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Investigación de virus

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Leucosis bovina enzoótica en un ternero de dos meses

Keisuke Oguma, Miho Suzuki, Hiroshi Sentsui⁎
Laboratorio de Epizootiología Veterinaria, Departamento de Medicina Veterinaria, Universidad de Nihon, 1866 Kameino, Fujisawa, Kanagawa, 252-0880, Japón

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: A un ternero de dos meses se le diagnosticó leucosis sobre la base del signo clínico de ganglios linfáticos superficiales
BLV agrandados. Se realizaron pruebas serológicas y genéticas para el virus de la leucemia bovina (BLV) porque el ternero nació
LBE de una vaca infectada con BLV. El suero tenía un anticuerpo BLV débilmente positivo y el provirus BLV se detectó dentro de las
Becerro
células neoplásicas al realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El análisis del sitio de integración del provirus BLV
PCR inversa
mediante PCR inversa reveló que la ubicación del sitio de integración del BLV era idéntica en todos los cromosomas en todos
Sitio de integración
los tejidos tumorales examinados. Por lo tanto, las células tumorales proliferaron monoclonalmente después de la infección
por BLV. El presente estudio muestra que la leucosis bovina enzoótica puede ocurrir en un animal joven, como en el ternero
de dos meses de nuestro estudio.

1. Introducción 2. Materiales y métodos

El virus de la leucemia bovina (BLV) es el agente etiológico de la leucosis
bovina enzoótica (EBL). BLV se transmite horizontalmente por artrópodos como el
tábano o a los terneros a través deen el úteroinfección y la ingestión de calostro
de una vaca infectada con BLV. La transmisión iatrogénica puede ocurrir a través
de instrumentos quirúrgicos o mangas contaminadas con sangre infectada
durante la palpación rectal. El linfoma ocurre en aproximadamente 5% a 10% de
las vacas infectadas con BLV, predominantemente en animales mayores de 3 a 5
años.Gutiérrez et al., 2014a). El diagnóstico de infección por BLV se determina
serológicamente a través de una prueba de inmunodifusión en gel de agar (AGID),
un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Hoff-Jørgensen, 1989; Kettmann
et al., 1994). Otro método de diagnóstico es la detección del genoma BLV
integrado en muestras de sangre y tejido mediante la reacción en cadena de la
polimerasa genómica (PCR) (Fechner et al., 1996). Sin embargo, el genoma y el
anticuerpo de BLV son detectables en algunos casos de leucosis bovina esporádica
(SBL), incluida la forma juvenil, que no estaba relacionada con la infección por BLV.
Jacobs et al., 1992). La confirmación de solo uno o unos pocos sitios de integración
de BLV dentro de un tejido tumoral muestreado es diagnóstico de EBL porque los
tumores de EBL son de origen monoclonal u oligoclonal.Kettmann et al., 1980;
Kettmann et al., 1983; Coulston et al., 1991; Murakami et al., 2011). En el presente
estudio, investigamos un caso de LBE en un ternero de dos meses diagnosticado
mediante un análisis del sitio de integración de los tejidos tumorales.
2.1. Descripción del caso
Una ternera demacrada de dos meses de edad con neumonía, bronquitis
y ganglios linfáticos superficiales agrandados fue examinada en un centro
de servicios clínicos veterinarios de la Asociación Nacional de Seguros
Agrícolas. Un examen de sangre reveló leucocitosis (23 560 células/μL) con
marcada neutrofilia (15 078 células/μL), incluido un aumento en el número
de células punzantes (3063 células/μL). El recuento de monocitos también
estaba ligeramente elevado (942 células/μl) y el recuento de linfocitos era
normal (4476 células/μl). No se detectaron eosinófilos ni basófilos en un
frotis de sangre. La actividad de lactato deshidrogenasa sérica fue de 3432
unidades/L. El ternero fue sacrificado humanamente y se le realizó la
necropsia. Se notó linfadenomegalia generalizada y se observaron nódulos
anormales en la superficie y en el parénquima de los órganos torácicos y
abdominales (Figura 1). Sin embargo, la anemia, la fiebre y el
agrandamiento simétrico de los ganglios linfáticos, que son los signos
clínicos generales de la forma juvenil de SBL (Hendrick, 2002), no se
observaron. Un examen microbiológico de los hisopos de abscesos
encontrados en el pulmón y la tráquea detectados coronavirus bovino,
Actinomyces pyogenes, Streptococcus bovis,yMycoplasma bovis.
2.2. Análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de BLV

