4 wl een, ARCHIVOS DE Tesi) ete ise 1 alien iae Meise baile fee e FERNANDO ACEVEDO; JUAN CARLOS GENTINA ea wee i Ae P wm| | e \ ARCHIVOS DE INGENIERIA BIOQUIMICA FUNDAMENTOS DE INGENIERIA BIOQUIMICA FERNANDO ACEVEDO B. JUAN CARLOS GENTINA M. ANDRES ILLANES F. EDITORES, ® EDICIONIS UNIVERSITARIAS DE VALPARAISO DI LA UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISOnls prohibidas, sin la autorizacién eserita de los Utulares det establecidas en las le (neh Jo ius sancione: Cappyeiplite, bi s, la reproduccién total 0 junctal de estit obra por cualquier medio o procedimiento, comprendidos 1a | teprogialia y el Lratamicnto informatico y la distribucion de ejemplares de ella f mediante alquiler 0 préstamo publicos. iNDICE Prélogo Pag. 7 Capitulo 1 METABOLISMO Y CONTROL CELULAR Claudia Altamirano © Fernando Acevedo Bonzi Andres Hanes: 9 Juan Carlos Gentina Morales iv Andrés Illanes Frontaura Capitulo 2 a CINETICA ENZIMATICA EN FASE HOMOGENEA Inscripcion N° 124.783 Rolando Chamy : Andres Manes 43 ISBN 956-17-0325-4 : Capitulo 3 Tirada de 300 ejempla pi CLD CINETICA ENZIMATICA EN FASE HETEROGENEA Derechos Reservados Andrés Hanes 69 Ediciones Universitarias de Valparaiso Ca; lad C: ; pitulo 4 de la Universidad Catolica de Valparaiso ee eee Calle 12 de Febrero 187, Valparaiso CINETICA DE FERMENTACIONES Fono (32) 273087 - Fax (32) 273429 Fernando Acevedo E.mail: euvsa@ucv.cl Juan Carlos Gentina 91 www.euv.cl Disefto Grafico: Guido Olivares S. Capitulo 5 : Diagramacion: Mauricio Guerra P. REACTORES ENZIMATICOS Correccién de Pruebas: Osvaldo Oliva P. Andres Hlanes 169 Impreso en Salesianos S.A. Bulnes 19, Santiago de Chile v Capitulo 6 : REACTORES CON CELULAS INMOVILIZADAS HECHO EN CHILE Vitalin Moritz 199 =SRENCIA DE MASA, MOMENTO Y CALOR ‘MRMENTACIONES Fernando Acevedo TRASLACION DIE ESCALA EN FERMENTACIONES Vernando Acevedo TERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y DE AIRE Vitalis Moritz Capitulo 10 BIOSEPARACIONES 217 eis 293 PROLOGO La Ingenteria en Bioprocesos se gesta como disciplina en Chile con la creaclon de la Escuela de Ingenieria Bioquimica en la Universidad Catolica de Valparaiso, la cual ha sido por 32 afios lider reconocida Jonal ¢ internacionalmente en el area de la biotecnologia indus- lat Escuela de Ingenieria Bioquimica ha impulsado durante estos afios como uno de sus objetivos principales el establecimiento de un con- {acto permanente con la sociedad, a través de acciones de perfeccio- niente profesional, extension, investigacion y asistencia técnica. Lat INcucla se ha preocupado especialmente de la difusién de la disci- plina y la profesion a través de charlas, ciclos de seminarios y eventos diversos, y a través de la participacién de sus profesores en congresos y simposios nacionales e internacionales, asi como también de la pu- blteacion de trabajos en libros y revistas de reconocido prestigio. itv asi como la Escuela de Ingenieria Bioquimica, a través de su Plan [estrategico de Desarrollo establecié su misién como el cultivo de la disciplina de la Ingenieria Bioquimica que se manifiesta en el estudio, la formacién de profesionales y graduados, el desarro- llo de una investigacién aplicada, y la proyeccién de sus aplica- clones hacia el entorno. Avorde con esta mision y como una forma de difundir la especialidad on la region iberoamericana, la Escuela ha organizado hasta la fecha avis versiones del Curso Latinoamericano de Biotecnologia con singu- lar éxito, constituyéndose en un evento tradicional y presente en to- tlow los citlendarios de actividades que se manejan en el area de la hlotecnologia industrial. Es asi como mas de 200 estudiantes de apontyrado y protesionales han encontrado en esta actividad un impor- (ante apoyo para el desarrollo de sus carreras. Kntre el 15 y el 27 de Octubre del aio 2000, la Escuela de Ingenieria Mloquimica realiz6 el VI Curso Latinoamericano de Biotecnologia que conté con la participacién de 37 alumnos provenientes de 14 paises. Esta actividad tuvo como objetivo ofrecer un entrenamiento a nivel avanzado a profesionales latinoamericanos que se desempenan en el cimpo de la biotecnologia, para lo cual se enfatiz6 la aplicacion de principios biolégicos y de ingenieria a problemas de sistemas microbiologicos y enzimaticos. En la