UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

Área Social Humanística

Evaluación de focos potenciales de Paragonimiasis y determinación mediante

técnica molecular de la especie de Paragonimus presente en los
departamentos del área Sur de Guatemala.

Protocolo

(Ejemplo)

Integrantes de grupo

Guatemala, agosto de 2023

1
Índice

1. Introducción ................................................................................................................... 3
2. Antecedentes ................................................................................................................. 4
2.1. Paragonimus sp..................................................................................................... 4
2.2. Paragonomiasis ..................................................................................................... 5
2.3. Técnica Molecular ................................................................................................. 6
2.3.1. Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): ................. 7
2.4. Enfermedades olvidadas ..................................................................................... 8
2.5. Trabajo previo y experiencias en Guatemala ................................................ 8
3. Justificación del trabajo de investigación ............................................................ 9
4. Pregunta de investigación ....................................................................................... 11
5. Objetivos ...................................................................................................................... 11
5.1. General ................................................................................................................... 11
5.2. Objetivos Específicos ........................................................................................ 11
6. Hipótesis....................................................................................................................... 11
7. Materiales y métodos ................................................................................................ 11
7.1. Universo ................................................................................................................. 11
7.1.1. Población: ...................................................................................................... 11
7.1.2. Muestra: .......................................................................................................... 11
7.2. Variables ................................................................................................................ 12
7.2.1. Variables independientes .......................................................................... 12
7.2.2. Variables dependientes .............................................................................. 12
7.3. Materiales y equipo ............................................................................................. 12
7.4. Métodos ................................................................................................................. 13
7.4.1. Selección de los sitios de muestreo ....................................................... 13
7.4.2. Colecta de cangrejos en los sitios de estudio ..................................... 13
7.4.3. Búsqueda de Paragonimus y toma de datos de los hospederos
intermediarios ............................................................................................................. 13
7.4.4. Determinación de la especie de Paragonimus presente en las
muestras colectadas ................................................................................................. 14
7.4.5. Extracción de ADN: ..................................................................................... 14
7.4.6. Amplificación de ADN ................................................................................. 15
7.4.7. Visualización de las bandas: .................................................................... 16
7.4.8. Purificación del ADN de interés:.............................................................. 16
7.4.9. Secuenciación: ............................................................................................. 16
7.4.10. Análisis de las secuencias .................................................................... 17
7.4.11. Evaluación de Coliformes:..................................................................... 17
7.4.12. Análisis de la información ..................................................................... 17
8. Cronograma de trabajo............................................................................................. 18
9. Resultados Esperados ............................................................................................. 18
10. Financiamiento ........................................................................................................ 19
11. Referencias ............................................................................................................... 21
12. Anexos ....................................................................................................................... 24

2
1. Introducción

La paragonimiasis en una enfermedad causada por un trematodo del género

Paragonimus que es causante de una enfermedad principalmente zoonotica, pero
se han identificado ocho especies de Paragonimus en el ser humano, el que actúa
como hospedero final. La distribución del género Paragonimus se encuentra
localizado principalmente en zonas pasifico costeras de Asia, África y América
(Blair, Xu, & Agatsuma, 1999).

La enfermedad es de comienzo gradual y puede evolucionar a una forma crónica.

Las dos formas principales son: la paragonimiasis clásica, que afecta los pulmones,
y la forma no clásica, que origina el síndrome de larva migrans que ocasiona
paroxismos de tos que suelen expulsar esputo sanguinolento y pardo por la
presencia de huevecillos de la especie de Paragonimus. A veces aparecen derrame
pleural, neumotorax, bronquiectasia y fibrosis pulmonar. Los síntomas tienden a
ceder después de cinco años, pero a veces persisten incluso por 20 años (Chen,
1978; Kang et. al., 2000).

La forma en que el ser humano suele infectarse con Paragonimus es por medio de
la ingesta de cangrejos crudos o mal cocidos infectados con la duela en su fase
infectiva denominada metacercaria. Debido a las costumbres alimenticias de sus
habitantes, los países asiáticos mantienen una constante vigilancia epidemiológica
sobre las infecciones de esta enfermedad. En Guatemala, la transmisión hacia
seres humanos se encuentra más reducida debido a una diferencia en la dieta con
las poblaciones asiáticas. Sin embargo, algunas comunidades guatemaltecas, cuya
ubicación se encuentra aledaña a ríos o cuerpos de agua, hacen de su dieta diaria
el consumo de cangrejos, pudiendo llegar a consumir cangrejos infectados con
Paragonimus.

Guatemala es un país con un alto índice de enfermedades parasitarias, dentro de

las cuales se puede contar a la Paragonimiasis. Aun así, la enfermedad se
considera como una de las enfermedades olvidadas (descrita así por la OPS), y
puede ser fácilmente confundida con la tuberculosis, por tener una similar
sintomatología (WHO, 2007).

A pesar de que existen algunos estudios que han identificado la presencia del
parasito, éstos solo se han realizado en pocas localidades de Guatemala (Rosas,
2000). Es por ello que es importante determinar la presencia de Paragonimus en
nuevas comunidades en riesgo y determinar la situación actual del parásito en los
sitios donde ya ha sido reportada su presencia. Adicionalmente, en los estudios
realizados en años anteriores se realizaron análisis moleculares para la
identificación de las especies de Paragonimus encontrados, sin embargo, estos
reportes tienen aproximadamente más de Cinco años de haber sido realizados y
puede que existan nuevas especies no identificadas aún.
3
2. Antecedentes

2.1. Paragonimus sp.

Clasificación:
Reino Animal
Subreino Metazoa
Filo Platyhelminthes
Clase Trematoda
Subclase Digenea
Familia Paragonimidae
Subfamilia Troglotreminae
Género Paragonimus
(Le et. al., 2006)

El taxón Digenea es importante tanto económicamente como médicamente. Los

digeneos son llamados comúnmente duelas y son endoparásitos comunes en
vertebrados. Existen aproximadamente 11,000 especies de digeneos. Su desarrollo
es indirecto y el ciclo biológico incluye por lo menos dos estados infectivos, de ahí
su nombre (dos generaciones). El primer hospedero intermediario es generalmente
un gastrópodo y el segundo hospedero intermediario generalmente es un crustáceo,
como el cangrejo (Ruppert & Barnes, 1996).

