INGENIERA GENTICA.

MANIPULACIN GENTICA TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

Bajo la denominacin de Gentica molecular se engloban procesos y fenmenos relacionado con el material gentico como son la replicacin, transcripcin, traduccin, el cdigo gentico y las mutaciones. La Gentica molecular empieza en 1953 cuando Watson y Crick descubren la estructura del ADN, que es la base de disciplinas absolutamente revolucionarios en la Biologa y podramos decir que en toda la Ciencia. Ms adelante, en 1970 Smith y Wilcox descubren las enzimas de restriccin, Temin y Baltimore descubren la retrotranscripcin, en 1983 K.B Mullis desarrolla la PCR, se desarrollan tcnicas de secuenciacin de ADN, y otras muchas ms. Todas estas tcnicas constituyen la Ingeniera Gentica (= Manipulacin gentica) que permitir manipular el genoma de un ser vivo. Esta manipulacin consiste en: Introducir genes (normalmente de otro ser vivo) en un genoma. Eliminar genes. Modificar su secuencia de bases Secuenciar genes Clonar genes del ADN

Realmente habra que denominar a dichas tcnicas Tecnologa Recombinante, ya que con ellas se obtienen nuevos ADN que no existan.

Si aplicamos estos mtodos y tcnicas a los seres vivos para obtener un producto o servicio, hablamos de BIOTECNOLOGA, que ha experimentado una autntica revolucin gracias a ellos. Por ejemplo, la insulina o la hormona del crecimiento que se inyectan los diabticos hoy da es la humana, pero la fabrican bacterias (E. coli), tambin se puede citar muchas vacunas. Por tanto la Ingeniera Gentica se sita entre la Gentica Molecular y la Biotecnologa. Es decir, para poder fabricar insulina con bacterias antes hay que manipular el gen humano (localizarlo, cortarlo, clonarlo e insertarlo en la bacteria, es decir, hacer ingeniera gentica).

Gentica sirve Molecular de base para la

Manipulacin gentica

se aplica en la

Biotecnologa

Algunos hechos destacables de la I.G. y la biotecnologa son: 1977 Herbert Boyer inserta el gen de la somatostatina en el ADN de E. Coli, 1978 en EE.UU. se logra producir insulina humana en bacterias y en 1983 se comercializa. 1980 Weismann, en Suiza, sintetiza interfern con bacterias. 1982 Se obtienen ratones transgnicos gigantes a partir de vulos a los que se inyect el gen de la hormona del crecimiento. 1984 Obtencin por biotecnologa de la vacuna contra la hepatitis B 1985 Alec Jeffreys, en Gran Bretaa desarrolla la tcnica de la huella gentica , que permite identificar personas a partir de muestras como pelo, sangre, esperma,

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etc. En 1995 sirve para exculpar a un jugador de futbol americano del asesinato de su mujer. 1990 El mdico French Anderson inicia la primera terapia gnica en un nia con una inmunodeficiencia. Comienza el P.G.H. de manera oficial. 1995 Secuenciacin del genoma de la levadura Sacharomyces cerevisiae 1997 Secuenciacin del genoma de la bacteria Escherichia coli 1998 Secuenciacin del genoma del gusano Caenorhabditis elegans, y de las bacterias que producen el tifus y la tuberculosis. 2000 La empresa Celera Genomics anuncia que ha terminado la secuenciacin completa dl genoma humano.

