AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

Objetivos: Partiendo de una suspensin bacteriana, emplear la tcnica de siembra en estras en placa de Petri para obtener colonias separadas y poder lograr el aislamiento de cepas en cultivos puros. Aprender el fundamento y mtodo de algunas pruebas bioqumicas para la identificacin bacteriana.

AISLAMIENTO
La mayor parte de los estudios que se realizan sobre las bacterias requieren que cada cepa bacteriana est en cultivo puro, es decir que est aislada de los restantes microorganismos que pueden acompaarla. Este aislamiento es un paso bsico antes de emprender cualquier estudio serio con bacterias en el laboratorio, y logra mediante el uso de tcnicas sencillas de siembra en medios slidos a partir de la mezcla bacteriana, con objeto de que tras un tiempo de incubacin para permitir el crecimiento, aparezcan colonias separadas.

Una colonia o clon es una poblacin bacteriana que procede de una sola clula. A partir de cada colonia de cada tipo presente en ese medio slido se puede aislar la cepa correspondiente, obtenindose un cultivo puro.
(NOTA: vase el Apndice de este cuaderno, para un repaso sobre conceptos relativos a medios de cultivo, que manejaremos a lo largo de estas Prcticas).

1.1.- Material necesario: Mezcla bacteriana (suspensin en la que hay dos o ms cepas bacterianas, que se pretenden aislar e identificar). Tubo con 15-20 ml de tripticasena-soja-agar (TSA), un medio complejo e indefinido, mantenido en sobrefusin (45C). Placa de Petri estril. Tubos inclinados con medio complejo TSA Placa con medio selectivo y diferencial (Agar de Mac Conkey).

1.2.- Tcnica: Forma de tender las placas 1. Se parte de un tubo con 15-20 ml de medio TSA esterilizado en autoclave. El medio contiene agar al 1,5%, y estar en sobrefusin mientras se mantenga a ms de 45C (bao Mara) 2. Abriendo ligeramente la placa de Petri, se vierte en ella el medio en sobrefusin y se deja solidificar en la placa. 3. El agua formada debido a la condensacin se debe eliminar para que no interfiera en el aislamiento. Para ello se lleva la placa a una estufa de 37C, y se coloca abierta, de modo que la parte inferior donde est el agar descanse invertida sobre la tapa.1 4. Una vez seca, se cierra la placa y se saca de la estufa para proceder a la siembra. (En adelante las placas se colocarn siempre descansando sobre la tapa).

Mientras se seca la placa, vamos a "echar un vistazo" microscpico a nuestra mezcla problema: realizamos una tincin de Gram, para hacernos una idea inicial de la variedad de bacterias de esa mezcla desde el punto de vista de morfologa, agrupaciones y coloracin Gram.
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Siembra en placa: diseminacin en estras A partir de la suspensin bacteriana inocularemos las dos placas (TSA y Agar de Mac Conkey) mediante el procedimiento de diseminacin en estras. Este mtodo consiste en tomar con el asa de siembra una gota de la mezcla bacteriana, y extenderla sobre la superficie del agar, formando una serie continua de zigzags muy apretados. De esta forma conseguimos que la concentracin de bacterias que van pasando a la superficie del medio sea cada vez menor, y existan zonas en las que la distancia entre bacterias sea lo suficientemente grande como para que las futuras colonias no se superpongan.

Tipos de medios empleados Siembra en medios generales (TSA) para permitir el crecimiento de todos los microorganismos de la muestra Siembra en medios selectivos y diferenciales: Agar de Mac Conkey que permite seleccionar preferentemente bacterias Gram-

intestinales que crecen en presencia del cristal violeta y de las sales biliares que lleva el medio (agentes selectivos) y determinar su capacidad o no fermentadora de la lactosa, en base a la produccin de cidos que baja el pH y vira el indicador (rojo neutro) de naranja a rosa y adems las bacterias incorporan el indicador a las colonias que