presente publicacién se reinen los temas desarrollados por los diferentes profesionales pertenecien- (es a la Escuela durante la sexta y anteriores versiones del Curso. Esta publicacion corresponde al primer numero de la serie Archivos de Ingenicria Bioquimica, la cual se ha definido como una instancia la difusién y el desarrollo de la disciplina, interpretando fielmen- (c ka misién que se ha fijado la Escuela de Ingenieria Bioquimica. Ks nuestro deseo que esta publicacién, contribuya a la difusion y de- wrollo de la Ingenieria de Bioprocesos en los paises del area ibero- americana, Capitulo 1 -ABOLISMO Y CONTROL CELULAR Claudia Altamirano Andrés Illanes Escuela de Ingenieria Bioquimica Universidad Catélica de Valparaiso, Chile 1, ESTRUCTURA CELULAR Se cree que todos los organismos derivan de una unica célula primiti- va, que superd a sus competidores y las aventajé en el proceso de divivion celular y evolucién. Hace aproximadamente 1,5 millones de ‘non sc produjo un evento evolutivo de gran relevancia: la transicion desde c¢lulas pequefas con estructura interna muy sencilla, denomi- nuduy celulas procaridticas, hasta células eucariéticas, mayores y no- lablemente mas complejas. Kn la actualidad, dentro de los organismos procariéticos (procariotas) ae Incluyen los diversos tipos de bacterias y algas verdeazuladas; mien- Iras que en los organismos eucaridticos (eucariotas) se consideran los demas Upos de algas, protozoos, hongos (levaduras y mohos), células veyetiles y animales. los organismos unicelulares (tanto procariotas como eucariotas) es- (in conformados por una sola célula, capaz de sobrevivir individual- mente, reproducirse y (en algunos casos) aparcarse. Los organismos multtcclulares (generalmente eucariotas) existen como una estructura cooperativa conformada por muchas células, que pueden tener dife- renites especializaciones. Lat celula procariética se caracteriza por carecer de un nucleo diferen- ehudo, Est célula esta formada por un tinico compartimento limitado por una membrana, la membrana celular, que habitualmente se halla rodeadia por una pared celular rigida. En el espacio interior de la célu- aCLAUDIA ALTAMIRANO / ANDRES ILLANES, Ja, cHloplasma, esti la zona nuclear, formada por una molécula de ADN de doble hélice densamente enrollado, y los ribosomas. Lar cella eucariotica es mucho mas compleja, existiendo un alto gra- do de compartamentalizacién. La célula esta rodeada por la membra- na celular, similar a la de procariotas. E] nticleo esta diferenciado en el clloplasia, mediante la envoltura nuclear. En él se encuentra el ma- ferlal genético, que puede estar distribuido en varios cromosomas. El ciloplasma que lo circunda, consiste en el citosol y los organulos ciloplasmaticos suspendidos en él, tales como, las mitocondrias y cloroplastos, y sistemas membranosos como el aparato de Golgi y él reticulo endoplasmatico (RE), que en conjunto constituyen el ciloesqucleto. Gran parte de los ribosomas se encuentra asociado al REE. Sobre la superficie exterior de la membrana celular puede existir una cubierta 0 una pared celular. La presencia y naturaleza de la cubierta depende del tipo de célula. Laas caracteristicas y funciones de las principales estructuras celula- res se describen a continuacién: Pared_cclular: Estructura rigida, compuesta principalmente por polisaciridos. Su funcién es conferir resistencia mecanica a Ia célula. Muubrana celular: Estructura flexible y delgada, de composicién lipoprotcica. Confiere a la célula permeabilidad selectiva para la in- xestion de nutrientes y excrecién de productos metabilicos. Es ade- mis sitlo de diversas reacciones metabdlicas. Ctlosol: Proporciona el medio acuoso para el funcionamiento de las proteinas. Mico: Orginulo mas evidente de la célula eucaristica, Esta separado del citoplasina por la envoltura nuclear (constituida por dos membra- nas, Interna y externa). Su componente activo es el acido desoxirribonucleico (ADN) que es el portador y preservador de la infor- macion genética, Es cl lugar mas importante de sintesis de ADN y ARN. Ribosomas: lstructuras formadas por acido ribonucleico (ARN) y pro- (cinas especilicas. Es el sitio de sintesis de proteinas estructurales y functonales (enzimas, hormonas, citoquinas). Mitocondria: Estructar