De las diferentes fases que posee el parásito, tanto la cercaria como la

metacercaria consitituyen sus fases infectivas. La cercaria es de forma elipsoidal y
de corta vida y tiene una minúscula cola característica en forma de muñón. Su
superficie corporal está recubierta de finas púas y sus movimientos en el agua se
asemejan a un distoma libre, flotando y serpenteando, buscando determinados
camarones y cangrejos. Se alojan en la musculatura de los crustáceos valiéndose
para ello de su aguijón perforador (Rosas, 2000; Le et al., 2006).

La metacercaria es la segunda fase infectiva del parásito. Se instala en el

hospedero secundario (el cangrejo) y vive en el hepatopáncreas. Tiene forma
alargada ovoidal y tiene movimiento ameboide. Pueden ser observados
macroscópicamente y pueden sobrevivir alrededor de 72 horas en tejido muerto o
tres semanas en el agua (Soulbsby, 1987).

El adulto es un parásito hermafrodita. Mide 8-16 mm x 3-4 mm de grosor. Es

vesiculoso o fusiforme, rosado a pardo-rojizo, parecido a un grano de café. Tiene
una cutícula transparente provista en toda su extensión de múltiples espinas de
forma y tamaños variables. Posee ciegos intestinales flexuososo y no ramificados.
Los huevos son ovoides, de 85 por 55 µm. Se encuentran en los esputos y son más
o menos frecuentes en las heces fecales. Los adultos generalmente se encuentran
dispuestos en pares en cavidades quísitcas del pulmón, abdomen (mesenterio,
hígado, bazo) o el cerebro. Su longevidad es de alrededor de seis años (Rosas,
4
2000). Para el caso de Guatemala se han reportado tres especies de Paragonimus:
P. mexicanus, P. westermani y P. kellicotti (Fuentes, 1993; Rosas, 2000)

El ciclo de vida de Paragonimus sp., como ya fue mencionado, consta de dos

hospederos intermediarios para completarlo (parástio poliheteroxeno). Los primeros
hospederos son caracoles gasterópodos pulmonados de los géneros Brotia,
Pomacea, Semissulcospira, entre otros. Los segundos son cangrejos y langostinos
de río: Astacus, Potamon, Eriochier y Sesarma, entre otros. Los hospederos finales
o definitivos son el hombre, animales domésticos como el gato, cerdo y el perro,
animales silvestres, como la nutria, zorrillo, mapaches, lobos, pizotes y demás
carnívoros (Aguilar, 1997) (ver anexo 1).

Una vez dentro del huésped final, los huevos llegan al exterior en las heces o el
esputo. En el agua se forma el miracidium, que al salir del opérculo del huevo, en
menos de 24 horas, debe encontrar un caracol que le sirva de hospedero. Lo
penetra por la cabeza o el tegumento, se instala en el pulmón, se redondea y pierde
los cilios, formando el esporocisto.

El esporocisto se instala bajo la epidermis, forma la redia, se dirije al

hepatopáncreas formando una fase intermedia redia hija, luego forma la cercaria,
que tiene un estilete, abandonan el caracol y penetran en el cuerpo del segundo
hospedero (un crustáceo) instalándose en los músculos del mismo, dando lugar a la
metacercaria que se hace infectante a los 40-45 días. Cuando este hospedero es
consumido por un mamífero (hospedero definitivo), las metacercarias quedan libres
dentro del intestino, lo perforan y caen a la cavidad abdominal donde 30 días
después viajan a la cavidad torácia. Después atraviesan la pleura y pulmones para
instalarse en los bronquiolos. Aquí se agrupan en pares de vermes y se hacen
adultos de 5-6 semanas en cavidades quísticas en el interior del hospedero
(Aguilar, 1997).

Existen reportes de enquistmiento en la pared abdominal, cerebro, higado y rara

vez subcutaneamente como elevaciones redondas pequeñas y sólidas (County of
Orange Health Care Agency, 2006). También se han reportado casos de problemas
oculares al invadir el sistema nervioso, ocasionando glaucomas secundarios
(Fontenla, Grau & Pita, sin año).

2.2. Paragonomiasis

Enfermedad conocida también como duela pulmonar, diastomiasis pulmonar y

hemotisis endémica o parasitaria. Está distribuida en Asia en los países de Filipinas,
Taiwan, Japón y Norte de China. En América se distribuye en los países de
Canadá, Estados Unidos, Cuba, Brasil, Costa Rica, Ecuador, México, Panamá,
Venezuela, Honduras, Guatemala, Nicaragua. En algunos países se considera
endémica, como Camerún, China, Ecuador, Japón, Perú y República de Corea
(OMS, 1993; Aguilar, 1997). Su agente causal es el trematodo del género
Paragonimus, para América se han reportado casos que involucran a las especies
5
P. mexicanus (P. peruvianus), P. westermani y P. kellicoti (Fuentes, 1993;
Heymann, 2004).

A través de rayos X y por sintomatología, la enfermedad puede ser confundida con

tuberculosis o histoplasmosis (Alvarado, Pariona, Beltrán, 2004). Se cree que
existen 21 millones de personas infectadas alrededor del mundo (Quijada, Lima dos
Santos & Avdalov, 2005). Los síntomas de la enfermedad incluyen tos, hemoptisis,
dolor pleurítico de pecho. A pesar de que los pulmones son los órganos más
afectados, la infección extra-pulmonar es relativamente común, encontrándose al
parasito en el sistema nervioso central, en tejidos subcutáneos, pared intestinal,
cavidad peritoneal, hígado, ganglios linfáticos y las vías genitourinarias (Chin, 2001;
Heymann, 2004).

