Introduccin a la ingeniera gentica

Ingeniera gentica: trabaja principalmente con la manipulacin de genes (manipulacin de secuencia de DNA). Como herramienta principal se usan las enzimas de restriccin, que son las enzimas que cortan o modifican en sitios especficos cadenas de DNA de doble hebra o simple hebra. La ingeniera gentica se basa en tcnicas tales como el DNA recombinante y clonamiento molecular, por ejemplo mezclar el DNA de una bacteria con el de un ser humano, producir insulina humana, etc. El DNA sin genes tambin es clonable. Otros usos que se le da es la creacin de organismos transgnicos, con DNA mezclado. En estos organismos transgnicos se encuentran la creacin de vegetales que resisten al ataque de plagas. Las sistemas de las enzimas de restriccin se estudiaron inicialmente en bacterias. Se basa en la observacin de la especificidad en infecciones por bacterifagos. La gentica molecular y microbiana investigada por primera vez por Stamford en 1972. Metodologa: (permite cortar, modificar y unir) 1. El DNA es cortado con enzimas de restriccin. Se generan fragmentos de DNA. (enzimas, mecnicamente, sonicacion, mtodos fsicos o qumicos, etc) 2. Se modifican con enzimas como por ejemplo, fosfatasa alcalina (desfosforilar), nucleasa S1 para cortar hebra simple,etc 3. Unin: La ligasa une el OH 3 con el fosfato 5 formando un enlace fosfoester. El DNA se une a una molecula vector. Se introduce a la clula hospedera. Se selecciona la secuencia deseada con los vectores (vectores virales). Los vectores virales son especficos ya que tienen un receptor. (Mecanismos de seleccin para diferenciar, quienes son las bacterias que incorporaron el DNA, lo que se usa es que en las bacterias se tiene un gen de resistencia a antibitico, las bacterias que no incorporan el gen se mueren) Enzimas de restriccin: (enzimas de restriccin de bacterias) Cuando se estudiaba el fago lambda en los aos 50 se hace un experimento para determinar si todos los virus son lticos. Se tienen diferentes cepas (Strain) de DNA de virus, la cepa A y la Cepa B. En el experimento se observa que una cepa viral produce lisis a una bacteria y que la otra cepa no produce lisis en la misma. La cepa A es infectada con un virus de la cepa B, el DNA entra desnudo en las bacterias. La cepa B

corta el DNA viral que es inyectado por el virus. En cambio en la cepa A existen distintas molculas que cortan el DNA de la cepa B. Razones: Muchas cepas de bacterias tienen enzimas de restriccin-modificacin y reconocen el DNA forneo (como el DNA del fago) y lo cortan para prevenir infecciones. Al mismo tiempo, estos sistemas protegen el DNA cromosomal de la clula hospedadora con un similar corte y degradacin. Las enzimas de restriccin reconocen secuencias palindrmicas: 5-3GAATTC ** Las secuencias siempre se leen 5-3, es la misma secuencia en ambas hebras. CTTAAG La modificacin es una simple metilacin. Las enzimas de restriccin cortan los segmentos de DNA donde no se encuentra metilado. Por esto como defensa de las enzimas de restriccin del DNA celular, este se encuentra metilado. Para que exista replicacin en el DNA, este debe estar completamente metilado. Si la replicacin es semiconservativa quedan segmentos metilados y otros no metilados de DNA, por lo que se conoce como DNA hemimetilado El DNA hemimetilado no puede ser cortado por una endonucleasa y es un excelente sustrato para la metilasa. Esta metilacin es hecha por una enzima llamada metilasa. La misma secuencia metilada es reconocida por la metilasa y por la endonucleasa.

Como se muestra en las imgenes cuando el DNA esta metilado la enzima de restriccin no reconoce la secuencia y no puede cortar. Las diferentes cepas de bacterias tienen diferentes secuencias de reconocimiento para la restriccin y la modificacin. Mientras la cepa A del ejemplo anterior puede estar metilada y protegida con una secuencia especifica, la cepa B produce enzimas de restriccin que reconocen y cortan diferentes secuencias. Cuando el fago A infecta a la cepa B, las enzimas de restriccin de la cepa B degradan al DNA invasor.

En las bacterias encontramos diferentes casos:

R(restriccin) Endonucleasa R+ RR+ RM(modificacin) Metilasa M+ M+ MM-

Tiene modificacin y restriccin Esta todo metilado, no se puede cortar el DNA. La bacteria se muere, ya que como no metila, las enzimas de restriccin cortan todo el DNA donde encuentren el palndrome. Estas bacterias son usadas en ingeniera gentica ya que con esto se asegura que el DNA no se modifica.

