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Recuperación e identificación de ADN Y­STR humano a partir de inmaduros

de chrysomya albiceps (Diptera: Calliphoridae). Simulación de investigación de
delito sexual con cadáver de víctima en estado de descomposición
CA Chamouna,b, *, MS Couric , RG Garridod , RS Moura­Netoe , J. Oliveira­Costaf
aDepartamento de Criminalística de la Policía Civil del Estado de Espírito Santo, CEP: 29.045­402, Vitóri, ES, Brasil
b
Instituto Federal de Educación, Ciencia y Tecnología de Espírito Santo (IFES), CEP: 29.135­000, Viana, ES, Museo
C
Nacional de Brasil, Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ), Departamento de Entomología, CEP: 20940­040, RJ , Brasil
d
Instituto de Investigación y Peritaje en Genética Forense, IPPGF de la Policía Civil del Estado de Río de Janeiro, CEP: 20211­040, RJ, Brasil
eUniversidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ), Instituto de Biología, CEP: 21.941­902, RJ, Brasil
F
Instituto de Criminalística Carlos Éboli (ICCE), Policía Civil del Estado de Río de Janeiro, CEP: 20.060.050, RJ, Brasil

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

Historia del artículo: El número de delitos sexuales en Brasil, como en varios otros países, es muy elevado. En muchos de estos crímenes las mujeres
Recibido el 22 de julio de 2019 violadas son asesinadas y sus cuerpos son encontrados días después, en avanzado estado de descomposición, con una intensa
Recibido en forma revisada el 13 de febrero de 2020 fauna cadavérica. La Entomología Forense estudia insectos y otros artrópodos que pueden utilizarse en el análisis pericial de diversos
Aceptado el 8 de marzo de 2020
tipos de delitos. Los dípteros, el orden de insectos que comprende las moscas verdaderas o de dos alas, representan uno de los
Disponible en línea el 10 de marzo de 2020
grupos de insectos más grandes conocidos y es la principal fuente de entomofauna cadavérica. Miembros de su familia Calliphoridae
se observan en cadáveres en todas las fases de descomposición. La recuperación e identificación del ADN Y­STR humano del tracto
Palabras clave:
gastrointestinal de los gusanos y pupas de la especie Calliphoridae Chrysomya albiceps puede proporcionar una buena herramienta
entomología forense
para la recopilación de pruebas en investigaciones de delitos sexuales que involucran violación y muerte, en las que el cuerpo de la
genética forense
Delitos sexuales víctima abandonada se encuentra en un estado de putrefacción. En este estudio, el modelo animal utilizado fue una cerda, Sus

Violación
scrofa, la cual fue sacrificada en una zona boscosa con tres disparos de una pistola Taurus calibre 0,40, e inoculada con semen en
Asesinato sus regiones anal y vaginal, simulando violación y homicidio. Durante la descomposición, se recolectaron entre 20 y 80 gusanos cada
Perfil criminal 24 h y se conservaron en alcohol al 70 %, totalizando 289 gusanos y 157 pupas (446 inmaduros) durante un período de 14 días (336
h) de descomposición. Luego se diseccionó cada gusano para extraer el tracto digestivo, que se colocó en un tampón de extracción.
La fase molecular procedió con la extracción, cuantificación, amplificación y electroforesis capilar de las muestras, probando 16 loci
STR del cromosoma Y. Fue posible establecer un perfil parcial de ADN Y­STR, con amplificación de hasta ocho sitios, considerando
una combinación de las muestras tomadas en las horas 144 h, 168 h, 192 h, 216 h, 240 h, 288 h, 312 h y 336 h.

© 2020 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

1. Introducción
El Instituto de Investigaciones Económicas Aplicadas (IPEA—Instituto de
Pesquisa Econômica Aplicada) publicó que en Brasil, sólo en 2016, la policía
registró 49.497 casos de violación. Dado que se trata de un delito que no se
denuncia en gran medida (alrededor del 90% no se denuncia), el número real
de mujeres violadas anualmente en Brasil probablemente oscila entre 300.000 y
* Autor correspondiente.
Direcciones de correo electrónico: biochamoun@gmail.com, chamoun@ifes.edu.br
(CA Chamoun), courimarcia@gmail.com (MS Couri),
grazinoli.garrido@gmail.com (RG Garrido), rsmneto@biologia.ufrj.br (RS Moura­Neto),
janyraforensebio@gmail.com (J. Oliveira­Costa).
500.000 casos. Fuentes del Ministerio de Salud indican que la gran mayoría
de las víctimas de violación son mujeres y casi todos los violadores son
hombres (portadores del cromosoma Y). Además, los últimos datos oficiales
también muestran que el número de denuncias de violación aumentó un 90,2
% entre 2011 y 2016 en Brasil [1]. Según el "Dossier de la Mujer", en 2017
hubo un aumento del 5,1 % en Río de Janeiro, en relación al año anterior,
con un total de 4.173 mujeres violadas, equivalente a 11 mujeres violadas por
día sólo en Río de Janeiro . 2].
En 2016, 4.645 mujeres fueron asesinadas en el país, lo que representa
una tasa de 4,5 homicidios por cada 100.000 brasileños. En los últimos 10
años, hasta finales de 2018, hubo un aumento del 6,4 % en el número de
mujeres asesinadas en Brasil [1]. Es importante resaltar que muchas víctimas
de violación son asesinadas y sus cuerpos abandonados, encontrándose los
cadáveres días después del crimen, ya

