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Tema 2:
Técnicas espectroscópicas

ESPECTROMETRIA DE MASAS (MS)

Ø Repaso: ¿Qué es la MS? Fundamentos.
El espectrómetro de masa

Ø Métodos y fuentes de ionización.

MALDI; ESI

Ø Aplicaciones en biotecnología

Repaso

¿Qué es la Espectrometría de Masas?

La Espectrometría de Masas (MS) es una técnica analítica

que permite determinar el Peso Molecular y la Estructura
Molecular de una molécula a partir de medir la relación
masa/carga (m/z) de iones.

Fuente de
Energía
Materia Iones

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A diferencia de las otras técnicas espectroscópicas en la espectrometría de masas la fuente
de energía es una de ionización y en las otras es de luz.
La fuente de ionización atraviesa la muestra generando iones: TÉCNICA DESTRUCTIVA
Lo bueno esq como es tan sensible la técnica se usa poca muestra 1
Se detectan solo especies iónicas (cationes y radicales cationes; aniones y radicales aniones)
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Repaso

M+⋅

Repaso
El espectro de masas
Abundancia relativa (%)

Información que provee:

- Peso molecular
- Fórmula molecular (alta resolución)
- Estructura (patrón de fragmentación)

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Repaso
El espectrómetro de masas
Características generales

v Capaz de vaporizar sustancias de volatilidades muy

diferentes.

v Capaz de generar los iones a partir de las moléculas neutras

en fase gaseosa.

v Capaz de separar los iones acorde a su relación m/z.

v Capaz de detectar los iones formados y registrar esta

información apropiadamente.

http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/.../espectrometria_de_masas.pdf

Repaso
El espectrómetro de masas
El sistema requiere alto vacío
10-5-10-8 torr para proporcionar
a los iones un camino libre de
colisiones
Bombas: turbomoleculares o
difusoras

Introducción
Detección y
de la Ionización Analizador
muestra Registro

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Introducción
de la muestra

Inserción directa
(sólidos o líquidos)

Infusión directa: capilar o columna capilar (líquidos y gases)

Ionización/
Fragmentación

Métodos de ionización: mecanismo por el cuál tiene lugar

la ionización de una molécula como eyección de e-; captura
electrónica, protonación, cationización, desprotonación y
transferencia de molécula cargada desde la fase condensada
a la fase gaseosa.

Fuentes de ionización: dispositivo mecánico que permite

que la ionización ocurra. Ejemplos: Impacto electrónico,
Ionización química, Bombardeo de átomos rápidos (FAB),
Desorción Láser asistida por una matriz (MALDI),
Electronebulización (ESI).

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Método de
Ionización

Generación del ion Eyección de un e-

molecular.
Carga neta (-). Compuestos con
Alta fragmentación alta afinidad electrónica. Ej.
debido a la gran Halogenados.
energía cuando se
impacta.
Radical anión

Formación de radicales
cationes. Compuestos no
polares de bajo PM. Alta
fragmentación.
Captura de e-

Método de
Ionización

Protonación Desprotonación
PROTONACIÓN

La especie debe tener

algún sitio básico para
poder protonarse que
tenga la afinidad
correspondiente de
capturar protones.

Sobre sitios ácidos: fenoles, ácidos

carboxílicos, ácidos sulfónicos.
Sobre sitios básicos: aminas Carga neta (-)
en péptidos. Carga neta (+)

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Método de
Ionización

En la cationización Cationización Transferencia de fase

Parto de una especie
en lugar de H+ se ya cargada pero se
adquieren cationes tiene en solución
por formación de necesito volatilizarla
complejo para poder detectarla
covalente --> por lo en fase gasosa.
que el ion
molecular será= Recordar!!
molécula + catión Para EM necesito
MCatión+ que la muestra a
inyectar esté en fase
Por desorción o eyección de la
especie con carga a la fase
GASEOSA.
gaseosa
Adición de iones. Formación de complejo
no covalente. Ej. Na+, K+, NH4+.
Carbohidratos. Carga neta (+)

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Fuente de
ionización

Ionización por impacto electrónico (EI)

Alta fragmentación.
Mecanismo involucra
principalmente
eyección de un e-.
M → M•+ + e–

Para moléculas de
polaridad baja o media de
PM hasta 500.