Se realizó una PCR genómica para amplificar unaenvfragmento del gen del
provirus BLV. El ADN molde se extrajo de ganglios linfáticos mamarios, cervicales
superficiales, inguinales e hiliares aumentados de tamaño utilizando

⁎Autor para correspondencia en: Laboratorio de Epizootiología Veterinaria, Departamento de Medicina Veterinaria, Universidad de Nihon, 1866 Kameino, Fujisawa, Kanagawa, 252-0880, Japón.
Dirección de correo electrónico:sentsui.hiroshi@nihon-u.ac.jp (H. Sentsui).

http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2017.03.016 Recibido el 8 de
febrero de 2017; Aceptado el 18 de marzo de 2017 Disponible en
línea el 19 de marzo de 2017
0168-1702/ © 2017 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
K.Oguma et al.
Figura 1.La apariencia del ternero y los hallazgos macroscópicos de la necropsia. (A) Emaciación de la pantorrilla. (B) El agrandamiento de un ganglio linfático de la glándula parótida. (C y D) Nódulos blancos en el lóbulo pulmonar (flechas).
el Gentra Puregene Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania), según las instrucciones
del fabricante. También se extrajo ADN de sangre periférica utilizando el
DNeasy BloodFechner et al., 1997). Se utilizaron las siguientes
imprimaciones externas:env5032 (5′-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3′)y env
5608r (5′-AACAACAACCTCTGGGAAGGGT-3′).Esto da como resultado la
amplificación de un fragmento de 598 pb. Se produjo un fragmento de 444
pb utilizando los siguientes cebadores internos:env5099 (5′-
CCCACAAGGGCGG-CGCCGGTTT-3′)yenv5521r (5′-
GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-3′).La PCR se realizó utilizando GoTaq Green
Master Mix (Promega, Madison, WI) y cebadores con una concentración final
de 0,5 μM. La amplificación durante la primera ronda de PCR se realizó de la
siguiente manera: la desnaturalización inicial fue a 94 °C durante 2 min,
seguida de 40 ciclos de los siguientes 3 pasos: a 94 °C durante 30 s, 62 °C
durante 30 s , y 72 °C durante 30 s. La segunda ronda de PCR se realizó con
el mismo protocolo, excepto que la temperatura de hibridación se fijó en 70
°C y se realizaron 35 ciclos de amplificación.
2.3. PCR inversa (iPCR)
El procedimiento para iPCR se realizó como se informó anteriormente (
Murakami et al., 2011). Las muestras de ADN de tejido tumoral que se usaron para
la PCR genómica se digirieron conbclYO,Pstyo, oBssHII y luego se autoligaron
usando Mighty Mix (Takara Bio, Shiga, Japón). Los productos resultantes se usaron
como moldes para PCR usando cebadores inversos. Los productos de la PCR se
sometieron a electroforesis en un gel de agarosa y las muestras positivas se
clonaron en un vector pCR2.1-TOPO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). A
continuación, el producto se secuenció utilizando el kit de secuenciación cíclica
BigDye Terminator v3.1 con un analizador genético Applied Biosystems 3130
(Thermo Fisher Scientific). La secuencia del genoma bovino adyacente a los 5′La
repetición terminal larga se determinó usando la búsqueda BLAT de vaca de la
Universidad de California, Santa Cruz (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?
command=start) contra la congelación de octubre de 2011 de la secuencia del
genoma de la vaca como se describió anteriormente (Miyasaka et al., 2015).
2.4. Cuantificación del número de copias del provirus BLV en tejidos tumorales
El provirus BLV en los tejidos tumorales se cuantificó mediante reali- zación dúplex.
121
Investigación de virus 233 (2017) 120–124
PCR a tiempo que permitió la detección simultánea de BLVpolíticoy el gen de
la beta-actina bovinaACTBen un solo tubo de PCR. Para hacer muestras
estándar para la cuantificación, un BLV parcialpolíticoEl fragmento del gen
se amplificó a partir del ADN genómico de células de riñón de cordero fetal
persistentemente infectadas con BLV (células FLK-BLV) (Van Der Maaten y
Miller, 1975) utilizando un juego de cebadores (Adelante: 5′-
AAGCTCACCCACTGCAACTCT-3′,Reverso: 5′- TCTGATTGTGAGTCCAGAGGG-3′)y
clonado en un vector pCR2.1-TOPO (Thermo Fisher Scientific). Un bovino
parcialACTBEl fragmento del gen también se amplificó a partir del ADN de
células renales bovinas de Madin-Darby utilizando un conjunto de cebadores
(Adelante: 5′-TACGCCCTTCCCCATGCCATCCTGCG-TCTG-3′,Reverso: 5′-
TCTTCATTGTGCTGGGTGCCAGGTCATTGA-3′) y clonado en un vector pCR2.1-
TOPO. losRsaVector digerido con I que contiene unpolíticofragmento fue
subclonado en unecológicodigerido por RV ACTB-vector clonado. El plásmido
