Resumen I parcial laboratorio

¿Por qué utilizar pruebas moleculares?

 Importante para iniciar el tratamiento correcto
 Importante para prevenir la propagación de enfermedades contagiosas

Consideraciones para laboratorios de diagnóstico molecular

Toma de muestras, transporte y procesamiento: Mantener la integridad de los ácidos nucleicos a través
de estos procesos.

Control de contaminación: Flujo de trabajo unidirecciona

Área blanca: preparación de reactivos

Área gris: procesamiento de las muestras

Área negra: amplificación y detección

Extracción de ácidos nucleicos

Muestras: Cultivos bacterianos Sangre, células tejidas, semen leche, pelos etc.
Protocolos: caseros, kits comerciales, manuales y automatizados.
Métodos no comerciales “Caseros”: Salting Out, Fenol-cloroformo, CTAB

Métodos comerciales: Thermo Fisher® , Qiagen® , Promega

Agentes Caotrópicos: Isotiocinato de guadinina (GITC), cloruro de guanidina

• Disuelven estructuras celulares y proteínas (nucleoproteínas)

• Desnaturalizan rápidamente nucleasas (RNasa, DNasa)

Práctica 1: Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos
Los protocolos de extracción de ácidos nucleicos permiten separar esta biomolécula de otros
compuestos provenientes de la célula o del ambiente del cual se tomaron las muestras.
Fases de la extracción de ácidos nucleicos

a) Lisis celular/nuclear

b) Remoción de contaminantes (eliminación de proteínas, lípidos, carbohidratos, otros)

c) Precipitación / elución del material genético

1. Lisis celular/nuclear

Detergentes: dodecil sulfato de sodio (SDS), Nonidet-P40 (NP40) y sarkosil mas usado para ruptura de
membrana celular.

Enzimas: La lisozima actúa desestabilizando la pared celular de las bacterias rompiendo las uniones
glucosídicas entre los polisacáridos N- acetilglucosamina (NAG) y el ácido N-acetilmurámico (NAM).

Útil para ADN total o ADN Plasmidico.

Agentes desnaturantes: cloruro de guanidina útil para tejidos y tipos celulares.

2. Remoción de contaminantes (eliminación de proteínas)

 proteinasa K: eliminación de proteínas, es una enzima proteolítica.

 EDTA: para inhibir la acción de las DNAsas.

 CTAB + NaCL 0.7 M: Elimina glicoproteínas, obtener ADN más puro.

 Desproteinización: solventes orgánicos tales como el fenol y el cloroformo.

Desnaturalizan proteínas.

Fenol: debe ser bidestilado, equilibrado y protegido contra la oxidación mediante la adición de
8-hidroxiquinolina.

Cloroformo: se le adiciona alcohol isoamílico en proporción 24:1 volumen a volumen (v: v) con
el fin de prevenir la producción de espuma y facilitar la separación de las fases acuosas.

Eliminación de ARN (opcional en algunos casos)

 Se realiza mediante digestión de ARN con RNAsas como la ribonucleasa A de páncreas bovino.

3. Precipitación Concentración del ADN

 precipitación con etanol en presencia de cationes monovalentes a concentraciones de
0.1 a 0.5 M.
 Induce un cambio estructural en el ADN que causa la agregación y precipitación del
mismo.
 Remueven los residuos de fenol y cloroformo.

Sales mas utilizadas

 acetato de sodio
 acetato de potasio
 acetato de amonio
 cloruro de litio.

Protocolo de extracción de ADN mediante método de hervido (Boiling method)

El método de extracción de hervido La ebullición se considera un método adecuado para la extracción

de ADN de una variedad de microorganismos. Este método ya es muy utilizado en todo el mundo y se
caracteriza por su protocolo sencillo y bajo costo.

Extraer ADN genómico (gDNA) de forma rápida y eficiente, adecuado para PCR de punto final

 Caldo Luria-Bertani (LB): es uno de los más usados para el cultivo de

Escherichia coli y de otras especies bacterianas, debido a que es rico en
nutrientes, de fácil elaboración y permite el crecimiento de una gran variedad de
cepas.
• Caldo Infusión Cerebro Corazón (HBI) : medio de cultivo alternativo

 Agua libre de nucleasas (mQ): libre de ADNasas y ARNasas útil para resuspender
el pellet formado.
Procedimiento
1.Centrifigar a 4000 rpm/15 min, 10 a 15mL de caldo LB hasta formar pellet.
2.Descartar el sobrenadante con cuidado de no perder el pellet formado.
3. Resuspender el pellet con 1mL de agua libre de nucleasas y trasvasar a un tubo de
microcentrífuga de 1.5mL.
4. Centrifugar a 12,000 rpm por 10min.
5. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100µL de agua libre de nucleasas y
homogenizar con vortex. Centrifugar nuevamente por 5 minutos (repetir 2 veces más con caldo
LB, 3 veces con caldo HBI).
6. incubar a 95 C por 15 min.
7. Centrifugar a 12,000 rpm por 10 minutos
8. extraer el sobrenadante
9. guardar a -20 C por 24 horas o -70 C indefininamente.

Práctica 2: Verificación y cuantificación de Ácidos Nucleicos

Cualitativo: Spot en agarosa - Electroforesis en gel de agarosa (Bromuro de etidio, SYBR GoldTM,
DiamondTM)

Cuantitativo: - Espectrofotometría – Fluorometría Y Nanodrop.

