3er trimestre 2002

00029

9 778411 355668

A travŽs
del microscopio

6,50 EURO
 I. TECNICAS

Sumario 4 El microscopio acústico

Calvin F. Quate

14 Microscopios con sonda de barrido

H. Kumar Wickramasinghe

24 El microscopio de efecto túnel

Gerd Binnig y Heinrich Rohrer

32 Microscopía confocal
Jeff W. Lichtman

38 Microscopios de rayos X
Malcolm R. Howells, Janos Kirz y David Sayre

46 La física de superficies
Rodolfo Miranda

56 Técnicas de microfotografía
Jearl Walker

II. OBSERVACIONES
64 Camillo Golgi y la reacción negra
Paolo Mazzarello

72 Cajal y la estructura histológica

del sistema nervioso
José M. López Piñero

80 Las primeras observaciones

Brian J. Ford

84 Representación visual de embriones humanos

Bradley R. Smith

90 Aplicaciones biológicas del microscopio de fuerzas

Carlos Bustamante y Ricardo García
 TECNICAS

MICHAEL GOODMAN
El microscopio
acústico
Este instrumento es hoy un medio de trabajo
común en distintas especialidades científicas y actividades industriales.
En este artículo de 1979 uno de sus creadores explicaba
los fundamentos en que se basa
Calvin F. Quate
L
as ondas sonoras que vibran en
la atmósfera con frecuencias
inferiores a unos 20.000 hertz
(oscilaciones por segundo) nos son
familiares como medio de comunica-
ción. Por ejemplo, las oscilaciones de
la voz humana pertenecen a este
grupo. La atmósfera no constituye
un medio favorable para la propaga-
ción de ondas acústicas de frecuen-
cias más elevadas, ultrasónicas. Estas
vibraciones inaudibles se disipan rá-
pidamente en gases tales como el aire.
Las ondas de los ultrasonidos pueden
propagarse a distancias apreciables
con moderada atenuación sólo en
líquidos y sólidos. Las ondas acústi-
cas que vibran en esos medios conden-
sados a frecuencias ultrasónicas se
emplean para la formación de imáge-
nes y no para la comunicación. Existen
dispositivos ultrasónicos basados en
la producción y detección de ondas
acústicas con frecuencias del orden
del megahertz (un millón de oscila-
ciones por segundo). Se emplean fre-
cuentemente en el estudio de objetos
submarinos y en averiguar caracte-
rísticas estructurales internas de los
órganos del cuerpo humano y de mate-
riales. Por ejemplo, un feto en el seno
de una mujer preñada puede ser exa-
minado de este modo con completa
inocuidad.
El microscopio acústico constituye
una extensión de la tecnología de for-
mación ultrasónica de imágenes. Sus
ondas ultrasónicas tienen frecuen-
cias próximas a un gigahertz (mil
millones de oscilaciones por segundo),
cerca de mil veces mayores que las
frecuencias típicas de los sistemas
macroscópicos de formación ultrasó-
nica de imágenes. En términos de las
longitudes de onda la comparación
es ilustrativa. Se miden en metros las
4 TEMAS 29
longitudes de onda de los sonidos pro-
ducidos por la voz humana, en milí-
metros las de los ultrasonidos emplea-
dos en los dispositivos macroscópicos
de formación de imágenes y en micro-
metros las de la mayoría de los micros-
copios acústicos perfeccionados. Es
decir, las ondas empleadas en estos
nuevos dispositivos de formación de
imágenes son de longitud compara-
ble con la de las ondas electromagné-
ticas de la luz visible.
No hay que sorprenderse, por tanto,
de que el microscopio acústico empiece
a proporcionar imágenes con una reso-
lución que no desdice de la que tie-
nen las imágenes conseguidas con el
microscopio óptico ordinario. Lo que
puede resultar extraño es que los que
trabajan en este campo se esfuercen,
no en igualar la resolución del micros-
copio óptico, sino en rebasarla. Pero
no se trata solamente de la resolu-
ción. El origen del contraste en los
sistemas acústicos es completamente
distinto del de los ópticos. Ciertas
propiedades, hasta ahora inaccesi-
bles, de los objetos microscópicos em-
piezan a entrar en consideración en
las imágenes acústicas. Se confía en
que el microscopio acústico encontra-
rá su lugar al lado del microscopio
óptico, el microscopio electrónico y el
futuro microscopio de rayos X, for-
mando una línea de dispositivos com-
plementarios para explorar el mundo
de las cosas muy pequeñas.
S. Y. Sokolov, de la Unión Soviética,