aparecen de color rosa. Es frecuente, adems, ver precipitadas las sales biliares alrededor de las colonias productoras de cido. Incubacin Una vez inoculadas las placas, se llevan a la estufa de 28 o 37C C para permitir el crecimiento bacteriano. Muchas bacterias con tiempos breves de generacin generan colonias patentes a las 24-48 h. Estudio de las colonias En el medio complejo no selectivo TSA se podrn detectar varios tipos de colonias, correspondientes a siguientes caracteres culturales de las bacterias: Forma de la colonia (punteada, circular, filamentosa, rizoide, irregular, etc.) Tamao relativo de unos tipos de colonias respecto de otros de la misma zona de la placa. Aspecto de la superficie (ms o menos brillante, etc.). Forma de los bordes (liso, ondulado, lobulado, desgastado, filamentoso, etc.) Elevacin respecto del sustrato (plana, elevada, convexa, pulvinado, umbilicada, etc.) Consistencia (ms o menos cremosa, ms o menos mucosa, etc.) Caracteres pticos (transparente, traslcida, opaca). Pigmentos no difusibles (la colonia presenta un color propio) o difusibles (el medio se colorea alrededor de la colonia)2

Esto hay que comprobarlo en medios desprovistos de colorantes. Obviamente, los colores que pueden presentar las colonias y el agar en un medio como el Agar MacConkey se deben a procesos desencadenados por componentes incluidos en el medio, pero no nos dicen nada sobre posibles pigmentos de la bacteria.
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Para que el estudio sea completo, se debe realizar una tincin de Gram a cada tipo de colonia presente, para relacionar la descripcin morfolgica de las colonias con el aspecto al microscopio de las bacterias. Simultneamente se observar lo que ha pasado en el medio selectivo y diferencial agar de Mac Conkey: Crecen en ese medio todas las bacterias que lo hacen en el medio no selectivo? Por qu? Cul es el aspecto de las colonias y de su entorno en ese medio considerado ahora en su faceta de medio diferencial? Explicar el fundamento bioqumico (metablico) que explica dicho aspecto. 2.- Obtencin de cultivos puros A partir de colonias de cada tipo aparecidas, es muy fcil obtener un cultivo de cada cepa: 1. Elegimos una colonia bien separada de cada tipo (si hace falta, sealamos con un rotulador la zona de la placa Petri que la contiene). 2. Con el asa flameada y fra, tomamos la colonia seleccionada (o una porcin), e inoculamos en la superficie del agar inclinado: introducimos el asa cargada hasta el fondo del tubo, y vamos haciendo un zigzag apretado hasta arriba, con lo que vamos descargando gran cantidad de bacterias de ese tipo en ese medio fresco estril. 3. Esta operacin la hacemos por separado con cada uno de los tipos de bacterias que hayamos detectado en los estudios morfolgicos macroscpicos y microscpicos) 4. Introducimos los tubos as inoculados en la estufa a la temperatura adecuada 5. Tras un da de incubacin sacamos los tubos y observamos si la superficie del agar est cubierta por un csped continuo de bacterias. 6. Para comprobar si en cada tubo hay un cultivo puro, hacemos una tincin de Gram, y confirmamos que solo hay un tipo de bacterias.

PRUEBAS BIOQUMICAS BACTERIANA

PARA

LA

IDENTIFICACIN

Las pruebas bioqumicas a realizar no son las mismas para todos los tipos de microorganismos que se quieran clasificar. Se realizarn una serie de pruebas bioqumicas sobre las bacterias aisladas, conociendo en cada caso su fundamento. Prueba de la oxidasa Finalidad y fundamento Se trata de saber si la bacteria posee el citocromo c, que forma parte de la cadena transportadora de electrones de ciertas bacterias respiradoras. El citocromo c, al recibir los electrones se reduce, y se oxidar, cediendo los electrones al oxgeno, en una reaccin catalizada por el complejo citocromo a+a3 (llamado citocromo oxidasa). Para llevar a cabo esta prueba pondremos en contacto una porcin de bacterias con un el reactivo de oxidasa que est reducido (color celeste plido). Si la bacteria tiene citocromo c, captar electrones del reactivo reducido que entonces se oxidar y cambiar rpidamente de color, pasando a un azul oscuro. Material y reactivos Reactivo de oxidasa: solucin de clorhidrato de tetrametil-pfenilndiamina al 1% en agua destilada. El reactivo debe prepararse unos minutos antes de realizar la prueba, para evitar que a la hora de su uso se haya autooxidado. Papel de filtro. Tcnica y resultados posibles

