El dioxido de carbono supercritico (SCCO2), Co2 por encima este de su temperatura y presin critica (), a sido usado para

la extraccin, cromatografa y como solvente para catlisis qumica debido a que este es amigable con la naturaleza, inflamables, baja toxicidad y alta disponibilidad. La capacidad para manipular las porpiedades fsicas del solvente por el cambio simple de presin y temperatura es nico en sistemas supercriticos. La catlisis enzimtica se ha conducido en SCCO2, en lugar de en los medios convencionales para hacer las reacciones enzimticas ms ecolgicos. El uso de enzimas en solventes orgnicos a incrementado recientemente como intento de los qumicos para amplicar las aplicaciones de la biocatalisis. Muchos sustratos asi como muchos productos de reacciones, tienen baja solubilidad en agua haciendo las reacciones biocataliticas en fase acuosa difciles para emplear. Pero usando enzimas en solventes no acuosos esto hace posible superar la barrera, pero su uso en solventes organicos esta limitado por la actividad cataltica relativamente baja en comparacin con reacciones en agua. Por lo tanto, adems de la investigacin en curso en sistemas libres de solventes, la sntesis en fluidos supercriticos (SCF), puede ser potencialmente preferida como nueva alternativa para reacciones catalizadas con enzimas. Las enzimas empleadas en mas trabajos donde participan fluidos supercriticos mas especficamente, dixido de carbono, son lipasas. Las lipasas son mas bien enzimas estables que pueden convertir un rango general de sustratos en particular en hidrlisis y reacciones de esterificacin. Metodologia de superficie de respuesta es una colleccion de tcnicas estadsticas y matematicas, utiles para el desarrollo la mejora y optimizacin de procesos. Asi medir el desempeo o las caractersticas de calidad se llama la respuesta. Las variables de entrada son algunas veces llamadas variables independiente, y y son sujetas al control por cientficos e ingenieros. El campo de la metodologa de superficie de respuesta consiste en la estrategia experimental para explorar el espacio de el proceso o variables independientes, modelos estadsticos empricos para desarrollar una relacin adecuada entre la aproximacin los mtodos de produccin y las variables de proceso y optimizacin de encontrar los valores de las variables del proceso que producen deseable los valores de la respuesta [5]. La identificacin y adaptacin de experimentacin los datos de un modelo de superficie de respuesta apropiadas requiere un poco de uso de los fundamentos estadsticos del diseo experimental, un modelo de regresin tcnicas y mtodos de optimizacin. Los tres de estos temas generalmente se combinan en RSM. Los primeros informes sobre la enzima reacciones catalizadas en SCCO2 se en 1985 por Randolph et al., Hammond et al. y Nakamura et al. [25]. La ventaja de usar SCF para las reacciones enzimticas se ha demostrado por Mori et al. [6] y Kamat et al. [7], por ejemplo, mejorado velocidad de reaccin, el control de selectividad por las presiones, etc [1]. Las enzimas son capaces de catalizar las reacciones diferentes en un enantioselectiva manera. Enantioselectividad es una propiedad muy til de enzimticas accin, lo que permite la produccin de sustancias enantiopuro. Lo Se ha demostrado que las enzimas muchas veces se ven fuertemente afectados por la eleccin del solvente [8]. Los disolventes pueden modificar la conformacin de la enzima y por lo tanto alterar su eficiencia cataltica o especificidad que puede aumentar la regio-y enantioselectividades de reacciones.

El efecto biolgico de los compuestos quirales es dependiente de una de los enantimeros, por lo que es importante producir en enantiomricamente forma pura. Debido a su capacidad para catalizar reacciones, en lo orgnico como as como en sistemas acuosos, lipasas conducen a la sntesis enantioselectiva de la amplia variedad de compuestos [9]. Quiral?-Hidroxi cetonas especialmente benzoins son importantes en muchas unidades estructurales biolgicamente compuestos activos y se trata de bloques de construccin verstil en sntesis asimtrica [10]. Es importante para obtener enantiopuros benju de racmica benzoil-benju. Para ello, la enzima, temperatura y la presin effectswere estudiado para la sntesis de benju en SCCO2 y despus de 90 minutos, la conversin del 50% con un enantimero ms de 62% fueron realizadas por Candida cylindracea (CCL) en nuestro estudio anterior [11]. Este es el primer estudio para obtener las condiciones ptimas para exceso enantiomrico mximo de benju en SCCO2 los medios de comunicacin con RSM. Con el fin de aumentar en exceso enantiomrico, DMAP (4 dimetilaminopiridina) y trietilamina a la reaccin mezcla en condiciones ptimas.