tuvo en el decenio de 1920 la idea de
utilizar ondas acústicas del orden
de los gigahertz en un sistema de mi-
croscopía. Pero la tecnología necesa-
ria para producir tales ondas no es-
tuvo disponible hasta comienzos del
decenio de 1960. Gran parte de los
primeros trabajos sobre dispositivos
ultrasónicos de muy alta frecuencia
fueron realizados por Hans E. Böm-
mel y Klaus Dransfeld en los Labora-
torios Bell. A finales de ese decenio,
James S. Imai e Isadore Rudnick, de
la Universidad de California en Los
Angeles, se las ingeniaron para pro-
ducir en helio líquido ondas acústi-
cas de una longitud de onda de sólo
0,2 micrometros.
A hora, a finales del decenio de
1970, varios grupos, con técnicas
algo diferentes, están empeñados en
la tarea de intentar desarrollar un sis-
tema práctico de microscopía acústica.
En las primeras fases del esfuerzo
tuvieron un papel destacado los in-
vestigadores de la Zenith Radio Cor-
poration, dirigidos por Adrianus Kor-
pel y Lawrence W. Kessler. (Este último
ha pasado a la Sonoscan, Inc., que
fabrica una versión de barrido con láser
del microscopio acústico.) Nuestro
grupo de la Universidad de Stanford
ha perseguido el objetivo activamente
durante cinco años. Hemos conseguido
reducir la longitud de onda operativa
en nuestro dispositivo de cinco micro-
metros a medio micrometro.
Mientras tanto, ¿qué es lo que he-
mos descubierto? Hemos aprendido
que un microscopio acústico puede
construirse con un elemento focali-
zador más simple que el constituido
por las lentes del microscopio óptico
ordinario. Hemos encontrado que la
resolución de un microscopio acús-
tico sólo está limitada por la longi-
tud de onda con la que opera y que
las aberraciones no desempeñan un
papel importante. Hemos demostrado
que los detalles en las micrografías
acústicas pueden ser tan finos como
en las micrografías ópticas. Hemos
confirmado que es fácil medir el espe-
 sor de películas de semiconductores
y metales con las ondas acústicas y
que, por tanto, es posible estudiar la
adhesión de tales películas a un subs-
trato. En el caso de muestras bioló-
gicas, hemos conseguido imágenes
con un elevado contraste de varios teji-
dos sin necesidad de una tinción pre-
via. Confiamos en que esta cualidad
DANIEL RUGAR, UNIVERSIDAD DE STANFORD
del microscopio acústico permitirá
que pronto pueda emplearse para
lograr nueva información de las célu-
las vivas.
¿Cómo se forman las imágenes en
un microscopio acústico? Al igual que
en el microscopio óptico, la base resi-
de en el cambio de la velocidad de
propagación de las ondas al atrave-
sar la superficie de separación exis-
tente entre dos medios materiales
distintos. En las ondas acústicas este
cambio es mucho mayor que el que
presentan las ondas luminosas. El
índice de refracción, que mide las
velocidades relativas de la luz entre
dos medios, nunca es mayor de 1,9 y
usualmente no vale más de 1,5. Por

1. MICROGRAFIA ACUSTICA de un conjunto de cromosomas huma-
nos, obtenida por el autor y sus colaboradores, en el departamento
de física aplicada de la Universidad de Stanford, como prueba del
grado de resolución alcanzado por el nuevo dispositivo ultrasónico
de formación de imágenes. Con este fin, tanto el portaobjetos con la
muestra como la lente del instrumento estaban sumergidos en argón
líquido. Se mantenían a una temperatura de 85 grados kelvin (menos
188 grados Celsius) rodeando el recipiente que contenía el argón lí-
quido de un baño con nitrógeno líquido. Se analizaron electrónica-
mente las señales ultrasonoras registradas para obtener la imagen
de los cromosomas en una pantalla de televisor. Las líneas vertica-
les que aparecen en la fotografía obedecen a defectos en el proce-
so de barrido. El frotis de cromosomas fue preparado en el laborato-
rio de Howard M. Cann en la facultad de medicina de la Universidad
de Stanford. Se eliminó el recubrimiento de proteína de los cromo-
somas y fueron teñidos de la forma habitual para poner de manifies-
to en las micrografías ópticas su estructura en bandas. El aumento
es de 3500 diámetros.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 5

