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CURSO

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

INTEGRANTES:
ABURTO RODRIGUEZ, Ruddy
CASTILLO MENDOZA, Abigail

DOCENTE:
CASTILLO CALDERN Augusto

CORTIJO PALACIOS, Kiara


VILLALOBOS CIPRIANO, Juana
SING RAMOS, Miguel

Objetivos Generales:
Disear y realizar diferentes experiencias de estudios cinticos de
la enzima invertasa(2,1--D-fructan fructanohidrolasa (EC 3.2.1.7))
de un caldo crudo libre de clulas de kluyveromyces marxianus
NRRL Y-7571 en sus formas solubles e inmovilizada.

Objetivos Especficos:
Preparacin de reactivos y obtencin de curvas de calibrado de
protenas y DNS.
Obtencin del caldo crudo enzimtico kluyveromyces
marxianus ATCC-16045 por fermentacin en matraces.
Determinacin del rango de linealidad y actividad enzimtica
(actividades volumtrica y especfica) de la enzima en el caldo
crudo.
Determinar los parmetros cinticos de la enzima soluble.
Inmovilizar invertasa en geles.
Disear y montar el sistema mini-reactor con invertasa
inmovilizada, para determinar parmetros cinticos de la

1. DETERMINACION
LINIALIDAD

DEL

RANGO

DE

Curva de Calibrado DNS:


Abs=0.5204X-0.0125
A1 : sin diluir
Tubos

Abs

0,171

0,329

0,64

4
Tubos
0
1
2
3
4

0,972
Abs
0
0,419
0,646
0,925
1,2

X (g/L)
t
real
0
0
0,3526133 1,7630668
7
7
0,6562259
3,2811299
8
6,2692159
1,2538432
9
A2: dilucion
1:29,4590699
1,8918139
9
5X (g/L)
X (g/l)
real
0
0
0,829169869
1,65833974
1,26537279
2,53074558
1,801498847
3,60299769
2,329938509
4,65987702
X (g/l)

(min)
0
5
10
15
20
t (min)
0
5
10
15
20

Tabla De Composicin Qumica


A3: dilucion 1:4
Tubos

Abs

X (g/l)

0,123

0,260376633

0,155

0,321867794

0,239

0,483282091

0,342

0,681206764

X (g/L)
real
0
1,0415065
3
1,2874711
8
1,9331283
6
2,7248270
6

t (min)
0
5
10
15
20

2. Determinacin de Protenas - Mtodo Bradford


Solucin estndar
bovino 0.5 g/l
Curva calibrado
N
1
2
3
4
5

albumina
protenas

Sol. Tampn
Sol. Std uL
uL

100
80
20
10
0

0
20
80
90
100

de

Albmina
g/l

0,5
0,4
0,1
0,05
0

suero

0.5

g/l

ABS
595nm
0,344
0,199
0,044
0,016
0

DETERMINACIN DE
PROTENAS-MTODO
BRADFORD:
Curva de Calibrado y=0,6444x0,0147
ABS
0,070

Dilucin
1

e(g/l)
0,131440099

0,036

1/2

0,07867784

0,013

1/4

0,042985723
PROMEDIO

e(g/l)
-real
0,1314400
99
0,1573556
8
0,1719428
93
0,1535795
57

2. Determinacin de la Actividad Enzimatica


(actividad volumetrica y especifica) de la enzima en
el caldo crudo
Escogemos el tramo mas linealidad , durante un
tiempo prolongado
t (min)

X (g/l)

0
5

0
9,632013836

10

19,24000769

Pendiente(gl/min) :
1,924

Dato:
e(mg/ml)

0,15357955
7

3.- Determinacin de los Parmetros Cinticos


Vmax y Kmax de Invertasa Soluble
ECUACION Y =0.5204X-0.0125
So = 4 g/l
absorbancia

producto
(gr/l)

0,035
0,137
0,32
0,557
0,776

0,0913
0,2873
0,6389
1,0944
1,5152

producto
(gr/l)*
dilucion
0,1826
0,5746
1,2779
2,1887
3,0304

tiempo
(min)

resto(g/l)

0
2
6
10
15

0,1826
0,3920
1,0953
2,0061
2,8478
V1 =

1/V1 =

0,1839

5,4377

S1 =

1/S1 =

0,2500

So = 7.3 g/l
absorbancia

producto
(gr/l)

producto
(gr/l)*
dilucion

0,029
0,165
0,441
0,63
0,962

0,0797
0,3411
0,8714
1,2346
1,8726

0,1595
0,6822
1,7429
2,4693
3,7452

tiempo
(min)

resto

0
2
6
10
15

0,1595
0,5227
1,5834
2,3098
3,5857

V1 =

1/V1 =

0,228

4,3860

s1 =

1/S1 =

7,3

0,1370

HALLANDO LAS INVERSAS


A1
A1
A2
A2
A3
A3

1/V
5,4377
4,386
4,2571
3,4807
3,3818
3,0874

1/S
0,25
0,137
0,1075
0,0752
0,0654
0,0518

RECOPILACION DE DATOS DE LOS 3 GRUPOS


Concentracin

4 g/l

7.3 g/l

9,3

13,3

15,3

19,3

tiempo (min)

resto(g/l)

resto(g/l)

resto(g/l)

resto (g/l)

resto(g/l)

resto(g/l)

