MICROORGANISMOS Y

BIOTECNOLOGÍA

Dra. M. E. Arias Fernández

Dpto. Microbiología y Parasitología
E-mail: enriqueta.arias@uah.es

PROGRAMA
•• Introducción
Introducción aa la la Biotecnología
Biotecnología


Hitos
Hitos importantes
importantes

Microorganismos

Microorganismos de
de interés
interés biotecnológico
biotecnológico

Mejora

Mejora de
de cepas
cepas

•• Sistemas
Sistemas de
de fermentación:
fermentación: biorreactores
biorreactores



El
El problema
problema del
del escalado
escalado de
de procesos
procesos

•• Industrias
Industrias de
de propagación:
propagación:

Producción

Producción de
de biomasa
biomasa como
como fuente
fuente proteínas
proteínas (SCP)
(SCP)

Producción

Producción de
de vacunas
vacunas

•• Industrias
Industrias de
de fermentación:
fermentación:

Producción

Producción de
de metabolitos
metabolitos primarios:
primarios: bioetanol,
bioetanol, aminoácidos,
aminoácidos,
ácido
ácido cítrico.
cítrico.

Producción

Producción de
de metabolitos
metabolitos secundarios:
secundarios: los
los antibioticos
antibioticos

Producción

Producción de
de enzimas
enzimas

Producción

Producción de
de bebidas
bebidas alcohólicas
alcohólicas

1
 ¿Qué
¿Qué es
es la
la Biotecnología?
Biotecnología?

BIOTECNOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA es es elel uso
uso integrado
integrado de de la
la
bioquímica,
bioquímica, microbiología
microbiología yy ciencias
ciencias dede la
la
ingeniería
ingeniería para
para lograr
lograr la
la aplicación
aplicación
tecnológica
tecnológica (industrial)
(industrial) dede las
las capacidades
capacidades de de
los
los microorganismos,
microorganismos, célulascélulas animales
animales yy
vegetales
vegetales y/o
y/o fracciones
fracciones subcelulares
subcelulares
derivadas
derivadas de
de ellos.
ellos.

Federación
Federación Europea
Europea de
de Biotecnología
Biotecnología

HITOS
HITOS IMPORTANTES
IMPORTANTES
1.-
1.- Biotecnología empírica: Producción
Biotecnología empírica: Producción de
de alimentos
alimentos yy
bebidas
bebidas (6000-4000
(6000-4000 ac)
ac)

2.-
2.- Louis Pasteur: “el
Louis Pasteur: “el padre
padre de
de la
la Biotecnología”
Biotecnología”
1857:
1857: Microbiología
Microbiología de
de las
las bacterias
bacterias lácticas
lácticas
1860:
1860: Papel
Papel de de las
las levaduras
levaduras en en lala fermentación
fermentación
alcohólica
alcohólica

3.-
3.- Finales
Finales S.
S. XIX-principios
XIX-principios S. XX: Procesos
S. XX: Procesos biotecnológicos
biotecnológicos
desarrollados
desarrollados enen condiciones
condiciones no
no estériles
estériles (acetona,
(acetona,
butanol,
butanol, etanol).
etanol).
Tratamiento
Tratamiento dede aguas
aguas residuales
residuales yy compostaje.
compostaje.

4.-
4.- 1929:
1929: Descubrimiento
Descubrimiento de
de la
la penicilina
penicilina (Fleming)
(Fleming)
1940:Introducción
1940:Introducción de de la la esterilidad
esterilidad en en procesos
procesos
biotecnológicos:
biotecnológicos: antibióticos,
antibióticos, aminoácidos,
aminoácidos, etc.
etc.

5.-
5.- Biotecnología actual: Introducción
Biotecnología actual: Introducción dede la
la tecnología
tecnología del
del ADN
ADN
recombinante
recombinante yy utilización
utilización de
de microorganismos
microorganismos
genéticamente
genéticamente modificados
modificados

2
 MICROORGANISMOS
MICROORGANISMOS DE
DE INTERÉS
INTERÉS INDUSTRIAL
INDUSTRIAL
LEVADURAS
LEVADURAS YY ACTINOBACTERIAS
ACTINOBACTERIAS
HONGOS
HONGOS FILAMENTOSOS
FILAMENTOSOS
Saccharomyces

Penicillium
Streptomyces

Aspergillus BACTERIAS
BACTERIAS

Leuconostoc
FACTORÍA CELULAR Bacillus

Lactobacillus
Azúcares

Biocombustibles, Metabolitos
Enzimas, etc.