DAN TODD el contrario, la velocidad de las ondas
RAYO sonoras puede cambiar en un factor
SONORO diez al atravesar una interfaz (super-
ficie de separación) sólido-líquido ade-
cuada.
RAYO El elemento focalizador primario
LENTE R
SONORO del microscopio acústico, desarrollado
RAYO por nuestro grupo en Stanford, con-
LUMINOSO RAYO siste en una interfaz esférica cón-
LUMINOSO cava, de unos 40 micrometros de radio,
formada entre zafiro y agua. En tal
superficie de separación los rayos
sonoros se desvían fuertemente ha-
2. TANTO LOS RAYOS SONOROS COMO LOS RAYOS LUMINOSOS se refractan, o desvían, al cia dentro al entrar en el líquido. En
atravesar la superficie de separación entre materiales en los que las velocidades de propa- nuestro sistema todos los rayos con-
gación de las ondas son distintas. El ángulo de desviación es mucho mayor en los rayos so- vergen en un estrecho “embudo” pró-
noros (diagrama de la izquierda). La presencia de una concavidad esférica en el material de ximo al centro de curvatura de la es-
mayor índice de refracción (esto es, en el que las ondas se propagan más deprisa) servirá pa- fera. En dicha interfaz el cambio en
ra localizar ambas clases de rayos (diagrama de la derecha). En esta situación, los rayos so- la velocidad de la luz sería pequeño
noros convergen más rápidamente que los rayos luminosos y en consecuencia la aberración y el ángulo de convergencia del haz
resultante en la imagen obtenida es menor. Para las ondas sonoras, la distancia local es 1,3 localizado sólo sería ligero. La aberra-
veces mayor que el radio de curvatura de la lente (simbolizado con la letra R). Para los rayos ción resultante debería eliminarse
luminosos, la distancia focal es unas tres veces mayor que el radio de curvatura de la lente. recurriendo a sistemas de lentes con
múltiples superficies refringentes.
En el caso acústico, una lente esfé-
DAN TODD

rica con una única superficie refrin-

gente resulta casi la hipótesis ideal.
ZAFIRO AGUA La fuerte convergencia hace que la
aberración sea mínima. Además, el
recubrimiento antirreflector, seme-
RADIO DE jante al comúnmente empleado en
CURVATURA las lentes ópticas, puede aplicarse al
DE LA LENTE zafiro para reducir la reflexión de las
(40 MICROMETROS) DISTANCIA FOCAL ondas acústicas en la interfaz. Sin
(40 MICROMETROS) embargo, las reflexiones residuales
TRANSDUCTOR no pueden eliminarse completamente
PIEZOELECTRICO y constituyen una pequeña fuente de
(OXIDO DE CINC) interferencia. Por fortuna, podemos
CAPAS distinguir las diferentes reflexiones
DESVIADORAS con ayuda de una señal de prueba
(ORO) formada por un pulso momentáneo de
ultrasonido. La parte del pulso que
viaja a través del líquido se reflejará
a partir del objeto y llegará al recep-
ALAMBRE LENTE
tor más tarde que la parte reflejada
DESVIADOR por la lente. Este procedimiento per-
(ORO)
mite identificar la causa de las ondas
PLANO FOCAL reflejadas, pues quedan registradas
LIMITADOR en distintos momentos.
DE RAYOS CAPA
(DIOXIDO
DE SILICIO)
ANTIRREFLECTORA
(VIDRIO) L as principales componentes del
sistema acústico son bastante
simples, si se comparan con el prodi-
gioso despliegue de equipo electró-
nico necesario para producir las seña-
les y prepararlas para conseguir la
3. LENTE ACUSTICA diseñada por el grupo del autor en Stanford. Consiste en una superficie imagen final. Se ha diseñado nues-
cóncava y esférica de separación entre zafiro y agua formada en la punta biselada de una tro sistema de modo que podamos lle-
corta varilla de unos 6 milímetros de diámetro (izquierda). La película piezoeléctrica que se var las señales hacia dentro y hacia
encuentra depositada en la superficie posterior de la lente de zafiro convierte las señales fuera de la celda acústica tan pronto
eléctricas en otras acústicas durante el proceso de formación de la imagen. La misma pelí- como sea posible. La razón de esta
cula sirve a continuación para convertir las señales acústicas en señales eléctricas en la fa- manera de proceder reside simple-
se siguiente de lectura. La parte ampliada de la derecha muestra el perfil aproximado del haz mente en que, en la actualidad, las
de ultrasonidos localizado en el agua. Las líneas blancas paralelas en ambos esquemas ilus- señales eléctricas son más fáciles de
trativos son los frentes de onda acústicos. La superficie lisa de la varilla de zafiro se ha he- manipular que las acústicas.
cho rugosa para dispersar las ondas espurias. Además, se aplica usualmente un elemento El primer paso en el proceso de la
antirreflector de vidrio a la superficie frontal de la lente al objeto de reducir las reflexiones obtención de la imagen consiste en
acústicas internas. convertir una señal eléctrica en otra