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Fuente de
ionización

IMPACTO ELECTRONICO
Ventajas Desventajas
Ø Sensibilidad sub-pM a pM Ø Limitados PM (500) debido
a desorcion termica
(volatilidad)
Ø Disponibilidad de Ø Posible descomposición
biblioteca de espectros por calentamiento antes
(NIST) > 200000 de vaporizar
compuestos
Ø Uso de patrones de Ø Demasiada fragmentación,
fragmentación para resultando a veces en
identificar compuestos por ausencia de ion molecular.
comparación
Ø Información estructural

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Fuente de
ionización

Ionización química (CI) Moléculas de PM hasta

500.

Ánodo

Muestra

Poca fragmentación. Analizador

Mecanismo involucra
principalmente
protonación. Filamento

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 IMPACTO ELECTRÓNICO (EI) IONIZACIÓN QUÍMICA (CI)
-ALTA fragmentación -Poca fragmentación
-Para moléculas de -PM hasta 500
polaridad baja o media de 23/3/20
PM hasta 500.
-Mecanismo: -Mecanismo: protonación
eyección de e

Comparación EI vs CI

Atenolol

PM: 266

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Fuente de
ionización
:
•Desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).
• Técnica analítica de ionización muy utilizada para biomoléculas.
• El analito se co-cristaliza con un exceso del compuesto de la
matriz, el cuál absorbe energía en el UV.
• La muestra se irradia con un láser. La matriz se vaporiza llevando al
analito.
MATRICES TIPICAS

ácido ácido ácido

a-ciano-4-hidroxicinámico 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico 2,5-dihidroxi benzoico
(a-ciano o HCCA) (ácido sinapínico) (DHB)
péptidos y glicoproteinas péptidos y proteinas péptidos y pequeñas proteínas

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Fuente de
ionización

MALDI Concentración de
muestra
20-50 µM (5 µL)

Ionización ocurre por

protonación o cationización.
Compuestos de alto PM
(500kDa).

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Fuente de
ionización

cationizacion
protonacion

Crédito: Mikayé (Own work) [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC

BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia
Commons

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Fuente de
ionización

Espectro MALDI de la proteína albúmina sérica bovina

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A mayor z, menor m/z

Fuente de
ionización

Ventajas
Ø PM al menos hasta 300
kDa.
Ø Sensibilidad en el orden
de fmol a pmol. Atomol es
posible.
Ø Ionizacion blanda con
poca fragmentación.
Ø Tolerancia a sales hasta
mM.
Ø Permite análisis de
mezclas complejas.
MALDI
Desventajas
Ø Background de la matriz.
Interferencia por debajo de 700 Da.
Depende de la matriz
Ø Posible fotodegradación por
desorción laser/ionización.
Ø La matriz ácida puede causar
degradación de algunos compuestos.
Ø Problemas de reproducibilidad para
análisis cuantitativo.

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Fuente de
ionización

Ionización por bombardeo

de iones de átomos ligeros (FAB)

Matriz: solvente no volátil

donde se disuelve el analito.
Se utiliza Cs o Xe
(átomos, iones o alcohol
clústers) m-nitrobenzílico
(NBA)

glicerol

Concentración de
[M+H]+
muestra
[M-H]- 1000 µM (5 µL)

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Fuente de
ionización

FAB

Atenolol
PM: 266

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11

Ventajas
Ø PM hasta 7 kDa.
Ø Análisis rápido.
Ø Ionización blanda con poca
fragmentación. Obtención de
ion molecular
Ø Tolerancia a sales mM
Ø Fácil adaptación para alta
resolución (masas exactas). La
matriz puede ser referencia
para el análisis de masas
exactas.
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Fuente de
ionización
Electronebulización (ESI)
• Se producen moléculas ionizadas
gaseosas desde una solución líquida.
• Se producen especies con carga
múltiple.
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FAB
Desventajas
Ø Caída de sensibilidad a valores de
masa altos
Ø Comparada con MALDI o ESI es poco
sensible. Requiere altos pmoles a
nanomol de material.
Ø La matriz ácida puede causar
degradación de algunos compuestos.
Ø Poca fragmentación, limitada
información estructural.
Ø Alto background de picos de la matriz.
Ø Solubilidad del compuesto en la matriz
Ø Poca utilidad para especies no
polares.
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Concentración
de muestra
20-50 µM (50 µL)
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Fuente de
ionización

Electronebulización (ESI)

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Fuente de
ionización

Electronebulización (ESI)

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Fuente de
ionización

Determinar el PM de mioglobina a partir de su espectro de masas.