2. Materiales y mtodos

C. cylindracea lipasa fue adquirido de Fluka. otros productos qumicos se obtuvieron de Merck. La hidrlisis enantioselectiva de benzoil-benju se llev a cabo en el reactor supercrtico de lotes de lquidos. Esquema del reactor SCCO2 se muestra en la fig. 1. Se compone de reactor con un volumen interno de 10 ml, 690 bar de presin mxima y 150 C de temperatura mxima, regulada por un termostato. 30 mg benzoyl-benzoin, el benju y el enzima se disolvieron 30 mg en 2 ml de DMSO (dimetilsulfxido) y 8 ml de fosfato de potasio (pH 50 mM, 7), respectivamente, luego se

mezcla y poner en el 10 ml de SCF del reactor y se ajust el pH mediante la adicin de HCl y NaOH soluciones. Se wasmeasured antes de comenzar el experimento, y tambin medida aftercompleting el experimento. Progreso de la reaccin Se vigilancia followedby cuidado con TLCanalysisupto50% de conversin [11]. Al final de la reaccin de la mezcla se extrajo con acetato de etilo para separar el benju y el benju de benzoilo. Actividad de la enzima de C. cylindraceawas probado a diferentes temperaturas (35-45 C) a 90 bar y 90 minutos el tiempo de incubacin en SCCO2. Se midi la actividad mediante el empleo de cido oleico y esterificacin oleil alcohol con la titulacin. Los experimentos se llevaron a cabo con enzima / sustrato (w / w): 1,5% y cido / alcohol relacin molar de 1.33 / 1 a 50 C. La velocidad del agitador fue de 200 rpm. En las condiciones dadas oleil alcohol, cido oleico y cylindracea C. se mezclaron y despus de 90 minutos de la muestra fue tomada de la mezcla de reaccin y se titula con NaOH 0,1 N [11]. Exceso enantiomrico de benju se determin mediante anlisis por HPLC. La columna se aplica a partir de las industrias Daicel tipo CHIRALCEL OD (0.46cm x 25 cm). Los compuestos fueron detectados con UVdetector a 254 nm. El columnwas funcionar a roomtemperature. La fase mvil fue n-hexane/2-propanol (9:1, v / v). Caudal se establece en 0,8 ml / min y el volumen de inyeccin fue de 10? L. DMAP y trietilamina son los peligrosos y comercialmente aditivos disponibles que se utilizan para aumentar la resolucin cintica [12]. Efecto de las bases (DMAP y trietilamina) fue investigado por la adicin de 5 mg de DMAP y trietilamina 1 ml de mezcla de reaccin a condiciones ptimas [11]. 3. Diseo experimental y optimizacin de RSM RSM consiste en un grupo de tcnicas empricas dedicadas a la evaluacin de las relaciones existentes entre un grupo de control factores experimentales y las respuestas medidas de acuerdo a uno ms criterios [13,14]. RSM utiliza un diseo experimental como como el diseo central compuesto para ajustar un modelo de mnimos cuadrados la tcnica. Si el modelo propuesto es el adecuado, segn lo revelado por la la comprobacin de diagnstico proporcionado por un anlisis de varianza (ANOVA) y los grficos de residuos, grficos de contorno no puede ser utilizada para estudiar la respuesta y encontrar el ptimo. Como la temperatura conocida, presin y pH son parmetros importantes para la sntesis de compuestos qumicos en el medio SCCO2 [15-19]. Los efectos de tres variables (T, P y pH) en el enantimero el exceso de benju en SCCO2 fueron estudiados mediante el uso de RSM. El diseo experimental ms comunes utilizados en RSM es el centro de compuesta de diseo (CCD), que tiene previsibilidad igual en todos los direcciones desde el centro [20]. De acuerdo con la central compuesto diseo, el nmero total de combinaciones es 2k 2 + k n0, donde k es el nmero de variables independientes y n0 el nmero de repeticiones de los experimentos en el punto central [21]. El alcance y la los niveles de las variables investigadas en este estudio se presentan en la Tabla 1. Sobre la base de los experimentos preliminares de los valores de temperatura, la presin y el pH se define teniendo en cuenta la degradacin de la enzima con la temperatura y el pH y las enzimas cambiar

