicin de MGC.Estas clulas pueden aparecer no slo en cultivos celulares o organotpicos [18], sino tambin in vivo en pacientes con tatuajes de amalgama [26-28] o implantes ortopdicos [29]. Por lo general son considerados como una respuesta especfica inflamatoria [26 - 29]. Ambas pruebas consolidar los resultados obtenidos por los experimentos de la corrosin y la proliferacin celular.

El etiquetado de actina y el citoesqueleto es un ensayo cualitativo. Los resultados reflejan de alguna manera a los obtenidos por la prueba de proliferacin. Clulas HPEM muestran la morfologa celular similar y la distribucin de filamentos de actina y la intensidad en el control de las clulas y en las clulas cultivadas en cp-Ti y NiTi y Ti6Al4V. Sin embargo, las clulas cultivadas en CV-Ni slo mostrar algunos filamentos de actina raros, y el color verde de la clula se debe probablemente al etiquetado de actina despolimerizado en el estado globular llamado.Thisdepolymerising efecto es menos evidente en las clulas cultivadas en 316, donde todava hay un cierto nmero de clulas que presentan los filamentos de actina. El responsable ltimo de todos estos efectos biolgicos es la liberacin de iones de Ni-nquel puro por una baja resistencia a la corrosin electroqumica, sino tambin por accin directa de los fluidos biolgicos y de las clulas vivas [30]. El nquel es casi no libera cuando se ala con una aleacin de alta calidad con excelentes caractersticas fsicas [31].

conclusin La nueva tecnologa ha sido aplicada para la caracterizacin electroqumica y biolgicos de la aleacin con memoria de forma Ni Ti en comparacin con sus componentes puros y dos diferentes aleaciones se utilizan actualmente. Los ensayos electroqumicos revelan una clara diferencia de comportamiento a la corrosin en inorgnicos y orgnicos (biolgicos) electrolitos, y que los organismos vivos, como las clulas tienen un efecto adicional sobre la resistencia a la corrosin. Las pruebas de rutina de la citotoxicidad y, en particular, las evaluaciones de la funcin celular ms realista, como la determinacin de los efectos inflamatorios y la integridad del citoesqueleto han confirmado que el nquel no es slo una especie de corrosivo, sino tambin un material citotxico. Su potencia txica depende del tipo de clulas: es ms txico para las clulas L132 que para HEPM o clulas NIH3T3.Su uso en implantes, prtesis y otros dispositivos mdicos deben ser regulados dentro de la condicin de los ms bajos de liberacin. cp-Ti y NiTi son resistentes a la corrosin y especialmente biocompatible. La evidencia se muestra que la introduccin de nquel en la aleacin no genera ninguna reaccin citotxica ni altera el comportamiento fisiolgico y funcional de las clulas. Adems, le confiere una propiedad muy especial en esta aleacin que es memoria de forma y que proporciona esta aleacin con algunas ventajas importantes en los dominios de ortodoncia y cardiovascular.