6 TEMAS 29
acústica por medio de una película
piezoeléctrica depositada en la su-
perficie posterior de la lente de zafi-
ro. La película está formada por nu-
merosos cristalitos, cada uno de los
cuales tiene una dirección preferida:
su eje longitudinal, en general, es
perpendicular a la superficie del subs-
trato en el que está depositado. Un
campo eléctrico alterno aplicado a lo
largo de dicho eje comprimirá y ex-
pansionará el cristal según vaya va-
riando la polaridad del campo. Desde
hace años, se dispone de películas
piezoeléctricas, las cuales forman ya
parte de muchos dispositivos acús-
ticos comerciales. La película pie-
zoeléctrica de óxido de cinc que no-
sotros empleamos permite convertir
la energía electromagnética en ener-
gía acústica o mecánica con un ren-
dimiento que se aproxima al 50 por
ciento.
La lente acústica localiza el haz de
ultrasonidos, producido de este modo,
sobre una zona muy pequeña en el
plano del objeto. La imagen se con-
sigue moviendo dicha zona a lo largo
del plano objeto, punto por punto y
línea a línea, realizando un barrido.
El procedimiento es análogo al de una
cámara de televisión donde, luego de
enfocar la imagen sobre una superfi-
cie fotosensible, se registra rastrean-
do la superficie con un haz de electro-
nes. Sin embargo, en el microscopio
acústico el barrido se realiza mecá-
nicamente y su velocidad es mucho
menor. Necesita varios segundos pa-
ra completar el campo, lo cual hace
necesario almacenar durante algún
tiempo las señales registradas antes
de que puedan ser utilizadas para
formar una imagen del objeto.
Las señales reflejadas por el objeto
y guardadas en la memoria electróni-
ca terminan amplificándose y modu-
lan la intensidad del haz de electro-
nes en un receptor usual de televisión.
La imagen se consigue rastreando el
haz de electrones a través de la pan-
talla en sincronía con el movimiento
realizado por el haz acústico al seguir
el objeto (o, en nuestro modelo actual,
con el realizado por el objeto respecto
al punto focal del haz acústico). Se
mantiene una correspondencia pun-
to por punto entre las posiciones del
impacto del haz electrónico sobre el
monitor de televisión y la posición
del impacto sobre el objeto del haz
acústico. Si el impacto del haz electró-
nico se traslada un centímetro sobre
la pantalla del televisor mientras el
impacto del haz acústico se traslada
sobre el objeto diez micrometros, la
imagen resultante corresponderá a un
aumento de mil diámetros. Puede
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
ajustarse fácilmente la razón entre sado por un motor de corriente con-
estas traslaciones y con ello la ampli- tinua, es mucho más lento que el
ficación de las imágenes puede variar movimiento horizontal.
de cien a varios millares. Los visitantes que acuden a nues-
En nuestro sistema actual, el barri- tro laboratorio suelen plantear dos