muy compleja que cumple multiples funcio- 10 CAPITULO 1 / METABOLISMO Y CONTROL CELULAR hes metabélicas como oxidacién de carbohidratos, lipidos y aminoicidos, fosforilacién oxidativa y respiracion. Cloroplasto: Presente sdlo en células fotosintéticas. En este organulo ocurren las principales reacciones de fotosintesis: sintesis de ATP, poder reductor y oxigeno y reduccién de CO, a biomoléculas organicas. Aparato de Golgi: Sistema de saculos membranosos aplanados y apilados, implicado en la modificacion, seleccién y empaquetamiento de proteinas para la secrecién 0 para la exportacion a otros organulos. RE rugoso: Estructura de séculos membranosos aplanados, exterior- mente recubierta por ribosomas. En su interior se realizan modifica- ciones post-traduccionales de proteinas especificas. RE liso: Estructura de saculos membranosos tubulares y carente de ribosomas. Su principal funci6n se centra en el metabolismo de lipidos. En las siguientes secciones se analizara el metabolismo celular, el con- rol y desregulacion de la expresién génica y las manipulaciones Yenéticas para aquellos microorganismos y lineas cclulares animales rontinuas (LCAC) que son de importancia para el desarrollo de proce- sos biotecnolégic: 2, METABOLISMO CELULAR Las células animales y la mayor parte de los microorganismos son heterotrofos, es decir, requieren de una fuente de carbono reducida relativamente compleja, por ej. glucosa. En el caso de los nuicroorganismos, la misma fuente de carbono es, generalmente, utili- vada como fuente de energia. Los requerimientos nutricionales res- lantes incluyen una fuente de nitrégeno, sales minerales, en algunos casos. vitaminas y aminodcidos especificos y otros componentes en concentraciones traza. Por contraste, los requerimientos nutricionales dle las LCAC son notablemente mas complejos e incluyen glucosa y wlutamina, como fuentes de carbono y energia, aminoacidos esencia- les, vilaminas y una serie de sales y compuestos organicos en concen- lractones traza . [esta diferencia se explica en base a la gran flexibilidad metabdlica que han desarrollado los microorganismos para sobrevivir a bruscos cam- bios en su entorno. Mientras que las LCAC, que provienen de un orga 1 oeCLAUDIA ALTAMIRANO / ANDRES ILLANES itso alGiumente diferenciado, sélo sobreviven dentro de un estrecho tango de condiciones ambientales altamente especificas, dado que en sti iumbiente natural, el sistema global del organismo superior es el responsable de suministrar y regular el nivel de nutrientes y mante- ner iin ambiente homeostatico. A pesar de estas diferencias, ambos sistemas celulares pueden ser vistializados como una compleja maquinaria cuya funcion es transfor- maw tos nutrientes a su disposicion en masa celular (véase su compo- siclon en Tabla 1), productos extracelulares y metabolitos terminales. Tabla 1. Composicion celular (% base seca) Proteinas Ac. Nucleicos Lipidos Bacter 40 - 60 10 - 25 10 - 15 Levaduras 40 - 50 5-15 1-6 Hongos filamentosos 20 - 45 3-10 2-8 LeAc 60 - 70 4-8 8-14 E1 metabolismo es una actividad altamente coordinada, en la que par- Ucipan numcrosos sistemas enzimaticos relacionados, a través del cual se Intercambia materia y energia entre la célula y su entorno. Cada una de las reacciones del metabolismo celular es catalizada por una proteina (cnzima) altamente especializada para realizar dicha funcion Is] melabolismo se puede dividir en dos fases: Catabolismo: Fase degradativa, en la que moléculas nutritivas com- plejas son degradadas para producir moléculas mas sencillas como por ejemplo piruvato, acido lactico o urea. Paralelamente, se produce Hberacton de la cnergia quimica inherente a la estructura de las moléculas nutritivas y su conservacion en forma de enlaces fosfodiéster, energélicamente ricos, en la molécula de trifosfato de adenosina (ATP). Anabolismo: Mase biosintética, en la que tiene lugar la sintesis de pre- cursores de macromoléculas (aminoacidos, acidos grasos, nucléotidos, ete.) y de los componentes macromoleculares de la célula (proteina, carbohidratos, ADN, ARN y lipidos) a partir de sus respectivos precur- sores, La blosintesis de estos compuestos requiere el consumo de ener- gia quimica aportada por el ATP generado durante la fase catabdlica. 