http://dx.doi.org/10.1016/j.forsciint.2020.110239 0379­0738/© 2020

Elsevier BV Todos los derechos reservados.
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2 CA Chamoun et al. / Ciencias Forenses Internacional 310 (2020) 110239
en avanzado estado de descomposición, lo que dificulta la investigación penal, ya
que a medida que pasa el tiempo se encuentran menos rastros probatorios de los
perpetradores. Los gusanos de las moscas pueden servir como fuentes valiosas de
información especializada y los insectos ya se han utilizado como vestigios
importantes de diversos tipos de delitos. Uno de los órdenes de insectos más
grandes es el Diptera, y su relevancia es aún más crucial en los casos en que hay
cadáveres en descomposición, debido a la presencia predominante de moscas que
ponen huevos. La familia Calliphoridae contiene diversas especies necrófagas de
importancia en Entomología Forense, siendo de particular interés la especie
Chrysomya albiceps [3].
Las investigaciones han demostrado que C. albiceps se encuentra comúnmente
asociado con la mayoría de los cadáveres, en todas las etapas de descomposición,
y se ha encontrado en el sur de Europa, África, India y China, así como en América
del Sur y Central [4] . Estudios con cadáveres de conejos en Kuwait han demostrado
la abundante presencia de C. albiceps en ambientes agrícolas y urbanos [5],
mostrando la gran capacidad depredadora de esta especie en el segundo y tercer
estadio de su ciclo de vida, confirmando su notable competitividad, frente a otras
especies, al tiempo que refuerza su clasificación como un importante indicador
forense [6].
Las nuevas técnicas de biología molecular que implican la recuperación,
aislamiento e identificación de ADN humano ingerido por gusanos cadavéricos
pueden ayudar en la investigación de delitos sexuales, especialmente en casos de
violación que involucran a una víctima fallecida, encontrada días después, en
estado de putrefacción. Varios estudios han demostrado la vulnerabilidad de las
mujeres a la violencia sexual. Investigaciones realizadas en varios países muestran
que una de cada 14 mujeres ha sido abusada sexualmente y que existe un gran
subregistro de este tipo de delitos [7].
Se realizaron estudios pioneros en el aislamiento y amplificación de ADN humano
utilizando un marcador STR forense (D18S51) en muestras recolectadas de
chinches Cimex lectularius L [8]. Con el uso de larvas de Calliphora vicina, que se
alimentaban de cadáveres humanos, fue posible recuperar ADN autosómico
humano y cromosoma Y [9]. Utilizando marcadores STR y SNP de larvas de tercer
estadio de especies de Lucilia sericata que se alimentan de heridas diabéticas, fue
posible obtener un perfil completo de ADN humano [10].
Recientemente, en Brasil, investigadores y expertos criminalistas han
demostrado la posibilidad de recuperación in vitro del ADN Y­STR de gusanos de
C. albiceps que se alimentaban de carne de res mezclada con semen humano,
incluso después de varios días de descomposición [11] . Anteriormente, las
investigaciones demostraron la posibilidad de amplificar el material de ADN
recolectado de las superficies de los lugares del crimen, utilizando muestras
defecadas y regurgitadas por moscas adultas alimentadas con sangre y fluidos
biológicos de cerdos en putrefacción [12] .
También vale la pena mencionar que algunos estudios ya han demostrado que
las pruebas de los testigos, especialmente en casos de delitos sexuales, no
presentan una confiabilidad satisfactoria. Se cometen errores en la identificación de
sospechosos inocentes y puede producirse confusión de detalles entre distintos
acontecimientos [13]. Esto refuerza la idea de que la identificación de testigos,
como prueba condenatoria en delitos sexuales, presenta un riesgo de condena
injusta [14].
El objetivo de este trabajo fue verificar la posibilidad de recuperar e identificar
ADN Y­STR humano, in situ, obtenido de gusanos y pupas de Chrysomya albiceps,