4. Resultados y discusin 4.1. El diseo experimental con RSM Sobre la base de los experimentos preliminares, el efecto de la temperatura, la presin y el pH en exceso enantiomrico de benju se Estudi con RSM y la aplicacin de RSM arrojaron los siguientes ecuacin de regresin, que es una relacin emprica entre los valores de exceso enantiomrico de las variables de la prueba de benju codificada unidad. La siguiente es la ecuacin polinmica de segundo orden que muestra la superficie de respuesta instalado:

donde Y es la respuesta, es decir, exceso enantiomrico de benju, y x1, x2 y x3 se codifican los valores de la temperatura de la prueba los valores, presin y pH, respectivamente. Un resumen del anlisis de varianza se presentan en la Tabla

3. El anlisis de varianza de modelo de regresin cuadrtica demuestra que el modelo es Altamente significativa como se desprende de Fisher F-prueba de valor que con un 28,36 Baja probabilidad probability valor (Pmodel> F <0,0001). Este resultado indica que es estadsticamente significativa en el nivel de confianza del 99,999%. la bondaddel ajuste del modelo se verific mediante el coeficiente de determinacin (R2) [22]. En este caso, el valor del coeficiente de determinacin (R2 = 0,9623) indica que slo 3.77% no synthes is was de benju explicada por el modelo. El valor del coeficiente de determinacin ajustado R2 adj (0,9284) tambin es alta para abogar por los significados de alta del modelo. Falta de ajuste es la variacin de los datos alrededor de una cocina equipada modelo [20]. La falta de ajuste F-valor de 0,99 implica la falta de ajuste es no significativo en relacin con el error puro. El significado de cada coeficiente se determin por valor de F y P-(problemas) valor (Tabla 3). Los valores de "Prob> F" a menos de 0,0500 indican que los trminos del modelo son significativas. Correspondientes valores de p sugieren que, entre las variables de prueba utilizados en este estudio, x2 (presin), x3 (pH), x2 1 (temperatura) 2, x2 2 (presin) 2 y x2 3 (pH) 2 son

trminos significativos del modelo con los valores de p inferiores a 0,05. pH, plazas de la temperatura, la presin de las plazas y las plazas de pH tiene la mayor efecto en exceso enantiomrico de benju. Otras interacciones se encuentran para ser insignificante. El coeficiente de determinacin (R2) del modelo fue 0,9623, lo que indica que el modelo de una representacin adecuada de las relaciones entre los parmetros seleccionados. Los resultados del anlisis mostraron que los valores experimentales fueron significativamente de acuerdo con los valores previstos y tambin sugiri que el modelo de la ecuacin. (4) fue satisfactoria y precisa (Fig. 2). Las parcelas del modelo de segundo grado con una variable mantiene en constante nivel y las otras dos variables con los rangos experimentales se shownin Figs. 3-5.Symmetrical forma indica que una there was interaccin significativa entre los parmetros (P, T y pH; Figuras 3-5).. Fig. 3 representa la interaccin entre la presin y la temperatura. El exceso enantiomrico mayor al aumentar la presin de 70 bar a 80 bar y temperaturas desde 35 hasta 40 C. El mximo ee se obtuvo un 60%. A temperatura y presin constante aumento provoca un cambio en la conformacin de la enzima. Es posible mencionar que SCCO2 presin afectara a la estructura de la enzima, el cambio de su actividad especfica. Las interacciones entre Las molculas de CO2 y la enzima, cerca de la regin crtica, se incrementan y habilitada para estimular cambios en la conformacin de la enzima. Como resultado de esta interaccin los sitios activos de la enzima aparecen y catalizar

la sntesis enantioselectiva de benju a cierta presin. A altas presiones enantioselectividad disminuye debido a la formacin de los carbamatos que nos lleva a la inactivacin de los enzima [17,23]. En la literatura se han obtenido resultados similares. Presin podra inducir a la modificacin de la estructura y funcin de las partculas de la enzima que conduce a un cambio en la actividad de la enzima, aunque el papel de las molculas SCCO2 durante el paso de catalizador an no est bien entendido. Ikushima et al. [23] inform sobre el posible efecto de las molculas de CO2 en la actividad de la lipasa. Los investigadores estudiaron estructuras secundarias de una enzima en SCCO2 y las interacciones que operan entre de dixido de carbono y molculas de la enzima. Se encontr que SCCO2 medio en la regin crtica prximo, debe ser un disparador para la activacin de la enzima que causa el movimiento de los grupos de la superficie y la creacin de un sitio activo, produciendo una maquinaria estereoselectiva. De una manera correspondiente, los otros autores seal que enantioselectividad dependa de la presin en la hidrlisis enzimtica la 3-hidroxi-5-fenil-4pentenoicacidethylester [17]. enantioselectividad aumento de la presin y en el 103 el valor mximo de barras se alcanz. Despus de la enantioselectividad se redujo con de presin. Ellos pensaban que por encima de 103 bar la

