anLO aboot v > re 5 (54 EF] Sourier CEFN yjHistologia y Embriologia del ser humano Bases celulares y moleculares 4° EDICION Aldo R. Eynard Médico, Doctor en Medicina Profesor Titular de Biologia Celular, Histologia y Embriologia (Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cérdoba, Argentina), Investigador Principal del Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Técnicas (CONICET, Argentina) kG eo Fi Sourier FCEFyN finales, parciales y libros de ingenieri EDITORIAL MEDICA, Cc panamericana ) BUENOS AIRES - BOGOTA - CARACAS - MADRID - MEXICO - PORTO ALEGRE e-mail: info@medicapanamericana.com www.medicapanamericana.comindice general Prélogo 1 ix Prélogo 2 xi Prefacio xv PARTE 1 Un enfoque evolutivo de la célu' Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich ELCAMINO HACIA LA PROTOCELULA DELOS PROCARIONTES A LOS FUCARIONTES: LA GANANCIA DECOMPARTIMIENTOS COMPARTIMIENTOS Y FUNCIONES: LA MEMBRANA CELULAR _5 NIVELES DE ORGANIZACION CELULAR 8 EL ESTUDIO DE CELULAS Y TEJIDOS, SU RELACION CON OTRAS AREAS BIOMEDICAS Capitulo 1 Métodos generales para el estudio de las células y los tejidos 10 Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich Resumen conceptual 10 ‘TECNICA CITOHISTOLOGICA Y MICROSCOPIAS —__11 Técnica citohistolégica n Técnicas citoquimicas 4 ‘Técnicas inmunocitoquimicas v7 Microscopias 20 Bisuiocraria y LECTURAS ADICIONALES 8 PAGinas wep AUTOEVALUACION Capitulo 2 ELmi ; inn di Mirta A. Valentich, Guillermina A. Bongiooanni y Roberto A. Rovasio Resumen conceptual 33 COMPONENTES NUCLEARES 8S ‘Envoltura nuclear 00S Recuadro 2-1 Proyecto Genoma Humano Recuadro 2-2 Longitud de la cadena de DNA Cromatina 36 36HUMANOS a Recuadro 2-4 Telomerasa y terapia génica 42 CONCEPTOS GENERALES DE GENETICA Y HERENCIA 42 Caracteristicas quimicas del DNA 42 Recuadro 2-5 Mendel, el padre de la genética moderna 42 Claves del cédigo genético y transferencia de la informacién 43 Recuadro 2-6 Pruebas de la universalidad del cédigo genético 44 Proliferacién y renovacién celular 46 Etapas del ciclo celular 47 Recuadro 2-7 Envejecimiento celular 48 Métodos basicos para el estudio cromosémico 52 Técnicas de biologia molecular para manipulacién de genes (o tecnologia de DNA recombinante o métodos de ingenieria genética) 55 Recuadro 2:8 Seleccion de embriones sanos —__56 Recuadro 2-9 Propésitos rs | ‘ivas de la ingenieria genética 56 Recuadro 2-10 Genomas de diferentes especies 59 Recuadro 2-11 Localizacion de un gen 60, Aplicaciones de la tecnologia del DNA en la investigacién basica 60 Recuadro 2-12 Diferentes tipos de genotecas 61 Recuadro 2-13 PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) _62 Recuadro 2-14 Aplicaciones y proyeccion de la tecnologia del DNA Aplicaciones y proyeccién médica de las técnicas de DNA recombinante _65 Recuadro 2-15 Estrategia del RNA de interferencia (RNA) 66 Recuadro 2-16 Identificacién de personas 67 Recuadro 2-17 Terapia génica en el tratamiento del cancer 68 Busuiocraria y LECTURAS ADICIONALES CD Pécinaswen gg AUTOEVALUACION 08 Capitulo 3 Lineas de montaje, transito y destino de macromoléculas ymembranas para exportacién y para uso interno 2 Mirta A. Valentich y R. Olga Calderén Resumen conceptual 2 RET{CULO ENDOPLASMATICO RUGOSO (RER) __73Recuadro 3-1 Desintoxicacién, salud y enfermedad 5 SINTESIS DE PROTEINAS, LiPIDOS Y GLUCOCONJUGADOS 7 Duplicacién o replicacién del DNA 7 ‘Transcripcién 78 Traduccign LISOSOMAS Y EL COMPLEJO DEL PROTEOSOMA_ 81 Los lisosomas Recuadro 3-2 Enfermedades de origen lisosémico 83 El complejo de los proteosomas 87 Recuadro 3-3 Proteosomas y enfermedades neurodegenerativas 87 BiuioGraria y LECTURAS ADICIONALES 8 Capitulo 4 Evolucién de las fuentes de energia y su transformacion 90 Mirta A. Valentich y R. Olga Calderén Resumen conceptual 90 PEROXISOMAS Recuadro 4-1 Mutaciones y alteraciones peroxisémicas 2 Recuadro 4-2 Enfermedades peroxisémicas 93 MITOCONDRIAS 0 D - . Oxidacién mi 5 R 3 ava ; A Recuadro 4-4 Transferencia mitocondrial y rescate de células con mitocondrias disfuncionales —_______og Mitocondrias y regulacién de la vida celular 9 Binuiocraria y LECTURAS ADICIONALES Pégiwas wee gy AUTOEVALUACION tt Capitulo 5 Relaciones de la célula hacia su interior y con su medio exterior 0 gg Roberto A. Rovasio, Mirta A, Valentich y Aldo R. Eynard Resumen conceptual 103LA SUPERFICIE CELULAR 104 Estructura basica de las membranas celulares: Lipidos, proteinas y carbohidratos 104 Recuadro 5-1 Cambios evolutivos en el origen de la protocélula 105 Comunicacién celular 109 Moléculas de adhesién celular m5 CITOESQUELETO us Interacciones que modulan el cambio de forma y los movimientos de la célula us Polaridad celular 21 Migracién celular 121 Recuadro 5-2 El citoesqueleto y la diferenciacion del axon 122 Recuadro 5-3 Un movimiento celular sin participacion del citoesqueleto 124 Recuadro 5-4 La fibronectina es necesaria para la migracién de células embrionarias 126 MATRIZ EXTRACELULAR 27 Componentes y sus funciones de adhesién y de sustrato 27 EPIGENESIS: PARADIGMA DE LA INTEGRACION DE LA CELULA CON SU MICROAMBIENTE 27 Cémo funciona la modulacién epigenética? 128 Qué importancia tiene la epigenética?..., :para qué sirve? 129 BisLioGRAFiA Y LECTURAS ADICIONALES 131 PAGINAS WEB 132 AUTOEVALUACION 132 PARTE Il Interacciones celulares, patrones complejos e histogénesis 135 Aldo R. Eynard, Mirta A. Valentich y Roberto A. Rovasio SOCIEDADES CELULARES 137 COMUNICACION Y RESPUESTA CELULAR, BASE DE UNA ESTRUCTURA COOPERATIVA 137 EL EMBRION, UN PARADIGMA DE INTERACCIONES PARA FORMAR ESTRUCTURAS COMPLEJAS: 138 Capitulo 6 Componentes celulares y moleculares involucrados en etapas tempranas del desarrollo embrionario 140 Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich Resumen conceptual 140itis DESDE LA FERTILIZACION A LA IMPLANTACION: EL EMBRION EN SU PRIMERA SEMANA 141 Fertilizacién, reconocimiento intercelular temprano y fecundacién 141 Recuadro 6-1 La locomocién orientada del espermatozoide 143 Recuadro 6-2 La participacion esencial de ambos proniicleos 144 Aumento del ntimero de células y redistribucién de las primeras poblaciones celulares: segmentacién y blastulacién 145 La implantacién del embrién: sitios normales y consecuencias de una implantacién anormal 147 Recuadro 6-3 Colaboracién entre la clinica y la investigacién basica 149 EL DISCO EMBRIONARIO BILAMINAR EN SU SEGUNDA SEMANA DEL DESARROLLO 149 EL EMBRION ADQUIERE UNA TERCERA CAPA DE CELULAS EN LA TERCERA SEMANA 151 Importantes desplazamientos y distribucién de las células embrionarias (gastrulacién) 151 Recuadro 6-4 Aspectos moleculares del desarrollo temprano de mamiferos 153 Inducciones embrionarias fundamentales 154 Recuadro 6-5 Migracién orientada de las células de la cresta neural 159 Sefiales para la formacién del mesodermo embrionario y cavitacién del celoma 159 ESBOZOS DE LA FORMA EMBRIONARIA DURANTE LAS SEMANAS CUARTA A OCTAVA 159 Evolucién y derivados de las tres hojas embrionarias: las estirpes de los tejidos estables y la organogénesis temprana 161 Los plegamientos y adquisicién de la forma embrionaria 163 ORIGEN Y CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS TEJIDOS 164 Bisuiocraria y LECTURAS ADICIONALES 167 PAciNas wee 168 AUTOEVALUACION 168 Capitulo 7 Las funciones de revestimiento, proteccién, comunicacién y produccién 170 Aldo R. Eynard y Carmen Carda Batalla Resumen conceptual m1 EPITELIOS Y GLANDULAS EXOCRINAS: HISTOGENESIS, ESTRUCTURA, ACTIVIDADES Y DERIVADOS: 171 EPITELIOS 7 Origen embriolégico de los epitelios 171Clasificacién de los epitelios 172 Recuadro 7-1 Alteracién de los epitelios 17 Elementos celulares y moleculares para el comportamiento social de las células: bases estructurales de las interacciones y soportes 180 Recuadro 7-2 Cambios epiteliales en algunas patologias 181 Membranabasal ag La ampliacién de la superficie y el movimiento en las células epiteliales 183 Glanditlas exocrinas as Sintesis, almacenamiento y secreci6n regulada de los productos celulares 187 BinuiocRaria Y LECTURAS ADICIONALES 0 PAciNaswen AUTOEVALUACION ts Capitulo 8 Las actividades de defensa y reparacién del cuerpo 195 Tejido conjuntivo y érganos de sostén y del metabolismo mineral 96 Aldo R. Eynard y Carmen Carda Batalla Resumen conceptual 196 TEJIDO CONJUNTIVO 196 ‘Componentes celulares y extracelulares 197 Histogénesis 207 Distribucién y variedades del tejido conjuntivo 208 Respuestas normales y patolégicas del tejido conjuntivo 210 ORGANOS DE SOSTEN Y DEL METAROLISMO MINERAL _210 ‘TEJIDO CARTILAGINOSO 210 Células ‘Matriz extracelular 24.4... Histogénesis: condrogénesis, variedades de crecimiento condral 213 a EC ES 213 Células ‘Matriz extracelular a Periostio y endostio 218 Histogénesis: tipos de proceso de osificacién y hueso resultante 219 Crecimiento en longitud 221 INTERACCION ENTRE TEJIDOS DE SOPORTE: ARTICULACIONES _ 223 Respuestas normales y patolégicas del tejido éseo 223 Sangre y médula ésea 224 Mirta A. Valentich e Iuén Novak Componentes celulares de la sangre 225Recuadro 8-1 Examen de la sangre 225 Recuadro 8-2 Fritroblastosis fetal 2 ‘Componentes extracelulares de la sangre 232 Histogénesis de los elementos formes de la sangre: eritropoyesis, mielopoyesis, plaquetopoyesis, linfopoyesis en las etapas prenatal y posnatal 233 Recuadro 8-3 Coagulaci6n intravascular 233 Recuadro 8-4 Trasplante de médula 6sea 235 ELsi: = a Mirta A. Valentich y Horacio M. Serra Conceptos de inmunidad 237 Componentes del sistema inmunitario 237 Complejo mayor de histocompatibilidad 239 Generacién del elenco o repertorio linfocitario 240 Respuesta inmunitaria innata y adaptativa 243 Recuadro 8-5 