1. Impregnar un trozo de papel de filtro con unas pocas gotas de reactivo de oxidasa. 2. Cargar el asa de siembra con bacterias de un cultivo puro e tocar una zona del papel de filtro impregnado con el reactivo, cuidando de no raspar el papel. 3. Las bacterias oxidasa-positivas cambiarn el color enseguida a azul oscuro, mientras que las oxidasa-negativas dejarn el color sin cambio. Prueba de la catalasa Finalidad y fundamento Se trata de detectar si la bacteria es o no capaz de sintetizar la enzima catalasa, que descompone el perxido de hidrgeno (agua oxigenada) en agua y oxgeno: catalasa H2O + O2 H2O2 El oxgeno provoca en el citoplasma de las clulas la aparicin de productos txicos (perxidos, superxidos, radicales hidroxilos, oxgeno singlete, etc.) Las bacterias que viven en ambientes con oxgeno necesitan enzimas adecuadas para eliminar y detoxificar estas sustancias. Una de estas enzimas es precisamente la catalasa. Material y reactivos Portaobjetos. Agua oxigenada de 10 volmenes. Tcnica y Resultados En un porta poner una gota de agua oxigenada por cada bacteria que se vaya a ensayar. Tomar con el asa flameada una porcin de bacteria, y colocarla sobre la gota de agua oxigenada. Si la bacteria es catalasa positiva, se ver una efervescencia (debida al oxgeno desprendido en la reaccin).

Prueba O/F(glucosa) Finalidad Se trata de determinar si la bacteria estudiada produce cidos a partir de un azcar determinado (en este caso, la glucosa), por va fermentativa u oxidativa. Medio de Hugh-Leifson: Glucosa Peptona ClNa PO4HK2 Agar Prpura bromocresol Agua pH 1.0 g 0.2 g 0.5 g 0.03 g 0.3 g de 0.3 ml de una solucin en etanol al 1% 100 ml 7.2

El medio se esteriliza en autoclave a 115C (para evitar la caramelizacin de la glucosa) durante 20 min. Tcnica 1. Cada bacteria problema se inocula en picadura (en profundidad) en dos tubos idnticos del medio, empleando para ello el hilo de siembra. 2. En uno de los tubos se coloca una capa de parafina estril de 0.5 cm de grosor, aproximadamente (con lo que estamos creando en l condiciones de anaerobiosis). De esta manera vamos a tener la bacteria sembrada en el mismo medio pero en un tubo en condiciones de aerobiosis (y lo llamaremos tubo O), y en el otro tubo en condiciones anxicas (lo denominaremos tubo F). 3. Se incuban los dos tubos a la temperatura adecuada, de 24 a 48 horas. Resultados: interpretacin y fundamento

Datos a tener en cuenta: El prpura de bromocresol es un indicador de pH, que a valores neutros es de color prpura, pero a pH cidos (en torno a 4-5) vira a amarillo. Obsrvese que el medio lleva agar, pero a una concentracin ms baja que en los medios slidos normales. Por esta razn, a este tipo de medios que no son lquidos, pero que llevan concentraciones bajas de agar, se les califica como agar blando o agar semislido. Una consecuencia de esta baja concentracin de agar es que en el tubo que queda sin parafina (el O) el oxgeno puede difundir a travs del medio hasta el fondo, en cambio, en el tubo F la parafina impide la entrada de oxgeno al medio. La bacteria puede (o no) usar la glucosa. En el caso de usarla, puede (o no) producir cidos, lo cual se puede efectuar por va oxidativa y/o fermentativa. Esto lo comprobamos viendo el viraje (o no) de color del prpura al amarillo en cada uno de los tubos. Los posibles resultados seran: Si la bacteria ha crecido en el tubo O: es aerobia no fermentadora y no productora de cidos a partir del azcar Bacteria que produce cidos a partir del azcar, en aerobiosis (va oxidativa) Bacteria anaerobia facultativa, fermentadora Fermentadora, pero habra que comprobar si crece en el tubo O: si no crece, se trata de una bacteria anaerobia estricta con metabolismo fermentador