El esputo generalmente contiene estrías de pigmento pardo anaranjado, a veces de

distribución difusa, en las que con el microscopio pueden verse masas de
huevecillos cuya presencia confirma el diagnostico. Sin embargo, los colorantes
acidorresitentes que se emplean para identificar a los bacilos de la tuberculosis
destruyen los huevecillos e impiden el diagnostico. Los huevecillos también pueden
ser ingeridos, en especial por los niños, y aparecer en las heces, cuando se utilizan
algunas técnicas de concentración (Chin, 2001; Heymann, 2004).

El diagnóstico de Paragonimus específico se basa en el hallazgo de pruebas de

inmunodiagnosis (Quijada, Lima dos Santos & Avdalov, 2005), además de la
obserrvacion de huevos del tremátodo en esputo o heces o en las lesiones
cutáneas (Rosas, 2000). Aunque representa un problema mayor de salud pública
en Asia, en América es una efermedad zoonótica con casual repercusión humana,
debido probablemente a las diferencias culturales y hábitos alimentarios de la
población expuesta (Rosas, 2000). Los hospederos finales por lo regular son
mamíferos. La enfermedad suele persistir durante años y la persona infectada
puede parecer sana, se pueden alcanzar estados crónicos de 5 a 20 años y en
casos extremos hasta 30 años (Kang et. al., 2000).

En Guatemala, la presencia de Paragonimus se ha comprobado en distintas

localidades. Se reportó en el año 1946, cuando Caballeros identifica por primera
vez a Paragonimus en el río los esclavos del municipio de Cuilapa, departamento
de Santa Rosa; también se ha reportado en Guazacapán (Santa Rosa), río Moca
(Suchitepéquez, Sololá), río María Linda (Santa Rosa), en el departamento de
Escuintla en 1994 (Fuentes, 1993; Tongu et. al., 1995; Rosas, 2000).

2.3. Técnica Molecular

Identificación genética: La identificación genética es el uso de análisis

moleculares para la identificación certera de especies, individuos e inclusive, para
determinar el origen de muestras biológicas como tejido o sangre (Allendorf &
Luikart, 2007). La identificación molecular y clarificación taxonómica aplicados al
estudio de zoonosis representan un avance en la habilidad de diagnosticar
6
parásitos, lo que es un aporte valioso en estudios ecológicos y epidemiológicos
(Blair et al., 1997; van Herwerden, Blair & Agatsuma, 1999; Iwagami et al., 2000;
Pérez-Sweeney, 2003; Iwagami et al., 2003b; Le et al., 2006; Allendorf & Luikart,
2007).

El uso de marcadores moleculares en la identificación de individuos ofrece varias

ventajas comparado con los métodos tradicionales de rastreo, como basarse en
fenotipos naturales por ejemplo (Avise, 2004): todos los individuos de todas las
especies “portan” estos marcadores naturales; los marcadores son transmitidos a
través de generaciones; técnicas modernas de laboratorio, como el PCR, ofrecen la
posibilidad de obtener muestras biológicas no invasivas y no destructivas; la
identificación de un individuo en particular es muy confiable, si se usan múltiples loci
hipervariables producto de la alta variación genética poblacional en especies
sexuales. Sin embargo se requiere de equipo especializado y una buena cantidad
de dinero para llevar a cabo este tipo de análisis.

El caso particular de la identificación de especies mediante técnicas moleculares

surgió como una herramienta que lograba generar datos más confiables que los
aportados por los análisis morfológicos. Muchos marcadores moleculares se están
usando actualmente para la identificación de especies. El más ampliamente
utilizado es el ADN mitocondrial (ADNmt), aunque también se usan marcadores
nucleares como los microsatélites (Allendorf & Luikart, 2007; Mills, 2007).

El tipo de marcador molecular que ha de utilizarse depende de la escala a la cual se

quiere trabajar. Para separar entre especies, los marcadores 12S y 16S del ARN
ribosomal, que se encuentran dentro de la molécula de ADN mitocondrial, han dado
buenos resultados (Mills et al., 2000; Balitzki-Korte et al., 2005; Imaizumi et al.,
2007). Otros marcadores utilizados a nivel interespecífico son el gen o parte del gen
del citocromo b, el de citocromo c oxidasa I –COI-, la región control –D-Loop-,
ATPasa 8, NADH 5, todos marcadores del ADN mitocondrial (Mills et al., 2000; Blair
et al., 2005; Doanh et al., 2007; Doanh et al., 2009; Iwagami et al., 2003a,b). A nivel
intraespecífico uno de los más utilizados es el marcador nuclear de secuencias
repetitivas en tandem o microsatélites. En este estudio utilizaremos parte del gen
del citocromo c subunidad oxidasa 1 –cox1-, para la identificación taxonómica de
los especímenes de Paragonimus.

2.3.1. Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):

Este método requiere la síntesis enzimática in vitro de millares de copias de una

secuencia específica de ADN, utilizando ADN Polimerasas. El método se basa en
dos propiedades de la enzima ADN Polimerasa (Mertens y Ammersmith, 1998): 1)
Todas las ADN Polimerasas, producen una nueva molécula de ADN tomando como
molde el ADN que se tiene como muestra, en la dirección 5’ a 3’; 2) Ninguna ADN
Polimerasa puede iniciar la síntesis de una nueva molécula de ADN sin que antes el
ADN molde tenga grupos 3’ OH terminales (llamados oligonucleótidos cortos,
iniciadores, cebadores o primers) (Pérez-Sweeney, 2003; Mills, 2007).
7
ADN mitocondrial: Los genes presentes en la mitocondria son diferentes a los que
se encuentran en el material genético del núcleo. El ADN mitocondrial codifica
principalmente productos para el funcionamiento de la célula (y también las
proteínas que conforman a la misma mitocondria). Otra diferencia con el núcleo es
que el material genético mitocondrial es haploide. Además, una característica
ventajosa del ADNmt es que está presente en múltiples copias idénticas dentro de
una célula, por lo que el análisis de dicho ADN se puede llevar a cabo con una
pequeña cantidad de muestra, o muestras de poca calidad (Mills, 2007).