Infecci6n, evasion y potenciacion de la respuesta inmunitaria 248 Estructura histolégica de los érganos linfoideos 250 Recuadro 8-6 Origen de las células epiteliales de la stroma del timo 200 Recuadro 8-7 Experimentos basicos que contribuyeron al conaocimiento de las funciones del timo 252 Recuadro 8-8 Ganglio centinela 253 Recuadro 8-9 Incremento del tamaiio ganglionar 254 ‘Tejido linfoideo asociado con las mucosas (MALT) 255 R 5 ‘ Linfa y vasos linfaticos como vias de emigracién de células linfoideas _257 Recuadro 8-10 Emigracién de células presentadoras de Ag desde la epider: a los ganglios linfaticos y 7 i Buuiocraria y Lecruras apicionales PAginas wep 8 AUTOEVALUACION Capitulo 9 Los movimientos del cuerpo, de las visceras y del sistema Aldo R. Eynard y Sonia E. Mufioz Resumen conceptual 263 LOS TEJIDOS MUSCULARES 264 Desarrollo inicial de los tejidos musculares 264 MUSCULO ESTRIADO ESQUELETICO: BASE DE LOS MOVIMIENTOS VOLUNTARIOS 2see ee Estructura y composicién molecular en el mecanismo de la contraccién muscular 286 Recuadro 9-1 Ejemplo de una enfermedad degenerativa 270 La microanatomia del agrupamiento de fibras y los contactos meuromusculares 0 Recuadro 9-2 Riesgos para atletas y gimnastas 275 ELMUSCULO CARD{ACO: MOVIMIENTO AUTOMATICO YCONTINUQ El citoplasma de la célula cardiaca y la importancia de las uniones imtercelulares 24.01 7g Sistema contrictil y sistema de conduccién. Generacién y conduccién del impulso 277 Recuadro 9-3 Respuestas fisiolégicas y ante el dafio por parte del tejido muscular 27 EL.MUSCULO LISO: MOVILIDAD VISCERAL Y LA REGULACION. DDE FUNCIONES VITALES 200g foci 7 - Ejemplos de estructura-funcién-regulaci6n (intestino, presién sanguinea y parto) 279 D cia So, - Recuadro 9-5 Las células de la cresta neural cardiacas __286 SISTEMA CARDIOCIRCULATORIQ a Organizacién histolégica y funcional del coraz6n y los vasos sanguineos 287 CORAZON Endocardio JJ 8 Miocardio El corazén como glandula endocrina 289 Sistema de Purkinje 289 Epicardio 201 Vasos cardiacos intrinsecos 0 vasa vasorum cardiacos __291 Inervaci6n lt VASOS SANGUINEOS Capilares 201 Recuadro 9-6 Factores de riesgo y patologia de los vasos sanguineos 294 Arterias emas gg Estructuras vasculares especializadas 300Comunicacién entre células, tejidos, rganos y medio externo_305 Roberto A. Rovasio, Mirta A. Valentich y Aldo R. Eynard Resumen conceptual 306 ELSISTEMA NERVIOSO: DESARROLLO EMBRIONARIO _36 Si . a0 Recuadro 10-1 Estudio de células troncales (células madre) de cuerpo estriado de embrién de rata 308 Sistema nervioso periférico 312 Origen embriolégico de la glia 312 EL TEJIDO NERVIOSO: RECEPCION DE ESTIMULOS YELABORACION DE RESPUFSTAS a Recuadro 10-2 De la teoria celular a la biologia celular de la neurona 313 La citologia de la neurona 314 ‘Tamaio y forma de las neuronas 318 La vaina de mielina 318 La sinapsis 320 Células con actividad de defensa y trofica del tejido nervioso: la glia. 320 As mes del tejido nervioso en sus principales érganos 321 Plexos coroideos y liquido cefalorraquideo 327 La barrera hematoencefalica 08 Desarrollo y estructura general del sistema nervioso periférico 328 Degeneracién y reparacién neural 331 Las glandulas endocrinas: histogénesis, estructura y funcién _ 332 Mirta A. Valentich y Elsa M. Orgnero D Fea Hipéfisis 332 Recuadro 10-3 Enfermedad de Cushing 337 Recuadro 10-4 Células y prolactinoma 338 Tiroides 2 Recuadro 10-5 Alteraciones en el sistema vascular y eae Paratiroides 345 Suprarrenales 346 Glindula pineal 350 aes ; =Recuadro 10-6 El tejido adiposo, un érgano endocrino 351 BisuioGRaria Y LECTURAS ADICIONALES 8S PAginas wep 008 AUTOEVALUACION 353 PARTE Ii Interaccion entre tejidos para la formacion de organos 355 Mirta A. Valentich, Roberto A. Rovasio y Aldo R. Eynard CELULAS..., TEJIDOS..._ Y EL AUMENTO DE LA COMPLEJIDAD ESPACIO-TEMPORAL 85 Capitulo 11 Sistemas sensoriales: recepcién de seftales y elaboracién de respuestas 360 Roberto A. Rovasio y Pablo Gil Loyzaga Resumen conceptual 361 ORGANOS DE LOS SENTIDOS; INTERACCIONES CON EL SISTEMA NERVIOSQ 86 Desarrollo general de los sistemas sensoriales 361 EL OLFATO Y EL GUSTO: DOS QUIMIORRECEPTORES IMPORTANTES PARA LA SUPERVIVENCIA 363 Sistemas olfatorios principal y accesorio 364 El receptor olfatorio: localizacién, estructura, tipos celulares yconexiones centrales 364 Recuadro 11-1 Las placodas 366, El sentido del gusto 366 QUIMIORRECEPTORES PARA CONTROL DE EQUILIBRIOS ENDOGENOS 88 EL TACTO Y OTRAS FUNCIONES DEL PRINCIPAL TEJIDO DE REVESTIMIENTO: LA PIEL Y SUS DERIVADOS__368 Recuadro 11-2 Renovacién y regeneracién de los corpisculos 0 botones gustativos 369 Estructura de la piel 369 sé 5 a7 Derivados de la piel 374 EL SONIDO Y EL EQUILIBRIO, BASES DE SU RECEPCION 376 El ofdo en sus diferentes partes y funciones 376 Oido externa 376 Oido medio 376 Qido interno 8 Receptor del sentido del ofdo 379nce [0 Recuadro 11-3 Las células de la “sintonia fina” del sonido 381. LA LUZ Y LA IMAGEN EN LA PERCEPCION Y LA RESPUESTA AL, AMBIENTE 382 Dindmica del desarrollo éptico: un paradigma de eventos inductivos 382 383 El ojo: estructuras complejas para funciones importantes Recuadro 11-4 El cre jiento diferencial de axones de retina sobre moléculas purificadas de matriz extracelular 388 Glindulas lagrimales 391 BisLIOGRAFIA Y LECTURAS ADICIONALES. 391 PAGINAS WeB 392 AUTOEVALUACION 392 Capitulo 12 Funciones metabélicas de nutricién, excrecion y respiracién 394 Roberto A. Rovasio, Mirta A. Valentich y Aldo R. Eynard Resumen conceptual 395, INTEGRACION EMBRIONARIA DEL SISTEMA DIGESTIVO 395 Segmentos iniciales: desarrollo de la cabeza y el cuello 395 Recuadro 12-1 La encefalizacién y las células de la cresta neural 397 Desarrollo del sistema digestivo 403 Sistema digestivo 409 Mirta A. Valentich, Maria Elsa Gémez de Ferraris y Martin E. Fernindez Zapico Estructura, funciones y regulacién de sus actividades 409 El tubo digestivo: sistema de ingreso, absorcién, transito y eliminacién 409 Recuadro 12-2 Citologia exfoliativa y alteraciones cromosémicas an Recuadro 12-3 Receptores del gusto 412 Recuadro 12-4 Sindrome de Sjégren 419 Recuadro 12-5 La saliva, un liquido biolégico que refleja los habitos alimentarios 419 Recuadro 12-6 Esofagitis, espasmos, megaesofago y neoplasia esofagica 421 Recuadro 12-7 Atrofia gastrica, autoinmunidad y anemia perniciosa 426 Recuadro 12-8 Sindrome de Zollinger-Ellison 427 Recuadro 12-9 Ausencia de chapa estriada 429 Recuadro 12-10 Habitos de alimentacion y riesgo de cancer colorrectal 433 Las principales glindulas del sistema digestivo: moléculas activas para la digestién y proteccién 435 Recuadro 12-11 Células de la cresta neural y enfermedad de Hirschsprung 435Re ee eee Recuadro 12-12 Degeneracién grasa, cirrosis y falla hepatica crénica 439 Recuadro 12-13 Litiasis vesicular waz Recuadro 12-14 Proteinas de membrana de granulos de secrecién acinar pancreatica 444 Recuadro 12-15 Pancreatitis aguda 446 Recuadro 12-16 Glucemia y diabetes 447 Sistema respiratorio 448 Aldo R. Eynard y Carmen Carda Batalla Desarrollo del sistema respiratorio 448 Estructura y funcién del sistema respiratorio 450 Adaptaciones para la conduccién aérea, transporte de gases y eliminacién de catabolitos 450 Nariz (cavidades nasales) 451 Faringe 452 Laringe 452 ‘Triquea 453 Bronquios primarios 456 Pulmones 456 Recuadro 12-17 Ingenieria tisular del pulmén y sus potencialidades terapéuticas 461 Recuadro 12-18 Avances en la patologia neonatal y los neumonocitos tipo I soa Recuadro 12-19 Riesgo de muerte sabita en bebés de padres fumadores 465 Sistema urinario 466 Aldo R. Eynard, Maria E. Pasqualini y Néstor G. Garcia Desarrollo del aparato urinario 466 Recuadro 12-20 Interaccién molecular para la formacion del filtro renal 468 Organizacién histolégica y funcional del sistema urinario 471 Recuadro 12-21 El mal funcionamiento del TCD afecta el crecimiento de los nifios 481 Recuadro 12-22 Asa de Henle, importante regulador del volumen circulante 484 Recuadro 12-23 El rifién, organo esencial en el desarrollo de la hipertension arterial 484 Recuadro 12-24 Avances en la fisiopatologia de la barrera de filtracion glomerular 485 Recuadro 12-25 Sindrome de Liddle, donde slo esta alterado el tubulo contorneado cortical 485Recuadro 12:26 Modificaciones moleculares del dominio apical de la membrana plasmatica del urotelio por lipidos de la dieta. Implicaciones en la patologia 490 Recuadro 12-27 Célico renal, el dolor mas intenso de la patologia genitourinaria 41 Biguiocraria Y LECTURAS ADICIONALES 493 PAGINAS WEB 494 AUTOEVALUACION 495 Capitulo 13 Continuidad de la especie: sistemas reproductores masculino y femenino 497 Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich Resumen conceptual 498. HOMOLOGIAS Y DIFERENCIAS DEL DESARROLLO DEL SISTEMA. REPRODUCTOR 498 Determinacién sexual 498 Recuadro 13-1 Cascadas de sefiales en la determinacion sexual de mamiferos 499 Desarrollo inicial de las g6nadas 499 Recuadro 13-2 Mi ientada por quimiotaxis de las células germinales primitivas 500 Diferenciacién sexual de los conductos reproductores y glindulas anexas 501 Desarrollo de los genitales externos 503 Migraci6n de las génadas 505 Sistema reproductor masculino 505 Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich Testiculos 506 Conductos excretores intratesticulares 512 Epididimo 512 Conducto deferente 512 Glandulas asociadas S14 Pene (estructura histolégica y bases del mecanismo de la ereccién) 516 Recuadro 13-3 Bases moleculares de la ereccion... (y de la prevencién del infarto) 517 Semen 517 Recuadro 13-4 Componentes del semen atin poco conocidos 518 ‘Vasos, nervios y linfaticos 518 Sistema