OF O+FO+F+ O-F+

- -

Prueba del agar de Kligler (agar hierro y doble azcar) Finalidad Se trata de una prueba que se suele aplicar a bacilos Gram-negativos anaerobios facultativos y fermentadores (O+F+). Se realiza en un medio diferencial complejo que permite deducir varias caractersticas: Confirma si la bacteria es fermentadora anaerobia facultativa o slo respiradora aerobia. Si la bacteria es fermentadora, permite distinguir si fermenta slo glucosa o si tambin fermenta la lactosa; Detecta las bacterias que pueden usar el azufre (orgnico y/o inorgnico).

Medio de Kligler repartido en tubos en pico de flauta extracto de carne 3g extracto de levadura 3 g peptona de carne 20 g NaCl 5g lactosa 10 g glucosa 1g citrato frrico 0.3 g tiosulfato sdico 0.3 g rojo de fenol 0.5 g agar 15 g agua 1000 ml pH 7.4 Este medio se esteriliza en autoclave a 115C durante 20 min. El indicador de pH confiere a este medio, cuando est sin inocular, una coloracin anaranjado-parda. El rojo fenol vira a amarillo en condiciones cidas, y vira a rosa intenso en condiciones alcalinas. Tcnica La bacteria a ensayar, procedente de cultivo puro, se inocula con el hilo de siembra de dos formas distintas en este medio: en picadura (pinchando con el hilo impregnado de bacteria hasta el fondo) mediante estras, en superficie. De esta forma, la misma bacteria va a estar sometida a condiciones aerbicas (en superficie) y a condiciones anxicas (la concentracin de agar es suficientemente alta como para dificultar la difusin de oxgeno a la zona del fondo del tubo). Tras inocular la bacteria de esta doble manera, el tubo se incuba a 37C durante 24 h. Resultados e interpretacin

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Este medio nos puede suministrar una gran variedad de respuestas. 1) En cuanto a utilizacin de azcares a) Bacteria no fermentadora y aerobia. Aunque en realidad este medio est pensado para bacterias fermentadoras, veamos qu hara en este medio una bacteria heterotrofa aerobia no fermentadora: en profundidad no podra crecer, por lo que el fondo del tubo quedara sin cambiar. En el pico de flauta la bacteria podra respirar la glucosa hasta CO2 y H2O. El CO2 reacciona con los iones Na+, generando bicarbonato sdico (NaPO4H2), que alcaliniza la zona de la superficie donde la bacteria est creciendo (el pico), con viraje del indicador a rojo. b) Bacteria fermentadora de glucosa, pero no de lactosa (Lac-). En el fondo del tubo la bacteria crecer fermentando la glucosa y generando cidos fondo del tubo, amarillo. En el pico de flauta la bacteria crecer usando la glucosa por va oxidativa, degradndola hasta CO2 y H2O, que como ya sabemos, se combinan con el Na+, para dar el bicarbonato. Sin embargo, como hay poca glucosa, para seguir creciendo las Enterobacterias pueden desaminar los aminocidos y generar amonio (NH4+) superficie de color rojo. c) Bacteria fermentadora de glucosa y de lactosa (Lac+). La bacteria crece en dos fases (crecimiento diuxico): 1 usa la glucosa, que al estar en baja concentracin se agota pronto, y luego recurre a la lactosa. Este tipo de bacterias se distingue porque provocan que todo el tubo vire a amarillo. La explicacin es la siguiente: al igual que con la glucosa, la lactosa se 11

fermenta en el fondo del tubo fondo del tubo, amarillo, mientras que en el pico de flauta en principio utilizar las glucosa y despus la lactosa produciendo altas concentraciones de cidos superficie de color amarilla d) Bacterias que producen gas como producto de fermentacin. Muchas bacterias producen tambin gases en la fermentacin (H2, CO2). Ello se puede manifestar porque algunas burbujas quedan atrapadas en el medio, e incluso el agar puede desgarrarse o ser empujado hacia arriba, desprendindose del fondo del cristal. 2) En cuanto a la utilizacin de azufre a) Bacterias SH2+ (productoras de sulfuro de hidrgeno debido a la existencia de enzimas como cistena desulfurilasa o de tiosulfato reductasa), que se manifiesta como una banda de precipitado negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias pueden usar fuentes orgnicas de azufre (la cistena gracias a la cistena desulfurilasa) y/o inorgnicas (el tiosulfato por la actividad tiosulfato reductasa3), produciendo cido sulfhdrico (sulfuro de hidrgeno). Este SH2 reacciona con iones ferroso (Fe2+) procedente del citrato frrico del medio, dando un precipitado negro de sulfuro de hierro (FeS) muy patente. b) Bacterias SH2-. No provocan la aparicin de banda de precipitado negro.