12 CAPITULO 1 / METABOLISMO Y CONTROL CELULAR El catabolismo y el anabolismo se desarrollan simultaneamente, pero son regulados de forma independiente. En eucariotas las vias catabélicas y anabélicas a menudo se producen en compartimentos celulares diferentes. Aunque las rutas del catabolismo y el anabolismo son diferentes exis- ten rutas centrales comunes, denominadas anjibélicas, como el ciclo dc los acidos tricarboxilicos (ciclo de Krebs) 0 la fosforilacién oxidativa. Existen, ademas, algunas rutas metabdlicas altamente preservadas cn las diferentes especies celulares, como por ejemplo: la via glucolitica, la via de los fosfatos de pentosa, el ciclo de los acidos tricarboxilicos y las vias de sintesis de acidos grasos saturados, purinas y pirimidinas. Sin embargo, la regulacion de las rutas metabélicas puede diferir ampliamente de un organismo a otro. Los heterotrofos pueden dividirse en dos clases principales: los aerobios, que emplean el oxigeno molecular como ultimo aceptor de electrones, y los anaerobios, que emplean compuestos organicos como aceptores de clectrones. A su vez, los anaerobios se pueden dividir en dos subclases, los anaerobios estrictos, que no pueden emplear el oxigeno ¢ incluso algunos no lo toleran, y los anaerobios facultativos, que pue- den vivir tanto en ausencia como en presencia de oxigeno. Durante el imetabolismo anaerobio no se produce una oxidacion completa de la fuente de energia, por lo que resulta un proceso energéticamente me- nos cliciente. En el caso de algunos microorganismos asociados a la fermentacién alcohdlica, se puede observar que emplean compuestos organicos como aceptores de electrones aun en presencia de oxigeno. Esto se debe a que la capacidad del ciclo de los acidos tricarboxilicos de estas células es baja y facilmente se ve saturado por el flujo glucolitico, que es des- viado, en este caso, hacia la sintesis de etanol, lo que es necesario para mantener el equilibrio redox en el citoplasma. Este fendmeno, denominado Efecto Crabtree, supone la ruptura de puntos de regula- clon clave en la via glucolitica. Un fendmeno andlogo ocurre en LCAC: en este caso, la glucosa es metabolizada casi en su totalidad a lactato, existiendo un flujo muy bajo hacia el ciclo de los acidos tricarboxilicos. Este ciclo es vital para este tipo de células, en cuyo caso para mante- ner su fumcionamiento, el ciclo es alimentado a nivel del a-cetoglutarato por la segunda fuente de carbono y energia, la glutamina. 13CLAUDIA ALTAMIRANO / ANDRES ILLANES. Un esquema del funcionamiento metabélico aerobio de diferentes ti- pos de celulas se muestra en la Figura 1. En cl caso de células fotosintéticas, capaces de obtener energia metabéliea a partir de energia luminica, existe una ruta anabélica adiclonil, mediante la cual el poder reductor y energia metabélica ge- nerados en ka Jase luminosa son utilizados en la sintesis de azticares a partir de CO, en la fase oscura (Ciclo de Calvin). 3. EXPRESION GENICA Las protcinas, particularmente las enzimas y proteinas reguladoras, determinan directamente el funcionamiento celular al definir qué re- acciones quimicas se producen. Es decir, la dotacion enzimatica y los mecanismos de control sobre su sintesis y actividad, en un momento dado, definen los procesos metabélicos que se realizan, lo que en con- Junto constituye la fisiologia celular. Dado que en el material genético, ADN, se encuentra codificada la informacion que determina el curso de la sintesis proteica en la célula, el funcionamiento y coordinacién del metabolismo celular depende de la informacién génica y de las condiciones de entorno que condicionan su expresion. 3.1. Informacién génica y preservacién de la informacién EL ADN es una macromolécula constituida por dos hebras helicoidales. Cada hebra es un heteropolimero lineal constituido por desoxitribonucleétides unidos mediante enlaces fosfodiéster 3’ — 5’ entre lus moléculas de desoxirribosa. La clave del mensaje genético se en- cnentra en la secuencia de bases que conforman cada desoxtrribonucleétido: Adenina (A), Guanina (G), Timina (1), y Citosina (Cc) 14 ) CAPITULO 1 / METABOLISMO Y CONTROL CELULAR Glucosa Phe ‘ r Ed —> Proteinas Carbohidratos —= GBP ———» R5P J L__+ Nucledtido —» Ac. Nuciéicos oye <5 Proteins Fosfolipidos chy y ASp Gin Gly = | sea Ser pyr —PLedtato oy one bo : val —> Proteinas Tp A: : Lys AeCoA == Lipido 7 Lo Lip 4a Proteinas Fa 41g Ghu Pro Met = ‘i LS 4 Oxalacetato Citrate a Py Ala cea: Glioxilato 4°) \ NHseATP os \ tee oe Malato <-0== __srcetoglutereto —Glutamato>™ Glutamina \ AcCoA \ y s—< NH Asp Oxa ’ Ag Fumarato Succinato 4 [ims Pro ATP ATP 2H" + 2e + %02—> HO Figura 1. Esquema del funcionamiento metabolico aerobio de diferentes {pos de células (microorganismos y LCAC). Las rutas con linea punteada (---) son exclusivas de microorganismos. 