resultante que contiene ambospolíticoy ACTBa una relación molecular
exactamente equivalente se ajustó de 106a 101copias por dilución en serie de
10 veces usando EASY Dilution (Takara); estos se usaron como muestras
estándar. La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó mediante un ensayo de sonda
Taqman utilizando un termociclador ABI 7500 Fast (Thermo Fisher Scientific)
y Thunderbird Probe qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japón). Los cebadores y la
sonda parapolíticofueron los siguientes: Adelante (pol-4219F): 5′-
TTCACCTACGCTCTGCATGTG-3′,Reverso (pol-4339R): 5′-
CCAGATGCACTATGGCCTCAA-3′,y sonda (pol- 4256T): 5′-FAM-
CTGGAGCTACTCATGC-aglutinante de ranura menor (MGB)- 3′.ACTBse
cuantificó utilizando los siguientes cebadores y sonda: Adelante: 5′-
TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3′,Reverso: 5′-GGCAGACT-TAGCCTCCAGTG-3′,y
sonda: 5′-VIC-CTTCCTTCCTGGGTGAGTGAG-AAG-MGB-3′.Todos los cebadores
y sondas se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. La concentración final
de cada cebador y sonda fue de 0,6 μM y 0,2 μM, respectivamente. La
condición de PCR fue la siguiente: 95 °C, 20 s para la primera
desnaturalización, luego 40 ciclos de 95 °C, 3 s y 60 °C, 30 s. Copie los
números del provirus BLV yACTBse analizaron en el ADN de tumores típicos
de EBL desarrollados en 12 vacas adultas que fueron proporcionadas por un
centro de inspección de carne en Japón, además del ADN de cuatro tejidos
tumorales y la sangre periférica del ternero presente. qPCR se realizó por
duplicado. El significadopolítico número en 100 celdas de cada muestra que
se muestra en la sección Resultados se calculó de la siguiente manera:
[promediopolíticonúmero de copia/(mediaACTBnúmero de copia/2)] × 100.
K.Oguma et al.
2.5. Determinación de la secuencia del genoma completo de BLV
La secuencia proviral completa de la cepa BLV del ternero infectado se
determinó mediante PCR convencional. La secuenciación se facilitó dividiendo el
provirus en 22 partes y utilizando los cebadores diseñados a partir de las
secuencias BLV obtenidas de la base de datos del Centro Nacional de Información
Biotecnológica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).
2.6. Examen histológico de los tejidos tumorales
Los tejidos tumorales se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %
y se incluyeron en parafina. Las secciones de parafina se tiñeron con
hematoxilina y eosina. Los anticuerpos monoclonales para
inmunohistoquímica se adquirieron en el Centro de Anticuerpos
Monoclonales de la Universidad Estatal de Washington (Pullman, WA) e
incluyeron los siguientes: MM1A (CD3), CACT138A (CD4), CACT105A (CD5),
CACT80C (CD8α), MM10A (CD11b), LCT27A (CD45R/B220), BIG73A (IgM),
TH14B (MHC clase II) y BIG501E (cadena ligera λ). Anti-IgG2 (BG2-7) se
adquirió de Sigma Aldrich (Saint Louis, MO). La visualización se realizó
utilizando kits LSAB2, Universal (Dako, Glostrup, Dinamarca).
2.7. prueba AGID
El antígeno BLV para la prueba AGID se preparó usando células FLK-BLV.
Los fluidos de cultivo se concentraron usando sulfato de amonio, luego se
dializaron en agua destilada y se concentraron más con polietilenglicol
usando un procedimiento publicado (Kono et al., 1982). Las pruebas AGID se
realizaron de acuerdo con el manual de la OIE. El gel constaba de agar Noble
al 1,0 %, NaCl al 8,5 % y tampón Tris 50 mM. Los pozos tenían 5 mm de
diámetro y se colocaron seis pozos circunferenciales a una distancia de 3
mm del pozo central. El pocillo central se llenó con el antígeno y dos pocillos
exteriores opuestos se llenaron con el suero de control positivo. Se tomaron
muestras de suero del ternero y su madre. Se utilizó solución salina
tamponada con fosfato (PBS) como control negativo. La placa de difusión de
gel se dejó reposar a temperatura ambiente durante 48 horas y se
observaron las líneas de precipitación.
3. Resultados
3.1. Detección de BLV y análisis iPCR de tejidos tumorales
La PCR genómica de los cuatro ganglios linfáticos agrandados amplificó
el BLV envfragmento de gen en la primera y segunda rondas de PCR (Figura
2). Las mismas plantillas digeridas con enzimas de restricción se sometieron
a iPCR y, en total, se secuenciaron 29 clones. Las cuatro muestras de ADN
tumoral digeridas conecológicoRI yPstContenía el provirus BLV integrado en
la posición 25.702.287 del cromosoma 15.BssLa digestión con HII no dio
ninguna señal positiva. El sitio integrado era una unidad no transcripcional (