reproductor femenino 519 Mirta A. Valentich, Aldo R. Eynard y Roberto A. Rovasio Ovarios: Relacién estructura-funcién a lo largo del ciclo menstrual 519Recuadro 13-5 Numero de células germinales en el ovario humano durante toda la vida 521 Recuadro 13-6 Transicién de foliculo primordial a foliculo primario y diferenciacién de células tecales 523 Recuadro 13-7 Hormona antimillleriana, marcadora de reserva folicular 524 Regulacién hormonal: el ciclo ovarico 524 Recuadro 13-8 Hormonas marcadoras de las etapas preovulatoria y posovulatoria 527 Recuadro 13-9 Infertilidad 528 Sistemas de conduccién y anidamiento (Trompas de Falopio, titero y vagina) 528 Recuadro 13-10 Fecundacién in vitro y generacion de gemelos 528 Recuadro 13-11 Afecciones del sistema reproductor femenino 540 ‘Vasos sanguineos, linfaticos y nervios 540 BistioGraria ¥ LECTURAS ADICIONALES S41 PAcinas wes 542 AUTOEVALUACION 542 Capitulo 14 Interacciones materno-fetal-neonatal: placenta y glandula mamaria S44 Mirta A. Valentich, Aldo R. Eynard y Roberto A. Rovasio Resumen conceptual 545 Desarrollo de la placenta 545 Mirta A. Valentich, Aldo R. Eynard y Roberto A. Rovasio Desarrollo progresivo de la estructura y funcién del trofoblasto 347 Etapa lacunar del trofoblasto 548 Etapa trabecular del trofoblasto 548 Etapa vellosa del trofoblasto 548 Recuadro 14-1 Hipoxia y patrones de expresion alterada de genes 549 Conexiones vasculares entre la madre y el feto 350 Recuadro 14-2 {Un marcapasos fisiolégico en los vasos sanguineos placentarios? 351 Membranas y anexos placentarios 551 Actividad funcional de la placenta 552 Recuadro 14-3 Invasion parasitaria en placentas de madres chagasicas 553 Los sistemas cardiovasculares fetal y neonatal 553Recuadro 14-4 Papel del trofoblasto y el desarrollo de tolerancia embrionaria/fetal 554 Gldndula mamaria 8S Mirta A. Valentich y Laura R. Pascual Estructura histolégica general 557 Desarrollo embrionario y posnatal 558 Recuadro 14-5 Estroma, desarrollo e involucion mamaria __559 Recuadro 14-6 Yemas terminales y alveolares en el desarrolio mamario Embarazo y lactancia 560 Recuadro 14-7 Aspecto externo de la mama (qrados de desarrollo sequn Tanner) 561 Recuadro 14-8 Golpe o bajada de leche 562 Galactogénesis o produccién celular de la leche 362 Recuadro 14-9 Secrecion de la leche 563 Recuadro 14-10 Regulacién local de la sintesis de leche 363 Regresién después del destete 564 Involucién posmenopausica 565 Bisiocaria y LECTURAS ADICIONALES = PAGINAS WEB AUTOEVALUACION Capitulo 15 Desarrollo embrionario patolégico: bases genéticas y ambientales (epigenéticas) de las malformaciones 569 Roberto A. Rovasio, Mirta A. Valentich y Aldo R. Eynard Resumen conceptual 570 INFERTILIDAD 5G ANOMALIAS 0 MALFORMACIONES CONGENITAS S71 Recuadro 15-1 Tecnologias de la reproduccién asistida S71 ANOMALIAS POR ALTERACIONES DEL MATERIAL GENETICO __574 Algunos tipos de anomalias submicrosc6picas 0 génicas (mutaciones) __574 Algunos tipos de anomalias microscépicas 0 cromosémicas 574 Entidades patolégicas de origen genético 576 ANOMALIAS POR INFLUENCIAS AMBIENTALES —__577 Periodos criticos del desarrollo 578 Algunas embriopatologias 578 Recuadro 15-2 El sindrome alcohdlico fetal y la embriopatia por Acido retinoico (enfoques expermentales) 582mz Recuadro 15-3 el tabaco y el alcohol, dos toxicos BisioGraria y LECTURAS ADICIONALES SB PAGINAS WEB 588 AUTOEVALUACION Glosario 591 Claves de correccién 29 indice analitico 20sPARTE | Un enfoque evolutivo de la célula Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich Fig. 1-0. Imaginando una protocélula. Estructura vesicular con contenido orgénico, rodieada por una membrana visible con microscopia de fluorescencia (véase fig. I+). “Todas la formas de vida estn compuestas por moléculas que no estan vivas por si mismas. Pero, de qué manera difiere la materia viva de la no viva? Cémo podria r una primitiva forma de vida de un conjunto de moléculas no vivas? La tran sicidn de la materia no viva a la materia viva usualmente emerge en el contexto del origen de la vida.” (Del parrafo inicial de Rasmussen et al., 2004). Ce a ae i ae re como hy la conocemos. Hace unos 3 000 millones de aitos, cuando la Tierra estab n parte sumergida en Ia sopa prebidtica, no existian las células que Se eee Pee Pee ee ae eee eer ee De ee ame de convulsiones voleénicas y millones d a zaban a enfriarse-, no es dificil imaginar la aparicién de si adecuadas para la formacién de las primeras moléculas orginicas simples. Asi como hoy conocemos en detalle las formas de unién de unas moléculas con otras, razin para pensar que en aquella etapa prebidtica no existieran “afi pode uniones entre esas moléculas orginicas. Asi, la unién de unas moléculas con otras, con cierto grado de selectividad, daria origen a la formacién de los polimeros pPARTE | Capitulo 1 Métodos generales para el estudio de las células y los tejidos 10 Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A.Valentich Capitulo 2 El nucleo como centro interactivo de control celular 33 Mirta A. Valentich, Guillermina A. Bongiovanni y Roberto A. Rovasio Capitulo 3 Lineas de montaje, transito y destino de macromoléculas y membranas para exportacion y para uso interno 72 Mirta A. Valentich y R. Olga Calderén Capitulo 4 Evolucién de las fuentes de energia y su transformacién 90 Mirta A. Valentich y R. Olga Calderén Capitulo 5 Relaciones de la célula hacia su interior y con su medio exterior 103 Roberto A. Rovasio, Mirta A.Valentich y Aldo R. EynardEL CAMINO HACIA LA PROTOCELULA Como se mencioné en el pérrafo introductorio -avalado por abundante evidencia-, podemos ima- ginar el inicio del largo camino que dara origen a la célula®, como un enorme caldero que contiene mi- riadas de las primeras moléculas organicas simples (fig. I-1 A). Moléculas que, por afinidades fisicoqui- micas que no serian necesariamente diferentes de las del tiempo actual, determinaron uniones entre ellas. Estos enlaces permitirian el surgimiento de conjun- tos moleculares que denominamos los polimeros igenios (fig. I-1 B). Considerando el comporta- miento fisicoquimico de las moléculas “modernas’” tampoco es dificil imaginar que en aquella época los constituyentes de los primitivos polimeros tuviesen sus propias preferencias de union, cuya resultante seria otro polimero, complementario del primero (fig. 11 C). A la luz de nuestros actuales conocimien- tos, los cambios que acabamos de describir no sélo fueron posibles, sino muy probables. Lo dificil para nuestra dimensién humana es, precisamente, imagi- nar que para llegar a esos cambios, hicieron falta mu- chos millones de anos de evolucién molecular, y muchos trillones de interacciones moleculares falli- das, hasta que algunas de ellas comenzaron a ser es- tables. Es dificil de imaginar ~pero no imposible de conceptuar~ que muchos de los cambios que ocurren en nuestras modernas células (0 en un tubo de ensa- yo) en segundos o minutos, demoraron millones de Aaftos en “ensayos” hasta llegar a un estado fisicoqui- mico estable y reproducible. 2Cémo contintia esta historia prebitica? Ya tene- mos moléculas orgénicas simples formando poli meros. No hay razén para pensar que las moléculas integrantes de esos polimeros no hayan tenido afi- nidad para unirse con otras moléculas simples y que éstas, a su vez, puedan haberse unido entre para formar un nuevo polimero (fig. I-1 D). Pode- mos agregar a este razonamiento los millones de aftos que hagan falta, que nunca serdn pocos... Pe- ro, he aqui un nuevo cambio que sera esencial para Ja vida tal como hoy la conocemos, cual es la adqui- sicién de la capacidad de auto-duplicacién de un polimero (fig, 1 BD). En sintesis, en el viejo y largo camino hacia la pro- tocélula ya tenemos los elementos que serain la ba- se de muchos procesos importantes para la célula moderna y el niicleo fundamental de todos los sis- temas biolégicos. La formacién de polimeros y la capacidad de autoduplicacién de los mismos for- man la base de los procesos de sintesis biolégica y de la transferencia de informacién (fig. I-1 A-D). Sin embargo, a pesar de la importancia de esos millones de afios de evolucién molecular, atin esta- * Las palabras en negrita se definen en el Glosati. ‘mos lejos de la protocélula. Para que ella pudiera cexistir -sobre la base del conocimiento actual fue- ron necesarias al menos dos condiciones. En primer lugar, que el nuevo polimero (fig. I-1 D) pudiera te- ner un efecto “favorable” o “perturbador”, es decir, un efecto regulador sobre los otros polimeros (fig. 1 +y -). Sin embargo, estos efectos estarian tan di- luidos en las toneladas de sopa prebistica del anti guo planeta que la accién reguladora en ese sistema abierto seria intrascendente para la poblacion gene- ral de moléculas. Para la transformacion en un sis- tema cerrado fue necesaria la segunda condicién, bajo la forma de otro tipo de molécula organica sim- ple, que seguramente formé parte del joven planeta en aquella primitiva era geologica. Los lipidos (gra- sas) “como veremos en detalle mas adelante-, cuan- do son agitados en un medio acuoso rico en mine- rales y sales, tienen la propiedad de autoensamblar- se en envolturas con forma de vesicula con liquido encerrado en su interior. En la primitiva sopa, el li- quido no faltaba y las agitadas convulsiones tampo- co, que hacian muy probable que a lo largo del tiempo se fueran dando las condiciones para la pro- duccién del primer compartimiento vesicular con polimeros en su interior (fig. I-1 *). En este sistema cerrado, si la produccién de un nuevo polimero tu- viera un efecto favorable sobre los otros polimeros (fig. I-1 +), el