en condiciones similares a las encontradas en las escenas del crimen donde la
víctima fue violada, asesinada y encontrada. en estado de decadencia. La intención
era permitir la recuperación de pruebas para ayudar a la policía, los fiscales y el
poder judicial a absolver a sospechosos inocentes y procesar a los culpables.
2. Materiales y métodos
2.1. Colección y disección de insectos.
Inicialmente se construyó una zona boscosa dentro de las instalaciones del Centro de Capacitación y
Centro de Perfeccionamiento (CFA) de la Policía Militar del Estado de
Se utilizó Espíritu Santo (PM­ES) (coordenadas: 20180 26.3100 S, 40220 59.0700
E). Aquí se llevó a cabo el sacrificio del modelo animal utilizado para atraer insectos,
la observación del proceso de descomposición de los cadáveres y la recolección
de los insectos atraídos.
Se utilizó como modelo una cerda doméstica de la especie Sus scrofa, con un
peso de 15,0 kg (Fig. 1). El animal se obtuvo de un proveedor comercial autorizado.
Se proporcionó transporte de animales apropiado entre esta fuente comercial y
nuestras instalaciones de investigación.
Luego, el animal fue llevado al lugar de la investigación en condiciones humanas,
con alimentación, temperatura y ventilación adecuadas, acompañado por un
veterinario. Para simular una muerte violenta en el lugar, en una zona boscosa, el
animal fue sacrificado con dos disparos en la región cefálica, a quemarropa (no
más de 40 cm), con una pistola Taurus calibre .40, modelo 940 S&W, por un tirador
experimentado seguido de un desangrado, que provocaba la muerte inmediata
(unos segundos) con el menor sufrimiento posible.
La muerte fue confirmada por un veterinario. Menos de un minuto después de que
el animal fuera sacrificado, las moscas comenzaron a poner huevos (Fig. 2). Este
experimento fue realizado de acuerdo con la ley y los lineamientos asociados para
experimentos con animales y autorizado por el Comité de Ética de la Policía Técnica
y Científica de Espíritu Santo.
Los estudios han demostrado que, en promedio, un hombre sano eyacula 4,5
ml de semen [15]. En vista de esto, se utilizó un volumen de semen inferior al
promedio, para fortalecer la validez de los resultados obtenidos. Luego de la muerte
del animal, se inocularon 3,0 mL de semen humano (de donante voluntario y
anónimo) en las regiones anal y vaginal (1,5 mL en cada región), utilizando una
jeringa de plástico, simulando la eyaculación del violador.
Después de la inoculación con semen humano, el cadáver del animal expuesto
se colocó en contacto directo con el suelo y se protegió con una jaula con estructura
de metal, cubierta con alambre de gallinero en cinco lados (con agujeros lo
suficientemente grandes para que las moscas pasaran fácilmente), pero el sexto
lado abierto, mirando hacia el suelo, inmovilizado para evitar que los grandes
carroñeros lo giren y accedan al modelo animal (cadáver de cerdo). La jaula era
rectangular y medía 90 cm de largo, 70,0 cm de ancho y 50,0 cm de alto (Fig. 3).
Desde el cuarto día de descomposición, cuando aparecieron las larvas de
mosca del primer estadio, hasta el día 14 después de la muerte del animal, se
recolectaron gusanos de Chysomya albiceps en y alrededor de las regiones anal y
vaginal. Todas las recolecciones de pupas se realizaron sobre y dentro del suelo,
alrededor del cuerpo. Este período comprendió las etapas inicial, moderada y
avanzada de la descomposición cadavérica.
Los gusanos Chrysomya albiceps fueron elegidos para esta investigación
porque, entre las especies de dípteros carroñeros y alimentarios de Brasil, estas
larvas son las únicas que tienen procesos laterales y dorsales carnosos, que
terminan en un mechón de pelos o una corona de espinas fuertemente pigmentadas
en el ápice. Los gusanos fueron fácilmente identificados en el campo gracias a
estas características morfológicas, únicas entre las especies presentes en Brasil.
Además
Fig. 1. Cerdo Sus scrofa baleado con arma de fuego.