Fig. 3).
Figura 2.Detección de BLV en tejidos tumorales mediante PCR anidada. Las plantillas eran ADN genómico
extraído de ganglios linfáticos hiliares (Hil), cervicales superficiales (Cer), inguinales (Ing) y mamarios
(Mam). Los tamaños de fragmento esperados fueron de 577 pb y 423 pb en la primera y segunda PCR,
respectivamente. Los productos de PCR se cargaron en un gel de agarosa con un marcador de ADN (M).
122
Investigación de virus 233 (2017) 120–124
3.2. Cuantificación de BLV en tejidos tumorales
La qPCR de BLV en el ternero EBL mostró que el provirus BLV se integró
en un promedio del 57,7 % del total de células examinadas de los cuatro
tejidos tumorales (mediana: 57,3 %, rango: 44,7 %–71,6 %) y en solo el 1,8 %
de los leucocitos en sangre (Figura 4). La integración de BLV se detectó en
otros 12 tumores EBL adultos en un promedio del 123,6 % del total de
células (mediana: 102,0 %, rango: 7,2 %–322,9 %).
3.3. Secuencia del genoma de BLV
La secuencia del provirus BLV integrado tenía una longitud de 8720 pb y
se depositó en el Banco de datos de ADN de Japón (AB987702). La secuencia
completa de BLV mostró una homología de secuencia del 99,2 % con el
provirus BLV en células FLK-BLV (EF600696) y del 98,8 % con una cepa de
referencia japonesa BLV (K02120). Se encontró que el residuo en el codón
230 del precursor de la proteína Env era asparagina.
3.4. Examen histológico
La arquitectura histológica normal del tejido de los ganglios linfáticos agrandados se
interrumpió casi por completo por la infiltración de células tumorales grandes. Varias
mitosis fueron evidentes en la mayoría de las vistas de campo de alta potencia (Figura 5
A). Algunas células tenían núcleos atípicos y nucléolos prominentes (Figura 5B). Las
células tumorales fueron positivas para los siguientes marcadores: marcador de células B
CD45R, cadena ligera λ (Figura 5C), IgM (Figura 5D) e IgG2. Las células reaccionaron
débilmente con MHC de clase II y tuvieron un resultado negativo para otros antígenos.
3.5. Anticuerpo a BLV en sueros de ternera y madre en la prueba AGID
Se formó una línea de precipitación débil, pero detectable, en el suero de
la madre, pero se observó una reacción apenas positiva en el suero del
ternero leucémico (Figura 6).
4. Discusión
Generalmente, BLV requiere un largo período de latencia para causar EBL. Por
lo tanto, es más probable que la leucosis bovina en terneros se presente como
una forma esporádica independiente de BLV. Los métodos de diagnóstico
convencionales para la infección por BLV, que incluyen pruebas de anticuerpos y
PCR para la amplificación del fragmento del gen del provirus BLV, no pueden
distinguir entre casos de EBL y SBL con infección por BLV. Sin embargo, la
ubicación del sitio de integración de BLV dentro del tejido tumoral en un caso de
EBL es idéntica, ya que las células tumorales de EBL son de naturaleza monoclonal
y proliferan a partir de una sola célula transformada. En el presente caso, el
diagnóstico de EBL se estableció mediante iPCR porque BLV tenía sitios de
integración idénticos en tumores anatómicamente diferentes. Aunque el provirus
BLV se detectó en aproximadamente la mitad del total de células examinadas de
los cuatro ganglios linfáticos tumorales, atribuimos esto a la contaminación de
células estromales negativas para BLV. Un nivel comparable del BLVpolíticoEl gen
se amplificó en tumores EBL adultos. Las células tumorales se clasificaron como
células B-2 (B convencionales) ya que eran CD5−/CD11b−y marcador de células T
negativo (Ikeda et al., 2005).
Según se informa, el reemplazo de asparagina con ácido glutámico en el
codón 230 de la proteína Env mejora la patogenicidad de BLV a través de la
alteración del estado de glicosilación ligada a N (de Brogniez et al., 2015). Sin
embargo, la cepa BLV en el ternero en este estudio mantuvo la asparagina en este
sitio. Por lo tanto, la patogénesis de BLV analizada en nuestro estudio podría estar
relacionada con otras secuencias o sitios integrados en los cromosomas del
animal huésped.
El ternero tenía un título de anticuerpos bajo para BLV. Esto puede atribuirse a
la reciente infección con BLV y la rápida progresión del tumor antes de que se
pudiera producir una cantidad clínicamente detectable de anticuerpos BLV porque
los terneros recién nacidos tienen una respuesta inmunitaria más débil que los
adultos y su capacidad para producir anticuerpos es relativamente inadecuada.
K.Oguma et al. Investigación de virus 233 (2017) 120–124