resultado seria una mayor estabilidad del sistema; por el contrario, si el efecto fuese per- turbador, la resultante seria el estancamiento 0 la destruccién del microsistema (fig. I —). Es decir, la seleccién natural a nivel molecular operaria con mayor eficiencia en un sistema cerrado como el des- crito. Y esto nos pone en los umbrales de la primiti va protocélula, un sistema que contiene los elemen- tos basicos para seguir evolucionando hacia una mayor complejidad. La seleccién natural en el dm- bito molecular condicioné la evolucién quimica, precediendo a la evolucidn biolégica. Esa primitiva seleccin natural pudo realizarse debido a la for- macién del primer compartimiento. DE LOS PROCARIONTES A LOS EUCARIONTES: LA GANANCIA DE COMPARTIMIENTOS Con los componentes basicos de la protocélula y luego de unos cuantos millones de aitos adicionales de evolucién y seleccién natural, nos encontramos con la ancestral y actual célula procarionte (bacte- rias en su mayor parte). Estas son las células mas simples y primitivas que podemos conocer en nues- tos dias. Son pequenas y poseen un nucleoide o componente nuclear de acido desoxirribonucleico (DNA) que no esta separado del resto del proto- plasma. Por otra parte, su envoltura membranosa adquirié complejidad y frecuentemente se rodea con cubiertas externas (pared celular) formada porFig, 4. tapas en la evolucién hacia la protocélula. A. Moléculas orgénicas simples. B. Polimero primigenio. C. Poli- mero complementario. D. Nuevo polimero. (+) y (-) Efecto favorable o desfavorable sobre el polimero primigenio. % Formacién del primer compartimiento = protocélula. diferentes componentes moleculares que cumplen funciones definidas. Sin embargo, la membrana ce- lular rara vez, o transitoriamente, forma prolonga- ciones o tabicamientos intracelulares (cuadro [-1). El camino desde la célula procarionte primitiva hasta la célula eucarionte significé un enorme in- cremento de la complejidad (véase cuadro I-1). Sin embargo, esa complejidad podria resumirse en un concepto basico y general: la compartimentacién. La célula eucarionte ~caracteristica de organismos mas evolucionados- posee dos compartimientos principales (nticleo y citoplasma), delimitados por estructuras membranosas, al igual que las numero- sas estructuras (organoides) localizadas en el com- partimiento citoplasmatico. Las enormes diferencias entre bacterias y células cucariontes son notables en cuanto a tamaio, es- tructura y funciones. Sin embargo, esta diversidad parece enmascarar las numerosas semejanzas entre estos diferentes tipos celulares. Por ejemplo, si ob- servamos la composicién quimica de las bacterias, podremos comprobar que es casi idéntica a la de las células eucariontes y que una de las escasas diferen- cias es su tamaio (cuadro I-2). Mas adelante en es- te libro se notaran otras semejanzas, diferencias e interacciones entre las células procariontes y las cé- lulas eucariontes. 2Cémo se llegé a tal grado de compartimentacién en la célula eucarionte? El simple sentido comin nos indica que algo fragil (polimero primitivo o mo- derno DNA) se preserva mejor si esté protegido. Probablemente, la célula primitiva (protocélula 0 bacteria ancestral) experimenté pequefios cambios allo largo de eones, con resultados favorables 0 des- favorables que marcaron la evolucién de la compar- timentaci6n. La célula eucarionte moderna, que al- canz6 el nivel mas alto de complejidad, seguramen- te es el resultado de una seleccin natural que co- menzé con la formacién y la estabilizacién de un compartimiento nuclear (fig. 1-2 A, B). Por el con- trario, otras estirpes celulares como las bacterias ac tuales, protegen su DNA mediante la especializa- cién y el reforzamiento de envolturas de su tinico compartimiento protoplasmatico, pero al costo de mantener una estructura general pequefia, primiti- vay rigida. Eventualmente, al producirse una inva- ginacion de la membrana celular, que arrastr6 y ro- de6 el DNA, otras porciones de la misma membra- na unida a ribosomas formaron el primitivo reticu- Jo endoplasmatico (RE) (fig. I-2 B). Esto explicariaracteristicas diferenciales “élulas procariontes y célul Caracteristicas Procariontes Eucariontes Organismos Bacterias y cianobacterias Protistas, hongos, plantas y animales Tamafio Pequefio (1-10 ym) Grande (10-100 wm) DNA circular no asociado con proteinas en cromosomas Sistema genético DNA lineal asociado con proteinas en ‘cromosomas Nucleoide sin membrana Niicleo con membrana Poco DNA repetitivo DNA repetitivo Division celular Fisién, gemacién, no hay mitosis Varias formas asociadas con mitosis ‘Separacion de cromosomas por union a la membrana celular Separacion de cromosomas por arrastre de microtdbulos Sistema sexual Transferencia unidireccional de Fusién de genomas gaméticos asociada con genes de donador a receptor meiosis RNA y proteinas Sintetizados en el mismo RNA sintesis/procesado en nucleo compartimiento Membranas internas __Sdlo transitorias. Proteinas en citoplasma ‘Numerosos tipos y variedades Metabolismo ‘Anaerdbico 0 aerdbico Aerdbico Nutricién Difusi6n. Algunos ‘Absorcién, ingestion, secrecion, fotosintesis. fotosintetizadores Mecanismos complejos con organoides especializados Organizacién celular __Ausente, principalmente Compleja, principalmente multicelulares, con unicelulares muchas variedades celulares Motilidad citoplasmatica No posee citoesqueleto Citoesqueleto y motores moleculares Endocitosis y exocitosis ausente ‘Transporte vesicular Endocitosis y exocitosis Motilidad global Flagelos simples en ciertas bacterias Cilios y flagelos complejos Migracién sobre sustrato celular 0 extracelular por qué, como veremos las membranas interna y ex- tera de la envoltura nuclear se contintian con la membrana del RE. También existen s6lidos criterios moleculares que apoyan la propuesta de que la mito- condria se originé de una bacteria aerobia ancestral, al ser internalizada por un eucarionte primitivo, se- guido por la adaptacion simbiotica que les permiti6 a ambos tipos celulares obtener ventajas funcionales y evolutivas (fig. 12 B). El origen del cloroplasto de las células vegetales seria similar, pero por simbiosis con una bacteria fotosintética (fig. 1-2 C). En ambos casos, se sabe que muchas caracteristicas molecula- res de estos organoides (DNA, RNA, enzimas, etc.) son de “tipo bacteriano”, ambos estan envueltos por una doble membrana (la externa derivada de la membrana plasmatica) y ambos estan fuera del cir- cuito topolégico de endomembranas (fig, I-2 D). COMPARTIMIENTOS Y FUNCIONES: LA MEMBRANA CELULAR El concepto de compartimentacién -basico y fun- damental para el conocimiento de la biologia celu- lar- visualiza el citoplasma como un conjunto de espa- ios con diferente contenido, imitados por distintos tipos de membranas (fig. 1-2 D). Asi, todos los organoides estén rodeados por una membrana (0 dos, con me- nos frecuencia) que delimitan espacios con una or- ganizacién ultraestructural, composicién quimica, propiedades fisicas y funciones caracteristicas. Mu- chas de las enzimas que catalizan las funciones ce- lulares se encuentran distribuidas en forma selecti- va en los diferentes compartimientos, ya sea en componentes membranosos 0 en los espacios que delimitan. Las membranas, a la vez que separanNicleo— pees A B —e Peroxisomas \— choroplastos Neticuled: Fig. 1-2. Posible evolucién de los compartimientos celulares. A. Adquisicién de envoltura nuclear y reticulo endoplas- ma liso. RER: reticulo endoplasmdstico rugoso. medios de composiciones diversas y con frecuencia incompatibles, permiten y regulan la interaccién entre los compartimientos. La coordinacién de las actividades de la membrana mantiene un funciona- miento eficiente de la célula en tanto reciba el apor- te indispensable de nutrientes y oxigeno que asegu- re las condiciones homeostaticas constantes y con- troladas. Ademias, el funcionamiento correcto de la célula involucra interacciones con otras células y con el medio extracelular, todo lo cual se realiza a tico. B. Mitocondrias. C. Cloroplastos. D. Endomembranas de un eucarionte actual. REL: reticulo endoplasmatico través de una o mas membranas, lo cual determina el estado de salud de la célula y del organismo que integra Qué estructura posee la membrana que explique el elevado nuimero y variedad de sus funciones? La respuesta, también en este caso, debe referir a la evolucién, pero esta vez a la “evolucién del conoci- miento”. A lo largo de muchos decenios resultaba obvio que la célula debia tener una estructura bidi- mensional que la contuviera. Sin embargo, el mi- Cuadro 12. Diferencias en composicién quimica y volumen entre procariontes y eucariontes Composicién quimica Bacteria (E. coli) Célula de mamifero % del peso celular ‘Agua 70 70 ones inorganicos 1 1 Metabolitos pequenios 3 3 Proteinas 5 18 RNA 6 1 DNA 1 0,25 Fosfolipidos 2 3 Otros lipidos 1 2 Polisacaridos 2 2 Volumen total 2% 10% cm? 4% 19° cm? Volumen relativo 1 2000eal 3. La membrana celular segiin el modelo de Gorter- Grendel, con su doble capa de fosfolipidos orientados ‘con sus cabezas polares (P) hacia el exterior y las cadenas hidréfobas (CH) hacia el interior de la bicapa. (Gorter y Grendel, 1925). croscopio utilizado durante muchos afos para des- cribir en detalle muchos tipos celulares no permiti6 visualizarla, por lo que durante largo tiempo el concepto de membrana celular permanecié en el ém- bito de las intuiciones o las especulaciones. Cuando las herramientas tecnoldgicas lo permitieron, se avanzé sobre la idea de la composicién lipidica de Ja membrana propuesta por Overton en 1902. Para