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BIOLOGIA CELULAR MOLECULAR

Programa de Medicina
Guías para desarrollar en el Laboratorio

ELECTROFÓRESIS
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4.1. LOGROS

1. Separar diferentes muestras de ADN mediante electrofóresis en gel de agarosa.

2. Diferenciar entre el ADN procariótico y eucariótico.
3. Conocer los principios de la electrofóresis en gel de agarosa.
4. Conocer los principios de la electrofóresis en gel poliacrilamida.
5. Establecer diferencias entre las técnicas para ácidos nucleicos y para proteínas.

4.2. GLOSARIO

• Carga
• Resistencia
• Fricción
• Electromagnetismo
• Ánodo
• Cátodo
• Voltaje
• Gel

4.3. CONTENIDO

Todas las biomoléculas tienen una carga eléctrica específica; la técnica de electroforesis
nos permite separar distintas moléculas de igual tamaño y estructura pero de diferente
carga. Por medio de un campo electromagnético se hace correr el ADN a través de un ta-
miz molecular (gel de agarosa), la resistencia que opone este al paso, es lo que permite
separar los diferentes ácidos nucleicos que se extraen de las células.

La electrofóresis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nu-

cleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Los ácidos nucleicos ya
disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las
proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas nega-
tivas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un gel de
agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla).

Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, estas se moverán y deberán

ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así,
las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

La estructura química de la agarosa difiere de la poliacrilamida, y es por eso que permite

separar diferente tipo de moléculas.

La agarosa es un gel que se forma a partir del agar-agar, este es un polímero de origen
natural que se extrae de determinadas algas rojas.
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Es un polímero lineal formado por la repetición de unidades del disacárido agarobiosa, cuya
estructura es:
-(1-3)-b-D-Galactosa-(1-4)[3,6 anhidro]-a-L-galactosa-

Figura 9

Los geles de agarosa se forman porque las cadenas del polímero se unen entre sí por puen-
tes de hidrógeno, formando una red tridimensional rígida, que mantiene unidas las molé-
culas de agua mediante puentes de hidrógeno, formando un tamiz molecular que dificulta
el movimiento de los solutos.

Figura 10

El proceso de gelificación ocurre a temperaturas más bajas que el de fusión del gel. El gel
se funde a temperaturas de ebullición, cuando la agitación térmica es suficientemente ele-
vada para desorganizar esta estructura tridimensional, quedando una disolución viscosa de
polímeros desorganizados.

Los geles de agarosa son estructuras a la vez rígidas y con poros de gran tamaño, que
permiten que el gel sea atravesado por moléculas grandes, tales como ácidos nucleicos,
lipoproteínas, o partículas víricas.
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El tamaño de los poros depende inversamente de la concentración de agarosa; es posible

formar geles útiles para electrofóresis empleando agarosa desde 0,4% hasta 5%.

No resulta práctico emplear concentraciones superiores de agarosa ya que los geles resul-
tan poco elásticos y difícilmente manejables y en tal caso es mejor sustituirlos por geles
de poliacrilamida.

Algunos factores que afectan la Velocidad de Migración

Tamaño molecular de DNA: Las moléculas más grandes migran más lentamente a causa de
que su arrastre friccional es mayor.
Concentración de la Agarosa: Un fragmento lineal de ADN de un tamaño dado migra a
diferentes velocidades a través de los geles que contienen diferentes concentraciones de
agarosa.
Conformación del ADN: La forma del ADN circular, circular-superhelicoidal y lineal, del mis-
mo peso molecular, migran a través de los geles de agarosa a diferentes velocidades.
Voltaje aplicado: La velocidad de migración de fragmentos de DNA lineal es proporcional
al voltaje aplicado.
Presencia de Colorantes intercalados: El bromuro de etidio, un colorante fluorescente,
usado para detectar ADN en geles de agarosa, reduce la movilidad electroforética de ADN
lineal cerca del 15%. El colorante se intercala entre las pares de bases, extendiendo la
longitud de la molécula del ADN haciéndola más rígida.
Composición del Buffer de Electroforesis: la movilidad electroforética del ADN es afectada
por la composición y la fuerza iónica del buffer de Corrido electroforético. En ausencia de
iones la conducción eléctrica es mínima y el ADN migra muy lentamente. Con búferes de
alta fuerza iónica, la conductividad eléctrica es eficiente pero se generan cantidades signi-
ficativas de calor.