MANIPULACIN DEL ADN El hombre ha manipulado desde siempre el ADN de las especies y as han aparecido variedades de animales domsticos, frutales, cereales, etc., a veces por intercambio entre especies que de forma natural nunca se hubieran cruzado. Ha seleccionado individuos con determinados caracteres y aquellos que les interesaba los ha cruzado de manera selectiva (cruzamientos selectivos.) Es la seleccin artificial. Es un proceso lento y no siempre se obtenan los resultados esperados. Desde el descubrimiento de Watson y Crick hasta 1970 la manipulacin del ADN fue muy difcil. A partir de 1970 irrumpen con extraordinario xito unas tcnicas que permiten manipular y modificar el ADN de los organismos con facilidad. Son las TCNICAS DE INGENIERIA GENTICA o TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE. Sus ventajas, frente a los procedimientos clsicos son muchas: Mucho ms rpido y preciso. Se transmiten slo los genes deseados. Obtencin de productos en mucho mayor cantidad. Gracias estos mtodos podemos obtener fragmentos de ADN idnticos en cantidades ilimitadas (clonacin), determinar la secuencia de los genes, alterarlos, insertar genes de una especie en otra distinta, bien en sus clulas somticas o germinales. Algunas de estas tcnicas son: 1. Tomar o aislar fragmentos especficos de ADN de un organismo, para ello se cortan en puntos concretos. Es decir, fragmentar o cortar el ADN. 2. Unin de fragmentos de ADN. 3. Clonacin del ADN, para tener suficientes copias y estudiarlo mejor, o para que se exprese su protena en grandes cantidades. Se utilizan VECTORES DE CLONACIN. Tambin se puede hacer con la tcnica llamada PCR (Reaction Chain Polymerase = Reaccin en cadena de la Polimerasa.) 4. Insertar un gen en el ADN de otro ser vivo para que se exprese en l, o incluso en sus clulas germinales para que se transmita a la descendencia. Es la transformacin, y el ADN es recombinante. As se obtienen ORGANISMOS MODIFICADOS GENTICAMENTE ( = O.M.G.) o TRANSGNICOS. Para

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insertarlo en la clula husped primero se inserta en unos VECTORES DE TRANSMISIN = DE EXPRESIN. 5. Identificacin y secuenciacin, y modificacin para mejorar el producto, si su producto tiene inters industrial, farmacetico, agrcola, etc.

Para manipular el ADN se utilizan herramientas fundamentales: las enzimas de restriccin o restrictasas (cortan), las ligasas (unen) y los vectores de transmisin (transportan genes y los insertan en ADN distintos, es decir, de otras especies)

1.- OBTENCIN DE FRAGMENTOS DE ADN. CORTE DEL ADN Se puede hacer utilizando dos tipos de enzimas: las enzimas de restriccin y las retrotranscriptasa.

Enzimas de retriccin
En 1970 se descubri que las bacterias tienen un sistema de defensa para eliminar el ADN extrao que les infectaba. Eran unas enzimas que cortaban el ADN en unos puntos concretos de la secuencia (dianas de restriccin, formadas por cuatro u ocho bases). Se denominan enzimas de restriccin, restrictasas o endonucleasas de restriccin. Reconocen puntos concretos del ADN (secuencias palindrmicas o capicas) y lo cortan ah. Actan como tijeras moleculares. Se conocen ms de 100 distintas y cada una corta en una secuencia especfica a cada hebra de ADN. El corte puede ser de dos tipos y as se originan: Extremos romos o lisos, Extremos cohesivos o pegajosos o escalonado, as puede unirse a otros trozos que sean complementarios. Bacteria Tipo de extremo cohesivos cohesivos romos cohesivos cohesivos romos

Enzima

Eco RI Eco RII Bam HI Hae III Hind III Kpn I Sma I Bsu RI

Escherichia coli Escherichia coli Bacillus amyloquefaciens Haemophilus aegyptius Haemophilus influenzae Rd Klebsiella pneumoniae Serratia marcenscens Bacillus subtitlis

Al cortar una molcula de ADN con distintas enzimas de restriccin se obtienen una mezcla de fragmentos de distinto tamao. Los fragmentos obtenidos se pueden separar por un mtodo llamado electroforesis, basndose en la capacidad de desplazamiento en un campo elctrico segn su tamao y de carga elctrica. Las pequeas recorren una distancia

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mayor y las largas menor. Los fragmentos se mueven sobre una lmina de gel de agarosa. Despus se tien con un colorante y se obtienen una bandas. Cada banda corresponde a un tamao medido en pares de bases. El tamao de los fragmentos se suele expresar en KILOBASES (1000 nucletidos) si son cadenas monocatenarias, o 1000 pares de bases si se habla de bicatenarias. Si el tamao es inferior a 1000 bases se habla de bases o pares de bases.