ello, dos cientificos seleccionaron un modelo expe- imental simple, el eritrocito de mamifero formado esencialmente por una envoltura membranosa y un contenido homogéneo, sin mticleo ni organoides. Luego de eliminar el contenido, analizaron la en- voltura del eritrocito, describieron su composicién en lipidos y, calculando el espacio que ocupaban, concluyeron que la membrana plasmatica estaria formada por una doble capa de lipidos, lo que esta- blecié las bases estructurales de lo que se conoce co- mo el modelo de Gorter-Grendel (fig. I-3). Este mo- delo tedrico, basado sobre datos biofisicos y quimi- cos, explicaba parcialmente la permeabilidad de la membrana a las sustancias lipofilicas y la fusién es pontédnea entre membranas (véase cap. 5, cuadro 5- 1), pero no podia explicar muchas otras funciones celulares, para lo cual el modelo resultaba insufi- ciente, Durante 25 aitos, el concepto de membrana no se modified, a pesar de que s6lo explicaba parcial- mente el mecanismo de permeabilidad de molécu- las liposolubles o hidréfobas, y no podia explicar muchas otras funciones de la membrana celular. Por esta necesidad “funcional”, el modelo debié evolucionar y se propuso el agregado de capas ex- terna e interna de proteinas globulares adheridas (adsorbidas) a la bicapa de fosfolipidos, que con- form6 el modelo de Danielli-Davson (fig. I-4). Es- ta participacién proteica en la membrana, aunque Bicapa de {ostolipides ig: -4. La membrana celular segiin el modelo de Danie- i-Davson, con su doble capa de fosfolipidos y las protef- nas globulares adsorbidas a sus superficies externa e i terna, (Danielli y Davson, 1935). tampoco explicaba el mecanismo, ayudaba a vi sualizar mejor el transporte de moléculas hidrot las y la antigenicidad de la célula (véase cap. 5, cuadro 5-1). Sin embargo, el concepto de membrana atin no contenia los elementos que permitieran compren- der otras funciones y tampoco habia acuerdo en la estructura molecular y forma de integracién de las capas proteicas con Ids lipidos de la membrana. En la década de 1950, la estructura de la membrana se visualizé con los primeros microscopios electréni cos como una doble capa osmi6fila y, sobre una ba- se cuantitativa proporcionada por los datos ultraes- tructurales, Robertson postul6 en 1962 que las pro- teinas superficiales debian disponerse en forma e tendida sobre la superficie lipidica. Esta estructura y la visualizacién de la bicapa lipidica contribuye- ron a consolidar el concepto universal atin vigente de unidad de membrana, apoyado en particular por la semejanza estructural entre las membranas artificiales y diferentes tipos de membranas natura- les (fig. 1-5). Pasaron casi cuarenta afos para que el modelo de la membrana celular ganara nuevos componentes, nueva estructura y mayor dinamismo. Durante esa tercera etapa se hicieron contribuciones trascenden- tes a la estructura de la membrana que, con ligeras variantes, permanecen hasta la actualidad. Sobre la bas¢ de los modelos anteriores se propuso la incor- poracién de glucolipidos y glucoproteinas como parte integral de la membrana y no adsorbidos como. en el modelo anterior. Estas moléculas estarian inte- raccionando con la regién hidr6foba de la bicapa li- Pidica, exhibiendo su porcién glucidica hacia la si perficie externa de la célula, Esta tiltima caracteri tica permitio también que se reconociera la existen- cia real del glucocaliz. como un componente intrin-ig. 1-5. A. Micrografia clectréi de membrana artificial formada por el ensamble espontineo de lipido-proteina- agua. (W. Stoeckenius, tomada de De Robertis et al., fig. 7.7, 1968.) B. Membrana de dos células intestinales contiguas. (Tomada de De Robertis et al., lo (f) de Trypanosoma cruzi. (Rovasio, 1976.) seco de la superficie celular (véase cap. 5, figs. 5-2, 5-3 y 5-13) y no como un simple “artefacto de técni- ca” que los microscopistas visualizaban desde hacia varios aitos. ‘demas, se agregé al modelo un concepto dind- mico que fue muy movilizador en las ciencias bio- légicas. Se propuso que los diferentes componentes de la membrana tenian capacidad para movilizarse y realizar diferentes tipos de movimientos molecu- ares, como girar, bascular entre las superficies ex- terna e interna (flip-flop) y desplazarse tangencial- mente a lo largo y a lo acho de la membrana. Se concretaba asi el modelo de Singer-Nicolson (fig. I- 6). Este concepto de membrana, también denomina- do modelo del “mosaico fluido”, concibe un “mo- saico” como zonas mas viscosas de la membrana, que se mueven entre dreas més fluidas a la tempe- ratura corporal de cada especie. La integracién en este modelo de los componentes estructurales y di- namicos mencionados, en paralelo con los avances tecnolégicos y enfoques experimentales que permi- ticron apoyarlo, contribuyeron a explicar y funda- mentar muchas de las funciones celulares para las cuales la participacién de la membrana es esencial, como el flujo de membrana, el funcionamiento de los receptores, el reconocimiento celular, la activi- dad enzimatica superficial, la adhesién célula-cé- lula y la adhesi6n célula-sustrato, la motilidad ce- lular en un liquido, la migracién celular sobre sus- tratos, los fenémenos de endocitosis y exocitosis, .3, 1968.) C. Membrana plasmatica del cuerpo (flecha) y corte transversal de flage- los cambios de forma celular, la interaccién y el re- clutamiento de ligandos (capping), muchos fené- menos inmunes y de histocompatibilidad (véase cap. 5, cuadro 5-i). Paralelamente, permitié deter- minar la heterogeneidad fisicoquimica entre mem- branas de diferentes células y entre diferentes dominios de una misma membrana, as{ como la asimetria entre los componentes superficiales y ci- tosdlicos de una membrana. NIVELES DE ORGANIZACION CELULAR Llegar al concepto de que la célula actual es el re- sultado de un prolongado y complejo mecanismo evolutivo nos permitira introducirnos en los cinco capitulos de la Parte I del libro, en los que tratare- mos inicialmente algunos métodos e instrumentos para estudiar la célula, para detallar a continuacién sus principales estructuras, funciones y productos. Esos conocimientos daran las condiciones adecua- das para entender que los organismos de muchos metazoarios, como el ser humano, estén formados por un elevado ntimero de células (cerebro = jjj10" célulast!!) y que éstas no se disponen al azar, sino que se encuentran distribuidas con distintos gra- dos de complejidad en los diferentes niveles de or- ganizacién. En la Parte II (capitulos 6 a 10) veremos cémo las células se agrupan en diversas poblaciones celula-ee iy ol res y cOmo éstas se organizan en estructura mas complejas para formar los tejidos (epitelial, nervi so, muscular, etc.). La formacién de esos patrones complejos requieren interacciones celulares y mole- culares precisas, con lo cual integraremos la em- briogénesis, como desarrollo progresivo de niveles de organizacién de complejidad creciente a partir de una sola célula. Y también estudiaremos la hit togénesis, es decir, la formacién de los tejidos ba cos y sus derivados a lo largo de las etapas embrio- narias y su mantenimiento en la etapa adulta. Finalmente, en la Parte III (capitulos 11 a 15) de- sarrollaremos un nivel de organizacién superior al tratar la integracién entre los diversos tejidos para formar los érganos y la coordinacién de éstos en sistemas. Este tratamiento, en simultaneo con las etapas embrionario-fetales, permitiré integrar los conocimientos de forma y actividad celular-tisular con su desarrollo a lo largo del tiempo (compleji- dad espacio-temporal). En resumen, las células, los tejidos, los érganos y los sistemas son parte de los diferentes niveles que se organizan en un organismo vivo a lo largo del tiempo y de cuya equilibrada integracién dependen todos los procesos vitales. La manera arménica y coordinada del funcionamiento normal en el estado de salud se considerard en los ejemplos sobre los cambios que se producen en las células y en los te- jidos en el estado de enfermedad, cuando su estruc- tura, funcién 0 mecanismo de regulacién resultan alterados. EL ESTUDIO DE CELULAS Y TEJIDOS, SU RELACION CON OTRAS AREAS BIOMEDICAS La biologia celular, la histologia y la embriologia son dreas interdisciplinarias que convergen para el estudio de diversos aspectos de la estructura, la funci6n y la regulacién de conjuntos celulares inte- grados y organizados a lo largo del desarrollo de un organismo desde su etapa unicelular hasta su muerte. A su vez, esas disciplinas fundamentan y se involucran en miiltiples reas del conocimiento de las ciencias biomédicas. La biologia celular proporciona las bases estruc- turales de los cambios quimicos y metabslicos es- tudiados en quimica biolégica, asi como de las caracteristicas funcionales correspondientes a la siologia; son numerosos los mecanismos celulares y moleculares -asi como las herramientas utiliza- das para su estudio— que requieren los fundamen- tos de la biofisica. La histologia se relaciona con la anatomia, ya que ésta no se integra desde lo fun- a ig- 1-6. La membrana celular segtin el modelo de Sin- ger-Nicolson, con la doble capa de lipidos y las proteinas integrales que atraviesan total (P,) 0 parcialmente (P,) la ‘membrana. Una de las proteinas integrales forma un ca- nal o ttinel (t) que comunica ambas superficies de la ‘membrana. Se indican también los glucolipidos (GI) y las glucoproteinas (Gp) con sus residuos azticares hacia el lado externo de la membrana formando el glucocéliz. (Singer y Nicolson, 1972) cional si se desconoce la estructura histolégica, asi como no se comprende el estudio