15CLAUDIA ALTAMIRANO / ANDRES ILLANES, Hehidea su estructura quimica, las bases se aparean especificamente de la lormuat siguiente: A-T y G-C. Esta propiedad quimica es esencial en kv estructura del ADN, ya que la secuencia de bases en una hebra determina automaticamente la secuencia de bases de la hebra com- plementaria. Ello es decisivo en el mecanismo de replicacién semiconservativo, mediante el cual se transmite fielmente la informa- clon genética de una generacion a otra. La secuencia de bases en el ADN contiene la informacién necesaria para su autorreplicacién y la necesaria para la sintesis de proteinas. Un gen cs un segmento de ADN que codifica un producto funcional. expresion del gen para sintetizar la secuencia aminoacidica de la protcina correspondiente (producto del gen) se produce a través de dos procesos secuenciales: transcripcion y traduccion. 3.2. Transcripcién, EL producto de la transcripcién es el ARN, el cual es un heteropolimero Ineal, de una hebra, constituido por ribonucleétidos unidos mediante enlaces fosfodiéster 3° — 5’ entre las moléculas de ribosa. Las bases presentes en los nucleétidos son: adenina, guanina, uracilo (U) y cllosina. Existen tres tipos de ARN: ARN mensajero (ARNm), molécula trasmisora del mensaje génico, ARN de transferencia (ARNt): molécula encargada de la activacién de los aminoacidos para su correcta incor- poracton en el proceso de sintesis proteica a partir del mensaje codifi- cado en el ARNm y ARN ribosomal (ARNr): componente estructural principal de los ribosomas, donde tiene lugar la sintesis proteica. © inicia cuando la enzima ARN polimerasa se une a una Secucnela sefal, denominada promotor (ver Figura 2a), situada so- bre una de las hebras del ADN (hebra de ADN molde). Luego de un cierto desdoblantento de la doble hélice de ADN en la vecindad del complejo ARN polimerasa_ promotor, la polimerasa se desplaza a lo largo del ADN molde stutetizando una secuencia complementaria (A-U y G-C) de ARN de una hebra, Lat transcripcién se detiene, cuando la ARN polimerasa aleanza una secucncia de término en Ia hebra de ADN molde. Lat ARN polimerasa de procariotas es una enzima compleja provista de varlis stuibuntdades, una de las cuales, la subunidad 6, reconoce en la hebra de ADN molde la secuencia que indica el inicio de la transcrip- clon, Ello permite la correcta decodificacion del mensaje genético. La transeripeién a } CAPITULO 1 / METABOLISMO Y CONTROL CELULAR En células eucariotas existen tres tipos de ARN polimerasas (I, Il y III). El ARNr es transcrito por la ARN polimerasa I, el ARNm por la ARN polimerasa II y el ARNt por la ARN polimerasa III. En este caso son los factores de transcripcién (cualquier proteina que facilite el inicio de la transcripci6n, pero que no sea un componente estructural de la ARN polimerasa), mas que la propia enzima, los principales responsables del reconocimiento de las secuencias de inicio de transcripcién locali- zadas en el promotor. Los promotores asociados con cada una de es- tas ARN polimerasas son distintos. Se sabe que la velocidad de elongacién de la molécula de ARN durante la transcripcion es constante, y el paso que limita la velocidad de trans- cripcién es la frecuencia de inicio. Asi, mientras mayor sea la afinidad del promotor por la ARN polimerasa y/o factores de transcripcién, mayor ser la eficiencia de transcripcion. En procariotas, la molécula de ARNm que codifica para una proteina determinada se copia sin ninguna alteracién 0 modificacién previa desde una secuencia de ADN ininterrumpida. En eucariotas el proce- so es mucho mas complejo, debido a la estructura de su ADN. Este ‘sta constituido por secuencias coditicantes denominadas exones, y largas secuencias no codificantes (intermedias) denominadas intrones. 