CODIGO P-SA-81

RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE

Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 1 de 10

RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE

Clostridium sulfito reductor
(ICMSF)

ELABORÓ APROBÓ REVISÓ APROBÓ

PROFESIONALES SECRETARIO SALUD GERENTE DE REPRESENTANTE DE
DESARROLLO DIRECCIÓN
ORGANIZACIONAL

DORA PATRICIA
ROZO CRUZ
MARINA STELLA
GONZÁLEZ MIGUEL GIOVANNI ROMULO MUÑOZ ANGELA MILENA
ROBAYO BELTRAN KNORR ECHEVERRY LOZANO CAICEDO
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 2 de 10

1. OBJETIVO

Describir la Técnica de Aislamiento y recuento de bacterias de Esporas Clostridium

sulfito reductor para detectar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en
análisis microbiológico en alimentos de consumo humano.

2. ALCANCE

3. El procedimiento técnico de Aislamiento y recuento de bacterias de Esporas

Clostridium sulfito reductor en Alimentos de consumo humano, aplica a todas las
muestras para análisis microbiológico que son recepcionadas y analizados en
Laboratorio de Salud Pública

4. DEFINICIONES

 Clostridium sulfito reductor: Son aquella bacterias de morfología bacilar gram

positiva, anaerobias estrictas, capaces de formar esporas y con capacidad de reducir
el sulfito a sulfuro. Son colonizadores habituales del intestino humano y de algunos
animales. Esta cualidad unidad a la alta resistencia de sus esporas le dan valor como
indicadores de contaminación fecal de carácter no reciente tanto en agua como en
alimentos

 Espora: Célula reproductora producida por ciertos hongos, plantas (musgos,

helechos) y algunas bacterias. Ciertas bacterias producen esporas como mecanismo
de defensa. Las esporas bacterianas tienen paredes gruesas y pueden resistir las
altas temperaturas, la humedad, la acción de productos de limpieza y otras
condiciones desfavorables.

 Unidades formadoras de colonias (UFC): Término que debe utilizarse para reportar
la cuenta de colonias en placa.

 Siembra volumétrica: Este método de siembra consiste en sembrar una muestra

liquida, en medio de cultivo sólidos o líquidos.

4. RESPONSABLES

Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de

Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Pública del Meta cumplir con los
lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté
debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de
muestras.
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 3 de 10

5. GENERALIDADES

Constituido por un grupo de Bacilos Gram Positivos esporulados.

Son colonizadores habituales del intestino humano y algunos animales.

Algunas de las especies del género Clostridium tienen la propiedad de reducir el ion sulfito
a sulfuro que en presencia de citrato férrico o cualquier otra sal (metales pesados) forman
colonias de color negro

El recuento de esporas es considerado como el indicador más importante de las bacterias

anaerobias capaces de formar esporas. Estas estructuras de supervivencia suelen
presentarse en alimentos enlatados que no han sido producidos bajo condiciones de
calidad en cada proceso y malas condiciones de almacenamiento.

Factores de Contaminación en los Alimentos

 Refrigeración insuficiente
 Deficiente almacenamiento
 Preparar alimentos varias horas antes de servirlos
 Recalentamiento de restos de comida

6. REFERENCIAS

Norma ICMSF

7. DESARROLLO

7.1 Fundamento

Los microorgnismos anaerobios obligados (Bacillus, Clostridium...) sólo pueden crecer a

bajos potenciales redox, y algunos únicamente crecerán en ausencia de oxígeno. Suelen
encontrarse en la parte interna de los alimentos no procesados y juntamente con los
anaerobios facultativos constituyen los principales microorganismos de la alteración. Su
valoración en los alimentos nos sirve como indicador de contaminación telúrica remota por
la presencia de esporas resistentes. El número máximo de esporas, es decir, el "número
total de esporos", se puede determinar usando tratamientos térmicos de la muestra del
orden de los 70-80°C durante 10-15 minutos, con lo que conseguimos destruir las formas
vegetativas y revivificar tan solo los esporos. Al hacer recuento hay que partir del principio
de que una espora da lugar a una colonia en el medio de cultivo
7.1.1 AGAR SPS (AGAR SULFITO- POLIMIXINA - SULFADIAZINA)
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 4 de 10

SPS Agar se utiliza para la detección y recuento de Clostridium perfringens en los

alimentos.