microscépico de los tejidos y los 6rganos si no se conoce la anatomia global. Asimismo, el conocimiento de las estructu- ras y las funciones normales de células y tejidos forma la base y la sintesis integradora del conoci- miento para poder encarar el estudio de la anato- mia patolégica. Por otra parte, tanto la biologia ce- lular como Ia histologia no sélo estan estrechamen- te relacionadas con la embriologia y la biologia del desarrollo, sino que constituyen sus bases con- ceptuales, ya que todas las estructuras que forman el individuo son producto de complejos procesos de proliferacién, crecimiento, diferenciacién, cambio de forma y movilizaci6n celular. A su vez, los conocimientos de embriologia son fundamenta- les para un buen desarrollo conceptual de discipli- nas como ginecologia, obstetricia y cardiologia, entre otras. Finalmente, los contenidos y las estra- tegias de la biologia celular, la histologia y la em- briologia en el estado de salud son condicionantes para la adquisicién de conocimientos sobre el esta- do de enfermedad, en las dreas de clinica, cirugia y patologia, ya que tanto en situaciones normales como patolégicas existe una estrecha correlacién entre la estructura, la quimica y la funci6n.Métodos generales para el estudio wns C [15 céliilas y los tejidos Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich Lente montada en un soporte metilico Soporte para Fig. 1-0. A. Microscopio simple inventado por Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723), vista posterior (dere- cha) y lateral (izquierda), y manera de utilizarlo por el autor (recuadro). B. Microscopio compuesto inventa- do por Robert Hooke (1635-1703). POT eter E, conocimiento de la célula y de los tejidos se inicia en el siglo XVI con la invencién de los pri- ‘meros microscopios, que permitieron cruzar el limite impuesto por la resolucién del ojo humano. Durante los primeros afios, la observacion de pequeiios organismos o de partes diminutas de es- tructuras biolégicas mayores estuvo restringida a los objetos tal como podian obtenerse en su es- tado natural. Posteriormente se desarrollaron métodos para la preservacién de los especimenes, para lograr mayores contrastes que permitieran evaluar mejor su estructura y para analizar sus componentes. Ese largo camino, iniciado hace mucho tiempo, se mantiene en Ia actualidad y tra- za un paralelismo permanente entre el avance tecnol6gico y los progresivos descubrimientos cien- tificos. Aunque los sistemas aplicados para el estudio de células y tejidos son numerosos, los requeri- mientos bdsicos que veremos a continuacién son: 1) material de estudio preparado en forma ade- cuada (técnicas citohistolégicas) y 2) instrumental para su visualizacion y estudio (microscopios). En este capitulo se pasara revista a algunos métodos basicos que permiten estudiar la célula y los tejidos animales en su estructura y en diversos aspectos de su composicién quimica y funcion.TECNICA CITOHISTOLOGICA Y MICROSCOPIAS Técnica citohistolégica Lia técnica citohistolégica es el conjunto de proce- dimientos aplicados para preservar la estructura y la organizaciGn de células y tejidos, a fin de obtener una preparacién microscépica que permita su examen con un microscopic éptico (MO). Si bien existen téc- nicas para el estudio de células vivas, en muchos ca- sos es necesario interrumpir los procesos vitales, es ‘matar las células para hacer posible su estudio microscpico. Es muy importante saber que el con- junto de técnicas de preparacion indispensables para el estudio de los tejidos normales es el mismo que se ul liza para el anélisis de tejidos patolégicos. Los procedi- mientos de la técnica citohistol6gica incluyen una se- rie de etapas (cuadro 1-1; figs. 1-1 y 1-2): Observaciones importantes Toma de la muestra: manipulacién delicada para evitar su deformaci6n. La muestra puede obtenerse Cuadro 1-1. Etapas de la técnica histolégica* de un individuo vivo (biopsia) 0 muerto (necrop- la accién mas importante es la desnatu- acin de las proteinas, entre ellas las enzimas hidroliticas que producirian la autolisis. Ademas de los fijadores quimicos (con una relacién “volu- men fijador/volumen muestra” de 40/1), puede utilizarse la congelacién, sobre todo para el estudio de una biopsia durante el acto operatorio. Deshidratacién: el alcohol més utilizado es el eta- nol en concentraciones crecientes de 70% > 80% > 95% > 100%, durante una hora o mas en cada uno de ellos, segiin el tamano de la muestra, ‘Aclaracién: en esta etapa intermedia se elimina el alcohol del tejido y éste se impregna con un solven- te de la parafina que, ademés, le otorga transparen- cia. Inclusién en parafina: la parafina penetra en los tejidos y desplaza al agente aclarante, durante 5 a 20 horas segtin la naturaleza y las dimensiones de la muestra. Luego, la muestra se deposita en peque- fios recipientes y se deja solidificar. Preparacién del taco: el bloque de parafina con la muestra incluida se pega en un soporte de ma- dera 0 plastico (taco), para poder fijarlo al micré- tomo. Etapas Fundamento / Precauciones Producto / Instrumento Toma de la muestra Pequefio tamafio (2-3 mm) Bisturi, hoja de afeitar Fijacién Detiene procesos vitales, evita la autélisis __ Formol 10%, 12-24 h, vol. 40/1 Deshidratacion Facilita la penetracién de solventes Etanol en graduacion ascendente Aclaracion Favorece la penetraci6n de la parafina Xilol, benzol Inclusién en parafina Otorga dureza para poder realizar cortes Parafina (45 a 60 °C), estufa Preparacién del taco Soporte para el montaje en el micrétomo Bloque de madera o plastico Conte Permite la visualizacién de estructuras Micrétomo pequefias Montaje del corte sobre un Soporte para su observacién al microsco- _—Portaobjetos portaobjetos pio Desparafinacién Facilita la penetracién del alcohol Xilol, benzol Hidratacién’ Permite la penetracion de colorantes Etanol en graduacién descendente acuosos hasta el agua destilada Coloracién Otorga colores diferenciales ala muestra ___Hematoxilina-eosina Deshidratacion Facilita el montaje con medios hidréfo- Etanol en graduacion ascendente bos Aclaracion Otorga transparencia a los tejidos Xilol, benzol Montaje de cubreobjetos Permite obtener una preparacién perma: nente Cubreobjetos + resinas * La descripetén en e! cuadro y en el texto se refiere al procesamiento de tejidos sélidos. Para procesar células alsladas, obtenidas in vi 00 In vitro, se modifican algunos procedimientos, manteniéndose los lineamientos generale.1.Toma de una muestra Material Cépsula de Petri 3, Deshidratacién 5. Inolusién en paratina Paratina blanda PF: 44-48°C 2. Fijacién 6. Preparacién del taco Parafina Material Taco de madera Fig. 1-1. Técnica histologica. Desde la toma de la muestra hasta el montaje del corte. Corte: se realiza con un instrumento de precisién llamado micrétomo, a fin de obtener cortes muy delgados (8-10 um) y uniformes que permitan vi- sualizar estructuras muy pequenas. Los tejidos fija- dos por congelacién (véase Fijacién) se seccionan mediante un micrétomo de congelacién o con un criostato, instrumentos adecuados para mantener la muestra por debajo de -20 °C. Montaje del corte sobre un portaobjetos: los cor tes se depositan en la superficie de un recipiente con agua y luego se montan sobre un portaobjetos de vidrio y se dejan secar. Desparafinacién: este paso intermedio es necesario para permitir la penetracién del alco- hol del paso subsiguiente, ya que los solventes usados son miscibles tanto en parafina como en alcohol. Hidratacién: para permitir la penetracién de los colorantes, que en su mayoria estén en solucién acuosa, la muestra se debe hidratar en soluciones deVeena eee ens eee 9. Desparafinacién EHaHHS 10. Hidratacién 12. Deshidratacion 14, Colocacion de cubreobjetos ‘Cuibreobjetos Conte eiada Caaiss Portaabjetos: de Canada Eosina 13, Aclaramiento Preparacion histologica en condiciones de ser examinada fen el microscopio Fig. 1-2. Técnica histologica, Desde la desparafinacién hasta la preparacién microscépica permanente. etanol diluidas progresivamente (100% > 95% > 80% > 70%), hasta el lavado final con agua destilada. Coloracién: el uso de colorantes es necesario por- que el contraste de los tejidos es insuficiente para su observacién con un microscopio comin. En un co- lorante hay grupos quimicos que le otorgan propie- dades iGnicas al colorante, los cuales se pueden cla- sificar en colorantes basicos (colorantes catiénicos) por la presencia del grupo amino (-NH2), por ejem- plo, hematoxilina, fucsina basica, azul de toluidin: azul de metileno, o colorantes acidos (colorantes aniénicos) por la presencia del grupo carboxilo (~ COOH), por ejemplo, eosina El método de coloracién convencional mas utiliza- do en histologia e histopatologia se conoce como he- matoxilina-eosina (fig. 1-3). La hematoxilina es un colorante nuclear que se comporta como un coloran- te basico al tefir los componentes acidos de los teji- dos; por ejemplo, los nticleos celulares, por su conte- nido en DNA, se observan de color azul-violaceo. La eosina es un colorante citoplasmatico, acido, que ti- he los componentes basicos de los tejidos; por ejem-Se Cuadro 1-2. Coloraciones empiricas y sus aplicaciones Coloraciones Aplicaciones Hematoxilina de Mayer Nacleos celulares Eosina Citoplasma Hematoxilina férrica Nacleo, estriaciones del misculo esquelético Aldehido fucsina y orceina Hematoxilina fosfotdngstica Fibras elasticas Nicleo, mitocondrias, coligeno Impregnacién argéntica Aparato de Golgi, neuronas May Granwald-Giemsa Células sanguineas plo, el citoplasma celular de distintas tonalidades de ojo. El fundamento