Además, el ADNmt no sufre recombinación y su herencia es exclusivamente

maternal, por lo que es una buena fuente de información acerca de patrones de
relaciones maternales, estructura sexual poblacional, determinación de reducciones
en el tamaño poblacional e inferencias acerca de los sistemas de apareamiento
(Allendorf & Luikart, 2007; Mills, 2007).

2.4. Enfermedades olvidadas

Se estima que al menos 1 millón de personas en el mundo –la sexta parte de la

población mundial- sufre de una o más de las enfermedades olvidadas. Las
poblaciones más afectadas por estas enfermedades son las de mayor pobreza y
más vulnerables y se encuentra mayormente en las áreas tropicales y subtropicales
del mundo (WHO, 2007). Estas enfermedades desatendidas suponen una enorme
carga económica en términos de pérdida de productividad y los elevados costes
que genera la atención médica prolongada (OMS, 2003).

Las Enfermedades cubiertas por el Departamento de Enfermedades Olvidadas de

la OMS abarca Cólera, Leishmaniasis, Lepra, Fasciolaisis, Buruliasis, Filariasis
Linfática, Dengue y Dengue Hemorrágico entre otras (WHO, 2007).

La paragonimiasis, al igual que otras enfermedades, se encuentra dentro del grupo

de las enfermedades olvidadas, ya que son enfermedades que atraen poca
atención en el mundo industrializado; son enfermedades problemáticas
desatendidas durante mucho tiempo por gobiernos, investigaciones y agencias de
financiamiento (OMS, 2003).

En la actualidad la paragonimiasis, es una enfermedad que no presenta mayor

relevancia para las autoridades nacionales de salud. Sin embargo, este hecho no
hace que deje de afectar a las poblaciones, en especial las poblaciones de escasos
recursos. El ser una enfermedad desentendida, genera vacios de información con
respecto a su distribución y presencia actual en el país.

2.5. Trabajo previo y experiencias en Guatemala

En 1946, Caballeros descubre Paragonimus sp., en los pulmones de un zorrillo y de

un tacuazín en el municipio de Guazacapán, Santa Rosa y a orillas del río Moca en
8
Suchitepéquez. Dicho autor los identifica como P. rudis pero posteriores estudios
determinaron que la especie era P. kellicotti (Rosas, 2000).

Aguilar, en 1955, identificó Paragonimus sp., en un tacuazín en el río María Linda

(Rosas, 2000). Peñalonzo et al. en 1986, identifican el primer caso de
paragonimiasis en un paciente procedente del área del río Los Esclavos en Santa
Rosa. Al año siguiente, Cruz realiza un estudio de trematodos en cangrejos en la
misma localidad y otra vez se reporta la presencia de Paragonimus sp. (Cruz,
1987).

Teni & Pinto (1993) demuestra de nuevo la presencia de Paragonimus sp., en la

misma área del río Los Esclavos. En este estudio se reporta el nombre de dos
especies de huéspedes intermediarios, un caracol (Aroapyrgus alleei) y un cangrejo
(Potamocarcinus c.f. guatemalensis). En ese mismo año, se reporta la prevalencia
de P. mexicanus en niños escolares en esta misma área.

Pérez (1994) utiliza el método de diagnóstico ELISA para detectar anticuerpos

específicos de Paragonimus en niños y adultos de dos poblaciones del
departamento de Santa Rosa. En sus resultados reporta la presencia del trematodo
en dichas poblaciones.

En 1996, Pinillos realiza un estudio epidemiológico en el departamento de Santa

Rosa para determinar el porcentaje de huéspedes intermediarios infectados con
Paragonimus sp., en Chiquimulilla, Guazacapán y Taxisco. Además de reportar la
presencia del parásito, concluye que existe un alto consumo de cangrejos por parte
de los habitantes de estas áreas.

Rosas (2000) realizó un estudio de Paragonimus mexicanus en cinco afluentes del

Río Los Esclavos en Santa Rosa. En su estudio, colectó cangrejos para determinar
la presencia del parásito y de 312 cangrejos capturados, el 18.59% estuvo
infectado. Además inoculó artificialmente a cinco gatos para describir la
sintomatología de la enfermedad.

Iwagami et. al. (2003), realizaron un estudio filogenético y molecular basado en

secuencias de ADN de metacercarias de Paragonimus mexicanus de Guatemala y
Ecuador. Con el estudio se concluye que las especies de Paragonimus mexicanus,
de Guatemala y Ecuador, están genéticamente diferenciados probablemente al
nivel de subespecie.

3. Justificación del trabajo de investigación

Más de 40 especies han sido descritas en el género Paragonimus., dichas especies

han sido reportadas en Asia, América y África. Infecciones humanas han ocurrido
debido a varias especies del género en distintas partes del mundo. Se ha estimado
que más de 21 millones de personas alrededor del mundo se encuentran infectadas
con éste parasito. (Toscano et. al., 1995).
9
La paragonimiasis se encuentra dentro del grupo de las enfermedades olvidadas,
este hecho no hace que deje de ser importante ya que la presencia de este parásito
afecta tanto a la salud como a la economía de las comunidades. Para dicha
economía representa pérdidas, ya que debido a la sintomatología (fatiga,
debilitamiento, pérdida de peso, etc.) se produce un descenso considerable en la
productividad humana. Las poblaciones de bajos recursos son las que se
encuentran más vulnerables a adquirir la enfermedad; sin embargo, las poblaciones
con un nivel de ingresos más alto no están exentas de adquirir la enfermedad. Las
poblaciones de bajos recursos, que habitan en áreas aledañas a ríos o afluentes,
son las más vulnerables ya que hacen del cangrejo o camarón parte de su dieta
cotidiana debido a que representa un costo bajo o nulo, adquiriéndolo directamente
de los ríos.

