TEMA 6: TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS (HPLC).

INTRODUCCIÓN.

Cromatografía.

Método de separación física, los analitos no tienen ningún cambio en su identidad química, sino que se hace
una separación en base a sus propiedades físicas.

Esta separación se hace generalmente mediante una

distribución selectiva entre fases inmiscibles:

→ Fase estacionaria (FE).

→ Fase móvil (FM).
Diferencias en coeficientes de distribución de analitos. El analito no tiene la misma afinidad por la fase
estacionaria que por la fase móvil, entonces a lo largo de una corrida cromatografía se van estableciendo
diversos equilibrios en simultaneo que están dados por este coeficiente / por esta constante de distribución del
analito. Y que tiene que ver con cual es su naturaleza química y con cual es la naturaleza de la fase
estacionaria y móvil que estoy utilizando.

K = CFE/CFM.

FASE ESTACIONARIA.

Acorde a la naturaleza de la fase móvil y fase estacionaria yo puedo tener diversos tipos o clasificaciones de
la cromatografía:

Si nosotros usamos un liquido como fase móvil, vamos a hablar de una cromatografía liquida donde en la
fase estacionaria, dependiendo de esa naturaleza, yo voy a decir que es cromatografía liquida y que el
principio es de: Adsorción, Partición, o que estoy haciendo por Exclusión por tamaño, por Intercambio iónico o
por Afinidad.

ADSORCIÓN: yo voy a tener una fase estacionaria sólida donde mi analito se va a depositar de alguna
manera y la fase móvil al ir atravesando a lo largo de esa fase estacionaria va a ir, de acorde a la afinidad que
tiene este analito con la fase estacionaria lo va a ir arrastrando; y va a salir uno de ellos primero y
posteriormente el que tenga mayor afinidad por la FE,
depende la afinidad que tenga por esa FM.

PARTICIÓN: parecen similares, pero la diferencia es que

para la partición en general se habla cuando la FE es otro
líquido, que en realidad esta embebido o adsorbido sobre
un soporte solido, pero lo que es responsable por la
afinidad con el analito no es el soporte solido sino que es
ese liquido que se deposita sobre el soporte y que es el que va a interaccionar con el analito. La FM lo que
hace es ir arrastrando o a medida que se van estableciendo esos diversos equilibrios vamos a tener que se
van a ir separando.

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO, INTERCAMBIO IÓNICO, AFINIDAD: los principios cambian un poco porque:

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO: lo que yo tengo es un soporte que es poroso y que el tamaño del poro me va a
hacer que mi FM, al atravesar o al ir arrastrando o empujando mi analito, este analito no es por una afinidad
del mismo tipo que se establecen en adsorción y partición, sino que va a tener que ver con cuanto o no puede
penetrar en esos poros, tiene que ver con su tamaño y de esa forma los más grande son los que van a salir
primero y los más pequeños son los que van a quedar más tiempo retenidos.

INTERCAMBIO IÓNICO: uno tiene una FE donde lo que se deposita es un tipo de una resina de intercambio
iónico, ósea que tiene cargas negativas o positivas, y lo que yo tengo ahora es una mezcla de compuestos
también iónicos donde aquellos que sean positivos van a quedar adsorbidos en una primera etapa en esa fase
estacionaria, mientras que los negativos saldrían directamente porque no tendrían afinidad. Luego lo que
puedo usar es otro tipo de FM para eliminar y poder lavar esa columna.