de la accién de estos y otros co- Jorantes no se conoce, por lo que se denominan colo- raciones empiricas (cuadro 1-2; véase fig. 1-3). Deshidratacién: debido a que el medio de monta- je no es miscible con el agua, ésta se debe eliminar mediante inmersiones del portaobjetos con el corte histol6gico en soluciones de etanol de graduaci6n creciente (70% > 80% > 95% > 100%). Aclaracién: los reactivos utilizados (xilol o ben- zol), ademas de eliminar el alcohol, facilitan la pe- netracién de la resina del medio de montaje y otor- ga transparencia al corte de tejido. Fig. 1-3. Epitelio cilindrico simple de la mucosa géstrica, Se observan niicleos tenidos con hematoxilina (flechas) > Ce stn ae pean ° Ge > " " " a oct ° > (Corer La y qe y (Fam Site en = Poroxidasa Fig. 1-7. Esquema de los métodos inmunocitoquimicos directos (A) e indirectos (B y C). uso de un Ac secundario en las técnicas indirectas tiene varias ventajas. Por una parte, permite utilizar el mismo Ac secundario marcado, independiente- mente de la especificidad del Ac primario utilizado, ya que la especificidad est determinada por el Ac primario. Por otra parte, la introduccién del Ac se- cundario marcado aumenta la sensibilidad del mé- todo, ya que pueden unirse mas moléculas marca- das por cada molécula de Ag (comparense A y B de la fig, 1-7) En la figura 1-7 B se esquematiza el revelado del complejo Ag-Ac primario mediante Ac secundarios marcados con colorantes fluorescentes, radiois6to- pos y oro coloidal. En los métodos de revelado que utilizan enzimas como marcadores (véase fig. 1-7 C, peroxidase) es necesario adicionar al medio de incu- bacién el sustrato de la enzima utilizada (véase fig. 1-7 C, H,O.), cuya actividad generalmente se mani- fiesta por la formacién de un producto coloreado (véase fig. 1-7 C, sulfato de cobre) Un método inmunocitoquimico indirecto. muy sensible es el llamado peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) (véase fig. 1-8). Consiste en incubar el material, antigénico con un Ac primario especifico, luego con, un Ac secundario (véase fig. 1-8, puente) y después con un Ac terciario marcado con el complejo PAP, se- guido del revelado de la enzima, Debido a que el Ac secundario actia como puente entre el Ac primario y el terciario, es necesario que ambos, primario y tercia- rio, se obtengan de la misma especie animal. Por ejemplo, para detectar moléculas de miosina (protet- na muscular) en miisculo de ratén podremos utilizar un Ac primario de conejo antimiosina de ratén, luego un Ac secundario de cabra antiinmunoglobulina de conejo y, por ultimo, un Ac terciario de conejo marca- do con el complejo PAP (véase fig. 1-8). En la aplicacién de las técnicas de inmunomarca- cidn existen dos tipos principales de problemas: 1) La sobremarcacién, que consiste en una colora- cién de fondo difusa (background) o de precipi-Antigeno especie "A" =—_ Peroxidasa \ { dasa” (PAP). tado del marcador localizado fuera del sitio nor- mal del antigeno que debemos visualizar. Este ti- po de problema dificulta la interpretaci6n de la inmunomarcacién y puede estar provocado por la falta de especifici Ac primario o secur dario, o por la movi seit el ‘Ag por fijacion deficiente, 0 por solubilizacién del Ag, 0 por reaccin cruzada con otras moléculas antigéni- cas que comparten epitopes similares 2) La submarcacién, que es la marcacién escasa 0 au- sente del Ag en tejidos en los cuales se conoce su. presencia. La causa, en general, es la destruccion del Ag por un tratamiento indebido, o por fijacién inadecuada, o utilizacién de concentraciones ba- jas del Ac, o tiempos de incubacién o temperatu- ra inadecuados. Para reconocer y solucionar estos inconvenientes deben realizarse controles ade- cuados y variaciones de las técnicas, que son par- ticulares para cada caso en estudio y cuyo detalle excede los alcances de este libro. La eleccién entre diferentes métodos inmunocito- quimicos depende de muchos factores, como el ti- |) Incubacién con anticuerpo primario (especie "B") Il) Incubacién con anticuerpo secundario 0 “puente’ (especie °C") Ill) Incubacién con complejo PAP (peroxidasa - antiperoxidasa) (especie "B") IV) Revelado de la enzima y reaccién de color 1-8. Esquema de un método inmunocitoquimico indirecto y marcacién con el complejo “peroxidasa-antiperoxi- po de Ag en estudio (mayor o menor labilidad fren- tea fijadores histol6gicos, ubicacién dentro de la e tructura en estudio, etc.), del equipamiento que se ha de utilizar (microscopia 6ptica, de fluorescencia, electrénica, etc.), de la disponibilidad de reactivos, etc. Asimismo, el método seleccionado sera directa- mente dependiente del trabajo o investigacién que se desea realizar, por ejemplo, la determinacién de la proliferaci6n celular (fig. 1-9). En el cuadro 1-3 se senalan las ventajas y los inconvenientes de algu- nos métodos de inmunomarcacién. Por otra parte, existen métodos de fluorescencia que no utilizan anticuerpos marcados con fluorocro- ‘mos, sino moléculas que adquieren fluorescencia ba- jo alguna condicién biol6gica, quimica o fisica. Por ejemplo, un método para evaluar la viabilidad celu- Jar se basa en la determinacién simultanea de células vivas y muertas mediante marcadores que reconocen dos parametros de viabilidad celular: 1) la actividad de esterasa intracelular con el reactivo calceina AM y 2) la integridad de la membrana celular con el react vo etidio H-1. La calceina AM, que no es fluorescen-1-9. Cultivo celular con un método inmunocitoqui- mico para evaluar la proliferacién celular. Se incuba el cultivo con bromodesoxiuridina (BrdU), un andlogo de la uridina que se incorpora al DNA durante la division ce- lular y luego se demuestra su incorporacién mediante un anticuerpo primario anti-BrdU y un anticuerpo secunda- rio marcado con un fluorocromo (fluoresceina = verde). Se determina la proporcién de células en proliferacién mediante la expresiGn “células marcadas/total de célu- las”. Se observan figuras de mitosis (flechas). te, penetra en células vivas y es convertida, por la ac- tividad de la esterasa mitocondrial, en el colorante polianiénico calceina, que es retenido por las células vivas y fluoresce intensamente en color verde (véase fig. 1-10). Por su parte, el etidio H-1 no penetra la membrana plasmatica de células vivas, pero penetra Fig. 1-10. Cultivo celular con un método de fluorescencia para evaluar la viabilidad celular. Pueden observarse célu- las vivas (verdes) y muertas (rojas) luego del método de calceina-etidio. Un control positivo (recuadro) muestra to- das células muertas luego del tratamiento con un t6xico, la membrana dafiada de las células muertas y au- menta 40 veces su fluorescencia al unirse con los dci- dos nucleicos, con una sefial fluorescente de color ro- jo (fig. 1-10). Microscopias Microscopio éptico El microscopio 6ptico (MO) (microscopio de luz visible, microscopio foténico o microscopio de campo claro) esta compuesto por un estativo 0 par- Cuadro 1-3. Ventajas y desventajas de algunos métodos de inmunomarcacion Inmunofluorescencia Inmunoperoxidasa Inmunorradiografia Sensibilidad buena Se aplica usualmente en tejidos fres: cos 0 fijados y congelados Buena conservacion de la morfologia Labil conservacién de la marcacion Utiliza microscopia de fluorescencia Buena definicién de Ag extracelulares Sensibilidad buena Puede aplicarse sobre tejidos incluidos en parafina Excelente conservacion de la morfologia Conservacion indefinida de la Utiliza microscopia éptica con vencional Mala localizacién de Ag extrace- lulares y buena de Ag intrace- lulares Sensibilidad muy na Se aplica sobre tejidos frescos 0 incluidos en parafina o resina Excelente conservacién de la morfologia Conservacién indefinida de la marcacion Utiliza microscopia éptica con: vencional Buena localizacién de Ag extra: celulares e intracelularestierce y | ray Parte mecanica te mecénica (fig. 1-11, lado izquierdo) y por un tema 6ptico (fig. 1-11, lado derecho). A través del sistema Gptico se refractan los rayos luminosos provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamaito, in- vertida y virtual (fig. 1-12). Para lograr este resulta- do, el objeto en estudio debe ser transparente y po- seer contraste para poder discriminar sus distintos componentes. Como mencionamos en el apartado Técnica citohistoldgica, la transparencia se logra en parte con cortes muy delgados de! material en estu- dio (figs. 1-3 a 1-5) 0 mediante el estudio de “exten- didos celulares” o bien con cultivos de células aisla- das (figs. 1-9, 1-10 y 1-15). El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloracio- nes o mediante sistemas dpticos particulares (fig. 1- 15) (p. ¢j., microscopio de contraste de fase o mi- croscopio de interferencia). Los siguientes conceptos referidos a un sistema 6ptico son muy importantes para conocer el fun- cionamiento y el uso correcto del microscopio. Poder de resolucién El poder de resolucién (PR) es la capacidad pa- 1-11. Esquema de un microscopio éptico comin. ra distinguir los més finos detalles de las estructu- ras en estudio; o sea, dar imagenes distintas (sepa- radas) de dos puntos situados muy cerca entre si en el objeto de estudio. Esta caracteristica depen- de de la longitud de onda de la radiacién utiliza- da (2) y de la abertura numérica (AN) de la lente. Esta tiltima depende a su vez del indice de refrac- cién del medio que atraviesa la radiacién (n) y del seno del semiangulo de abertura de la lente (a) (cuadro 1-4). AN = 1) xsen a Se denomina angulo de abertura al limitado por los rayos mas periféricos del cono de luz que pene- tra en una lente. El PR es directamente proporcional a la AN. Asi, un objetivo con mayor AN tendra mayor PR que un objetivo con menor AN. EI PR es inversamente proporcional a la longi- tud de onda (i). Si utilizamos una fuente de radiaci6n con una longitud corta (p. ej., luz ultra violeta 0 electrones), ef PR sera mayor (véase fun- damentos del microscopio electrénico, mas ade- lante)Limite de resolucion Esta propiedad deriva del concepto anterior. El Ii mite de resolucién (LR) es la distancia minima que separa dos puntos para poder ser discriminados co- mo tales (0 el objeto mas pequerto que puede ser vi- sualizado). Es la inversa del poder de resolucién y depende principalmente de la longitud de onda (A) utilizada. 