SPS Agar contiene peptona como fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales.
Vitaminas, extracto de levadura material de construcción del complejo B que estimula el
crecimiento bacteriano. Citrato férrico de sodio y sulfito son indicadores de H2S.
Clostridium reduce el sulfito a sulfuro, que reacciona con el hierro de citrato férrico para
formar un negro hierro precipitado de sulfuro. Polisorbato 80 es un agente dispersante.
Sulfato de polimixina B y sulfadiazina son inhibidores para los organismos que no sea
Clostridium spp. tioglicolato de sodio es un reducción de agente. El agar es el agente
solidificante.
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 5 de 10

7.2 MATERIALES

Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara

conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de
muestras de alimentos para consumo humano.

7.2.1 Equipos

 Incubadora a 35°C ±1°C

 Tubos tapa rosca de 150 x 15mm estériles
 Baño María 80°C

7.2.2 Medios de cultivo y reactivos

 Agar SPS (Agar Sulfito- Polimixina - Sulfadiazina)

7.2.3 Cepas de Referencia

 Clostridium perfringens ATCC 13124

7.3 PROCEDIMIENTO
7.3.1 Controles y o curvas de calibración

 Control Positivo: A partir de una siembra de Clostridium perfringens ATCC 13124

sembrado en Agar SPS, se toma una porción de la colonia con la ayuda de un asa
recta desechable y estéril, siembra por punción en un tubo que contiene Agar SPS
(Agar Sulfito- Polimixina - Sulfadiazina) se adiciona agar SPS previa solidificación de
10 CC DE MEDIO la primera capa y de esta manare garantizar la anaerobiosis e
incubar a 35°C +/- 1°C - realizando lecturas a las 24, 48 y 72 horas am/pm debido a
que los microorganismos pueden producir.

 Control Negativo: Solo se realiza esterilidad del medio (SPS) incubar a 35°C +/- 1°C -
realizando lecturas a las 24, 48 y 72 horas am/pm.

7.3.2 Condiciones Ambientales y manejo de equipos

Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83

Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para
consumo humano.

7.4 Descripción del Método

La técnica se basa en Recuento en Tubo del número de colonias de bacterias
esporuladas y con capacidad sulfito reductora desarrolladas en medio de cultivo sólido
glucosado con sulfito sódico y una sal de hierro, tras incubación en anaerobiosis.
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 6 de 10

7.4.1 Metodología

 Preparación de la muestra. Pipetear 1ml de la muestra en tubo estéril.

 Colocar el tubo en baño de María a 80°C durante 10min. Dejar enfriar rápidamente en
vaso con agua con hielo.
 Verter 4 ml del Agar SPS en el tubo que contiene la muestra. Agitar suave y dejar
solidificar. Adicionar 5ml de agar SPS como una segunda capa de medio. Dejar
solidificar
 Incubar los tubos a 35°C+/-1 realizando lecturas a las 24, 48 y 72 horas am/pm.

NOTA: La adición de la doble capa del medio SPS a los tubos obvia la utilización de
cámara de anaerobiosis e indicador.

7.4.1.1 Lectura
7.4.1.1.1 Macroscópica

 Se recomienda observar los tubos incubados a 35°C +/- 1°C - realizando lecturas a las
24, 48 y 72 horas am/pm debido a que los microorganismos pueden producir H2S
tornando el medio de cultivo de color negro, impidiendo su lectura. A medida que se
observan colonias se van marcando en el mismo tubo.
 El recuento de 5 – 50 colonias
Ejemplo:
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 7 de 10

8. VERIFICACIONES

8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados

Para comprobar la capacidad del laboratorio de realizar de detectar Formas

Esporuladas de Clostridium Sulfito Reductor, con el método técnico de Aislamiento y
Recuento, realizar los siguientes controles con material de Referencia y analizados en
las mismas condiciones que la muestra.

Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa
de siembra estéril e inoculo en una caja del medio selectivo utilizado una muestra
(actividad 7.5)

Medio de Cultivo Control Imagen

Control Positivo
Clostridium
perfringens ATCC
13124

Agar SPS (Agar

Sulfito- Polimixina
- Sulfadiazina)

Control Medio de
Cultivo - Esterilidad

Registrar en los formatos

 F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

 F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas
 F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos
 F-SA-34 Control Interno de Equipos
 F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos.
 F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 8 de 10

Criterio de Aceptación o Rechazo

ACCION PARA
RANGO DE
INCUMPLIMIEN
CRITERIO LECTURA ACEPTACION
TO DE
CRECIMIENTO
CRITERIOS
Control Positivo
Clostridium
Colonias negras con Repetir Análisis
perfringens Inhibido
producción de H2S Verificar.
ATCC 13124

Repetir siembra
Control Negativo
Verificar el Crecimiento en de cepas ATCC
E.coli ATCC Masivo
el control Positivo y repetir el
25922
Análisis
Descartar
Reactivos y
Reactivos Vigencia del reactivo Reactivo Vigente a la adquirir y
vigentes dentro de la fecha fecha de utilización procesar con
reactivos en
fechas vigentes
Ajustar control
de Temperatura
y tomar
Temperaturas de Temperatura ajusta a Temperatura
nuevamente
Incubadoras 35ºC +/- 1 35ºC +/- 1
hasta obtener
temperatura
deseada.
Solicitar y
ejecutar los
mantenimientos
Calibración,
Mantenimiento Calibración, verificación y o verificaciones
verificación y
de equipos mantenimiento vigente pendientes para
mantenimiento vigente
realizar análisis
con equipos
idóneos
Descartar el
Material y
Verificar la fecha de
realizar el
Control de esterilización de Material, Fecha de esterilización
proceso con
Esterilización de verificar el cumplimiento de de Material. Controles
material que
Material los controles de de esterilización.
cumpla con los
esterilización.
controles de
esterilización.
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

PÁGINA Página 9 de 10

9. REGISTROS

Como Tiempo de
Registro Responsable Donde conservarlo Disposición final
conservarlo conservación
F-SA-18 Hoja
de Vida de Profesional
Equipos Universitario o Carpeta Documentos de Según tabla de retención Según tabla de retención
Profesional del calidad documental documental
Laboratorio Físico

F-SA-34
Control Interno Auxiliar de
de Equipos. Laboratorio,
Carpeta Documentos de Según tabla de retención Según tabla de retención
Profesional Físico
calidad documental documental
Universitario o
Profesional del
Laboratorio
F-SA-46
Control De Auxiliar de
Temperatura, Laboratorio,
Carpeta Documentos de Según tabla de retención Según tabla de retención
Limpieza y Profesional Físico
calidad documental documental
Desinfección Universitario o
de Equipos Profesional del
Laboratorio
F-SA-64
Identificación Auxiliar de
de Sustancias Laboratorio,
Carpeta Documentos de Según tabla de retención Según tabla de retención
Químicas Profesional Físico
calidad documental documental
Universitario o
Profesional del
Laboratorio
F-SA-75
Resultados Profesional
Microbiológico Universitario o Carpeta Documentos de Según tabla de retención Según tabla de retención
s de Alimentos Profesional del Físico calidad documental documental
Laboratorio

F-SA-101
Control de
calidad Profesional del
análisis Laboratorio Carpeta Documentos de Según tabla de retención Según tabla de retención
microbiológico Físico calidad documental documental

10. ANEXO
 CODIGO P-SA-81
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS DE FECHA DE
Clostridium sulfito reductor 05/10/2021
EMISIÓN
(ICMSF) VERSIÓN 03

Página 10 de
PÁGINA 10

11. HISTORIAL

VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS
1 22/07/2016 Versión Inicial

Descripción del método

2 21/06/2017 Cálculos y Expresión de
Resultados
Cambio de forma del documento y
3 05/10/2021
formatos asociados
Nota: Verificar la vigencia del documento en el listado maestro de documentos.