AFINIDAD: es de una forma similar a intercambio iónico, en el sentido de lo que yo deposito ahora es algún
anticuerpo que tenga afinidad específica con un antígeno en particular, y lo uso para separarlo de una mezcla,
de compuestos, de biomoléculas. Primero se va a usar FM para que queden retenidos aquellos que tengan
mucha afinidad y luego van a ir saliendo.
Tiempo de retención ajustado
Aquí se ve una representación de lo que ocurre en
una columna, antes de llegar al detector. En el eje
de las ordenadas está representada la [ ], y
cuando comienza la corrida, a medida que va
atravesando la columna acorde a como sea la
afinidad que tenga entre estos compuestos con la
FM y con la FE se van a empezar a separar. En
cada punto de estos es semejantes a que uno Llegan al detector
obtenga un plato teórico, que se va a formando completamente
ese equilibrio parte va atravesando esa columna y separados.
parte que tiene más afinidad se va quedando
atravesada o delegada. Esto ocurre hasta que se
terminan de separar correctamente y puede llegar
al detector, completamente separados.

Se ve que la FM es la que “empuja” al analito hacia el detector y la FE es la que va a tratar de que se quede
retenido un poco más de tiempo.

Al final lo que yo tengo cuando llega al detector lo que yo tengo es tiempo en función de la señal, que va a ser
de alguna forma proporcional a la concentración. Entonces yo tengo el tiempo de retención que sería el
tiempo tal cual desde que comencé la corrida hasta que sale el último de los analitos, y un tiempo de retención
que denomina ajustados (ajustado respecto al tiempo muerto), el tiempo muerto sería algo que no tenga de
afinidad por la columna, por esa FE, cuánto tiempo demora en llegar al detector (a veces esta marcado como
volumen muerto depende de las unidades que uno está utilizando). Entonces el tiempo de retención del
compuesto “A” ajustado seria el tiempo real que yo veo menos el tiempo que tarda en que yo atraviese la
columna.

Otro parámetro importante es la resolución, una forma aproximada, esto es cuanto es lo que me permite a mi
determinar que estos son dos picos separados. La formula nos indica que va a estar relacionada a la
diferencia entre el tiempo del analito B y el tiempo del analito A, dividido 2 veces al ancho de la base del
analito B o A (es aproximado porque acá tiene en cuenta como que son completamente simétricos, y tanto el
analito A como el analito B el ancho a la base es el mismo). Este es un tipo de resolución donde yo estoy
usando al ancho completo a la base. También hay otros que utilizan como resolución al 10% de la altura del
pico, la altura total sobre la altura aprox del 10%.
IDEAL!!! Analitos completamente separados.
 PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS.

Factor de retención: me da indicio de cuan un

retenido es un analito respecto a otro por la FE. A
medida que este factor de retención se haga
mayor significa que ese analito esta MAS
RETENIDO. Si este es demasiado elevado
también hay que tener en cuenta, situaciones de
compromisos, ya que insumo demasiado solvente
en las FM, porque voy a requerir mayores tiempos
de análisis.

Factor de selectividad: es una relación

entre los tiempos de retención ajustados
para un analito respecto a otro. Si ambos
están retenidos igual el factor de
selectividad seria 1, osea que lo que yo
necesito es que sea mayor a 1 ese factor
para poder decir que se están separando.

Resolución.
Cuanto es lo que me permite a mi
determinar que estos son dos picos separados.
Depende del nro de platos teóricos, selectividad y
de factores de retención

RESOLUCIÓN VS CONDICIONES EXPERIMENTALES.

La selectividad, si yo tengo 2 analitos A y B, puede ser que sea más

selectivo para uno que para el otro, entonces eso se ve reflejado en que
este alfa debería ser mayor a 1. La eficiencia, número de platos teórico
(N), cuantos más platos teóricos tenga una columna (eso está
relacionado un poco con la longitud de la columna, el tamaño del poro de la columna) mayor va a ser ese
número mejor va a ser más eficiente y mejor va a ser la resolución. Factor de retención, donde si este factor
de retención de si es 1 yo obtendría ½, y esto es un compromiso entre que el tiempo no sea extremadamente
extenso y tan poco que sea demasiado pequeño (si esto es muy pequeño quiere decir que mi analito sale muy
rápido de columna y por lo tanto la resolución se va a ser mas chica).