1 este caso, el ARNm transcrito desde un gen (transcripto primario) s modificado considerablemente, mediante diversos procesos post- transcripcionales, antes de abandonar el nucleo y entrar al citoplas ma como molécula de ARNm madura (Figura 2b). Los principales even- tos post-transcripcionales son: Maduraci6n por corte y empalme: proceso mediante el cual se eliminan secuencias intronicas del transcripto primario de ARNm y se unen secuencias codificantes. ‘Taponamiento: proceso mediante el cual se adiciona una molécula de 7-anctilguanosina en el extremo 5’ del transcripto primario de ARNm. Esta estructura (capucha) permite estabilizar el ARNm maduro contra icin degradativa de fosfatasas y nucleasas. Poliadenilacién: proceso mediante el cual se adiciona una secuencia de aeido poliadenilico al extremo 3° del transcripto primario de ARNm. Esta estructura otorga una mayor estabilidad a la molécula de ARNM en el citoplasma. 17CLAUDIA ALTAMIRANO / ANDRES ILLANES W.. Traduccién Lat sintests de protcinas es un proceso complejo que tiene lugar en los rihosomiats. [on ellos, el mensaje transcrito desde el ADN al ARNm, en la forma de una determinada secuencia de bases, es traducido fiel- mente a una determinada secuencia de aminoacidos en la molécula protelea. La traduccién se efecttia de acuerdo al cédigo genético, por el cual una secuucncia de tres nucleétidos (triplete o codén) en Ja molécula de ARNm codilica la incorporacién, mediada por el ARNt, de un aminoacido es- pecifico a la molécula proteica en formacién. El proceso de traduccion comienza cuando la subunidad ribosomal menor se une al ARNm. In el caso de cucariotas, la subunidad pequena del ribosoma se une al extremo 5’ del ARNm ayudada por el reconocimiento de la capucha 5’, Entonces, esta subunidad se desplaza a lo largo de la hebra de AKNm transportando su molécula de ARNt iniciador en busca de un codon AUG de iniciacién. En cuanto se ha seleccionado un codén de inicio cereano al extremo 5' ya no se utilizard como codén de inicio nlngtin otro triplete AUG. En procariotes, la union del ribosoma al ARNm se produce sobre una secuencla especifica denominada sitio de unién al ribosoma. Esta se- Cuencta es cercana al codén de inicio AUG y complementaria a regio- hes especilicas de ARNr. Ademas, puede haber un gran numero de estas secuencias sobre una misma hebra de ARNm. Como resultado de ello, normalmente los ARNm bacterianos son policistrénicos (una inivma molécula de ARNm codifican la sintesis por separado de mas de una proteina). Por el contrario, los ARNm de eucariotas son ionocistronteos, 6s decir, sobre cada molécula de ARNm se traduce tna Gntew hebra polipeptidica. En ambos tpos de células, el proceso de traduccién continua con la unton de la subunidad ribosomal mayor, complementando el ribosoma y dando tntclo a la fase de elongacion de la sintesis de proteinas. En estat lise inlervienen los aminoacil-ARNt. Cada aminoacil-ARNt se for- ma por la tnlén altamente especifica de cada aminoacido, previamen- te aetivade con ATP en la forma de aminoacil-AMP, con su respectivo ARNE que contiene en su estructura un triplete complementario al codon, denominado anticodén. De este modo los aminoacidos van sien- 18 — a CAPITULO 1 / METABOLISMO Y CONTROL CELULAR a Gen Proca Gen estyuctural AUG UAA ADN 5°30 Ce PRBS | Transcripcion ARN C RBS | Traduccion PROTEINA '~ ' Gen Eucariota 2 ve OP Potenciador ADN See 3 caja TATA intrones AAU Transcripcion ARN primario >, =a Corte y Empalme Taponamiento Poliadenilacién ARN maduro (t= examen tobe | Traduccién Proteing ———— Figura 2. Esquema del proceso de expresién génica (transeripcion y tra~ duccién). a) Células procariotas, b) Células eucariotas. 1’: promotor; ‘T: terminador; RBS: sitio de unién a ribosoma. 