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Fig. 2. La puesta de huevos por moscas cadavéricas comienza menos de un minuto después del sacrificio.
Fig. 3. Jaula con estructura de metal cubierta con alambre de gallinero.
que esta mosca es la especie más frecuente asociada a cadáveres en Brasil.
En el laboratorio, las larvas fueron examinadas bajo estereomicroscopio para
confirmar sus peculiares características morfológicas. De esta manera se
ratifica la identificación taxonómica utilizando la literatura [16] y también
mediante la crianza de parte del material recolectado [3,17] hasta la etapa
adulta.
Se acordó que una muestra esté compuesta por entre 20 y 80 gusanos,
dándose prioridad a las larvas presentes en las vías anal y
Fig. 4. Gusanos y pupas en placa de Petri (a). Gusano del tercer estadio antes (b) y después de la disección (c). La flecha punteada (mostrada en "b") indica la dirección del corte, desde la región posterior (Pr) hasta la
región anterior (Ar).
3
regiones vaginales. Todas las pupas en el suelo dentro de un radio de 2,5 m
del cuerpo y una profundidad de 10 a 15 cm se recolectaron utilizando una
paleta de jardín y un tamiz. Todo el material recolectado fue etiquetado con la
fecha de recolección y el tiempo de descomposición. Las muestras de gusanos
de C. albiceps se conservaron en alcohol al 70 %, donde permanecieron
hasta su disección.
El material recolectado fue llevado a los laboratorios de Dípteros del
Museo Nacional, Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ/MNRJ), Brasil
y al Laboratorio de Entomología Forense del Instituto de Criminalística Carlos
Éboli, Policía Civil, Río de Janeiro, Brasil.
En el laboratorio, los gusanos colectados fueron lavados individualmente,
externamente, con alcohol al 70 % y agua destilada, con el fin de eliminar
cualquier posibilidad de presencia de semen en superficies externas.
Todas las puparias se diseccionaron bajo un estereomicroscopio con la
ayuda de fórceps suaves y agujas hipodérmicas. Este procedimiento facilita
la extracción completa del pupario, evitando dañar la muestra para su posterior
disección. Luego se diseccionaron las larvas y pupas para eliminar su
contenido, incluida la parte inicial del intestino y los tejidos adyacentes. El
acceso a la disección se realizó por la región ventral, en orientación posterior­
anterior, utilizando bisturí metálico (Fig. 4), pinza metálica, placa de Petri de
vidrio (como soporte) y microscopio estereoscópico. Se hizo todo lo posible
para extirpar sólo los primeros dos tercios de las vísceras de los gusanos [11].
A algunas pupas más viejas no se les pudieron diseccionar las vísceras
porque ya se estaban convirtiendo en moscas inmaduras.
Las vísceras se mantuvieron en matraces Eppendorf de 2,0 mL, con 1,5
mL de tampón de extracción, durante al menos 18 h y como máximo 24 h de
incubación a temperatura ambiente, para su posterior análisis molecular.
Se lavaron bisturíes, pinzas y cajas de Petri con agua corriente, alcohol al 70
% y agua destilada, entre las disecciones de cada muestra [11].
2.2. Extracción y amplificación de ADN Y­STR
Esta etapa del experimento se llevó a cabo en el Instituto de Investigación
y Peritaje en Genética Forense (IPPGF) de la Policía Civil del Estado de Río
de Janeiro. La muestra de referencia, recolectada del donante voluntario de
semen con hisopo oral, se sometió a extracción con resina Chelex 1001. Es
importante decir que la extracción con Chelex es una técnica de rutina para
muestras de referencia en el laboratorio de ADN de la Policía, ya que es de
bajo costo y no utiliza solventes orgánicos, lo que no genera daño al experto
ni al medio ambiente [18] .
Las muestras del tracto digestivo de gusanos, obtenidas en la fase
entomológica (Colección y disección de insectos), fueron sometidas a
extracción orgánica del ADN mediante la técnica de fenol­cloroformo­alcohol
isoamílico [19], siguiendo el protocolo de extracción de tejidos blandos .
Después de completar el fenol
