EXTRACCIÓN DE ADN PLASMIDIAL

PLASMIDIAL DNA EXTRACTION

Arteaga Martínez A*; Barrios Pertuz D; Pacheco Grandeth A; Ramos Galván E.

Universidad de Córdoba, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Básicas.

* andresarteaga_9236@outlook.com

Resumen

Los plásmidos son fragmentos extracromosómicos de ácidos nucleicos (ADN o ARN) que
aparecen en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamaño variable aunque menor
que el cromosoma principal. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez. El objetivo de
esta práctica es describir las pautas y recomendaciones generales para la extracción del
ADN plasmidial, a partir de cultivos bacterianos de 24 horas de incubación. Para esta
práctica fue necesario utilizar cultivo de E. coli en caldo LB, que fue el microrganismo que
se utilizó para extracción de ADN plasmidial. Al final de hacer todos los procedimientos
correspondientes se obtuvo un precipitado al cual se le añadió 50 μl de Buffer T.E para
almacenar la muestra. Se obtuvo resultados donde se pudo observar y extraer el ADN
plasmidial en un tubo de ensayo, y posteriormente en un tubo eppendorf se guardó e incubó
La extracción de ADN plasmidial es un proceso riguroso que debe seguir las procedimiento
establecido, debido a que una alteración en algunos de estos, puede generar que no se
obtenga los resultados esperados.

Palabras claves: Buffer T.E, cultivo bacteriano, lisis celular, plásmido.