K y α responden a:

 Fase móvil, va a ser que yo cambie la fuerza de esa FM entonces va a tener un influencia sobre los
factores de retención y también sobre la selectividad.
 Fase estacionaria.
 Temperatura.

N responde a:

 Flujo, si yo disminuyo el flujo le da más posibilidad a que se establezcan diferentes platos teóricos, que
si yo aumento ese flujo no doy lugar a que esos equilibrios se establezcan fácilmente, también
disminuye el tiempo de retención cuando aumenta el flujo.
 Longitud de columna.
 Tamaño de partícula.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC).

 Tamaño de partícula: µm de la FE, de la columna.

 Alta presiones (son por una bomba que es la que
sirven para que el solvente pueda ser ingresado a
través de la columna y pueda tener la fuerza
suficiente para atravesar para empujar al solvente
a lo largo de esa columna que va a tener un
tamaño de µm, por lo que necesito mucha presión
para que eso lo atraviese): 10 MPa (2000 Psi).
 Después de la bomba, le sigue un inyector, después un detector y luego que sale de ahí todo va a
residuos y los datos se van adquiriendo en una computadora.
 Costo equipos: $$ a $$$$.
 Muy versátil, ya que puedo tanto cambiar todo lo que sea FE, pero tengo muchísimas maneras de
cambiar la FM.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA.

Tipo de sorción. Mecanismo de retención.

Adsorción fase sólida (NORMAL): Adsorción sobre la superficie en base a polaridad.

Fase modificada (NORMAL o REVERSA): Partición o reparto entre fases o interacción de adsorción.

Intercambio iónico: Interacción de cargas entre iones y contra-ionóforos en la FE.

Par iónico: Partición de pares iónicos neutros entre fases.

Exclusión por tamaño: Efecto de filtración por volumen hidrodinámico

Quiral: Interacciones diastereoméricas entre enantiómeros (soluto) y sitios quirales en la fase estacionaria.
Afinidad: Interacción bio-específica de solutos con un ligando inmovilizado.

FASE NORMAL: FE polar; FM no polar. (HPLC).

FASE REVERSA: FE no polar; FM polar. (HPLC).

FASE MÓVIL: SOLVENTES.

Nuestra mezcla de solventes que vamos a utilizar en nuestra corrida cromatografía. Los marcados son los que
se utilizan normalmente como Fase REVERSA.

Una forma de estimar la polaridad que va a tener

nuestra FM, es utilizando los índices de polaridad y la
proporción de cada solvente. Para calcular la polaridad
de esta mezcla de soluciones.

¿Qué modifiquemos esta FM en que va a influir?

Principalmente en los factores de retención.
mnemotecnia: Safé no?
ReverSA FE NO polar
FM polar

Normal
Modo HPLC. Composición fase móvil. FE polar
FE NO POLAR; FM POLAR FM no polar
REVERSA: agua (A) + SO (B) (ej. agua: acetonitrilo). Incrementa %B (< polaridad) disminuye k
(disminuyo el factor de retención). Esto se da porque, si yo tengo una fase estacionaria no polar y
tengo una FM que también disminuye su polaridad compiten de mejor manera con esta FE por ese analito que
está queriendo ser retenido, y por ende lo arrastra más fácilmente, si lo arrastra más fácilmente sale a menor
tiempo y si sale a menor tiempo el factor de retención indica que es menor.

NORMAL: SO no polar (poco polar) (A) + SO polar (más polar) (B) (ej. hexano: propanol).
Incrementa % B (> polaridad) disminuye k. si tengo mayor polaridad compite de mejor forma esa
FM por el analito por una FE que es también polar.
FE POLAR; FM NO POLAR
Cambios en selectividad, α (FASE REVERSA).

 Modificar % B (del solvente orgánico).

 Cambiar solvente B.
 Variar pH.
 Variar buffer.
 Aditivos.
 Agentes quelantes.

ISOCRATICO (utilizo la misma proporción de solvente durante toda la corrida cromatografía).