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Durante la extracción con cloroformo, todas las muestras se lavaron dos veces
en etanol absoluto, para mejorar la purificación del producto final. La
cuantificación del ADN total se realizó utilizando 2,0 ml de la muestra original
de la resuspensión de extracción final (mantenida a ­20 C) y 48 ml de H2O
ultrapura (Milli QTM) en una dilución 1/25 (una parte de muestra: veinticinco
partes de agua). . La estimación del ADN total y verificación de posible
contaminación por proteínas, fenol y ARN se realizó con el uso de un
espectrofotómetro, utilizando las proporciones 260/280 y 260/230 en la lectura
del cuantificador GeneQuant, en el que se utilizó un volumen de 50mL . Se
utilizó la dilución mencionada anteriormente. Después de la evaluación inicial
del ADN total, se cuantificó el ADN Y humano específico utilizando el sistema
de PCR en tiempo real 7500 (Life Technologies) sin software HID, utilizando el
kit de cuantificación de ADN QuantifilerTM Trio (Thermo­Fisher). Cuando el
material extraído no alcanzó las cantidades requeridas para la amplificación,
se utilizaron técnicas auxiliares de reextracción, purificación y concentración
de ADN, como el kit DNA IQ1 de Promega y la técnica Microcon (Millipore),
respectivamente.
Las amplificaciones de ADN de Y­STR se realizaron mediante la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un termociclador GeneAmp
PCR System 97001 (Life Technologies) utilizando el kit AmpF'STR1 Yfiler (Life
Technologies). En total, se probaron 16 loci en el cromosoma Y: DYS456;
DYS389I; DYS390; DYS389 II, DYS458; DYS19; DYS385; DYS393; DYS391;
DYS439; DYS635; DYS392; GATA H4; DYS437; DYS438; DYS448.
Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis
capilar en un analizador genético ABI PRISM 3100 Avant (Life Technologies),
con la ayuda del software ABI Prism 3100, Data Collection v1.0 y GeneMapper
v3.2 (Life Technologies), para la detección. del polimorfismo del Y­STR
humano. La búsqueda de haplotipos, para verificar si el número de loci
amplificados permitiría determinar el origen geográfico del haplotipo Y, se
realizó buscando en la base de datos YHRD (www.yhrd.org) utilizando un
haplotipo completo con 16 loci.
3. Resultados
Durante esta investigación, la temperatura varió de 19,2 C a 30,6 C y la
humedad relativa del aire de 46 % a 89 %. La recolección de gusanos se inició
a partir del 4° día de descomposición (96 h) en adelante, ya que en los días
anteriores (1°, 2° y 3° día) no hubo cantidades significativas. A partir del octavo
día de descomposición, solo se habían recolectado gusanos (en su mayoría
de tercer estadio) y, a partir del día 11, solo pupas (Tabla 1). Durante este
proceso se recolectaron 446 individuos, comprendidos 289 gusanos y 157
pupas.
Los electroferogramas mostraron que hubo amplificación en las muestras
desde el día 6 hasta el día 14 de descomposición, es decir, desde las 144 h
hasta las 336 h después de la muerte del animal, excepto en la muestra de
264 h, en la que no se amplificó ningún sitio. . Hubo un
Cuadro
1 Número de larvas y pupas de C. albiceps recolectadas por día de descomposición.
TIEMPO DE DESCOMPOSICIÓN INDIVIDUOS RECOGIDOS
larvas
51
96 horas (Día 4) 120
horas (Día 5) 144 53
horas (Día 6) 168 76
28
horas (Día 7) 192
horas (Día 8) 216 32
horas (Día 9) 240 48
horas (Día 10) 264 horas 11
(Día 11) 288 horas ( Día 0 18
12) 312 horas (Día 13) 0 23
336 horas (Día 14)
0 0 289
Total: 14 días
variación de 1 a 3 loci amplificada al analizar las muestras individualmente. La
muestra de 240 h fue de la que se obtuvo mayor cantidad de loci amplificados
y las muestras de 216 h, 288 h y 312 h fueron las que proporcionaron menor
número. Los resultados de las muestras combinadas demostraron la
amplificación de ocho de los 16 loci analizados.
En los electroferogramas de las muestras de 96 h (cuarto día de
descomposición) y 120 h (quinto día de descomposición) no se observó
amplificación de ningún locus, más allá de la muestra de 264 h mencionada