enantioselectividad lo que indica una disminucin de la inactivacin directa de la enzima por la formacin de los carbamatos. Formacin de carbamatos lleva a la inactivacin de la enzima. Estos efectos predomin una presin superior a 103 bar. Del mismo modo, la esterificacin de alcohol por trifluorometilo lipasewas examinado [1] y se encontr que el 55 C, enantioselectividad disminuye cuando la presin (8-19MPa) aument. Propusieron que el gran cambio en la densidad podra cambiar significativamente la interaccin de CO2 y la enzima, provocando la formacin de los carbamatos de de dixido de carbono y los grupos amino libres en la superficie de la enzima. Estas interacciones pueden cambiar la conformacin de la enzima en respuesta a la presin. Ikushima et al. [23] utiliza la transformada de Fourier infrarroja (FTIR) espectroscopia de supervisar la conformacin de la enzima durante SCCO2 esterificacin. En un rango limitado de presin de 7,7 8.5MPa, dramtica cambios en la C. cylindracea lipasa ocurrido para aumentar la velocidad de las reacciones de esterificacin. El rango de presin en la que el

enzima cataliza la produccin de compuestos pticamente activos coincidi con el rango de presin en la que el repentino conformacional los cambios se llev a cabo [23]. En la esterificacin del cido n-valrico y citronelol en SCCO2, Ikushima [24] observ un fuerte aumento en la velocidad de reaccin a presiones cercanas a la regin crtica de CO2. En la figura. 4, los efectos de la temperatura y el pH en enantiomrica el exceso se muestra. A valores de pH bajos (hasta pH 7) enantiomrica el exceso de aumento de hasta 40 C, luego disminuy debido a la inactivacin de la enzima en funcin de la temperatura. La actividad enzimtica se determina como 0,044, 0,0398 y 0,038 mol de ster / g de enzimas para la 35, 40 y 45 C, respectivamente, a 90 bar. La disminucin de exceso enantiomrico por la temperatura tambin puede atributo de densidad decreciente por la temperatura a presin constante. Disminucin de la densidad de los resultados de baja interaccin entre el CO2 y la enzima. En particular, en condiciones supercrticas, las pequeas variaciones en el resultado de la presin en los valores de alta densidad

y, en consecuencia es posible en gran medida varan todos los dependientes de la densidad de otras propiedades. Este comportamiento tambin est bien documentada por algunos autores [3]. El aumento de la densidad tambin provoca un aumento en supercrticos poder disolvente en fase y, en consecuencia, hay una mayor interaccin entre la enzima y el CO2. Fig. 5 representa el efecto del pH y la presin sobre los enantimeros el exceso de benju. Exceso enantiomrico pasado por amaximum y luego disminuy al aumentar la presin. A pH 7 y 80 bares de presin llev al exceso enantiomrico mximo. Los valores ptimos de las variables mediante la resolucin de la ecuacin. (4) con el experto en diseo de software se obtuvieron a 40 C, 78,9 bar y pH 6,4 al 62% (R-benju). Con el fin de verificar este resultado, la sntesis de benju en SCCO2 se llev a cabo en condiciones ptimas, el 63% (R-benju) de enantimeros valuewas exceso obtenido experimentalmente de acuerdo con la prediccin del modelo. En condiciones ptimas (a 40 C, 78,9 bar y pH 6,4), la efectos de las bases aadido al medio de reaccin como DMAP (4 -

dimetilaminopiridina) y trietilamina en exceso enantiomrico fueron investigados. La adicin de DMAP considerablemente mejorada el exceso enantiomrico (80% S-benju), mientras que trietilamina haba efecto negativo en ee. Es interesante que DMAP cambiado tambin el steroselectivity como S-benju. 5. conclusiones RSM xito podra optimizar las condiciones de reaccin para maximizar el exceso enantiomrico de benju. Las condiciones ptimas fueron 40 C, 78,9 bar y pH 6,4, el ms alto enantiomrica exceso de benzoinwas 62% (R-benju). En las condiciones ptimas DMAP fue aadido al medio de reaccin y el exceso enantiomrico alcanz el 80% (S-benju). Este estudio es el compromiso de seguir Los estudios con otros hidroxi-cetonas en medio de reaccin SCCO2.