do mecánico se consigue de la manera cuestiones: 1.a ¿No introduce, el movi-
siguiente. Se fija la muestra a un miento relativo entre la muestra y la
disco circular unido a un soporte que lente, vibraciones perturbadoras en
es impulsado horizontalmente por un la parte sólida del aparato o bien tur-
altavoz. El altavoz vibra con una fre- bulencia en el líquido? 2.a ¿Por qué
cuencia de 60 hertz y origina corri- no se sustituye el método de barrido
mientos horizontales de la muestra mecánico por otro electrónico, que
comprendidos entre 100 y 200 micro- eliminaría la necesidad de mover
metros. El conjunto puede trasla- todos los componentes y así podría ser
darse en dirección vertical, pues el más rápido?
altavoz va montado sobre guías ver- Respecto a la primera cuestión, al-
ticales. El movimiento vertical, impul- gunas veces se presentan vibraciones
MOTOR DE CONTINUA
(MUEVE SEGUN EJE Y)
SOPORTE
MOVIL
MOVI-
TORNILLO MIENTO
MICROMETRICO SEGUN
EJE Y
MOVIMIENTO
SEGUN EJE X
ALTAVOZ
(MUEVE SEGUN
EJE X) MUESTRA
PLACA
BASE GOTITA
DE AGUA
SOPORTE
DE LA MUESTRA
CABLE COAXIAL BLOQUE
DE LA LENTE
ENTRADA SALIDA
DE SEÑALES DE SEÑALES
DAN TODD
4. BARRIDO MECANICO de la muestra en dos dimensiones. Se consigue en la versión actual
del microscopio acústico de Stanford por medio del aparato representado. El disco circular
que sostiene la muestra se desplaza horizontalmente entre 100 y 200 micrometros por un al-
tavoz que vibra con una frecuencia de 60 hertz (oscilaciones por segundo). El corrimiento ver-
tical del conjunto muestra-altavoz está gobernado por un motor eléctrico de corriente conti-
nua. El movimiento vertical es mucho más lento que el horizontal. Las señales acústicas
reflejadas por la muestra se analizan electrónicamente y se destinan a modular la intensidad
del haz electrónico de un televisor. La imagen se forma rastreando el haz electrónico sobre la
pantalla sincrónicamente con el movimiento de la muestra relativo al punto focal del haz acús-
tico. La razón entre corrimientos de los dos haces da el aumento de la imagen final.
7
 en la muestra, pero son muy peque- nemos el instrumento y observemos ta va ligada a las posibilidades de
ñas, probablemente debido a que los detalles más finos, estos factores invención. Apreciamos ciertamente
modos de resonancia mecánica del podrán resultar importantes, pero no las ventajas potenciales del barrido
objeto son de frecuencias muy supe- es ése el caso por ahora. Las imáge- electrónico, pero todavía no hemos
riores a los 60 hertz del proceso de nes conseguidas con el instrumento logrado dar con un método no mecá-
barrido. En cuanto a turbulencia en están bien enfocadas con bordes níti- nico eficaz de barrido con un haz bien
el líquido, hasta el momento no se ha dos en todo el campo de visión. enfocado.
observado. A medida que perfeccio- La respuesta a la segunda pregun-