anteriormente. Los sitios amplificados con mayor éxito fueron DYS456 y
DYS458, con amplificación en cuatro y tres muestras, respectivamente. Los
que obtuvieron menor tasa de amplificación fueron DYS389II, DYS390,
DYS385, DYS439, DYS635 y DYS392.
La Tabla 2 presenta los resultados de amplificación individuales de las muestras
y los resultados combinados, en comparación con el haplotipo de referencia.
4. Discusión
La amplificación exitosa del ADN extraño en las muestras combinadas, a
pesar de la avanzada descomposición en modelos animales, demuestra el
buen potencial de esta técnica para su aplicación en el área criminal porque, a
medida que pasa el tiempo después del acto criminal, cada vez se pueden
encontrar menos rastros probatorios. por expertos criminalistas en la escena
del crimen. Clery [20] probó in vitro solo cuatro loci Y­STR (DYS19, DYS389I,
DY389II y DYS390), de gusanos de Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae),
utilizando una proporción de semen de 4 a 12 veces mayor que la utilizada en
el presente estudio. y mantener la temperatura controlada, algo inusual en el
lugar de una muerte violenta. Además, utilizó sólo dos programas para
recolectar gusanos (48 h y 145 h), lo que dio como resultado solo una muestra
de descomposición de 48 h, que en la práctica representaría una
descomposición inicial (moderada). Evidentemente, una de las principales
razones de este resultado satisfactorio (en comparación con los resultados de
Clery [20]) es la mejora de las técnicas y reactivos, como el poder de
amplificación de los kits utilizados actualmente en los laboratorios de ADN
forense de rutina, los capilares más sofisticados equipo de electroforesis y la
diferencia entre las técnicas de extracción utilizadas en los dos estudios (Clery
[20] solo utilizó extracción con Chelex), contribuyendo a un producto de
extracción final más amplificable.
Recientemente, se demostró la posibilidad in vitro de recuperar e identificar
ADN Y­STR humano a partir de gusanos alimentados con 600,0 g de carne de
res más 3,0 ml de semen humano después de 8 días de descomposición, con
éxito en la amplificación de 15 de los 16 loci probados [ 11 ]. En el estudio en
cuestión, realizado in situ, se amplificaron 8 loci de los 16 probados, después
de 14 días de descomposición. Sin embargo, las condiciones del presente
estudio son mucho más cercanas a las observadas en una escena del crimen
real, ya que se utilizó un modelo animal muy similar para la alimentación de
las larvas, con exposición total a los elementos climáticos que actúan sobre los
cadáveres de la escena del crimen real, como la lluvia. , la radiación solar y las
variaciones tanto bruscas como continuas de temperatura y humedad. Además,
cabe mencionar que la cantidad de semen (3,0 mL) en este estudio fue la
misma que la de Chamoun et al. [11], pero en lugar de 600,0 g, esa
investigación utilizó 15 kg (15.000 g) del animal sacrificado. Esto significa que
el uso en el presente estudio de 3,0 mL de semen por cada 15 kg de carne fue
Pupas 25 veces menor que el utilizado en el experimento in vitro (3,0 mL/0,6 kg de
0
carne), mencionado anteriormente. Como cada célula completa (esperma)
0 haploide (n) presenta alrededor de 3,0 pg de ADN y, en promedio, un hombre
0 normal y fértil produce 56,0 106 (56 millones) de espermatozoides por ml de
0
semen [15], por lo tanto cada ml de semen contiene 56 millones de
0
espermatozoides, cada uno con 3,0 pg de ADN, lo que da un total de 168 mg
01
28 de ADN por ml de semen. En este estudio se utilizaron 3,0 mL de semen,
totalizando 504 mg de ADN humano, por lo que se esperaba mucha mayor
dificultad para obtener resultados satisfactorios, no sólo por una proporción
57
mucho menor de semen en el estudio en cuestión, sino también por la mayor
20
157
posibilidad de inhibidores y/o interferencias de la PCR.
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CA Chamoun et al. / Ciencias Forenses Internacional 310 (2020) 110239 5