19CLAUDIA ALTAMIRANO / ANDRES ILLANES: do tieorporados al ribosoma en el orden dictado por Ia secuencia de codones en fa molécula de ARNm hasta alcanzar un codén de término (VAG, UIAA © UGG). En ese momento la cadena polipeptidica emerge del ribosoma y éste se desensambla para iniciar un nuevo ciclo de traduccion, La secuencia de aminoacidos unidos por enlaces peptidicos sintetiza- da cn cl ribosoma constituye la estructura primaria de una proteina, y estara determinada por la secuencia de codones en el ARNm y, como consecuencia, por el mensaje cifrado en el gen en la forma de una secuencia nucleotidica. Las propiedades funcionales de una proteina son consecuencia de su estructura tridimensional, que es la resultante de distintos tipos de interacciones entre los residuos aminoacidicos de la molécula y de éstos con las moléculas de solvente. La luncionalidad de una proteina estar entonces determinada, no sdlo por la informacion genética de la que deriva su estructura primaria, sino por cl ambiente que condiciona su conformacién tridimensional. Cube sefalar que algunos polipétidos sufren modificaciones post- traduccionales determinantes de su actividad bioldgica o destino fi- nal. Por ejemplo, algunos polipéptidos tienen en su extremo N termi- nal una secuencia denominada secuencia senal, clave en el proceso de transporte de proteinas a través de las membranas celulares. Esta secuencia es removida antes que la proteina madura (funcional) emerja de la membrana. sn células cucariotas existen ademas otras modificaciones enzimaticas post-traduccionales como por ejemplo: glicosilacién (union de oligosacaridos a residuos aminoacidicos especificos), fosforilacién, acetilacton, ete. 4, REGULACION DE LA EXPRESION GENICA EI correcto funcionamiento de la compleja maquinaria celular exige sistemas de regulacién altamente eficientes, que permitan a la célula coordinar su funclonamiento fisiolégico, utilizar eficientemente los nutrientes y adaplarse a cambios en el ambiente que la rodea. Dado que cada una de las reacciones bioquimicas que componen la maquinarla celular es catalizada por una enzima especifica, los mecz nismos de regulacién actiian a nivel enzimatico, ya sea a nivel de sin- 20 a CAPITULO 1 / METABOLISMO Y CONTROL CELULAR lests proteica, alterando la cantidad de enzima presente, 0 a nivel de actividad enzimatica, activacién o inhibicion, que no altera la canti- «lad de enzima presente, pero si su funcionalidad. La transcripcion es la primera fase de la expresion génica y la princi- pal etapa en que dicha expresion se controla. Ademas existen algunos mecanismos de control que acttian en la etapa de traduccién y otros durante eventos post-traduccionales. 4.1. Regulacion de la transcripci6n Para entender los mecanismos que actuan a este nivel, resulta util el concepto de operén, entendido como una unidad de expresion génica formada por los genes estructurales y los elementos que controlan su expresion. 1esde el punto de vista de la expresion génica, los operones se pueden dividir en: Opcrones de expresién constitutiva: Aquellos que se transcriben per- miinentemente, independiente de las condiciones ambicutales. Por cjemplo, operones para las enzimas ADN y ARN polimerasas, para las proteinas ribosémicas, ete. Opcrones de expresion regulable: Aquellos cuya expresion esta regula- dla en funcién de las condiciones ambientales. Dentro de esta catego- ria, se distinguen a su vez: operones de expresién inducible y operones de expresion reprimible. Ios mecanismos de regulacién de la transcripcion pueden actuar du- tante cl inicio o durante la elongacién de la transcripcién. 4.1.1 Regulacién del inicio de la transcripcién En procariotas Ia regulacién del inicio de la transcripcion se puede dcber a la presencia de subunidades sigma alternativas o de proteinas reguladoras que facilitan o impiden la union de la ARN polimerasa al promotor, Requlacion por subunidades alternativas. Se basa en que la subunidad @‘hormual’ de la ARN polimerasa es sustituida por un tipo de subunidad @ dilerente (codificada por genes distintos). La ARN polimerasa con lit 21CLAUDIA ALTAMIRANO / ANDRES ILLANES tuieva subunidad reconoce ahora un tipo de promotor distinto des- deel cual se inicia la transcripeién. Esto hace que se transcriban Gperones que hasta entonces permanecian silentes (sin expresién). Este (ipo de mecanismo opera, por ejemplo, en bacterias durante la respuesta al choque térmico, durante procesos de esporulacién 0 cuan- do sulren falta de nitrogeno. Regulacién por proteinas reguladoras. Puede ser de dos tipos: Induceién, que se refiere a Ia sintesis de ciertas enzimas, denomi- hadas inducibles, en respuesta a la presencia en el medio de deter- minados estimulos ambientales, no necesaria