PRUEBAS IMViC: para identificar fermentadores (Enterobacterias) Prueba del indol

bacilos

Gram-negativos

Finalidad y fundamento Se trata de comprobar si la bacteria es capaz de sintetizar la enzima triptofanasa, que cataliza la degradacin del triptfano hasta indol, pirvico y amonaco. El fundamento de la prueba consiste en la deteccin del indol producido como producto de desecho por las bacterias dotadas de triprofanasa, hacindolo reaccionar con un reactivo, que de esta manera cambia de color.

Algunas bacterias anaerobias facultativas pueden emplear tiosulfato como aceptor terminal de cadenas de electrones respiratorias anaerobias, reducindolo hasta sulfuro de hidrgeno.
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Medio de cultivo agua de peptona Peptona carne NaCl Agua pH de 1 g 0.5 g 100 ml 7.2

Reactivo de Kovacs Alcohol amlico pdimetilaminobenzaldehi do ClH concentrado 150 ml 10 g 50 ml

Tcnica 1. Inocular el tubo de agua de peptona con la bacteria problema, procedente de un cultivo puro. 2. Incubar en estufa a la temperatura adecuada (en nuestro caso, 37C), durante 24-48 h. 3. Aadir al tubo unas gotas de Reactivo Kovacs, agitar vigorosamente y dejar en reposo. Resultados e interpretacin

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Las bacterias indol-positivas forman un anillo rojo en la parte superior del tubo, mientras que las indol-negativas forman un anillo amarillo. El fundamento es el siguiente: En el caso de que la bacteria posea triptofanasa, mientras crece va degradando el triptfano segn la reaccin comentada arriba, de modo que en el medio se va acumulando indol como producto de desecho. Al aadir y mezclar el reactivo de Kovacs, el p-dimetil-aminobenzaldehido reacciona con el indol, en una reaccin catalizada por el ClH, dando un compuesto rojo (llamado rosindol). Mientras esto ocurre, el indol y el rosindol van siendo extrados en la fase alcohlica: se disuelven en el alcohol amlico, que es inmiscible con el agua, de modo que el resultado positivo se manifiesta como anillo rojo en la parte superior del tubo (la correspondiente a la fase acuosa). Si la bacteria es indol-negativa, en la fase alcohlica queda de color amarillo.4

Pruebas de Rojo de Metilo y Voges-Proskauer Hay muchas bacterias capaces de realizar fermentaciones a partir de azcares (obteniendo energa por fosforilacin a nivel de sustrato). Las enterobacterias, como grupo, pueden degradar fermentativamente la glucosa por dos rutas diferentes: Fermentacin cida mixta: a partir del pirvico (procedente de la glucolisis) se produce una mezcla de cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico, succnico), algo de etanol, y gases (H2, CO2). El resultado es que en un medio no tamponado, las bacterias que realicen este tipo de fermentacin acidificarn el medio. Fermentacin butilngliclica: se caracteriza porque no se producen cidos (o se producen muy poco), siendo su producto final una sustancia neutra de tipo alcohlico llamada butilnglicol (=2,3-butanediol). El intermediario previo a este butilnglicol es la acetona (=acetilmetil carbinol). Las dos siguientes pruebas estn encaminadas a detectar cada una de estas fermentaciones. La prueba del Rojo de Metilo, si sale positiva, indica la existencia de fermentacin cida-mixta, mientras que un resultado positivo en Voges-Proskauer detecta la fermentacin butilngliclica. Lgicamente, una determinada cepa de

Realmente el p-dimetilaminobenzaldehido puede reaccionar tanto con el indol como con el triptfano. Precisamente para eliminar la posibilidad de falsos positivos por reaccin con el triptfano es por lo que el reactivo va disuelto en alcohol amlico, inmiscible con el agua. El indol se disuelve en el amlico, pero no el triptfano, por lo que al aadir el reactivo, ste extrae selectivamente el indol de la fase acuosa, pasando a la alcohlica, donde reaccionar con el p-dimetilaminobenzaldehido, generando la coloracin roja.
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enterobacteria debe dar positivo en una de estas pruebas, y negativo en la otra, de modo que ambos ensayos se complementan entre s.