Transcriptasa inversa
Tambin se puede obtener el fragmento de ADN, en este caso ADN estructural, es decir, que codifica una protena o enzima, si se conoce su secuencia de aminocidos o la de su ARNm (ste se sintetiza in vitro o se asla de la clula por hibridacin). Una vez aislado, la transcriptasa inversa lee este ARNm y sintetiza se obtiene el ADN que lo codifica, llamado ADNc o complementario, que es un ADN sin intrones. Este mtodo es muy importante si el gen que se introduce es de eucariontes y se introduce en una bacteria. El gen introducido no tiene intrones.

HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS Por medio de la hibridacin de cidos nucleicos podemos localizar genes en el ADN. Hibridamos el ARNm sin intrones con el ADN y con fluorescencia o autorradiografa (istopos) localizamos el gen en el cromosoma. CLONACIN DEL ADN Para manipular el ADN es necesario disponer de una gran cantidad de molculas. Esto se consigue con la clonacin. Se puede hacer de dos formas: Clonacin molecular o gnica, utilizando clulas. Amplificacin por PCR, sin utilizar clulas.

Clonacin molecular o gnica

La clonacin molecular se hace utilizando clulas hospedadoras, bacterias normalmente. Es decir, se inserta el ADN deseado en su ADN y cuando la bacteria se reproduzca har mltiples copias de ese ADN. Para ello, una vez aislado el ADN hay que insertarlo en el ADN bacteriano. Para ello se utilizan los vectores de clonacin o de clonado. Estos vectores son pequeos molculas de ADN que tienen capacidad de autorreplicacin independientemente del ADN de la clula husped, como plsmidos, bacterifagos y csmidos. El gen deseado hay que insertarlo primero en estos vectores. Estos vectores llevan adems unos genes llamados marcadores que sirven para detectar o identificar las clulas que han incorporado los vectores. Estos marcadores son genes de resistencia a antibiticos (si se inserta en una bacteria) o genes de bioluminiscencia (si se inserta en una eucarionte). Los plsmidos naturales no tienen estos marcadores, sino que se aaden artificialmente. INGENIERA GENTICA 4

Cmo se inserta el vector en el ADN de la clula husped? Se corta el ADN del vector y el que contiene el gen deseado con la misma restrictasa y luego se unen con la ligasa. As tenemos un ADN recombinante, ya que procede de dos molculas distintas. La introduccin de un ADN extrao en bacterias, ya sea de forma natural o por vectores, se llama transformacin. Si el vector es un virus, la transformacin se llama transduccin. Si se hace en eucarionte se llama transfeccin, y si se inserta en las clulas germinales de estos se llama transgnesis y los descendientes de estos organismos, transgnicos o modificados genticamente (OMG). Por ejemplo, uno de los vectores ms utilizados en plantas es la bacteria Agrobacterium tumafaciens, y en clulas animales, el virus SV40. Una vez que las bacterias se han transformado, se las pasa a un medio de cultivo para que se multipliquen. Al mismo tiempo se replican los vectores de clonado y as se obtienen mltiples copias del gen deseado. Cada grupo de bacterias que procedan de una sola, llevarn ese vector y ese gen, constituye un clon. As se obtienen tantos clones como fragmentos de ADN se hayan insertado en las bacterias. El conjunto de clones obtenido se llama biblioteca genmica o genotecas. SELECCIN DE CLONES o TRANSFORMANTES De todos los clones obtenidos slo uno portar el gen deseado. Cmo se localiza o se extrae de la biblioteca genmica?. Es decir, hay que localizar un fragmento de ADN, que est dentro de una clula. El mtodo depende del vector utilizado: Transfiriendo los clones a cultivos con antibiticos. El que sobreviva es el que porta el marcador de resistencia. Otro mtodo muy usado es la hibridacin de cidos nucleicos, utilizando una sonda.