GRADIENTE (lo que hago es variar esa proporción entre solventes a medida que quiero disminuir los tiempos
de retención y acelerar de alguna forma esa corrida cromatografía).
SO: solvente orgánico.

¿Qué es lo que sucede en un cromatograma si yo modifico los

factores de retención o el alfa?

Si yo tengo 100% ACN en fase reversa lo que pasa es que es

demasiada la fuerza de esa FM compiten muy bien con esa FE,
entonces todos los analitos salieron juntos. Ahora si yo aumento la
polaridad para que vayan saliendo más lentamente, para que ya la
competencia no sea tan acelerada con la FE.

Para comparar la fuerza de la FM en la fase reversa, si yo tengo

mezclas ACN/H2O, MeOH/ H2O, THF/ H2O, entonces yo puedo ver
que si yo utilizo ACN al 50% es equivalente a que utilice 60% de MeOH o que utilice poco menos del 40%
THF. Esto me sirve ya que es algo empírico que me permite comparar si y estoy trabajando en MeOH/ H2O y
no llego a separar o los tiempos se hacen demasiado extensos, puedo ir modificando la FM con otro solvente
e ir viendo esto como modifica mis tiempos de retención.

FASE MÓVIL: CALIDAD SOLVENTES.

 Se necesitan que sean HPLC, es decir que sean muy puros y que
no tengan partículas en suspensión porque todo esto afectara a mi
cromatografía.
 Libre de partículas.
 Libre de burbujas, se desgasifican.

MeOH grado analítico aprox. USD 24/L.

MeOH HPLC aprox. USD 178/L.

FILTRAR y DESGASIFICAR.

Kitasato y se hace al vacio. Este material tiene doble finalidad porque filtra las partículas, porque
uno usa membranas generalmente de tamaños de poros muy pequeños para cualquier partícula de
polvo que puede haber y por otro lado al estar filtrado al vacio uno esta desgasificando para que no
tenga burbujas esa FM.

LA COLUMNA.

TIPOS DE COLUMNAS.

Existen diferentes tipos de columnas, acorde al tipo de

cromatografía que queremos realizar. La que está marcada en
amarrillo es la más común que se utiliza, lo que yo quiero es
poder separar los compuestos e identificarlos, pero no tengo
intención de aislar estos compuestos en cantidades que las pueda
utilizar (para este caso uno utilizaría la semipreparativa, la
preparativa o la industrial). Las 4 últimas se utilizan para poder
detectar los compuestos.
Si uno se fija en la columna, donde está el
empaquetado y después lo que tengo son las
férulas por las que las voy a unir a los conductos
que van a salir para lo que viene la FM, vienen
desde la bomba que está empujando esa FM y
atraviesa la columna y aquí está la férula que lo
va a conectar hacia el detector.

Eso nos va a variar mucho en lo que es la

eficiencia de la corrida cromatografía, lo que me
varia en la corrida cromatografía si me varia la
eficiencia quiere decir que estoy aumentando o
disminuyendo el número de platos teóricos. Si
yo voy disminuyendo el diámetro del empaquetado, este tamaño de partícula, el numero de platos por metros
se modifica y la velocidad del flujo. Entonces a medida que yo aumento el número de platos aumenta la
resolución porque estoy aumentando la eficiencia en la separación de los analitos.

ASIMETRIA DE PICOS.

Hace relación a la forma del pico y que un pico ideal tendría que ser algo
que sea completamente simétrico, significa que si yo parto a la mitad
desde el pico de la curva hasta la base me debería quedar dividida esa
curva en 2 partes exactamente iguales. Simetría del pico es un factor de
simetría, esta mas relacionado con la calidad de la columna, o si la
columna esta en un estado aceptable, si yo calculo el factor de simetría
como la relación de el ancho de la parte B con respecto al ancho de la
parte A, lo puedo calcular al 10% o al 5% de la altura del pico o a la base.
Si a mí me dan resultados entre 1,0-1,05 estoy diciendo que es
EXCELENTE, si estoy a 1,2 se puede decir que es ACEPTABLE, pero si
ya estoy a valores de 2 o mayores significa que esa corrida cromatografía
no me está sirviendo para separar bien los picos y mucho menos si los
quiero cuantificar.