Abstract

Plasmids are extrachromosomal fragments of nucleic acids (DNA or RNA) that appear in
the cytoplasm of some prokaryotes. They are of variable size although smaller than the
main chromosome. Each bacterium can have one or several at a time. The objective of this
practice is to describe the general guidelines and recommendations for the extraction of
plasmidial DNA, from bacterial cultures of 24 hours of incubation. For this practice it was
necessary to use E. coli culture in LB broth, which was the microorganism that was used
for plasmidial DNA extraction. At the end of all the corresponding procedures, a precipitate
was obtained to which 50 µl of Buffer T.E was added to store the sample. Results were
obtained where the plasmidial DNA could be observed and extracted in a test tube, and
subsequently in an Eppendorf tube it was stored and incubated. Plasmidial DNA extraction
is a rigorous process that must follow the established procedure, because an alteration in
some of these may result in the expected results not being obtained.
Keywords: bacterial culture, Buffer T.E, cell lysis, plasmid.
Introducción
Los plásmidos son moléculas pequeñas
de ADN circular capaces de replicarse de
forma autónoma, independientemente del
cromosoma. Son muy comunes en
bacterias y algunos de ellos, los más
pequeños, existen en las células
bacterianas en un número elevado (hasta
100 copias por célula). Los plásmidos son
una herramienta fundamental en Biología
Molecular e Ingeniería Genética ya que se
pueden usar como “vectores” para
introducir en ellos cualquier fragmento de
ADN de interés y de esta forma
amplificarlo de forma natural dentro de la
bacteria en la que el plásmido se replica,
es lo que se llama “clonar” un fragmento
de DNA (Caballero, Moyano y Muñoz,
2010).
La mayoría de los plásmidos son
circulares, pero, recientemente se han
identificado plásmidos lineales. Los
plásmidos generalmente se encuentran
distribuidos en bacterias, aunque también
suelen encontrarse en algunos hongos y
levaduras. En general no son esenciales,
sin embargo en algunos casos proveen a
las células ventajas selectivas (Checa,
2018).
La información genética que portan los
plásmidos no es generalmente vital para
la supervivencia celular. No obstante,
dicha información puede resultar
imprescindible en determinadas
circunstancias ambientales. Los
plásmidos son portadores de genes de
resistencia a antibióticos. Las bacterias
pueden llegar a tener un gran número de
copias de un mismo plásmido (plásmidos
multicopia), facilitando enormemente su
purificación. Hay distintos
procedimientos para la purificación de
DNA plasmídico, aunque todos incluyen
los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento
de las bacterias en un medio selectivo de
aquellas que llevan el plásmido. (ii) Lisis
de las bacterias para la liberación del
plásmido. (iii) Purificación del DNA
plasmídico (Prieto, López Y Pueyo, s.f).
Objetivo
Describir las pautas y recomendaciones
generales para la extracción del ADN
plasmidial, a partir de cultivos
bacterianos de 24 horas de incubación
Reactivos
 Buffer T.E. (10 Mm Tris-HCl, pH
8,0; 1 Mm de E.D.T.A)
 Solución 1: Glucosa 1:50 Mm;
Tris-HCl 25Mm, pH 8,0;
E.D.T.A. 10Mm a pH 8,0
 Solución 2: S.D.D al 1% e
hidróxido de sodio 0,2 N.
 Solución 3: Acetato de Sodio 3M
y Ácido Acético glacial 5M
 Isopropanol
 Etanol al 70%
Materiales y equipos
 3 ml de cultivo bacteriano en
caldo LB. Con Ampicilina.
 2 pipetas de 5 ml.
 Micropipetas de 100, 200 y
1.000 μl.
 Puntas de micropipetas
 Servilletas
 3 tubos Eppendorf
Metodología
Área de estudio
Esta práctica se llevó a cabo en las
instalaciones de la universidad de córdoba
específicamente en el laboratorio de
Biología Molecular, que se encuentra
localizado en el departamento de córdoba,
Colombia entre las coordenadas
geográficas 8°47’33” N 75°51’46” W
(Fig.1).
Fuente: Google Earth, 2019.
Figura 1. Localización del laboratorio de
Biología Molecular de la Universidad
de Córdoba.
Procedimiento
Preparación celular
 Se tomó el cultivo de E. coli y se
añadió 1,5 ml a un tubo de
microcentrifuga, se centrifugo la
muestra a 12.000 rpm por dos (2)
minutos a 20°C.
 Posteriormente a la centrifugación
se descartó el sobrenadante y se
le agrego 1.5 ml más de cultivo y
volvió a centrifugar a 12.000 rpm
a dos (2) minutos a 20°C.
Lisis celular
 Después de haber centrifugado se
descarta el sobrenadante, a la
biomasa obtenida (Células
bacterianas) se le añadió 200 μl de
solución 1 y se resuspende la
muestra, se agito en vortex, a
15.000 rpm durante un (1) minuto.
 Después se le añade 400 μl de la
solución 2 y se mezcló el tubo por
inmersión suavemente unas 5
veces, se dejó reposar la muestra
por 5 minutos a temperatura
ambiente.
 Después se le agregan 300 μl de la
solución 3 y se mezcló el tubo
por inmersión unas 5 veces,
después se incubo en hielo
durante unos diez (10) minutos.
 Posteriormente se centrifugo la
muestra por cinco (5) minutos a
12.000 rpm a 20 °C, después se
trasfirió el sobrenadante a un tubo
de centrifuga limpio.
Recuperación del plásmido
 Al tubo que contenía el
sobrenadante se le adiciona
isopropanol hasta llenarlo, y se
mezcló una vez por inmersión y se
dejó reposar la muestra a
temperatura ambiente durante
unos veintiséis (26) minutos.
 Después se centrifugo la muestra
por cinco (5) minutos a 12.000
rpm a 20 °C, posterior a la
centrifugación se descartó el
isopropanol con mucho cuidado.
  Después se le añadió etanol al
70% hasta llenar el tubo de
microcentrifuga, se mezcló por
inmersión y se volvió a
centrifugar por un (1) minuto a
12.000 rpm a 20 °C.
 Posteriormente a la centrifugación
se descartó el sobrenadante y se
añade 50 μl de Buffer T.E. al tubo
para almacenar la muestra.
Análisis de resultados
En la extracción de ADN plasmidial, las
células son lisadas y los restos celulares
se eliminan generalmente por
centrifugación. Las proteínas son
desnaturalizadas/digeridas utilizando una
proteasa y precipitadas con disolventes
orgánicos y el precipitado de proteínas es
eliminado por centrifugación. El ADN
purificado suele ser recuperado por
precipitación con etanol o isopropanol.
En presencia de cationes monovalentes
como el Na+, y a temperatura de -20°C,
el etanol absoluto precipita
eficientemente los ácidos nucleicos
poliméricos dejando atrás ácidos
nucleicos monoméricos y de cadena
corta, incluyendo los ribonucleótidos del
tratamiento, permitiendo así que
solamente quede el ADN plasmidial
(Rutgers University, 2013).
Existen diferentes técnicas para aislar el
ADN plasmídico y uno de los métodos
más usado es el método de extracción por
lisis alcalina. Este método aprovecha las
diferencias en el tamaño y la
superhelicidad que es el grado de torsión
que sufre el ADN plasmídico en contraste
con el cromosomal. La mayoría de los
cromosomas bacterianos, son moléculas
circulares extremadamente grandes que
no se encuentran superenrollados,
mientras que los plásmidos son moléculas
pequeñas y superenrolladas. Durante el
proceso de extracción, se busca
desnaturalizar el ADN plasmídico y el
cromosomal y posteriormente
renaturalizarlo, con el fin de que el ADN
cromosomal, no se aparee rápidamente y
pueda ser atrapado por complejos
proteicos, los cuales precipitaran; a
diferencia del ADN plasmídico que
rápidamente se renaturalizan y adquirirá
su conformación natural. Usando el
método de extracción por lisis alcalina se
puede obtener entre 100-500 µg de ADN
partiendo de 1.5 mL de cultivo de
bacterias en fase exponencial con un
moderado número de copias de 10 a 20
por bacteria (Checa, 2017).
Conclusión
Los plásmidos son moléculas de ADN
extracromosomal capaces de replicar
independientemente del cromosoma. Que
son de vital importancia para las
diferentes ramas de la biología como: la
biotecnología y la biología molecular que
las usan para lo clonación de ADN, esto
se debe principalmente a su pequeño
tamaño en comparación con los
cromosomas que facilita su extracción y
su manipulación. Además, sus
propiedades de replicación y conjugación
son de gran ayuda para el análisis
genético. La extracción de ADN
plasmidial requiere de un serie de
proceso que va desde la preparación
celular, pasando por las lisis celular hasta
llegar a la recuperación del plásmido, en http://www.labome.es/method/DNA-
estos procesos se trata de aislar esta Extraction-and-Purification.html
molécula de los demás componentes de la
célula. Cada reactivo que se utilizo fue
un papel importante en el aislamiento del
ADN plasmidial.