La sonda es un fragmento de ADN o ARN de cadena sencilla complementaria a la secuencia del fragmento que queremos localizar. Esta sonda puede ser:

El ARNm correspondiente a la protena que codifica el en buscado, y que se ha sintetizado in vitro. Un ADN llamado complementario (ADNc), obtenido a partir del ARNm por la transcriptasa inversa.

La sonda lleva una molcula (reporter) que puede un istopo radioactivo o una sustancia fluorescente. Sirve para verla por medio de autorradiografa (si lleva istopos) o con microcosopio de florescencia si lleva sustancia fluorescente. VER PGINA 215 BRUO. La sonda se aade al conjunto de clones y se espera que hibride. Si se quiere clonar el gen de la insulina humana y luego secuenciarlo, la sonda se prepara a partir de clulas del pncreas. Se asla de ellas el ARNm de la insulina, luego con la transcriptasa inversa (y con nucletidos marcados con istopos radiactivos) se obtiene el ADNc, que contiene nicamente secuencias codificantes, sin intrones porque procede del ARNm maduro.

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BIBLIOTECAS DE ADNc Y VECTORES DE EXPRESIN VER BRUO PAGINA 216

Podemos obtener genes sin intrones.

MTODO ACTUAL DE CLONACIN DE ADN. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.

AMPLIFICACIN

DEL

ADN.

Para manipular el DNA se necesita grandes cantidades. En la actualidad se clona ADN sin necesidad de utilizar clulas, por tanto in vitro, con un mtodo desarrollado en 1983 por K.B. Mullis, denominado Reaccin en Cadena de la Polimerasa, (Polymerase Chain Reaction o PCR). Es una tcnica mucho ms rpida y productiva: a partir de una sola cadena de DNA en una tarde se pueden obtener hasta 100.000 millones de molculas idnticas. El mecanismo es el mismo que utilizan las clulas cuando replican el DNA. Es decir, reproduce in vitro lo que ocurre dentro de la clula. Se utiliza la DNA polimerasa, que a partir de una cadena molde fabricar dos cadenas hijas idnticas. Para esto hay que suministrarlas:

La cadena molde, que es una de las cadenas de la doble hlice Desoxirribonucletidos Cebador

El mecanismo es simple: consiste en repetir ciclos de sntesis. Cada ciclo consta de: 1. Desnaturalizacin de la doble cadena a copiar, con temperaturas altas. Cada hebra sencilla servir de molde. 2. Lectura de la hebra molde 3. Incorporacin de nucletidos 4. Mantener temperatura muy elevada durante todo el proceso De esta manera, en el primer ciclo se obtienen dos cadenas, en el segundo, cuatro, en el tercero 8, etc. El nmero de molculas obtenidas se obtiene por esta frmula N = 2 n donde n es el nmero de ciclos realizados. Cada ciclo equivale a una replicacin. As al cabo de 20 ciclos se obtienen 1048576 molculas de ADN. Cada ciclo dura unos 5 minutos, ya para que se obtenga una amplificacin til se necesita 20 ciclos. Hoy da se hace de manera automatizada. La DNA polimerasa utilizada al principio era la de Escherichia coli. Pero al elevar la temperatura para la desnaturalizacin del DNA la enzima se desnaturalizaba y haba que reponerla en cada ciclo. Esto encareca y ralentizaba el proceso. Esto se solucion al descubrirse las bacterias termfilas (extremfilas) que vivan en aguas termales, cuyas protenas soportan temperaturas elevadas. Se utiliz la polimerasa de Thermus aquaticus, que soportaba hasta 95 C. Esta polimerasa se denomin Taq polimerasa.

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La PCR tiene varias aplicaciones: en criminologa sirve para obtener copias de la muestra de ADN de los sospechosos (huella gentica), pruebas de paternidad, y recuperacin de ADNs de especies extinguidas o a punto de extinguirse (lince, oso, bucardo, etc).

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