Fig. 3.Análisis BLAT del sitio de integración de BLV en el cromosoma 15 y la organización genómica del huésped circundante.

Figura 4.Cantidad del provirus BLV en tumores y sangre del ternero en el presente estudio y 12 Figura 6.Título de anticuerpos de los sueros de la ternera leucémica y su madre. Ag: Antígeno. PS:
casos típicos de EBL. Porcentaje de BLV-políticocélulas positivas al gen en cada tejido tumoral antisuero de referencia positivo. Ternero y Madre: Sueros de la ternera leucémica y su madre.
(ordenadas) fue estandarizado por elACTBgene. Cuatro ganglios linfáticos tumorales de la PBS se colocó como control negativo.
pantorrilla: hiliares (H), cervicales superficiales (S), inguinales (I) y mamarios (M). Bl indica sangre
periférica.
Infección vírica (McClurkin et al., 1984), aunque esto no ha sido informado. Se ha
sugerido que la transmisión vertical del virus linfotrópico T humano-I, que está
cuarteto (Ingram y Smith, 1965; Senogles et al., 1979). Sin embargo, existe la
estrechamente relacionado con el BLV, es un factor de riesgo para la aparición de
posibilidad considerable de que el huésped tuviera una deficiencia inmunológica
leucemia de células T en adultos.Proietti et al., 2005).
contra el BLV. La prueba AGID mostró un anticuerpo BLV débilmente positivo, que
Aunque la relación entre la vía de transmisión y la patogenia de la LBE sigue
puede haber sido provocado por anticuerpos maternos remanentes que se
sin estar clara en el presente caso, el estado inmunológico del huésped, el tiempo
transfirieron del calostro y atribuible a una inmunorreacción débil contra BLV. Los
de infección del virus y la carga proviral pueden ser factores importantes en la
casos deen el úterola infección puede conducir a una tolerancia inmunológica
patogenia de la LBE a una edad temprana. Gutiérrez
hacia el BLV como se observa en la diarrea viral bovina