0,1826

0,1595

0,1826

0,2210

0,1633

0,2018

0,3920

0,5227

0,4880

0,6226

0,3574

0,6687

1,0953

1,5834

1,7448

2,0907

1,7487

2,3098

10

2,0061

2,3098

2,7940

3,1975

2,9362

3,4589

15

2,8478

3,5857

3,5203

4,4043

4,4427

4,9654

4.- Determinacin de los


Parmetros Cinticos
Vmax y Kmax de Invertasa
HALLANDO LAS INVERSAS
Soluble
A1
A1
A2
A2
A3
A3

1/Vmax=
Vmax =

1/V
5,4377
4,386
4,2571
3,4807
3,3818
3,0874

2,6824
0,37280048

1/S
0,25
0,137
0,1075
0,0752
0,0654
0,0518

Kmax/Vmax=
Kmax=

INMOVILIZACION Y EVALUACION DEL


COMPORTAMIENTO DE UN MINI-BIOREACTOR
ENZIMATICO
Para grupo A1

Curva de Calibrado-DNS
y=0,5621x-0,002
Tiempo
(h)

11,554
4,307

Absorba
Producto
ncia
Producto
real
X
ket/K
0,225938 0,225938 0,011296 0,063819
0
0,125
45
45
92
64
0,951787 1,903575 0,083881 0,477124
0,5
0,533
94
88
87
11
0,129781 0,741662
1
0,791
1,410781 2,821562
18
9
1,426792 5,707169 0,274061 1,592923
1,5
0,8
39
54
55
23
1,515744 6,062978 0,291851 1,700347
2
0,85
53
12
98
02
1,695427 10,17256 0,497331 2,997234
2,5
0,951
86
72
44
21
1,819960 10,91976 0,534691 3,247948
3
1,021
86
52
34
83
1,850204 18,50204 0,913805 6,694497
DATOS
3,5
1,038
59
37
2
Si (g/l)=
20 59
4,643603
1,912471
19,12471
Si/k 0,944938 7,287227
VR (ml)=
45
44
4
1,073
09
09
62
01
X(Pformad
o/Sinicial) 0,944938
ln (1-x) 2,899306
=
62
77
Kmax
0,944938
P/So
(g/l)=
4,307
62
Vmax=k.e
84,19014
t=
=
0,3728
68

Para grupo A3
Absorvanci
Tiempo (h)
a
0
0,032
0,5
0,35
1
0,622
1,5
0,469
2
0,614
2,5
0,513
3
0,514
3,5
0,314
4
0,342

Producto
0,06048746
0,62622309
1,11012275
0,83792919
1,09589041
0,91620708
0,91798612
0,56217755
0,61199075

Producto
Real
0,06048746
1,25244618
2,22024551
3,35171678
4,38356164
5,49724248
5,50791674
5,62177548
6,11990749

ket/K

0,00906858
0,17870446
0,32380181
0,49343768
0,64813706
0,8151057
0,81670604
0,83377632
0,90845878

13,33333
Si (g/l)=
33
VR
(ml)=
15
Kmax=

4,307

Vmax=

0,3728

0,03718389
0,75009401
1,39367385
2,20766052
3,05097454
4,21132273
4,22497005
4,37557195
5,20331406

Si/K=

3,095735
62

CONCLUSIONES
El Rango de Linealidad obtenido nos permiti conocer la actividad cataltica
que tiene la enzima a diferentes concentraciones, as como la afinidad que
esta tiene por el sustrato.
Se comprob que la actividad o poder cataltico de la enzima disminuye con el
paso del tiempo de la enzima sometida al medio de reaccin.
A mayor concentracin de enzima hay mayor hidrlisis, y a mayor tiempo de
hidrlisis, hay ms conversin de sacarosa en azcares reductores.
El valor de la constante de saturacin obtenido es de 4.307 gr/L
El valor de la velocidad mxima de reaccin fue 0.37280 gr/L*min.
La inmovilizacin de enzimas reduce la carga enzimtica inicial y aumenta las
restricciones difusionales internas, mientras que a concentraciones de
sustrato elevadas permite bajar o disminuir las restricciones difusionales
externas ofrecidas por el medio.

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