Tabla 2
Perfiles haplotípicos Y­STR humanos, en muestras 144 h, 168 h, 192 h, 216 h, 240 h, 288 h, 312 h y 336 h.

Genético TIEMPOS, NÚMERO DE INMADUROS Y ALELOS DE MUESTRA

Ubicación
144 h (Día 6) 168 h (Día 7) 192 h (Día 8) 216 h (Día 9) 240 h (Día 10) 288 h (Día 12) 312 h (Día 13) 336 h (Día 14) Haplotipo Haplotipo
76 inmaduros 28 inmaduros 32 inmaduros 49 inmaduro 39 inmaduro 23 inmaduro 57 inmaduro 20 inmaduros Cuestionado Referencia
Conjunto

DYS456 16 dieciséis dieciséis dieciséis 16 dieciséis

DYS389 14 14 14
I
DYS390 23
DYS389 30 30 30
II
DYS458 15 15 15 15 15
DYS19 dieciséis

DYS385 15 15 15
DYS393 14
DYS391 10
DYS439 12 12 12 12
DYS635 22 22 22
DYS392 12 12 12
Serpiente 11
H4
DYS437 15
DYS438 8
DYS448 20

Vale la pena señalar que la mayoría de las pupas se encontraron debajo del
suelo, en un radio de hasta 3,0 m desde el cadáver y a una
profundidad aproximada de 10 cm desde la superficie. Esto significa que incluso
con el retiro del cadáver existiría la posibilidad de
recuperar, aunque parcialmente, algunos loci Y­STR, lo que podría ser crucial
evidencia en el tipo de delito que deja poca evidencia debido a una
gran desfase entre la violación/homicidio y el descubrimiento de la
cadáver.
Varios factores pueden interferir con la amplificación del ADN, incluida la
calidad del ADN extraído, que puede verse influenciada por
contaminantes e interferencias, como proteínas, ácido ribonucleico
(ARN) y el propio fenol, utilizado en la extracción orgánica. El final
El producto de las amplificaciones de este estudio fue mejor en todas las muestras.
donde hubo doble y/o triple paso en orgánicos
extracción y combinación de este método con otros, como IQ
(Promega) y Microcon (Millipore), para la purificación y
concentración de ADN. Esto era necesario porque el final
El producto de la extracción estaba muy "sucio". Por lo tanto, para larvas
especímenes de moscas se recomienda el procedimiento de "limpieza adicional"
en el paso de extracción de ADN. Es de destacar que existen
Mejores formas de conservar muestras biológicas que el alcohol al 70 %.
lo que puede aumentar la degradación del ADN a temperaturas más altas. Este
puede haber sido un factor importante en la reducción del número de
ubicaciones amplificadas.
Otro aspecto importante del estudio aquí es la posibilidad de
grandes cantidades de ADN no deseado (ADN de larvas de mosca, sacrificadas
ADN de modelo animal, ADN bacteriano, ADN de hongos, etc.) que interfieren
con amplificación. De hecho, se encontraron concentraciones muy altas de ADN.
encontrado en todas las muestras analizadas (entre 96,4 ng/mL y 161,84 ng/mL)
mL (lo ideal sería entre 0,5 ng/mL y 1,0 ng/mL). En el
Pruebas moleculares preliminares de este estudio, en las que solo se utilizó
extracción con fenol­cloroformo, sin doble o triple paso.
en el paso de lavado con etanol y sin el uso de Microcon, hay
no hubo amplificación en las muestras analizadas, lo que confirma la
Importancia del control del inhibidor mediante el material extraído sucesivamente.
lavados.
También es importante señalar que el CODIS (ADN Combinado
Index System), utilizado por el FBI y varios otros países.
incluido Brasil, tiene un requisito mínimo de 7 loci. En el laboratorio,
con estudios de validación adecuados para evaluar la posibilidad de
múltiples contribuyentes, pudimos, a nuestro leal saber y entender,
lograr suficiente liderazgo investigativo para guiar/ayudar en
determinar la autoría/culpabilidad criminal. Otro importante
La cuestión del estudio en cuestión es que en los casos de violación con
penetración vaginal y/o anal, es normal tener lesiones en
estas regiones, provocada por la violencia del violador, con la liberación
de fluidos biológicos, especialmente sangre. Esto atrae a un mayor número
de moscas a estos lugares, para poner huevos. La ausencia de estas lesiones
en las regiones vaginal y anal del modelo animal utilizado en este
El estudio puede haber reducido el número de insectos en estas regiones de
interés. Varios autores han informado de la preferencia de las moscas por
puesta de huevos en orificios naturales húmedos y lesiones corporales, atraída por
los fluidos liberados en estos casos [21,22].
Aunque se han encontrado más de 400 loci Y­STR [23] y
descrito, el haplotipo mínimo para el mínimo europeo
El haplotipo es de 9 loci y las recomendaciones de la Comisión Científica.
El Grupo de Trabajo sobre Métodos de Análisis de ADN (SWGDAM) establece 11
loci [24,25]. CODIS se utiliza en más de 60 países y tiene más
Más de 36 millones de perfiles genéticos catalogados actualmente, según
las últimas estadísticas proporcionadas en julio de 2013 por INTERPOL Global
Encuesta de perfiles de ADN. Actualmente, de los 190 miembros de INTERPOL
países, 135 utilizan perfiles de ADN en investigaciones criminales,
incluido Brasil [26].
Los kits moleculares utilizados en el presente estudio amplifican muestras.
con concentraciones alrededor de 500 pg (0,5 ng). Investigaciones recientes utilizando