Prueba del rojo de metilo Finalidad Detectar la acumulacin de cidos orgnicos de cadena corta (p ej. , frmico y actico) procedentes de la fermentacin cida-mixta.

Medio de cultivo Medio MR-VP (2ml/tubo)

Peptona 5g Glucosa 5g Tampn 1000 ml fosfato PH 7.2 Este medio est tamponado: los componentes estn disueltos en una solucin amortiguadora de pH, ajustada a neutralidad. Indicador Solucin de rojo de metilo en alcohol etlico de 96 (0.1 g en 300 ml de etanol, que se completan hasta 500 ml con agua). Tcnica 1. La bacteria se inocula en un tubo del medio MR-VP. 2. Se incuba a 37C durante 24-48 h. 3. Se aaden unas cuantas gotas de indicador Rojo de Metilo, se agita vigorosamente, y se espera unos segundos para leer los resultados. Resultados

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Si la bacteria ha realizado la fermentacin cida-mixta, se habr acumulado en el medio gran cantidad de cidos durante su crecimiento, de modo que se habr superado la capacidad tamponadora del tampn: el pH habr bajado en torno a 4.0. Al aadir el reactivo de rojo de metilo (que originalmente es amarillo), si el pH es bajo, vira a color rojo, con lo que nos detecta un resultado RM positivo. Una bacteria que no haya acumulado suficientes cidos (porque no haya realizado la fermentacin cida-mixta), no habr provocado un descenso sustancial del pH (recurdese que el medio va tamponado), por lo que al aadir el reactivo de Rojo de Metilo, obtendremos un color amarillo (resultado RM negativo)

Prueba de Voges-Proskauer Finalidad Comprobar si la bacteria posee la fermentacin butilngliclica, que produce sustancias alcohlicas neutras: acetona como intermediario y butilnglicol como producto final. Medio MR-VP Es el mismo medio empleado en la prueba del Rojo de Metilo. Reactivos Solucin de potasa (KOH) al 16% en agua. Solucin de -naftol al 6% en etanol. Tcnica 1. La bacteria se inocula en un tubo del medio MR-VP. 2. Se incuba a 37C durante 24-48 h. 3. Se aaden unas gotas de la solucin de potasa, y se agita bien. 4. Se aaden unas gotas de solucin -naftol, y se vuelve a agitar. Resultados Tras esperar unos minutos (que se pueden acortar calentando ligeramente el tubo), se comprueba si hay resultado VP-positivo: en este caso se desarrolla una coloracin rosa. Esto se debe a que la potasa oxida a la acetona, convirtindola en diacetilo, que ulteriormente reacciona con el -naftol y con grupos amino de la peptona, en medio alcalino, para generar un complejo de color rojo.

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Si tras aadir adecuadamente los reactivos se obtiene una coloracin amarillenta o pardusca, se considera un resultado VPnegativo.

Utilizacin de citratos Finalidad Se trata de conocer si la bacteria es capaz de crecer en un medio en el que el citrato constituye la nica fuente de carbono.