Fuente Ionización: ESI

p= m/z 1542 z1 = M + z1
p1= (M + z1)/z1; 1696 (z1-1) = M+ z1 -1
p2= (M+ (z1-1))/(z1-1) z =11 y M = 16951

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ESI
Ventajas Desventajas
PM hasta 70 kDa. :
Presencia de sales reduce la sensibilidad.
Electronebulización (ESI) reducen sensibilidad.
Sensibilidad en el orden de fmol Mezclas complejas
a pmol.
Ionización blanda. Generación Análisis simultaneo en mezclas puede ser
de complejos en fase gaseosa. pobre.
Adaptable fácilmente a LC. Cargas múltiples puede ser confuso en el
análisis de mezclas.
Adaptable a analizadores de Pureza de la muestra es muy importante.
masa en tándem.
Multiples cargas permite
análisis de iones de alta masa
con instrumentos de bajo
intervalo de m/z.
No hay interferencia por matriz.

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Fuente de
ionización

Comparación entre fuentes de ionización

(500)

(70 kDa)

24 kDa
(7 kDa)

(150 kDa)

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Fuente de
ionización

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Analizador

Analizador:
Parte del equipo responsable de la separación de las
partículas cargadas.

Tipos de analizadores:

Ø Deflexión de campo magnético (sector magnético)

Ø Tiempo de vuelo (TOF)
Ø Cuadrupolo (Q): campo magnético modulado.
Ø Trampa de iones (IT): cuadrupolo hiperbólico.
Ø Resonancia ciclotrón-ion
Ø Transformada de Fourier.

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El detector se identifica por su resolución.

Resolución: M/DM= M1/(M1- M2)

Es importante saber a que

altura se toma la resolución
para poder comparar equipos.

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Analizador

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Ion molecular: empleo de picos isotópicos

Abundancia natural de isótopos comunes

Abundancia, %
Elemento M+ M+1 M+2
1 2
Hidrógeno H 99,985 H 0,015
12 13
Carbono C 98,9 C 1,1
14 15
Nitrógeno N 99,6 N 0,4
16 17 18
Oxígeno O 99,76 O 0,04 O 0,20
32 33 34
Azufre S 95,0 S 0,8 S 4,2
19
Flúor F 100
35 37
Cloro Cl 75,5 Cl 24,5
79 81
Bromo Br 50,5 Br 49,5
127
Iodo I 100

Metano: 12C1H4 PM=16; 13C1H4 o 12C2H1H3 PM=17 ( 1,18%)

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Ion molecular: empleo de picos isotópicos

Abundancia natural de isótopos comunes

Abundancia, %
Elemento M+ M+1 M+2
1 2
Hidrógeno H 99,985 H 0,015
12 13
Carbono C 98,9 C 1,1
14 15
Nitrógeno N 99,6 N 0,4
16 17 18
Oxígeno O 99,76 O 0,04 O 0,20
32 33 34
Azufre S 95,0 S 0,8 S 4,2
19
Flúor F 100
35 37
Cloro Cl 75,5 Cl 24,5
79 81
Bromo Br 50,5 Br 49,5
127
Iodo I 100

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Perfiles y Proporciones de isótopos

M+X M+X

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Ion molecular: picos isotópicos

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Ion molecular: picos isotópicos

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Formas de fragmentación en los

compuestos orgánicos

1. Ruptura de un enlace simple

2. Eliminación de una molécula neutra

3. Formación de carbocationes estabilizados

por resonancia

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Típica en alfa carbonilo.

FRAGMENTACION DE PEPTIDOS

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MS aplicada a la Biotecnología
• Identificación y análisis estructural de proteínas.
• Análisis de carbohidratos y oligonucleótidos.
• Monitorear procesos de fermentación en la industria
biotecnológica.

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MS aplicada a las biomoléculas

Conformación de proteínas
protonación protonacion
menor completa de
sitios basicos
menor
probabilidad mayor probabilidad
de cargarse de cargarse.

ESI

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MS aplicada a las biomoléculas

Estructura de péptidos

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MS aplicada a las biomoléculas

Análisis de carbohidratos

MALDI-MS de un oligosacárido. Matriz: DHB. El pico a m/z 1973

representa un segundo azúcar que contiene un residuo extra de
hexosa. ○ manosa, ☐ galactosa, N-acetilglicosamina; ▽ fucosa.

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BIBLIOGRAFÍA

• Principios de análisis instrumental, 5ta ed. Skoog, Holler, Nieman,

McGraw Hill, 2001.
• Mass Spectrometry for biotechnology, G. Siuzdak, Academic Press, 1996.
• Modern Chemical Techniques, B. Faust, RSC, 1997.
• Spectrometric Identification of Organic Compounds, 7th Ed. R. M.
Silverstein, F. X. Webster, D.J. Kiemle, John Wiley & Sons, 2005.

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