PRINCIPALES ETAPAS DE UN PROCESO DE

PRODUCCION
• Búsqueda y selección de microorganismos (“Screening”)
• Organismos mesófilos
• Organismos extremófilos
SI BIEN LOS MICROORGANISMOS SON BUENOS PRODUCTORES DE UNA GRAN VARIEDAD DE
COMPUESTOS, LOS PRODUCEN EN BAJA CANTIDAD, POR LO QUE SE REQUIERE :

• Aumentar los rendimientos mediante:

• Obtención de mutantes (técnicas de mutagénesis, recombinación
genética, fusión de protoplastos)
• Empleo de tecnología de DNA recombinante (para aumento de la
dosis genética de enzimas claves, utilización de nuevos sustratos, etc).
• Diseño y selección de medios de cultivo que maximicen la producción,
disminuyan los costos o faciliten la recuperación de productos.
• Diseño y selección de las condiciones y sistemas de cultivo más
convenientes

3
 MEJORA
MEJORA DE
DE CEPAS
CEPAS
 CICLOS
 CICLOS DE
DE MUTACIÓN-SELECCIÓN
MUTACIÓN-SELECCIÓN

INTERCAMBIO DE
INTERCAMBIO DE INFORMACIÓN
INFORMACIÓN GENÉTICA
GENÉTICA NATURAL
NATURAL

Reproducción

Reproducción sexual
sexual en
en eucariotas
eucariotas

Transferencia

Transferencia horizontal
horizontal en
en bacterias:
bacterias: transformación,
transformación, transducción,
transducción, conjugación
conjugación

TECNOLOGÍA DEL
TECNOLOGÍA DEL ADN
ADN RECOMBINANTE
RECOMBINANTE

Mutagénesis

Mutagénesis dirigida
dirigida

Fusión

Fusión de
de protoplastos
protoplastos

Ingeniería

Ingeniería genética:
genética: requisitos
requisitos

Aislamiento

Aislamiento yy purificación
purificación de
de ácidos
ácidos nucleicos
nucleicos

Fragmentación

Fragmentación yy ligación
ligación de
de fragmentos
fragmentos de
de ADN
ADN

Vectores

Vectores (plásmidos,
(plásmidos, fagos,
fagos, cósmidos)
cósmidos)

Introducción

Introducción del
del ADN
ADN recombinante
recombinante en
en el
el hospedador
hospedador

PCR

PCR yy secuenciación
secuenciación

 GENÓMICA:
 GENÓMICA: secuenciación
secuenciación de
de genomas
genomas completos
completos

 PROTEÓMICA:
 PROTEÓMICA: electroforesis
electroforesis bidimensional
bidimensional yy técnicas
técnicas de
de secuenciación
secuenciación de
de péptidos
péptidos basadas
basadas
en
en estreptometría
estreptometría de
de masas
masas

PRODUCTOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO

CÉLULAS BIOCONVERSIÓN PRODUCTOS DE

LAS CÉLULAS

ENZIMAS
PRODUCTOS
(Glucosa QUÍMICOS
(Ac. Cítrico)
Isomerasa)

ANTIBIÓTICOS
ETANOL
(Penicilina)

LEVADURAS PRODUCTO ADITIVOS

(Esteroides) ALIMENTARIOS
(Aminoácidos)

4
 Biorreactor
Biorreactor agitado
agitado

ESQUEMA DE UN PROCESO BIOTECNOLÓGICO

Etapas
Etapas en
en el
el desarrollo
desarrollo de
de un
un bioproceso
bioproceso para
para la
la producción
producción comercial
comercial de
de un
un producto
producto
obtenido
obtenido mediante
mediante tecnología
tecnología del
del ADN
ADN recombinante
recombinante