Medio de Kosser
Fosfato sdico 1.5 g amnico Fosfato monopotsico 1 g Sulfato magnsico 0.2 g Citrato sdico 2.5 g Azul de bromotimol 0.016 g Agua destilada 1000 ml pH 6.8 El medio fresco (sin inocular) es transparente y de color verde, porque al pH neutro el indicador azul de bromotimol es verde. Tcnica e interpretacin de los resultados (en prcticas se emplea medio lquido)

1. Se inocula la bacteria en un tubo con medio de Kosser. 2. Se incuba 24-72 horas. 3. Los resultados se leen directamente en funcin de la turbidez del medio y del viraje del indicador:

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El primer indicio de que la bacteria es citrato positiva es que haya turbidez patente. Pero la confirmacin depende de que el medio haya virado a color azul. La explicacin es la siguiente: la bacteria C-positiva puede usar el citrato como fuente de carbono debido a una enzima llamada citratoliasa, que forma cido oxalactico (AOA), que se introduce en el Ciclo de Krebs, generando CO2. El CO2 se combina sobre la marcha con agua e iones Na+, produciendo bicarbonato sdico (Na2CO3H), que es basificante. Pero adems, al crecer, la bacteria usa fosfatos, entre ellos sdico amnico, liberando amonio. En resumen, el efecto combinado de que la bacteria vaya retirando citrato (que es cido), y liberando sustancias alcalinas como el bicarbonato sdico y el amonio, hace que el pH del medio suba por encima de 8 u 8.5, con lo cual el indicador vira desde verde a azul. Las bacterias citrato-negativas no pueden crecer en este medio, ya que no cuentan con otra fuente de carbono. Por lo tanto, dejarn el medio transparente y de color verde (sin virar el indicador).

Reduccin de nitratos Finalidad Comprobar si la bacteria a ensayar posee la capacidad de usar nitratos como aceptor final de electrones en sus cadenas de electrones (por lo tanto, se trata de un tipo de respiracin anaerobia). Hay bacterias que pueden usar NO3- como aceptor de electrones alternativo al oxgeno, en una reaccin catalizada por la nitratoreductasa disimilatoria, en la que se produce NO2-, que se acumula en el medio. Incluso hay bacterias (Pseudomonas) que no slo reducen el nitrato a nitrito, sino que poseen una ruta reductora por la que contina la reduccin, desde el nitrito, pasando por xido ntrico (NO), xido nitroso (N2O) y finalmente nitrgeno molecular (N2), en un proceso conocido como desnitrificacin. Las Enterobacterias solo reducen los nitratos a nitritos Medio de cultivo: Agua de peptona adicionada de nitrato potsico al 0.2%. Tubos con 3-4ml con campana de Durham Reactivos Solucin de cido sulfanlico al 0.8% en actico 5 N. Solucin de -naftilamina al 0.5% en actico 5 N. Tcnica y resultados

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1. Inocular el medio con la bacteria a ensayar procedente de cultivo puro, cuidando de no inclinar demasiado el tubo para evitar que entre aire en la campana de Durham. 2. Incubar a 37C durante 24-48 h. 3. Al retirar el tubo tras la incubacin, registrar si se han acumulado o no gases en la campana de Durham. La presencia de una burbuja de gases indica la formacin de N2. 4. Para revelar la prueba respecto de la produccin de nitritos, aadir unas cuantas gotas de solucin de sulfanlico y agitar, y otras cuantas gotas de solucin de -naftilamina, y agitar. 5. Tras unos segundos, si se forma una coloracin roja intensa, esto indica que los reactivos han reaccionado con nitrito, el cual se ha formado por reduccin desasimilatoria de los nitratos del medio (bacteria nitrato-positiva). Si tras aadir los reactivos el medio permanece de color amarillento, la bacteria se considera nitratonegativa. Prueba de la urea Finalidad Se trata de detectar si la bacteria estudiada es capaz de hidrolizar la urea (merced a la enzima ureasa) hasta amonaco y anhdrido carbnico: ureasa CO (NH2)2 + H2O CO2 + 2 NH3 Medio de cultivo Peptona de carne Cloruro sdico Fosfato monopotsico Glucosa Agar Rojo fenol Agua 1g 5g 2g 1g 20 g 6 ml de una solucin al 0.2% 1000 ml

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pH 6.8 a 7 A pH neutro, este medio tiene color amarillo. El indicador rojo fenol tiene la capacidad de virar a rosa a pH alcalino por encima de 8-8.5. El medio sin la urea se funde, se reparte alcuotas de 3 ml en tubos y se esteriliza en autoclave a115C durante 20 min. Luego se enfra y se mantiene en sobrefusin en un bao a 50C. A continuacin se aade a cada tubo 0.3 ml de una solucin acuosa de urea al 20% esterilizada por filtracin (la urea no se puede esterilizar por calor, porque se descompone a altas temperaturas). Los tubos se mezclan, y se dejan solidificar tendidos un pequeo ngulo respecto de la horizontal, para generar la superficie de agar en pico de flauta. Tcnica y resultados