Por qu el DNA del fago invasor no es metilado cuando entra a la bacteria? Solo el DNA hemimetilado es sustrato de la metilasa, por lo que solo los DNA hemimetilado pueden ser metilados. En la siguiente replicacin el DNA es hemimetilado, el DNA hemimetilado es ahora sustrato de la metilasa, y la clula queda con muchos DNA metilados, estos DNA quedan protegidos de la restriccin. ECO R1 (enzima endonucleasa de E. coli) La enzima ECO R1 rompe un enlace fosfoester, dejando un extremo de hebra simple, 5. Si el DNA se encuentra completamente metilado no hay corte. Reconoce la secuencia 5-GAATTC-3. La cepa de la bacteria de donde se obtiene la enzima protege a su propio DNA produciendo una metilasa especfica, esta toma un grupo metilo desde la S-adenosinmetionina y la pone en el N6 de la segunda adenina en la secuencia de reconocimiento de la ECOR1.

Enzimas tipo II Son los sistemas ms simples y ms comunes comercializados. En este sistema hay enzimas R y M separadas, capaces de reconocer el sitio de corte sin ocupar protena S. No requieren de formacin de complejo. El sitio de reconocimiento es corto, la secuencia palindrmica es de 4 a 6 pares de bases. El corte en el sitio de reconocimiento (o adyacente a l) puede producir extremos romos o sticky ends. Estas enzimas no requieran ATP para su actividad endonucleasa. Nomenclatura: Su nombre proviene de la bacteria donde se produce. (I por la primera enzima descrita) Las enzimas que cortan al medio son las que dejan extremos romo, las que cortan al inicio dejan extremos pegajosos y son ms fciles de unir por la ligasa, esto est codificado en el plsmido. Si se desea cortar un DNA grande y la enzima de restriccin reconoce 6 pares de bases, hay menor probabilidad de cortes. El nmero es de 46, ya que reconoce 6 pares de bases y existen 4 nucletidos distintos.

La enzima de restriccin tiene una estructura cuaternaria: tiene dos subunidades: dos polipptidos separados que son idnticos, por lo que es un homodmero. Deben cortar ambas hebras en la misma posicin. En la imagen siguiente se muestran los tipos de corte de diferentes enzimas y los extremos 3 y 5. Los extremos ms fciles para pegar por DNA ligasa son los cohesivos, por que se acercan solos y luego la DNA ligasa los une. Para pegar extremos romo se necesita mayor concentracin de DNAligasa. ECORI deja extremos libres 5 y PstI deja extremos libres 3. Cul es sustrato de una DNApol? En la replicacin una RNA polimerasa debe tener un molde y un primer, el ltimo nucletido del primer 3 OH, este debe estar libre para la replicacin. (Dato: La polimerasa replica de 5 a 3).

En la figura se muestra una electroforesis, donde se separa por tamao, se mira el DNA fragmentado por enzimas de restriccin. Si en el gel se ven 5 bandas, nos preguntamos cul es el tamao del DNA, pero no se puede saber con una banda ya que la intensidad de la banda se relaciona con la cantidad, no directamente con el tamao. En una banda que uno vea puede haber ms de un tipo de molcula del mismo tamao o pueden haber quedado fragmentos pequeos. Para confirmar el tamao real del DNA se corta con diferentes enzimas para poder comparar los tamaos y determinar efectivamente el tamao. Isoesquizmeros: Son enzimas que reconocen y cortan secuencias iguales pero provienen de distintos genes. Tienen la misma actividad enzimtica pero trabajan en distintas clulas. Neoisoesquizmeros: Reconocen la misma secuencia pero no cortan de igual manera. (Por ejemplo, unos cortan dejando extremos romo y los otros cortan dejando extremos sticky)

Mutacin: Una mutacin puede hacer aparecer un sitio nuevo de corte o hacer desaparecer otro, esto tiene como utilidad diferenciar cepas, estudios clnicos. Generar DNA recombinante. Polimorfismo de longitud de fragmento: Se tiene una cepa A y una cepa B y se corta con una enzima de restriccin se esperara que del mismo patrn de fragmentos. Por ejemplo: si hay una mutacin, el sitio desaparece y se genera un fragmento C suma de A y B, si la persona tiene una patologa se determina con esta tcnica.

Star Activity Cuando el DNA es digerido con algunas enzimas de restriccin bajo condiciones no estndar, el corte puede ocurri en diferentes sitios de la secuencia normal de reconocimiento, esto es llamado star activity. Un ejemplo de una enzima que puede tener esta actividad es la enzima EcoRI, el corte puede ocurrir con la misma secuencia que reconoce normalmente (GAATTC) pero con una sustitucin simple de alguna base. Las condiciones no estndar pueden ser las siguientes: Alto pH (>8.0) o baja fuerza inica (ej. si se olvida poner un tampn) Concentraciones de glicerol > 5% :

El glicerol se ocupa como anticongelante o persevante, pero al salir de este estado la concentracin no debe ser mayor del 5% para que la enzima no pierda especificidad, sin embargo las enzimas son mantenidas en 50% de glicerol, lo que no las afecta por que con la baja temperatura estas enzimas no estn activas. Concentracin de enzimas extremadamente alta (>100 U/ug of DNA) Presencia de solventes orgnicos en la reaccin. (e.g. ethanol, DMSO)