el kit PowerPlex1Y23 (Promega) ha demostrado la alta
sensibilidad del umbral de amplificación de los loci Y­STR, y es
posible identificar perfiles completos de ADN Y­STR en muestras con
sólo 62,5 pg (pg) de ADN masculino, en mezclas de 125,0 pg de ADN masculino
a 3000,0 ng (3,0 mg) de ADN femenino [25]. Esto sugiere que si el
La técnica utilizada aquí se repitió con el uso de métodos más avanzados.
kits moleculares, los resultados de amplificación podrían ser aún mejores, ya que
Estos kits tienen una sensibilidad significativamente mayor.
También cabe mencionar que algunos estudios han demostrado que
regiones del cromosoma Y, de hombres del mismo patrilinaje, pueden
presentan diferencias significativas, que permitirían
Individualización de sospechosos [27]. En estos sitios, llamados RM Y­STR (RM =
Rapidly Mutating), se utilizan rutinariamente 13 loci en el
área forense por varios países [28]. Evidentemente, es aconsejable
hacer de la amplificación de STR autosómicos la primera opción si el
el análisis citológico encuentra espermatozoides intactos en la muestra [29],
lo cual no sería común en un cuerpo en descomposición.
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6 CA Chamoun et al. / Ciencias Forenses Internacional 310 (2020) 110239
Algunos estudios con muestras de víctimas de violación mostraron la
variación en la sensibilidad de amplificación de los loci Y­STR, con algunos loci
demostrando una mayor amplificación (DYS393, DYS437, DYS389I, DYS458
y DYS391) y otros (DYS389II, DYS390, DYS385, DYS439, DYS635 y DYS392).
inferior [23,30]. Recientemente, estudios in vitro con recuperación de ADN Y­
STR humano a partir de gusanos alimentados con carne molida descompuesta,
previamente inoculada con semen humano, obtuvieron resultados similares
para esta diferencia en la sensibilidad de los loci [11] . En el estudio in situ
presentado aquí, no se observó esta variación en la amplificación de los loci.
Esto pudo haber ocurrido debido a la climatología y a las diferentes condiciones
experimentales de este estudio, que eran muy cercanas a la escena real de un
crimen de abandono de un cadáver, en un lugar boscoso, después de la
violación.
Otro factor importante para optimizar la aplicabilidad de esta técnica
dentro de la rutina experta sería la posibilidad de eliminar la fase de disección
larvaria, que es bastante laboriosa y requiere mucho tiempo. Esto podría
lograrse mejorando el paso de extracción de ADN directamente de larvas de
mosca intactas sin la escisión visceral de gusanos y pupas recolectados. De
este modo, el análisis se aceleraría, aportando resultados más rápidos,
cruciales para los delitos sexuales, cuanto menor es la posibilidad de
reincidencia y mayor es la seguridad de todos.
5. Conclusiones
Es posible recuperar e identificar ADN Y­STR humano a partir de larvas de
insectos del orden Diptera. Los resultados de los análisis aquí presentados
demuestran la posibilidad de obtener material genético humano amplificable
a partir del tracto digestivo de gusanos y pupas de dípteros, de la especie C.
albiceps, en condiciones muy similares a las observadas en escenas reales de
crímenes de violación y homicidio. , presentando la víctima hasta 14 días de
descomposición.
Es necesaria la continuidad de los estudios relacionados con esta técnica,
con el objetivo de mejorar los resultados prácticos. El número mínimo y máximo
de larvas recolectadas de cadáveres humanos en descomposición de la escena
del crimen debe ser objeto de más investigaciones, permitiendo que lo que se
pueda recolectar, en la práctica, se acerque al tamaño de muestra promedio
ideal para una amplificación exitosa.
Declaración del autor
Chamoun CA: Concepción y diseño del estudio, Adquisición de datos,
Análisis y/o interpretación de datos, Redacción del manuscrito, Revisión
crítica del manuscrito para contenido intelectual importante, Aprobación de la
versión del manuscrito que se publicará.
Oliveira­Costa J.: Concepción y diseño del estudio, Adquisición de datos,
adquisición de datos: Couri MS, Garrido, RG, Moura­Neto RS, Análisis y/o
interpretación de datos, revisión crítica del manuscrito para contenido intelectual
importante, Aprobación de la versión del manuscrito a publicar.
Couri MS: Análisis y/o interpretación de datos, Revisión crítica del
manuscrito para contenido intelectual importante, Aprobación de la versión del
manuscrito a publicar.
Garrido RG: Análisis y/o interpretación de datos, Revisión crítica del
manuscrito para contenido intelectual importante, Aprobación de la versión del
manuscrito a publicar.
Moura­Neto RS: Análisis y/o interpretación de datos, Revisión crítica del
manuscrito para contenido intelectual importante, Aprobación de la versión del
manuscrito a publicar.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen la beca recibida de la Fundación
del Apoyo Estatal a la Investigación de Espírito Santo (FAPES) AL CAC.
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