Además de afectar severamente la salud humana, Paragonimus puede llegar a

afectar a animales domésticos como cerdos, que si no son cocinados
correctamente puede constituir otro mecanismo de transmisión hacia el ser
humano. Aparte de ser otro mecanismo de transmisión, el hecho de estar infectados
con el parásito puede hacer que los animales no se desarrollen correctamente y
morir antes de poder ser consumidos, reduciendo de esta manera la alimentación
disponible de las comunidades (Blair, Xu & Agatsuma, 1999).

Los estudios realizados sobre el parásito y la enfermedad, se han llevado a cabo en

pocas partes del país (Tongu et. al., 1995; Rosas, 2000; Teni & Pinto, 1993). Por la
falta de información en la distribución del parásito, la enfermedad se puede
diagnosticar erróneamente como tuberculosis, generando un gasto extra al tratarla
de manera incorrecta. Es por ello que la información actualizada de la presencia de
Paragonimus en cangrejos consumidos por algunas comunidades puede ayudar a
establecer nuevas zonas de riesgo. Se debe tomar en cuenta el hecho de que la
enfermedad no se encuentra erradicada del país y aún puede generar problemas de
salud en distintas comunidades y gastos extras a entidades gubernamentales como
el Ministerio de Salud. La información de este estudio ofrecerá datos importantes
sobre algunas áreas de distribución que servirán para incrementar el conocimiento
acerca de Paragonimus y para realizar estudios comparativos.

Adicionalmente, es importante recalcar el hecho de que en los estudios

anteriormente desarrollados en el país, a pesar de que se realizaron técnicas
moleculares para la determinación de las especies del parásito, éstas
identificaciones y reportes tienen más de cinco años de haber sido realizados, por lo
que nuevas determinaciones moleculares pueden ratificar los reportes realizados
con anterioridad e incluso pueden generar nuevos reportes de distribución en el
país. Autoridades como el Ministerio de Salud pueden utilizar la información
generada por este proyecto como una herramienta valiosa para el combate de esta
enfermedad, lo que facilitará la prevención o eliminación de focos potenciales de
paragonimiasis.

10
4. Pregunta de investigación

¿Cuáles son los focos potenciales de Paragonimiasis en la costa sur de Guatemala

y que especies están presentes?

5. Objetivos

5.1. General
• Evaluar los posibles focos de Paragonimiasis y determinar mediante técnica
molecular la especie de Paragonimus presente en los departamentos del área
de Sur de Guatemala.

5.2. Objetivos Específicos

• Determinar la presencia de Paragonimus en ríos de los departamentos de

Jutiapa, Santa Rosa, Escuintla, Suchitepéquez, Retalhuleu y San Marcos,
durante el transcurso del año.

• Determinar la especie de Paragonimus presente en hospederos intermediarios

del área sur de Guatemala, utilizando ADN mitocondrial.

• Localizar nuevas zonas de riesgo para la transmisión de dicha enfermedad.

• Realizar análisis microbiológicos (coliformes totales y fecales), en los sitios de

colecta seleccionados.

6. Hipótesis

Paragonimus sp. está presente en crustáceos colectados en ríos de áreas donde

aún no ha sido reportado para el país.

7. Materiales y métodos

7.1. Universo

7.1.1. Población:

Parásitos de la especie Paragonimus sp., presente en los ríos de la Costa Sur de

Guatemala.

7.1.2. Muestra:

Cangrejos colectados en los ríos de la Costa Sur de Guatemala infectados con

Paragonimus sp.

11
 7.2. Variables

7.2.1. Variables independientes

Parásitos de la especie Paragonimus sp. en fase cercaria.

7.2.2. Variables dependientes

Numero de cangrejos de los ríos de la Costa Sur infectados con el parasito
Paragonimus sp.

7.3. Materiales y equipo

Resmas de papel bond Carta y oficio; Material de oficina (post-it,

resaltadores, grapas, clips); Tinta para impresora; Cartapacio tipo Leitz
Combustible (Diesel)
Etanol al 95%
Bandejas plásticas para abrir los cangrejos de río
Bolsas plásticas para basura
Botas de hule para la colecta de cangrejos de río
Cubetas de 5 o 6 galones con tapadera
Vacuntainers para guardar las muestras de trematodos encontrados
Paquete de marcadores indelebles diferentes colores, lapiceros, Masking
tape, tijeras, ganchos, folders, marcadores de punta fina (Para marcar los
vacuntainers)
Cd`s; Memorias USB para almacenar información
Jabón en polvo; Cloro; Desinfectante
Papel mayordomo; Esponjas para larvas bandejas y cristalería
Toallas de Tela para la limpieza
Pinzas de punta fina para extraer a los trematodos encontrados
Cajas de guantes quirúrgicos para el trabajo de laboratorio
Tijera especial para abrir los cangrejos de río
Guantes gruesos para la colecta de cangrejos
Impresora para imprimir todos los informes mensuales y el final
Libretas de campo especiales, resistentes al agua
Palas desmontables marca coleman
Cernidor para la colecta de cangrejos de río
Hielera grande para el transporte de cangrejos colectados

12
 7.4. Métodos

7.4.1. Selección de los sitios de muestreo

Debido a que está enfermedad está muy asociada a las comunidades cercanas a
ríos y que en su dieta diaria requieren del consumo de cangrejos, se trabajará
directamente con personas que se dedican a la colecta de cangrejos ya sea para
auto consumo o para la venta. Se trabajará en los departamentos de Jutiapa, santa
Rosa, Escuintla, Suchitepéquez, Retalhuleu y San Marcos, y en cada departamento
se seleccionaran dos comunidades cercanas a ríos, cuya selección será a través de
la ubicación de los ríos por medio de fotointerpretación utilizando sistemas de
Información Geográfica (SIG), luego por medio de verificación en el campo se
elegirán las comunidades aledañas a los ríos seleccionados.
.
7.4.2. Colecta de cangrejos en los sitios de estudio

Después de la selección de los sitios de muestreo se realizarán 4 colectas

espaciadas trimestralmente durante el transcurso de todo el año (Casas et.al.
2008). La colecta se realizará a lo largo de los ríos, seleccionando 5 puntos de
muestreo. En cada punto se colectará a lo largo de transectos de 10 metros y se
espaciarán cada 5 metros. En cada punto de muestreo se realizará una búsqueda
de los hospederos intermediarios, cangrejos de río, durante 45 minutos. La captura
de cangrejos se hará por medio de una colecta manual buscando bajo las piedras y
en agujeros.