1. Cada tubo se inocula con una bacteria procedente de cultivo puro, por el mtodo de estras en superficie. 2. Se incuba a 37C durante 24-48 h. 3. Los resultados se leen directamente en funcin del viraje o ausencia de viraje del indicador rojo de fenol. Un tubo rosa indica una bacteria ureasa-positiva: al degradar la urea, se produce amonio (que de por s es muy alcalino) y anhdrido carbnico, que al combinarse con agua e iones sodio produce bicarbonato sdico (tambin alcalino), con lo que el pH del medio sube hasta 8 u 8.5, haciendo que el rojo de fenol pase de amarillo a rosa. Un tubo que permanezca amarillo indica una bacteria ureasa-negativa.

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APNDICE: MEDIOS DE CULTIVO El conocimiento de la nutricin microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Como se ha estudiado en las clases tericas, en general, todos los microorganismos tienen parecidos requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, as como la cantidad relativa de cada nutriente. Los microbilogos, en su trabajo cotidiano, estn acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o frmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo. Un medio de cultivo es una solucin acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en la que estn presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). Los medios de cultivo se pueden clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos: 1) Medios complejos o indefinidos: su composicin qumica exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos: Ejemplos: Digeridos Digeridos Digeridos Digeridos crudos de extracto de carne de extracto de levadura de peptona de carne o de soja de casena (de la leche).

Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido qumicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confeccin es fcil y rpida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgnicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que desconocemos la composicin qumica y proporcin exacta de los distintos nutrientes. 2) Medios sintticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias qumicas puras, orgnicas y/o inorgnicas. La composicin concreta de un medio sinttico depender de la bacteria que queramos cultivar: lgicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintticas ser ms sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintticas. En la tabla siguiente se dan las composiciones de sendos medios sintticos para dos bacterias diferentes.

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3) En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio "mezcla" de los anteriores, denominado medio semisinttico: llevan algunas sustancias qumicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composicin indefinidas. Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos elaborar dos tipos de "versiones", segn su estado aparente: medios lquidos (por ejemplo, los dos de la tabla) medios slidos: derivan de los lquidos simplemente aadiendo a la solucin nutritiva un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta solucin. En los primeros tiempos de la Bacteriologa slo se conoca como sustancia gelificante incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que funde a 25oC (por encima de esta temperatura el medio se lica), y adems, muchas bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina. El gelificante ms usado es el agar-agar, extrado de algas rojas (p. ej. Gelidium), del cual existen versiones ms o menos purificadas (las ms puras estn ms enriquecidas en el polisacrido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introduccin de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayora de bacterias, que son mesfilas. En los medios slidos se suele emplear una concentracin de 1.5-2% de agar. Pero hay una categora de medio, llamada semislido o agar blando, que emplea concentraciones menores (0.3-0.5%). Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un gelificante inorgnico, el silicagel o gel de slice. Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al igual que los anteriores, se tratan con la suficiente amplitud en estas sesiones de clases prcticas: Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos slidos que incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas.

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Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o ms tipos de bacterias en funcin de su distinto comportamiento respecto de algn nutriente del medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio. Ejemplos: En el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metablicos de bacterias producen cambios de color y precipitacin de sales cuando producen cidos por fermentacin de ciertas fuentes de carbono. El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la capacidad (y el tipo) de hemolisis de ciertas bacterias. Algunos medios son simultneamente selectivos y diferenciales. p.e. agar de MacConkey, un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal. Es selectivo frente a muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal, y tambin contraselecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las Enterobacterias estn evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hbitat natural (el intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio (aunque no son las nicas capaces de hacerlo). En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de Enterobacterias segn que puedan o no fermentar la lactosa, con produccin de cidos. Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de cidos orgnicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; adems, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenmeno ocasionado por la precipitacin de las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando iones NH4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo.

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