Figura 5.Histología de los tejidos tumorales. Se muestran microfotografías de tinción con hematoxilina y eosina (A y B) e inmunohistoquímica de la cadena ligera λ (C) e IgM (D). Las flechas son figuras mitóticas (A) y
nucléolos (B). Una punta de flecha en (B) es un núcleo atípico. Las pequeñas células redondas que se muestran en (B, lado izquierdo) se consideran linfocitos residuales no tumorales. Todas las barras de escala son de 50
μm.

123
K.Oguma et al.
et al. reportaron la dinámica de propagación de BLV en terneros que fueron
infectados durante la primera semana de vida. Se ha demostrado que la infección
perinatal conduce a una alta carga proviral en terneros sin EBL (Gutiérrez et al.,
2014b). Algunos estudios han observado una relación entre un alto número de
copias del provirus BLV y la gravedad de la enfermedad.Aída et al., 2013). En
consecuencia, se considera importante un análisis de la relación entre el número
de provirus en sangre y el desarrollo de EBL. Debido a que la carga proviral de
nuestro caso fue tan baja como 1.8% en células nucleadas de sangre periférica,
concluimos que el ternero tenía linfosarcoma sin aparente linfocitosis persistente.
En conclusión, iPCR es un método efectivo para evaluar el crecimiento clonal
de una célula tumoral EBL a través de la identificación de la ubicación del sitio de
integración BLV. Se ha demostrado que la EBL se desarrolla en terneros a una
edad temprana, y un título bajo de anticuerpos de BLV no puede descartar una
infección. En consecuencia, EBL puede haber ocurrido en terneros que fueron
diagnosticados con la forma juvenil de SBL. La infección por BLV es cada vez más
frecuente en Japón (Murakami et al., 2013). Por lo tanto, la detección precisa de la
infección por BLV y el diagnóstico de EBL son necesarios para prevenir la
transmisión de BLV.
Reconocimiento
Este estudio fue apoyado por una subvención para el Proyecto Frontera
Académica para Universidades Privadas del Ministerio de Educación, Cultura,
Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón (S-1491007).
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