GENÉTICA
GENÉTICA

FERMENTACIÓN
FERMENTACIÓN PURIFICACIÓN
PURIFICACIÓN

5
 PRODUCCIÓN DE SCP

 Causas
 Causas que
que promovieron
promovieron su
su interés
interés

Escasez de

Escasez de proteínas
proteínas en
en la
la nutrición
nutrición de
de países
países en
en desarrollo
desarrollo

Necesidad de

Necesidad de combatir
combatir contaminación
contaminación causada
causada por
por residuos
residuos
industriales
industriales

Capacidad de

Capacidad de los
los microorganismos
microorganismos para
para oxidar
oxidar fracciones
fracciones del
del
petróleo
petróleo

 Microorganismos
 Microorganismos como
como fuente
fuente de
de proteínas
proteínas

Algas

Algas (Spirulina,
(Spirulina, Chorella,
Chorella, Scenedesmus)
Scenedesmus)

Levaduras

Levaduras (Candida,
(Candida, Saccharomyces)
Saccharomyces)

Hongos

Hongos filamentosos
filamentosos (Fusarium,
(Fusarium, Paecilomyces, Lentinus, etc..)
Paecilomyces, Lentinus, etc..)

Bacterias

Bacterias (metilotrofas)
(metilotrofas)

FUENTES DE CARBONO UTILIZADAS PARA LA

PRODUCCIÓN DE SCP

Fuentes

Fuentes de
de carbono
carbono fósiles:
fósiles:
•• Hidrocarburos
Hidrocarburos
•• Metanol
Metanol
•• Etanol
Etanol

Fuentes

Fuentes de
de carbono
carbono renovables
renovables
•• CO
CO22
•• Melazas
Melazas
•• Lactosuero
Lactosuero
•• Efluentes
Efluentes industriales
industriales
•• Residuos
Residuos sólidos:
sólidos: lignocelulosa
lignocelulosa

Proceso “Pruteen”

6
ESQUEMA
ESQUEMA DEL
DEL PROCESO
PROCESO DE
DE FERMENTACIÓN
FERMENTACIÓN EN
EN ESTADO
ESTADO SÓLIDO
SÓLIDO (SSF)
(SSF)
DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS Y MADERA
DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS Y MADERA

MATERIA
MATERIA PRIMA
PRIMA
Streptomyces

MADERA
 % humedad
 aw
Degradación de

Degradación de lignina
lignina
 Tamaño de partícula

Incremento de de la
SSF  Tiempo y Tª de incubación
Incremento la
Streptomyces  Pretratamiento del sustrato digestibilidad
digestibilidad
Streptomyces  Optimización del inóculo
 ...
Incremento de

Incremento de proteínas
proteínas

PAJA DE TRIGO

PROBLEMAS QUE PLANTEA EL CONSUMO DE SCP

Presencia

Presencia de
de pared
pared celular
celular indigerible
indigerible

Alto

Alto contenido
contenido en
en ácidos
ácidos nucleicos
nucleicos

Color,

Color, sabor
sabor u
u olor
olor desagradables
desagradables

Necesidad

Necesidad de
de controles
controles rigurosos
rigurosos
•• Poder
Poder nutritivo
nutritivo
•• Toxicidad
Toxicidad
•• Características
Características organolépticas
organolépticas

Necesidad

Necesidad de
de fuente
fuente de
de carbono
carbono barata
barata Micoproteína

Fermentadores

Fermentadores de
de material
material no
no tóxico
tóxico

Proceso

Proceso de
de extracción
extracción yy purificación
purificación debe
debe ser
ser sencillo
sencillo

Competencia

Competencia con
con proteínas
proteínas de
de la
la soja
soja yy del
del pescado
pescado

7
PRODUCCIÓN DE BIOMASA DE LEVADURAS

VACUNAS

8
 INFECCIONES
INFECCIONESEMERGENTES
EMERGENTES YY RE-EMERGENTES
RE-EMERGENTES
Nuevas enfermedades emergentes
Tuberculosis MDR
Enfermedades re-emergentes Difteria
SARS

vCJD Fiebre tifoidea S. aureus resistente a

S. aureus resistente a vancomicina
vancomicina Cólera
E. coli O157:H7

E. coli O157:H7
Gripe H5N1

Malaria MDR

S. aureus resistente a
vancomicina

Hantavirus

Dengue Hepatitis c

Cólera Fiebre Lassa SIDA

Fiebre amarilla Fiebre amarilla Peste Ébola
Hantavirus Malaria MDR
Cólera

¿CÓMO
¿CÓMO SE
SE DESARROLLA
DESARROLLA UNA
UNA VACUNA?
VACUNA?

