GLUCLISIS

CONOCIMIENTOS REQUERIDOS
a) Gluclisis: etapas. b) Destino del piruvato en condiciones anaerbicas: fermentacin.

BIBLIOGRAFA: - D. L. Nelson y M. M. Cox. Lehninger. Principios de Bioqumica Ed. Omega SA, 5 edicin (2009). - L. Stryer, J. M. Berg y J. L. Tymoczko. Bioqumica. 6 edicin (2008).

La gluclisis es el proceso mediante el cual se degrada una molcula de glucosa en una serie de reacciones catalizadas enzimticamente, dando como resultado dos molculas de piruvato. La energa libre cedida por la glucosa durante la serie de reacciones de la gluclisis se conserva en forma de ATP y NADH (Figura 1).

Gluc
Hexoquinasa

Gluco
Fosfohexosa isomerasa

Fructo
Fosfofructoquinasa-1
Figura 1. Gluclisis.
2

Fructosa

El piruvato formado puede tener diferentes destinos segn las condiciones, el organismo o el tejido donde se produce la gluclisis. En los organismos o tejidos aerbicos, en condiciones aerbicas, el piruvato se oxida completamente a CO2. Los electrones de esta oxidacin pasan al O2 a travs de una cadena de transportadores en la mitocondria, formando H2O, la energa procedente de las reacciones de transferencia electrnica impulsa la sntesis de ATP. En el msculo esqueltico, cuando hay bajas concentraciones de oxgeno (hipoxia), el piruvato se reduce a lactato y acepta los electrones del NADH, regenerando as el NAD+ para que contine la gluclisis. Este proceso tambin ocurre en algunos tipos celulares o tejidos como eritrocitos o retina, an en condiciones aerbicas, y en algunos microorganismos y se denomina Fermentacin lctica. En algunos tejidos vegetales y ciertos microorganismos, como la levadura de cerveza o de panificacin, bajo condiciones anaerbicas o de hipoxia, el piruvato se convierte en etanol y CO2, proceso denominado Fermentacin alcohlica (Figura 2). Glucosa
Gluclisis

2 Piruvato
Condiciones anaerbicas o de hipoxia Condiciones aerbicas Condiciones anaerbicas o de hipoxia

2CO2

2 Etanol + 2CO2
Fermentacin etanlica en levaduras

2 Lactato 2 Acetil-CoA
Ciclo del cido ctrico Fermentacin lctica en miocitos, eritrocitos y algunos microorganismos

4CO2 + 4H2O
Animales, plantas y microorganismos en condiciones aerbicas

Figura 2. Destinos del piruvato.

La regulacin de la velocidad de gluclisis se consigue, en parte, mediante el control alostrico de varias de las enzimas involucradas, especialmente aquellas que catalizan las reacciones irreversibles: hexoquinasa (HK), fosfofructoquinasa-1 (PFK-1) y piruvato quinasa (PK). A continuacin se detallan algunos inhibidores y activadores de la gluclisis y la enzima sobre la que actan:

Enzima Hexoquinasa PFK-1

Inhibicin/activacin Inhibida por fenilalanina, EDTA, citrato, oxalacetato y su producto (la glucosa 6-fosfato). Inhibida por cidos grasos de cadena larga, fenilalanina, ATP y citrato. Activada por ADP, AMP y fructosa 2,6-bisfosfato. 3-P Inhibida por Hg2+ y agentes alquilantes (iodoacetato, iodoacetamida) que bloquean el sitio activo de la enzima, y arseniato, que compite con el fosfato inorgnico. Inhibida por fluoruro, por formacin de un complejo fluorfosfato de magnesio en el sitio activo de la enzima. Inhibida por Ca2+, que compite con el Mg2+, alanina, citrato, cidos grasos de cadena larga, ATP y Acetil CoA. Activada por fructosa 1,6-bisfosfato.

Gliceraldehdo deshidrogenasa Enolasa Piruvato quinasa

TRABAJO PRCTICO OBJETIVO:

Determinar el consumo de glucosa por levaduras en presencia de diferentes efectores.

Materiales y reactivos:

- Glucosa 1,25 mM - Fosfato de sodio 50 mM pH 5,5 - Fluoruro de sodio 200 mM - Cloruro de calcio 200 mM - Fructosa 1,6-bisfosfato 10 mM - Vaselina lquida - Levaduras (en polvo) 1 % (p/v) - Reactivo comercial para la determinacin de glucosa en sangre por el mtodo enzimtico GOD/POD:

GOD/POD: solucin de glucosa oxidasa (GOD, 1000 U/ml) y peroxidasa (POD, 120 U/mL). Reactivo 4-AF: solucin de 4-aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0,92 mol/L. Reactivo Fenol: solucin de fenol 55 mmol/L.

Procedimiento: Siga el protocolo experimental que se indica en la tabla siguiente: TABLA

Glucosa (mL) 0.5 1 1.5 2 2 2 2 2 2 Buffer Fosfato (mL) 1 1 1 1 1 NaF (mL) 1 CaCl2 (mL) 1 Fructosa 1,6-bP (mL) 1 Agua (mL) 2.5 2 1.5 1 0.5 1 1 Levaduras (mL) 1 1 1 1 1

Tubo 1 2 3 4 5 6-7 8-9 10-11 12-13 14-15

1) Las levaduras se agregan a todos los tubos en el mismo momento. 2) Tomar una alcuota de 1 mL de los tubos N 6 al 15, rotular como tiempo 0 y conservar en hielo. 3) Agregar 0,8 mL de vaselina lquida sobre la superficie del lquido en los tubos N 14 y 15. 4) Poner a incubar los tubos N 6 al 15 en un bao termosttico a 30C. Luego de 45 min de incubacin, tomar alcuotas de 1 mL de cada tubo y rotular como tiempo 45 min. Para tomar la alcuota de los tubos 14 y 15, se deber atravesar la vaselina con la pipeta y tomar slo la fase acuosa. 5) Centrifugar durante 2 min a 3000 rpm todas las alcuotas de 1 mL (tiempo 0 y tiempo 45 min). Las alcuotas rotuladas como tiempo 0 se pueden centrifugar mientras transcurren los 45 min de incubacin. 6) Tomar 0,3 mL del sobrenadante de todos los tubos centrifugados y de los tubos N 1 al 5 para cuantificar la glucosa.

Cuantificacin de glucosa por el mtodo de la Glucosa Oxidasa-Peroxidasa: Se llevar a cabo por el mtodo enzimtico de acuerdo con las siguientes reacciones: Glucosa oxidasa Glucosa + O2 + H2O D-Glucono- -lactona + H2O2 Peroxidasa 2 H2O2 + 4-AF + Fenol 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona + 4 H2O Para cuantificar la glucosa consumida preparar: 0,7 mL de agua + 0,3 mL de muestra + 0,5 mL de reactivo de glucosa (GOD/POD) Incubar 10 min a 37 C y medir la absorbancia en 505 nm.

Anlisis de los resultados 1. Realice la curva de calibracin de absorbancia en funcin de la concentracin de glucosa. 2. Calcule el porcentaje de glucosa consumido en cada condicin. Discuta los resultados. 3. Compare los resultados obtenidos en los tubos N 6-7 y N 14-15. Explique su respuesta teniendo en cuenta el metabolismo involucrado. 4. Si usted desea determinar el contenido de glucosa en una muestra de suero, elegira el mtodo de la Glucosa Oxidasa o el de Somogyi-Nelson? Justifique su respuesta.