Los puntos de muestreo serán georeferenciados y se tomarán tanto las

características físicas y climáticas de los ríos como las características del ambiente.
Además se realizara un análisis microbiológico (cantidad de coniformes) para
evaluar el estado de conservación de los ríos.

Para el análisis de coniformes las muestras de agua se tomaran con envases de

agua pura nuevos de medio litro y al llegar al sitio de muestreo se vaciarán y se
tomarán las muestras de agua, se colocarán en la hielera y se trasladaran al
laboratorio.

Los cangrejos colectados se guardarán en recipientes herméticos de plástico con

tapadera, con capacidad máxima de 1 litro de agua, conteniendo agua fresca del río
para ser trasladados. Posterior a la colecta, los cangrejos serán llevarán al
laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología –LENAP- USAC, en hieleras,
con la finalidad de mantener a los cangrejos y a los trematodos vivos, el mayor
tiempo posible. Al llegar al laboratorio se sacrificaran con choque térmico, para así
poder disectarlos y examinarlos.

7.4.3. Búsqueda de Paragonimus y toma de datos de los hospederos

intermediarios

13
En el laboratorio, los cangrejos colectados serán determinados hasta donde sea
posible y se les tomarán medidas de largo y ancho de caparazón, se determinará el
sexo y finalmente se le extraerá el hepatopáncreas. Se tomará una muestra del
hepatopáncreas entre dos portaobjetos con una solución salina y se observará al
estereoscopio para la búsqueda de trematodos.

Cada trematodo encontrado en la muestra del hepatopáncreas de los cangrejos

será extraído y guardado en vacuntainer de 5ml en etanol al 95%, con la finalidad
de mantener la muestra como registro y como material disponible para pruebas de
ADN.

7.4.4. Determinación de la especie de Paragonimus presente en las

muestras colectadas

La fuente de ADN para la identificación taxonómica se extraerá de las

metacercarias provenientes de los cangrejos. Las muestras se analizarán en el
Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología, de la Escuela de Biología de
la Universidad de San Carlos de Guatemala. En el laboratorio de Biología Molecular
del referido centro de investigaciones, se trabajarán todos los aspectos
concernientes al trabajo de PCR, desde la extracción del ADN de interés, la
amplificación, la visualización y la purificación del mismo.

7.4.5. Extracción de ADN:

La extracción de ADN de las muestras de metacercarias se realizará mediante el uso

de reactivos comerciales. En este caso, se utilizará el kit DNeasy Tissue kit, de
QIAGEN. El procedimiento que se lleva a cabo para la extracción del material
genético se basa en la lisis del tejido. También se basa en la utilización de mini-
columnas giratorias de purificación que tienen integrado un sistema de membranas de
sílice, a las cuales se unen las moléculas de ADN. Este Kit fue elaborado
específicamente para ese tipo de muestras (QIAGEN, 2006). El protocolo que se
seguirá para la extracción del material genético de las muestras se detalla a
continuación (los buffers que se mencionan a continuación, ASL, AL, AW1 y AW2,
vienen ya preparados en el kit):

1. Agregar 300µl de Buffer ASL. 20µl de Proteinasa K, 20µl 1M de DTT a un

tubo de 1.5ml para microcentrífuga.

2. Cortar una pieza de 2-5 cm de la pluma (arriba de 25 mg), y transferir al tubo

para microcentrífuga del paso 1. Cerrar y mezclar continuamente con vortex por
10 segundos. Continuar con el paso 3.

3. Incubar a 56ºC hasta que la muestra esté completamente lisada. Se puede

quedar incubando toda la noche.

14
 4. Mezclar la muestra con el vortex por 15 s. Agregar 300µl de Buffer AL a la
muestra, y mezclar vigorosamente con el vortex. Después agregar 300µl de
etanol (96-100%), y vuelva a mezclar con el vortex.

5. Pipetear la muestra del paso 4 (no incluya precipitado) dentro de la Mini-

columna DNeasy y agregarla en un tubo colector de 2 ml. Centrifugar a ≥6000 x
g (8000 rpm) por 1 min. Descartar el tubo colector que contiene el filtrado.

6. Colocar la Mini-columna DNeasy en un nuevo tubo colector. Agregue 500 µl

de Buffer AW1, y centrifugue por 1 min. a ≥6000 x g (8000 rpm). Descartar el
tubo colector que contiene el filtrado.

7. Colocar de nuevo la Mini-columna en un nuevo tuvo colector de 2 ml, añadir

500 µl de buffer AW2, y centrifugar por 3 minutos a 20000 x g (14000 rpm) para
secar la membrana DNeasy. Descartar el filtrado y el tubo colector.

8. Colocar la Mini-columna DNeasy en un tubo de microcentrífuga de 2 ml, y

pipetear 200 µl de buffer AE directamente sobre la membrana DNeasy. Incubar
a temperatura ambiente por 1 min., y luego centrifugar por 1 min. a 8000 rpm.