FASE ESTACIONARIA.

Si es Fase Normal dijimos que la FE es polar y

generalmente es una fase polar con grupos silanos,
un empaquetado, mientras que a medida que yo voy
haciendo reacciones de sililación y voy incrementando
con cadenas carbonadas extensas, lo que estoy
haciendo es disminuirle la polaridad a esta FE.
Entonces voy pasando de un empaquetado que seria
para una fase normal a un empaquetado que va a
servir para una fase reversa, donde uno puede
terminar estos empaquetados.

En fase reversa en HPLC las más comunes son la

C18 y la C 8.
 En el solvente los de menor polaridad los voy a poder usar en fase normal, mientras que los de mayor
polaridad los voy a usar para fase reversa.

¿Cuándo es preferible utilizar FASE NORMAL? FE POLAR; FM NO POLAR

1. Muestra no retenida en fase reversa (muy hidrofílica).

2. Muestra demasiada retenida en fase reversa (muy hidrofóbica).
3. En fase reversa, la separación es inadecuada (α=~1).
4. Isómeros de posición, estereoisómeros o diastereómeros.
5. Cromatografía preparativa.
6. La muestra se disuelve en solvente no polar.

LA BOMBA.

Hay una amortiguación de pulsos para que el caudal sea

realmente constante a lo largo de toda la corrida cromatografía
donde las presiones se generalmente trabajan a altas presiones
para poder mantener un flujo que sea libre de pulsaciones.

 Generar presiones por encima de 6000 psi.

 Flujo libre de pulsaciones.
 Caudal de 0,1 mL a 10 mL por minuto.
 Reproducibilidad y estabilidad, porque yo no quiero que tenga fluctuaciones en las líneas de base porque
eso depsues me va a influir en que yo no pueda cuantificar los analitos.
 Componentes resistentes a la corrosión.

INTRODUCCION DE LA MUESTRA.

Tamaño del lazo: 0,5 µL a 2 mL dependiendo del tipo de HPLC.

Esta imagen que se ve es el inyector y la perilla que se observa
está en una posición o de carga o de inyección, para que este en
inyección la tenga que girar. Donde dice 20 microlitros es el lazo o
loop, y es el volumen que contiene ese lazo y lo que me asegura
es que cada inyección este inyectando 20 microlitros de la
muestra. Se ve la jeringa, son de punta roma y eso es para no
dañar al inyector. El lazo puede estar conectado a los residuos en
la posición de carga, yo inyecto y lo enjuago un par de veces para asegurarme de lo que yo tenga acá sea
libre de burbujas y por otro lado sea todo mi muestra. Cuando yo lo cambio a posición de inyect, lo que va a
pasar es que se cambia de una forma la conexión y ahora el loop está conectado a la columna, y ahora la FM
atraviesa el loop y hace que toda la muestra que está en el lazo pase a la columna y de esa forma se inyecta
la muestra para la corriente.

DETECTORES.

IDEALMENTE.

 Alta sensibilidad.
 Buena estabilidad y reproducibilidad.
 Respuesta lineal amplia.
 Volumen interno pequeño.
 Tiempo de respuesta corto independiente de velocidad de flujo.
 Poco sensible a cambios de temperatura y presión.
 Alta confiabilidad y fácil de utilizar.
 Respuesta similar para distintos analitos o selectivo.
 No destructivo.

SENSIBLES A CONCENTRACION
(ultravioleta, fluorescencia).

SENSIBLES A MASA.

ESQUEMA CELDAS DE FLUJO.

ESPECTROMETRIA ACOPLADA A HPLC.

Espectrometría de masas. Para cada pico --> espectrómetro de masa

La velocidad del flujo que llega al detector es un factor importante.