Bibliografía

Caballero J; Moyano E. y Muñoz J.

(2010). Purificación de ADN plasmídico
y electroforesis del mismo en gel de
agarosa. Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular, Campus
Universitario de Rabanales. Recuperado
de https://www.uco.es/dptos/bioquimica-
biol-
mol/pdfs/38%20PURIFICACION%20D
NA%20PLASMIDO.pdf

Checa A. (2017). Método: Extracción de

ADN plasmídico (Lisis alcalina
modificado). Recuperado de:
http://conogasi.org/articulos/metodo-
extraccion-de-adn-plasmidico-lisis-
alcalina-modificado/

Prieto J; López J. y Pueyo C. (s.f).

Purificación de ácidos nucleicos.
Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular, Campus Universitario de
Rabanales. Recuperado de
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-
biol-
mol/pdfs/37%20PURIFICACION%20AC
S%20NUCLEICOS.pdf

Rutgers University (2013). Extracción y

purificación de ADN. Labome. Rutgers
University, New Jersey, United States.
Recuperado de
Anexos

Anexo 1. Decantación del sobrenadante Anexo 4. Muestras en reposo

Anexo 2. Agitación de la mezcla en Anexo 5. Adición de la solución 3

vortex

Anexo 3. Adición de la solución 2 Anexo 6. Incubación en hielo

Anexo 7. Adición del isopropanol Anexo 9. ADN plasmidial obtenido más
50 μl de Buffer, rotulada para su
almacenamiento

Anexo 8. Adición del etanol