Filtros fluorometros miden las concentraciones de soluciones que contienen moléculas fluorescentes
Integrated Quantus

Protocolo “Spot” en agarosa

Objetivo General: Evaluar de forma cualitativa la extracción de ADN genómico (gDNA) mediante la
técnica de “spot en agarosa”.

La técnica de “spot en agarosa” consiste en preparar un gel en agarosa al 1% y posteriormente llevar a

cabo una corrida electroforética.

Este método proporciona una forma rápida y económica de determinar si se logró extraer ácidos
nucleicos (ADN, ARN) y analizar simultáneamente si el material genético presenta degradación.

Muestra: gDNA

Agarosa

• Colorante de ácidos nucleicos: Bromuro de etidio 0.5 µg/ml (alternativa: Diamond, Promega®)

• Colorante de carga (Blue/Orange Loading Dye, 6X, Promega®)

• TAE 0.5X, 1X

Práctica 3: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Técnicas de amplificación

El diagnóstico molecular requiere técnicas para detectar concentraciones muy bajas de ácidos nucleicos
en el contexto de compleja estructura genómica.

Kary Mullis inventor de la técnica PCR

AMPLIFICACIÓN DE DIANA (Target)

Todos son procesos mediados por enzimas (polimerasas), para sintetizar copias de los ácidos nucleicos
diana.

oligonucleótidos cebadores: Delimita los productos de amplificación

Produce 108 - 109 copias de la secuencia blanco

PCR

La PCR consiste en la replicación in-vitro de ADN realizada para la amplificación selectiva de una o más
secuencias blanco.

Áreas fuera de la región de interés no se amplifican (sondas específicas).

Permiten lograr una amplificación de más de un millón de veces.

Rango de temperatura donde ocurre la desnaturalización, hibridación y polimerización es de 4 a 96 C

Componentes

 Primers o cebadores Fragmentos de DNA, cadena sencilla, 18-24b

iniciador para comenzar la polimerización

Primers “forward”: es complementario a la secuencia localizada en el comienzo de la secuencia blanco.

Primers “reverse” es complementario a la secuencia final.

Los cebadores deben cumplir con algunos requerimientos tales como, tener entre ellos una temperatura
de fusión (Tm) igual o parecida, de manera que se puedan anillar o hibridar a la secuencia diana a la
misma temperatura.

 H20 libre de nucleasas

Agua estéril libre de enzimas nucleasas que degradan ácidos nucleicos

Master Mix
  Taq polimerasa

La Taq ADN polimerasa, aislada de Thermus aquaticus, es una

ADN polimerasa termoestable que cataliza la incorporación cebador-dependiente de nucleótidos en
ADN doble hebra en la dirección 5′→3′ en presencia de Mg2+. Es la ADN polimerasa termoestable
estándar utilizada en aplicaciones de la PCR.

 MgCL2

Se utiliza como fuente de iones magnesio, cofactor de la polimerasa, depende de su concentración la

eficiencia de la reacción será mayor o menor.

 Buffer: TRIS-HCL

tampón o amortiguador de pH es un sistema químico que afecta la concentración de los iones de

hidrógeno (o hidronios) en una solución.

Mantiene un pH de 8.5 en el master mix

 dNTPs

 Son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.

Concentración ideal 200 uL

Fases de amplificación:

1. Desnaturalización: Calentamiento para la separación de las cadenas de ADN, la mezcla es llevada por
el termociclador a temperatura de 95 °C. Esta temperatura debe ser mayor a la Tm de los cebadores.

2. Hibridación: Hibridación de los cebadores a las hebras de cadena sencilla de la secuencia blanco.
Generalmente se usan temperaturas de 37 a 65 °C, durante 10 a 120 segundos.

3. Extensión o polimerización: Etapa de amplificación propiamente dicha, en la que la DNA polimerasa

elonga los cebadores empleando como molde ambas hebras originales de la secuencia diana de ADN. La
extensión transcurre en sentido 5'→ 3’ a partir del extremo 3' OH de cada cebador, empleando como
sustrato los cuatro dNTPs hasta terminar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva etapa
de desnaturalización.

Ciclos de amplificación
  Desnaturalización por calor (95°C)
 Hibridación con los iniciadores específicas y complementarios (35-60°C).
 Polimerización mediante la polimerasa (72°C)

PCR en tiempo real

Análisis de la cinética de la reacción

• Amplificación y detección del producto en cada ciclo de la reacción.

Combina la amplificación del ADN con la detección de los productos en un solo paso.

• “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van generando: – Monitoreando
la amplificación de una secuencia especifica en tiempo real utilizando tecnologías fluorescentes.

Tipos de reporteros

 Intercalantes
 fluorescentes

PCR convencional

Análisis de punto final

1.Amplificación y detección de productos en 2 etapas separadas.

2.Segunda etapa: electroforesis

Variantes de PCR

1. Multiplex

2. Anidada (Nested)

3. Alelo-especifica ~ ARMS

4. Transcripción Reversa

5. Tiempo Real (Cuantitativa)

Secuenciación: análisis posterior a la PCR

• Determinación de la secuencia de nucleótidos

• Muchos métodos de análisis de ADN, ARN y proteínas se basan en el conocimiento previo de la

secuencia de nucleótidos de un genoma de interés.