6
5
4
3

2
1
4- DNA desnudo
1- Microorganismo atenuado
5- Sub-unidades superficie o
2- Microorganismo inactivado
péptidos sintéticos
3- Vector vivo recombinante
6- Proteína recombinante

9
 PRODUCCIÓN DE VACUNAS ATENUADAS

VACUNAS CONSTITUIDAS POR ANTÍGENOS PURIFICADOS

TOXOIDES: toxinas

TOXOIDES: toxinas inactivadas
inactivadas (tetánico,
(tetánico, diftérico)
diftérico)

FRACCIONES VIRALES

FRACCIONES VIRALES OBTENIDAS
OBTENIDAS DE
DE LA
LA ENVOLTURA
ENVOLTURA
DEL
DEL VIRUS:
VIRUS: gripe
gripe

POLISACÁRIDOS DE

POLISACÁRIDOS DE LA
LA CÁPSULA:
CÁPSULA: neumococo
neumococo

POLISACÁRIDOS CAPSULARES

POLISACÁRIDOS CAPSULARES CONJUGADOS
CONJUGADOS CON CON
PROTEÍNAS
PROTEÍNAS ANTIGÉNICAS:
ANTIGÉNICAS: meningococo,
meningococo, neumococo
neumococo

FRACCIONES BACTERIANAS:

FRACCIONES BACTERIANAS: tos
tos ferina
ferina

ANTÍGENOS MICROBIANOS

ANTÍGENOS MICROBIANOS RECOMBINANTES:
RECOMBINANTES: Antígeno
Antígeno
HBs
HBs del
del virus
virus de
de la
la hepatitis
hepatitis B
B

10
VACUNAS VIVAS RECOMBINANTES

VACUNAS DE ADN DESNUDO

11
VACUNAS COMESTIBLES

METABOLITOS
PRIMARIOS

12
 Diferencias entre metabolismo primario y
secundario

etanol penicilina

metabolito

Etanol
Producido
Producido por
por ::
1-
1- Levaduras
Levaduras
** Saccharomyces
Saccharomyces (a (a partir
partir de
de hexosas)
hexosas)
** Kluyveromyces fragilis (a
Kluyveromyces fragilis (a partir
partir de
de
lactosa)
lactosa)
** Candida
Candida oo Pichia
Pichia (a
(a partir
partir de
de
pentosas)
pentosas)

2-
2- Bacterias-
Bacterias-
** Clostridium
Clostridium (a
(a partir de celulosa)
partir de celulosa)
(termófilos,
(termófilos, anaerobios)
anaerobios)
** Zymomonas
Zymomonas mobilis
mobilis

3- Recombinantes-
3- Recombinantes-
E.coli recombinante:
E.coli recombinante: Introducción
Introducción de
de
los
los genes
genes Alcohol
Alcohol deshidrogenasa
deshidrogenasa yy
piruvato
piruvato decarboxilasa
decarboxilasa de
de Zymomonas.
Zymomonas.

Piruvato acetaldehido etanol

13
 PRODUCCIÓN DE BIOETANOL

Producción de ácido cítrico (400x1066 Tm/año)

Ácido
Ácido
cítrico
cítrico

Aplicaciones
Aplicaciones
•• Industria
Industria alimentaria
alimentaria (aditivo)
(aditivo)
•• Bebidas
Bebidas refrescantes
refrescantes
•• Industria
Industria química
química
•• Industria
Industria farmacéutica
farmacéutica

14
 Aminoácidos

Principales microorganismos
productores: Corynebacterium
Corynebacterium yy
Brevibacterium
Brevibacterium

Cepas super-productoras:
• Mutantes
Mutantes auxotrofos
auxotrofos yy regulatorios
regulatorios
• Mutantes
Mutantes alterados
alterados en
en la
la secreción
secreción
• Cepas
Cepas recombinantes
recombinantes