La acrilamida polimeriza por la acción del TEMED (catalizador) y el persulfatoamónico

(PSA-iniciador). La metilen-bis-acrilamida forma enlaces cruzados entre los polímeros de
archilamida. En conjunto se forma una especie de malla cuyo diámetro de poro viene de-
terminado por la concentración de acrila-mida/bis-acrilamida.

Se ha determinado que a mayor %T, menor tamaño de poro, y viceversa. Se ha observado

que para cualquier %T, el 5% C, es el que da lugar a los tamaños de poro más pequeños.
Valores de %C mayores o menores originan poros más grandes.

Las proteínas de menor tamaño migran mayor distancia en el gel YA QUE OFRECEN MENOR
RESISTENCIA AL PASO POR EL MISMO. Esta relación, sin embargo, no es lineal. El tama-
ño de poro creado en el gel determina que a partir de cierto tamaño de proteína estas no
avanzan o lo hacen con mucha dificultad.

Algunas ventajas con esta técnica es la Separación rápida de las proteína que no depende
de la forma de la proteína nativa y también se puede estimar el peso molecular, sin embar-
go presenta algunos inconvenientes ya que las proteínas separadas están desnaturalizadas
no son funcionales.
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4.4. MATERIALES Y MÉTODOS

• Cámara de electroforesis horizontal

• Transiluminador
• Micropipetas
• DNA
• Buffer de carga
• Bromuro de etidio
• Agarosa
• Buffer TAE (8 tris-acetato-EDTA)

Se prepara el gel de agarosa al 2% en TAE 1X. Se funde la agarosa por calentamiento y

cuando esté completamente disuelta se vierte en el molde, se le coloca el peine, y se deja
enfriar hasta que solidifique. Una vez se haya formado el gel de forma adecuada se retira el
peine cuidadosamente y el gel se coloca en la cámara de electrofóresis que contiene buffer
TAE suficiente para cubrir el gel completamente.

Figura 11

Para sembrar la muestra se mezclan en una placa:

- 5 microlitros de ADN.
-1 microlitro de bromuro de etidio
- 8 microlitros de buffer de carga
(Búferes de carga (Solución Loadding Buffer) tienen tres propósitos:
1. Incrementan la densidad de la muestra (Sucrosa), asegurando que el ADN baje en
forma pareja dentro del pozo.
2. Adicionan color a la muestra simplificando el proceso de carga.
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3. Contienen colorantes como el azul de bromofenol y el xylencianol que en un campo

eléctrico se mueven hacia el ánodo a una velocidad constante.

Una vez preparadas las muestras y sembradas en el gel se procede a conectar la cámara
de electroforesis a una fuente de poder y se deja correr aproximadamente 45 minutos a
80-100 voltios. Cuando se haya terminado el corrido se desconecta el equipo y se retira
cuidadosamente el gel para llevarlo al cuarto oscuro y observarlo en el trasiluminador de
luz UV para observar intensidad de fluorescencia al compararlo con los marcadores mole-
culares usados.
Debe recordar que la fluorescencia es lineal con la concentración del ADN.
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NOMBRE__________________________
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FECHA__________________ GRUPO____ Programa de Medicina
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NOTA_____

ESTE DESPRENDIBLE LE SERÁ EVALUADO

1. Si tiene una muestra ADN circular y un ADN lineal, ¿cuál cree usted que correrá más
rápido? Justifique su respuesta.

2. ¿Qué factores afectan la velocidad de migración de una muestra?

3. Trate de explicar por qué razón en una electrofóresis no aparecen bandas.

¿Las bandas son borrosas o extendidas?

¿Aparecen bandas curvadas?

4. Se le ha pedido que corra una electrofóresis en 1 hora pero usted desea ahorrar tiem-
po así que incrementa el voltaje. ¿Qué pasará cuando se haga la interpretación del
corrido electroforético?