9. Para maximizar el rendimiento de AND, repetir la elusión una vez más como
está descrito en el paso 8.

7.4.6. Amplificación de ADN

Genoma mitocondrial

Decidimos trabajar con el ADNmt debido a que es uno de los marcadores más
ampliamente utilizados para la identificación de especies según Avise (2004) y Mills
(2007). La amplificación de un fragmento del gen del citocromo c subunidad oxidasa
1, cox 1, del ADNmt se llevará a cabo mediante PCR, técnica que envuelve la
síntesis enzimática in vitro de millones de copias de una secuencia específica de
ADN (Pérez-Sweeney et al., 2003). Para ello se utilizarán cebadores o primers
específicos, los cuales se unen mediante hibridación a regiones conservadas que
delimitan las regiones repetitivas. Se emplearán en este estudio un par de
cebadores utilizados por Bowles et al. (1993), los cuales amplifican para una región
específica de aproximadamente 380 pares de bases, para lograr la identificación de
las especies de tremátodos. La tabla 2 muestra los cebadores que utilizaremos.

La reacción en cadena de la polimerasa se aplicará siguiendo los protocolos

utilizados por Iwagami et al. (2000, 2003), quienes han trabajado en la identificación
de diversas especies de Paragominus de Asia, incluyendo un trabajo con muestras
de Guatemala y Ecuador, describiendo detalladamente los ciclos para el PCR.

Tabla 2. Cebadores para amplificación del fragmento del citocromo b

Secuencia de FH5 FH3
15
los cebadores 5´-TTT TTT GGG CAT CCT 5´-TAA AGA AAG AAC
GAG GTT TAT-3´ ATA ATG AAA ATG-3´
Fuente: Iwagami et al., 2003b

El primer paso para el PCR, es la preparación de la mezcla maestra, la cual

contiene los cebadores, la enzima polimerasa y el ADN de interés, además de otros
reactivos para mantener en óptimas condiciones la reacción. El siguiente paso es la
amplificación por medio del PCR en un termociclador, con la siguiente secuencia de
pasos (Iwagami et al., 2003b):

• Primer paso: 94°C - 1 min.

• Segundo paso: 30 ciclos de: 94°C - 1 min.
50°C - 1 min.
72°C - 2 min.

Los productos de amplificación o amplicones se almacenarán a 4°C hasta el

momento en que se procederá a la visualización de las bandas amplificadas.

7.4.7. Visualización de las bandas:

Después de la amplificación se debe comprobar la presencia de los fragmentos del

ADN de interés en los amplicones. Para ello se utilizarán geles de agarosa. Luego
se observará la banda de ADN obtenida, en un transiluminador a una longitud de
onda de luz Ultravioleta de 256 nanómetros (nm). Este método se lleva a cabo
normalmente como un paso para determinar si la amplificación fue exitosa. Las
muestras que salgan positivas (es decir, si amplificaron bien y por consiguiente se
pudo observar su banda en el gel) son las que se purificarán posteriormente y se
enviarán a secuenciar.

7.4.8. Purificación del ADN de interés:

Después de haber obtenido el producto del PCR, debe realizarse una purificación
del ADN presente en los amplicones a partir de un kit comercial de purificación de
productos de PCR, el cual utiliza un proceso de purificación por medio de arrastre a
través de columnas. La purificación de ADN se realizará siguiendo el protocolo del
kit de purificación para productos de PCR PureLink, Invitrogen.

7.4.9. Secuenciación:

Los productos obtenidos del ADN mitocondrial se mandarán a secuenciar. Debido a

que el proceso de secuenciación es un proceso muy complicado y extremadamente
oneroso de realizar, los fragmentos amplificados por PCR o amplicones serán
enviados a un laboratorio especializado en la técnica en el extranjero. Los
laboratorios comerciales ofrecen garantía de los resultados y periodos de análisis
relativamente cortos.

16
 7.4.10. Análisis de las secuencias

El primer paso después de obtener las secuencias será el de alinear y editar los
fragmentos mediante el software Clustal, con secuencias especificas de
Paragominus (Iwagama et al., 2000, 2003a y b). Luego, para determinar a qué
especie pertenece una secuencia determinada, la compararemos con secuencias
de referencia de especies de Paragonimus, las cuales están registradas en el
GenBank, utilizando el programa BLAST. La identificación de la especie se logra
con el grado de similitud que presenta la secuencia desconocida, en este caso
proveniente de las metacercarias, con una secuencia conocida, que proviene de la
base de datos (Iwagama et al., 2000, 2003a y b). Como parte de los resultados que
se esperan obtener con el estudio, y como aporte al Banco Mundial de Genes, las
secuencias que obtendremos se ingresarán al GenBank con datos de Guatemala.

Para obtener una identificación de especie más confiable y robusta (Farrell et al.,
2000), calcularemos distancias genéticas entre los fragmentos de ADN que
provienen de cada muestra de metacercaria y las secuencias de referencia,
mediante el modelo de 2 parámetros de Kimura, utilizando el paquete PAUP versión
4.0 (Swofford, 2000). Luego, llevaremos a cabo un análisis cluster del tipo
“neighbour joining” con un remuestreo bootstrap de 1000 repeticiones, utilizando el
software MEGA versión 3.1.

7.4.11. Evaluación de Coliformes:

Se colectará el agua y se enviará al laboratorio antes de 24 horas y se evaluará de

la siguiente forma:

Rotular cada caja con el agar. Se colocará la membrana sobre el agar ENDO para
coniforme fecal y agar TGE para coniformes totales
Humedecer el medio con agua destilada (aproximadamente menos de un ml. con
agua destilada). Preparar la bomba de vació conectada al embudo y en el un
quitazato y sobre la boca de este se coloca el embudo,
Colocar la membrana y asegurar el embudo con una pinza, se agrega la muestra y
se filtra. Quitar con una pinza estéril y colocar sobre el agar e incubar a 37 grados
centígrados y leer a las 24, 48 y 72 horas. Se cuentan las unidades formadoras de
colonias UFC.