Principales productos:
• Acido
Acido glutámico:
glutámico: 600,000
600,000 Tm/Tm/ año
año
(U$S
(U$S 915
915 millones)
millones)
•• Lisina
Lisina :: U$S
U$S 500
500 millones
millones
•• Fenil
Fenil alanina:
alanina: U$S
U$S 200
200 millones
millones
•• Aspartato:
Aspartato: U$S
U$S 4343 millones
millones

PRODUCCIÓN DE LISINA POR

Brevibacterium flavum

Vitaminas
Vitamina B12-
Microorganismos productores: Bacterias de las
especies Propionibacterium shermani y
Pseudomonas denitrificans.
Producción: 150 mg/ L.

Biotina-
Microorganismo productor: cepas
modificadas (mutantes) de Serratia
marcescens.Producción: 150-600 mg/ L.

Vitamina B2 (Riboflavina)-
Microorganismos productores: -hongos
(Eremothecium ashbyi y Ashbya gossypii)
Candida sp
Bacillus subtilis recombinante
Producción: 20 -30 g/ L

15
 METABOLITOS
SECUNDARIOS

ANTIBIÓTICOS

Desde 1940 se han introducido
una gran variedad de moléculas con
actividad antibiótico para su uso en
medicina y agricultura.

En el mercado hay 160 antibióticos

en uso

Se han descrito 6.000 antibióticos de

los cuales 4.000 se han aislado de
Actinomycetes, y se describen
alrededor de 500 antibióticos nuevos
por año. Una sola cepa de
Streptomyces hygroscopicus produce
aproximadamente 200 antibióticos

Muchos nuevos antibióticos se

obtienen por semi-sintesis, es decir,
por modificacion de antibioticos
existentes

16
AISLAMIENTO
AISLAMIENTO DE
DE MICROORGANISMOS
MICROORGANISMOS PRODUCTORES
PRODUCTORES DE
DE ANTIBIÓTICOS
ANTIBIÓTICOS

PRODUCCIÓN DE PENICILINAS

17
 BIOCONVERSIÓN

PRODUCCIÓN DE CORTISONA

PRODUCCIÓN DE VITAMINA C

Reducción Acetobacter
Acetobacter oxidación
catalítica suboxydans
suboxydans
Glucosa D-sorbitol L-sorbosa
ácido ascórbico (vitamina C)

18
 PRODUCCIÓN DE
PROTEÍNAS ANIMALES
EN
MICROORGANISMOS

Primera Insulina recombinante humana

Human gene library was screened

and INS
El gene
El gen
gen desubcloned
de la
la insulina into a plasmid
insulina humana
humana fue expression
fue aislado
aislado clonadovector
yy clonado
en
en un
un plásmido
using lac
plásmido con
con el
el que se
que to
operon transformó
se promote
transformótranscription
Escherichia
Escherichia coli
coli

Expression
La
La insulina se in
insulina se E. coliyyresulted
expresó
expresó se in en
se acumuló
acumuló inclusion
en los bodies
los cuerpos
cuerpos de
de
inclusión
inclusión
packed full of insulin
El Isolation of
El aislamiento
aislamiento deinsulin
de la from
la insulina
insulina deinclusion
de los bodies
los cuerpos
cuerpos de
de inclusión
inclusión
is timelyes lento
es and yy caro
lentoexpensive
caro

http://www.apsu.edu/reedr/Reed%20Web%20Pages/Chem%204310/Lectures/recomb1.jpg

19
 Humilin (Eli Lilly, 1986) –
first industrially
Primera
Primera insulina produced
insulina humana
humana producidahuman
producida insulin
comercialmente
comercialmente

24 aaSe
Signal
Se peptide
añadió
añadió un leader
un péptido
péptido was
señal
señal added
líder
líder de
de 24 αααα5’ end.
24to

Se
secretion of insulin consiguió
Se into la
culture
consiguió la secreción de
de la
medium instead
secreción la insulina
of its retention inside
insulina
inclusion bodies en
en el
el medio
medio de
de cultivo
cultivo