061 x % LR= AN ELLR para: * el ojo humano = 0,1 mm + el microscopio 6ptico = 0,2 um * el microscopio electrénico = 2 a 10 A. En general, un tipo de luz no puede emplearse para resolver estructuras més pequefias que su propia longitud de onda. Asi, el LR del MO esta dado por la longitud de onda de la luz visible, que va desde 400 nm (violeta) hasta 700 nm (rojo). En términos practicos, una bacteria y una mitocon- dria son los objetos mas pequefios que pueden ser visualizados claramente en este tipo de microsco- pio (fig. 1-13). Poder de penetracién Es el que permite observar diferentes planos de la preparacién en una misma posicién del enfoque. Es inversamente proporcional a la AN y a la magnifi- cacién de la lente. Poder de definicion Es la capacidad de dar imagenes claras de contor- nos nitidos. Distancia focal Es la distancia entre el centro 6ptico de una lente y el foco donde se retinen todos los rayos luminosos que la atraviesan. Distancia frontal Es la distancia entre la preparacién microscépica y la lente inferior del objetivo. Nota: Debe recordarse que en los objetivos de inmersién, esta distancia es de apenas 0,1 mm. precaucién, al hacer en enfoque a mayor aumento! (véase fig. 1-12). Objetivos secos Son objetivos que se utilizan con interposicién de aire entre la preparacién y el objetivo (3x, 10x, 20x, 40x). ;Precaucién! jNo usar aceite de inmersién! Objetivos de inmersion Son objetivos que se utilizan interponiendo una delgada capa de aceite entre la preparacion y el ob- jetivo (40x, 60x, 100x). Tienen el propésito de lograr un mayor aprovechamiento de los rayos luminosos periféricos. Nota: Debe recordarse que en los objeti- vos de inmersién, esta distancia es de apenas 0,1 mm. ;Precaucién al hacer en enfoque a mayor au- mento! (véase fig. 1-12). Magnificacion 0 aumentos Se calcula multiplicando los aumentos correspon- dientes a los sistemas épticos empleados (ocular x objetivo). Es directamente proporcional a la AN, aunque no es necesariamente proporcional al PR (cuadro 1-5). Imagen retiniana — Distancia frontal Fig, 1-12. Formacién de la imagen en el microscopio y en la retina del observador.Cuadro 1-4. Valores para el calculo del poder de resolucion Valor maximo del seno de « =0,1 Valor maximo del indice de refracci6n =16 Longitud de onda (2) de la radiacién: infrarroja > 700 am roja = 700 nm anaranjada 610 nm amarilla = 565 nm blanca = 550 nm verde =515 nm azul = 463 nm indigo = 428 nm violeta = 400 nm ultravioleta $400 am rayos X =I nm electrones = 0,005 nm EIMO es adecuado para estudiar células y tejidos previamente fijados y coloreados. Como ya vimos, la coloracién de las preparaciones citohistologicas tiene por objeto provocar la absorcién diferencial de Ja luz, con el propésito de visualizar las diversa tructuras con colores distintos. Esa diferente capaci- dad de absorcién produce modificaciones en la am- plitud (intensidad) de la onda luminosa (fig.1-14 A- C). Cuanto més absorbente sea el material en estu- dio, menor ser la amplitud (intensidad) de la onda luminosa que lo atraviesa y la resultante sera la vi- sualizacién de colores diferentes. Por otra parte, para estudiar células u organismos vivos, a los cuales no es posible colorear, es necesa- rio recurrir a otros sistemas dpticos, como el mi croscopio de contraste de fase 0 el microscopio de interferencia. En estos casos, se aprovecha una ca- -a propia de los diferentes componentes Tmicroscopio electronica celulares que, aun siendo transparentes a la luz, po- seen distintas densidades relativas; es decir, dife- rente concentracién de materia por unidad de volu- men. Asi, los materiales que tienen distintos indices de refracci6n permiten diferentes velocidades de las ondas de luz que los atraviesan (véase fig. 1-14 A, B, D-G). Cuanto mayor es la densidad de una estruc- tura, mayor es su indice de refraccién y menor la velocidad de la luz que la atraviesa; es decir, las on- das de luz se retardan y cambian de fase. Con el MO comuin no es posible discriminar pequefias di- ferencias en los indices de refraccién o absorcién en las estructuras celulares no coloreadas. En cambio, los MO de contraste de fase y de interferen disefados para utilizar las caracteristicas épticas mencionadas y traducirlas en imagenes con grados visibles y diferenciales de contraste y brillo (fig. 1- 15). cry ‘tam 100m 100m tum 10 ym’ 100 pm 1 mm’ tem Moléculas Virus Bacterias Células Ovocitos pequenias. Ribosomas. animales de peces Mitocondrias Ceétulas Cloroplastos vegetales Fig. 1-13. Escala y tamano de objetos que pueden visualizarse con diferentes épticas.mo on Fig. 1-14. Esquema del paso de ondas luminosas a través de una célula coloreada (A, B, C) y una célula no colorea- da (F, G). Se sefalan ondas luminosas que atraviesan: 1) medios homogéneos (A, D, E); 2) medios con mayor in- dice de refraccién y no absorbentes (= retardo de fase) (B, FG) y 3) medio con mayor indice de refraccién y absor- bente (= retardo de fase y disminucién de la amplitud 0 intensidad) (C). Cuando colisionan ondas que estén en la misma fase (D y E) se produce una “interferencia cons- tructiva” con aumento de intensidad luminosa (D + E = H). Por el contrario, si las ondas estan desfasadas, se pro- duce una “interferencia destructiva” con disminucion de la intensidad (F + G = I) y éstaes la base del principio de la microscopia de contraste de fase. Microscopio de contraste de fase Es un MO de luz visible que posee diafragmas anulares en los sistemas 6pticos del objetivo (fig. 1- 16 a) y del condensador (véase fig. 1-16 b) que mo- difican (aceleran 0 retardan) los rayos luminosos periféricos con respecto a los centrales que atravi san el objeto (véase fig. 1-16). La imagen final reci- bida por el ocular (véase fig. 1-16 c) depende del efecto de interferencia entre la imagen directa dada por los rayos centrales (no modificados) (véase fig. 1-16 A) y la imagen proporcionada por los rayos més periféricos (acelerados o retrasados) (véase fig. 1-16 B). Si ambos conjuntos de rayos luminosos es- tan en fase, se suman y el objeto aparece més brillan- te que el medio que lo rodea (véase fig. 1-14 D + E =H); pero si ambos rayos estén fuera de fase, las on- das se anulan y el objeto se vera mas oscuro (véase fig. 1-14 F + G = 1). Las variaciones entre estas situa- ciones extremas proporciona una imagen final con una gama de grises (distintas intensidades), que re- fleja las diferentes densidades e indices de refrac- cidn de la preparacin estudiada (véase fig. 1-15). En sintesis, la funcién del microscopio de contraste de fase es combinar las ondas desfasadas y conver- tir las diferencias de fase en diferencias de amplitud (intensidad luminosa) a fin de poder detectar deta- lies en materiales no coloreados, por ejemplo, en cé- lulas vivas, mantenidas o cultivadas in vitro. Microscopio de contraste por interferencia diferencial EI microscopio de contraste por interferencia dife- rencial (DIC) posee un polarizador que filtra la luz que vibra en un solo plano y un juego de prismas es- peciales. Uno de ellos, ubicado cerca del condensador o sobre él, desdobla el rayo incidente en dos compo- nentes (dos ondas) que atraviesan la muestra. Los dos rayos luego son combinados nuevamente por un se- gundo prisma que los hace interferir para formar una imagen de aspecto tridimensional. Este microscopio fue disefiado para observar relieves en superficie de especimenes voluminosos, 0 dificiles de manejar 0 muy gruesos como para ser observados con el mi- croscopio de contraste de fase. Con el microscopio de interferencia también se pueden cuantificar los cam- bios de indices de refraccién. Como la densidad épti- ca y el retardo de fase del haz luminoso son propor- cionales a la masa de la muestra, es posible obtener datos cuantitativos de componentes celulares me- diante la comparacién de un haz luminoso de refe- rencia con las ondas de fase retardadas. Ademés, es posible traducir los cambios de fase como cambios de color y asi se obtienen imagenes de células vivas y “coloreadas” por medios épticos. Microscopio de fondo oscuro Se basa en la dispersion de la luz que provocan estructuras que pueden estar por debajo del limite de resolucién o en el limite de estructuras con dife- rente indice de refraccién. Esto se logra con un con- densador que sélo permite iluminar la preparacién, en forma muy oblicua (fig. 1-17). Asi, los compo- nentes celulares se observan brillantes por la dis persién de la luz (véase fig. 1-17 B) sobre un fondo negro, ya que la luz que no incide sobre las estruc- turas estudiadas no entra en el objetivo (véase fig. 1-17 A). Este microscopio, aunque no permite vi- sualizar los detalles estructurales, permite resolver particulas mas pequefias que las observadas con el microscopio comuin de campo claro. El efecto 6p' co es semejante a la visualizacién de las pequefias particulas que flotan en el aire de una habi cura donde entra un delgado rayo luminoso.