Compuestos polares o iónicos.

IONIZACIÓN QUÍMICA A PRESIÓN ATMOSFÉRICA (APCI).

ESI: Electrospray
 Complementaria a ESI: compuestos no polares o poco polares.
 Ionización suave.
 Permite velocidades de flujo hasta 2 mL min-1.
 Más tolerante a buffers que ESI.
 Más tolerante a condiciones experimentales que ESI.
 Presenta la presencia de aductos como (M+NH4)+ o (M+CH3COO)-.
 Hasta 2000 Da.

CUANTIFICACIÓN.
Efecto del ruido, lo que uno quiere es que tenga poco ruido.

Forma de cuantificar, uno puede cuantificar por altura o por el área del pico. Si quiero calcular o trabajar con
altura la forma es con el caso ideal donde este pico está muy bien formado, me trazo la transversal
aquí a la línea de base y me fijo cual es la altura,
con los errores que pueden llegar a tener
asociados a ello. Cuando uno quiere hacer una
buena cuantificación busca que los picos sea del
tipo a, esto nos permite trabajar con el área del
pico. Entonces el área lo puedo hacer por
triangulación o lo puedo hacer por los equipos
modernos, que integran el área bajo la curva.

Buena cuantificación. Pico ideal

1. MÉTODO DE ESTÁNDAR EXTERNO.

Yo voy a graficar lo que es el área o la altura del pico en función de la

concentración de ese analito, en general, comúnmente se expresa en miligramos
por mililitros. Grafico los puntos y por una regresión utilizando los mínimos
cuadrados, lo que uno busca tenga es una relación lineal y puedo tener mi area
proporcional a una constante para mi determinado analito.

Requiere:

 Reproducibilidad entre inyecciones.

 Condiciones constantes (flujo, temperatura).

2. MÉTODO DE ESTÁNDAR INTERNO.

Compensa errores de inyección, porque si yo tengo un error en la inyección tanto mi estándar interno como mi
analito de interés van a estar sufriendo el mismo error.
Un estándar interno en química analítica es una sustancia
Requiere: química que se agrega en una cantidad constante a las
muestras, el blanco y los estándares de calibración en un
 Alta pureza de estándar interno. análisis químico
 Químicamente inerte hacia FE, FM y analito.
 Tiempo de retención diferente pero cercana al analito,
 Factor de respuesta similar al analito.

La concentración del estándar interno siempre se mantiene constante entonces el área siempre debería
ser la misma, esto hace que estos sea una relación.

/ =

El factor de respuesta es como responde mi sistema y tiene que ver mucho con el detector para poder
detectar a los diferentes componentes.

Factores de respuesta: DRFx = Área x / [x];

DRFei = Área ei / [ei]

Luego D’RF= Área x * [ei] / Área ei * [x]

/ = ( ’ / [ei]) (equivale a la pendiente de la recta).

3. MÉTODO DE ADICIONES ESTÁNDAR (MOSA).

 estos se utilizan cuando uno tiene una matriz real diferente de la que hizo
una curva de calibración original.
 En presencia de matriz.
 Análisis de trazas.
 Voy variando la cantidad de mi analito, estándar conocido.
 Es para eliminar cualquier efecto que la matriz ocasione y cambie la
sensibilidad en la curva de calibración.
4. MÉTODO DE NORMALIZACIÓN DE ÁREAS.

Estimar proporción en una mezcla.

Supone:

 Factores de respuesta iguales, porque si estos no son idénticos esta proporción no es correcta.
 Todos los compuestos eluyen de la columna, sino voy a estar
teniendo un 100% erróneo.

EXACTITUD depende de:

→ Cantidad de muestra.
→ Resolución.
→ Simetría del pico.
→ Calibración.
→ Tratamiento de datos.
PRECISIÓN depende de:

→ Preparación de muestra.
→ Reproducibilidad instrumental.
→ S/N aceptable.
→ Simetría del pico.
→ Método de cuantificación.