pero usualmente de tipo nutricional. La molécula que acttia como sefal, denominada inductor, suele ser el sustrato de una enzima en una ruta catabolica © un analogo de dicho sustrato, no necesariamente metabolizable (inductor gratuito). También puede actuar como inductor un pro- ducto de la reaccién catabélica, como suele ocurrir en el caso de depolimerasas. Represién por retroalimentacién, que dice relacion con la supresion de la sintesis de una o mas enzimas asociadas a la ruta biosintética de un determinado compuesto, debido a un exceso del producto final de la ruta. La molécula que actiia como senal, se denomina correpresor y suele ser el producto final de una ruta biosintética o una molécula derivada En general, las moléculas que acttan como sefales de control se de- nominan efectores, y suelen ser moléculas pequefias. El mecanismo de accion de estos efectores es a través de su interaccién con protei- nas reguladoras especificas para cada operén. A su vez, la proteina reguladora (producto de un gen regulador) interacciona con secuen- clas especiticas localizadas en el sitio operador del operon cercano al promotor, controlando la expresién de los genes estructurales. ‘Tanto la induccién como la represién por retroalimentacién podrian estar sujetas a control positivo 0 negativo. Estos sistemas de control se definen segtin la respuesta del operén en presencia de la proteina reguladora, En el caso de control negativo, la presencia de la proteina reguladora impide la transcripci6n; este sistema proporciona un me- canismo de seguridad, ya que sila proteina reguladora no se sintetiza, hay transcripeion y se sintetizan las enzimas correspondientes. En el caso de control positivo, la presencia de la proteina reguladora es re- 22 — CAPITULO 1 / METABOLISMO Y CONTROL CELULAR qucrida para el inicio de la transcripeién, de modo que en su ausencia ho se sintetizan las enzimas correspondientes. En la Figura 3 se muestra un esquema que describe a nivel genético los mecanismos de regulaci6n (inducci6n y represién por retroalimen- tacién) bajo control positivo y negativo. El control negativo e inducible es propio de rutas catabolicas, donde el principio de economia debe garantizar que las enzimas de la ruta s6lo se sinteticen en presencia del sustrato, En este caso la proteina reguladora per-se bloqueara la transcripcién pero podra ser contra- rrestada por la presencia del efector (inductor). Un sistema paradig- matico de control negativo e inducible es el operon lac (metabolismo de la lactosa) de Escherichia coli (elucidado por Jacob y Monod). Este también es un control positivo, como se detallara mas adelante. El control negativo y reprimible es muy apropiado y econémico para detener la transcripcion de genes de rutas de biosintesis de precurso- res de biomoléculas (como aminodcidos en el caso de proteinas, de bases nitrogenadas en el caso de acidos nucleicos, etc.) cuando tales precursores estan disponibles en el medio de cultivo. En estos siste- mas, a diferencia de la regulaci6n de operones catabélicos, la proteina reguladora per-se es inactiva (aporrepresor) y debe ser activada por el correpresor, que suele ser el producto final de la ruta biosintética. En algunos casos, el gen regulador de este sistema también se ve reprimi- do por el represor activo, es decir, el nivel de aporrepresor esta autocontrolado, lo que constituye un sistema de regulacién autégena. I] control positivo e inducible, es muy bien ilustrado por el fendémeno de represién catabdlica. Cuando en el medio de cultivo existen dos fuentes de carbono como, por ejemplo, glucosa y lactosa, se presenta un crecimiento celular en dos fases llamado crecimiento diduxico. Mien- tras existe glucosa en el medio de cultivo, la lactosa no se metaboliza dcbido al impedimento de transcripcion de los genes estructurales del operon lac, que el catabolismo de la glucosa provoca. Pero una vez que la glucosa se agota, el operon lac se activa y se transcriben sus genes estructurales, provocando la sintesis de las enzimas que permiten inetiabolizar la lactosa. i] nombre de represion catabélica se acuho cuando aun se descono- cia la base inolecular de su funcionamiento. A pesar de que este t uilno contintia utilizandose por motivos histéricos, hoy se sabe que 23