7.4.12. Análisis de la información

Se evaluarán las diferencias entre sexos de los cangrejos infectados por medio de
una prueba de comparación de medianas no paramétrica. Se evaluará si existe
diferencia en la talla de los cangrejos infectados y no infectados a través de pruebas
paramétricas de comparación de medias. Además, se evaluará la similitud de los
sitios de estudio por medio de coeficientes de similitud binarios y coeficientes de
disimilitud cuantitativos. Como complemento a estos coeficientes, se realizará un

17
análisis de agrupamiento jerárquico de los sitios de muestreo. Todo esto se
realizará con el paquete estadístico R.

Con el paquete estadístico SPSS se realizarán análisis de varianza (ANDEVA’s)

para ver si existen diferencias entre las abundancias de trematodos y de cangrejos
en los lugares de muestreo.

Se realizará un análisis de regresión lineal y de correlación, para comprobar si

existe algún tipo de relación entre las variables coliformes y el número de cangrejos
presentes en cada sitio de estudio.

8. Cronograma de trabajo

Meses
Actividades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Actividades de X X
Gabinete
Trabajo de campo X X X X
Identificación de X X X X X X X X X X
cangrejos
Determinación X X X X X X X X X
molecular de
Paragonimus
Diseño de material X X X
de divulgación
Elaboración de X X
informe final
Presentación de los X
resultados del
estudio

9. Resultados Esperados

Los resultados que se esperan obtener al final del proyecto son:

a) Información actualizada sobre la presencia del parásito tanto en las áreas

donde ya se ha reportado como en otras áreas que potencialmente pueden
albergar poblaciones de huéspedes intermediarios infectados.

b) Se determinará con técnología molecular, la especie de Paragonimus que se

localizada en los hospederos intermediarios colectados durante la ejecución
del proyecto.

c) Se determinarà hasta donde sea posible los crustáceos que funcionan como
hospederos intermediarios de Paragonimus.

18
 d) Se determinara si existe algún patrón en la talla y/o sexo de cangrejos, con la
finalidad de que estas variables puedan ser utilizadas como diagnóstico de la
presencia de Paragonimus antes de que sean consumidos.

e) A partir de los análisis microbiológicos, donde se cuantificara la cantidad de

coliformes totales y fecales presentes en los sitios de colecta, se determinara
si los ríos aledaños a las poblaciones son utilizados como vertederos de
desechos biológicos. Este hecho ayudara a determinar si el ciclo de vida del
parasito Paragonimus sp., está completo y, sumado a la determinación de la
presencia del parasito en los hospederos intermediarios (los cangrejos
colectados), será posible determinar si las poblaciones aledañas a los ríos
se encuentran infectadas con Paragonimus sp., o se encuentran en riesgo de
infección.

f) Con la información obtenida del presente estudio, se elaborará material

divulgativo concerniente a la enfermedad, el modo de contagio, los síntomas
que produce, como detectarla, las medidas para disminuir su propagación y
evitar el contagio, etc. Este material será repartido a las autoridades de salud
cercanas a los sitios de colecta para que pueda ser difundido a las
poblaciones clave.

10. Financiamiento

Descripción de materiales, Costo Costo Fuente de

suministros y equipo unitario Total financiamiento
Para realizar trifoliares y carteles que ayuden a Q. 2500.00 Financista
divulgar la información obtenida por el proyecto
Impresión, encuadernación y reproducción del Q. 150.00 Financista
informe final
Resmas de papel bond Carta y oficio Q. 45.00 Q. 225.00 Financista
Combustible (Diesel) Q. 40.00 Q. 4000.00 Financista
Tinta para impresora Q. 300.00 Q. 1800.00 Financista
Etanol al 95% Q. 50.00 Q. 250.00 Financista
Bandejas plásticas para abrir los cangejos de río Q. 20.00 Q. 60.00 Financista
Bolsas plásticas para basura Q. 60.00 Financista
Botas de hule para la colecta de cangrejos de río Q. 150.00 Q. 300.00 Financista
Cubetas de 5 o 6 galones con tapadera Q. 100.00 Q. 500.00 Financista
Vacuntainers para guardar las muestras de Q. 100.00 Q. 500.00 Financista
trematodos encontrados
Material de oficina (post-it, resaltadores, grapas, Q. 200.00 Financista
clips)
Paquete de marcadores indelebles diferentes Q. 250.00 Financista
colores, lapiceros, Masking tape, tijeras,
ganchos, folders, marcadores de punta fina
(Para marcar los vacuntainers)
Cartapacio tipo Leitz Q. 60.00 Q. 120.00 Financista
19
 Cd`s Q. 200.00 Q. 200.00 Financista
Memorias USB para almacenar información Q. 250.00 Q. 500.00 Financista
Jabón en polvo Q. 80.00 Financista
Cloro Q. 500.00 Financista
Papel mayordomo Q. 10.00 Q. 100.00 Financista
Desinfectante Q. 34.20 Q. 102.60 Financista
Esponjas para larvas bandejas y cristalería Q. 10.00 Q. 20.00 Financista
Toallas de Tela para la limpieza Q. 6.00 Q. 60.00 Financista
Pinzas de punta fina para extraer a los Q. 87.50 Q. 350.00 Financista
trematodos encontrados
Cajas de guantes quirúrgicos para el trabajo de Q. 150.00 Q. 300.00 Financista
laboratorio
Tijera especial para abrir los cangrejos de río Q. 150.00 Q. 300.00 Financista
Guantes gruesos para la colecta de cangrejos Q. 100.00 Q. 200.00 Financista
Impresora para imprimir todos los informes Q. 400.00 Q. 400.00 Financista
mensuales y el final
Libretas de campo especiales, resistentes al Q. 300.00 Q. 300.00 Financista
agua
Palas desmontables marca coleman Q. 300.00 Q. 300.00 Financista
Cernidor para la colecta de cangrejos de río Q. 50.00 Q. 50.00 Financista
Hielera grande para el transporte de cangrejos Q. 350.00 Q. 350.00 Financista
colectados

20
11. Referencias
.
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23
12. Anexos

Anexo 1. Ciclo de vida del Paragonimus sp

24