ASe
chain
Se synthesized
sintetizaron
sintetizaron las in one
las cadenas
cadenas A yy B
A E. de
de la
Bcoli strain
la insulina
insulina por
por
separado
separado en
B chain synthesized inEscherichia
en a different coli
Escherichia E. coli strain
coli

Una
Una vez
vez purificadas
Chainspurificadas ambas
ambas
are purified cadenas se
se unieron
cadenas then
separately joinedquímicamente
unieron químicamente
together

Bebidas alcohólicas
• Productos

– Cervezas
– Vinos

20
ETAPAS DE LA ELABORACIÓN DE LA
CERVEZA

ETAPAS DE LA ELABORACIÓN DEL

VINO

21
 PRINCIPALES PRODUCTOS
PRODUCTO
PRODUCTO ORGANISMO
ORGANISMO PRODUCCION
PRODUCCION
(Ton/año)
(Ton/año)
Solventes
Solventes
Etanol
Etanol Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae
cerevisiae 20
20 millones
millones
Acetona/butanol
Acetona/butanol Clostridium
Clostridium acetobutylicum
acetobutylicum 2000
2000

Biomasa
Biomasa
Starters
Starters para
para alimentos
alimentos Levaduras
Levaduras yy bacterias
bacterias lacticas
lacticas 500,000
500,000
Proteina
Proteina unicelular
unicelular Candida
Candida utilis
utilis 50,000
50,000

Acidos
Acidos organicos
organicos
Acido
Acido citrico
citrico Aspergillus
Aspergillus niger
niger 250,000
250,000
Acido
Acido gluconico
gluconico Aspergillus
Aspergillus niger
niger 50,000
50,000
Acido
Acido lactico
lactico Lactobacillus
Lactobacillus delbrueckii
delbrueckii 50,000
50,000

Aminoacidos
Aminoacidos
Acido
Acido glutamico
glutamico Corynebacterium
Corynebacterium glutamicum
glutamicum 300,000
300,000
Lisina
Lisina Brevibacterium
Brevibacterium flavum
flavum 30,000
30,000
Fenilalanina
Fenilalanina Corynebacterium
Corynebacterium glutamicum
glutamicum 2000
2000
arginina
arginina Brevibacterium
Brevibacterium flavum
flavum 1000
1000

PRODUCTO ORGANISMO PRODUCCION

(Ton/año)

Pigmentos
Shikoninas Lithospermum (plantas) < 0.1
Beta-carotenos Levaduras

Proteinas de uso terapéutico

Insulina E. coli recombinante < 0.1
Hormona de crecimiento E. coli recombinante o celulas de
Eritropoyetina mamífero recombinante
FactorVIII-C celulas de mamífero recombinante
Activador del plasminogeno celulas de mamífero recombinante
Interferon alfa2 E. coli recombinante

Antibioticos
Penicilinas Penicillum chrysogenum 80,000
Cefalosporinas Cephalosporium acremonium 15,000
Tetraciclinas Streptomyces aureofaciens 15,000
Macrolidos (eritromicina) Streptomyces erythreus 10,000
Polipeptidicos (gramicidina) Bacillus brevis 2,000
Aminoglicosidos (estreptomicina) Streptomyces griseus 1,000
Aromáticos (griseofulvina) Penicillum griseofulvum

Insecticidas
Esporas bacterianas Bacillus thuringiensis < 0.1
Anticuerpos monoclonales Celulas de hibridoma < 0..01

22
PRODUCTO ORGANISMO PRODUCCION
(Ton/año)
Enzimas
Proteasas Bacillus spp 600
Alfa-Amilasas Bacillus amyloliquefasciens 500
Glucoa-amilasa Aspergillus niger 500
Glucosa isomerasa Bacillus coagulans 500
Pectinasa Aspergillus niger 100
Renina Mucor o levaduras recombinantes 50
otras 50
Vitaminas
B12 Propionibacterium shermanii 10
Riboflavina Eremothecium ashbyii

Vacunas
Difteria Corynebacterium diphteriae < 0.1
Tetanos Clostridium tetani
Pertussis Bordetella pertussis
Polio Virus atenuado crecido en riñon de mono
o celulas diploides humanas
Rubéola Idem anterior
Hepatitis B Antigenos de superficie expresados en
levadura

Alcaloides del ergot Claviceps paspali 5

23