E l examen de las superficies sóli-

das con este instrumento se rea-
liza exponiéndolas a las ondas esfé-
a b
ricas convergentes que proceden de
ONDA INCIDENTE
la lente acústica y luego registrando
las ondas divergentes reflejadas con
ayuda de la misma lente que ahora
actúa en sentido inverso. Las imá-
genes generadas por las ondas refle-
INFERIOR AL jadas muestran propiedades espe-
ANGULO CRITICO ciales. Conviene entender la razón
física de las diferencias entre estas
imágenes y las producidas por sis-
temas ópticos. Debido a que es más
fácil imaginarse la situación en el
caso de ondas planas, describiremos
las diferencias esenciales para éstas
y después discutiremos el proceso
general para ondas esféricas, con-
vergentes y divergentes.
ONDA REFLEJADA
Al incidir una onda plana perpen-
dicularmente sobre una superficie
REFLECTOR ELASTICO elástica plana se reflejará según la
dirección opuesta con una fase idén-
c d tica a la de la onda incidente. Sin em-
bargo, cuando la onda incidente avan-
za en una dirección inclinada respecto
a la normal puede excitarse una nueva
ONDA INTERNAMENTE REFLEJADA

onda, que aparece pegada a la super-

SUPERIOR AL ficie. Si esto ocurre, la onda reflejada
ANGULO CRITICO vuelve con un ángulo igual al de inci-
ANGULO CRITICO dencia, pero con una fase que es dis-
tinta de la correspondiente a la onda
incidente. Este fenómeno, denomina-
do reflexión total interna, ha sido in-
tensamente estudiado en las ondas
luminosas que inciden en superficies
transparentes por P. K. Tien, de los
Laboratorios Bell, y otros autores.
Forma la base de la nueva tecnolo-
gía de la óptica de ondas guiadas [véa-
se “La óptica de ondas guiadas”, por
Amnon Yariv; INVESTIGACIÓN Y CIEN-
DAN TODD

CIA , marzo, 1979].

5. ANGULO CRITICO para la reflexión interna. Es un concepto importante para comprender

el fundamento físico de las propiedades especiales de las imágenes conseguidas en mi-
E n los sistemas acústicos estas
ondas especiales viajan a lo lar-
go de las superficies libres y de las
croscopía acústica. Puede hacerse visible en términos esquemáticos con ayuda de la ilus- interfaces. Pueden ser excitadas ajus-
tración, en la que tanto las ondas incidentes como las reflejadas se han representado como tando la dirección de las ondas in-
si fueran ondas planas. Cuando una de tales ondas incide perpendicularmente (a) será re- cidentes con el valor del ángulo crí-
flejada en dirección opuesta con una fase idéntica a la de la onda incidente. Los frentes de tico. Para ángulos menores o mayores
las ondas planas se han representado alternando líneas blancas de trazo seguido y de trazo que el crítico, la onda se refleja total-
interrumpido. Los trazos seguidos designan crestas de las ondas; los interrumpidos, valles. mente en fase con la incidente y no
Cuando la dirección de la onda plana incidente se inclina respecto a la normal formando un se transmite energía vibratoria hacia
cierto ángulo (c), a lo largo de la superficie del material reflector se excita una onda refleja- el interior del sólido. Para ondas sono-
da internamente y se altera la fase de la onda reflejada. (Se ha supuesto que el salto en la ras incidentes en una superficie de
fase fue de media oscilación.) Si los ángulos de inclinación son menores o mayores que el separación líquido-sólido, el ángulo
crítico (b, d) las ondas se reflejan en fase. En microscopía acústica las ondas reflejadas in- crítico puede llegar a ser de sólo diez
ternamente viajan por todas las superficies. grados.

8 TEMAS 29
 K. W. Andrews y R. I. Keightly, de
la British Steel Corporation, han
empleado la reflexión total interna
de ondas sonoras de alta frecuencia
para examinar diversos materiales
sólidos. Es sabido que las propieda-
des elásticas de los materiales cam-
bian al aumentar los esfuerzos que
soportan, y sería de esperar que dicho
cambio afectase a la velocidad de las
ondas sonoras que se propagan a lo
largo de la superficie del material.
Andrews y Keightly han demostrado
que el ángulo crítico para la refle-
xión total interna varía no sólo con
el esfuerzo aplicado, sino también
con la composición del material. En
su aparato se determinan los ángu-
los críticos exponiendo la superficie
a un haz de ondas sonoras planas,
inclinado varios grados respecto a la
posición de incidencia perpendicu-
lar. El transductor piezoeléctrico, pa-
ra la recepción de las señales re-
flejadas, está también inclinado los
mismos grados respecto a la perpen-
dicular aunque en dirección opuesta.

a ZAFIRO AGUA b

ON
DA
IN
CI
DE
NT
E

DA DA
E JA E JA
FL FL
RE RE
DA DA
ON ON

REFLECTOR
ELASTICAMENTE
REFLECTOR IDEAL DURO

c d

DA DA
E JA E JA
FL FL
RE RE
A A
OND OND
REFLECTOR
ELASTICAMENTE
REFLECTOR DURO CON UNA
DAN TODD

ELASTICAMENTE CAPA SUPERPUESTA

BLANDO UNICA

6. ONDAS ESFERICAS CONVERGENTES de ultrasonidos formadas por
la lente zafiro-agua en el microscopio acústico. Se han representa-
do después de ser reflejadas por cuatro superficies reflectoras dis-
tintas. En el caso de un reflector ideal (a) los frentes de onda refleja-
dos divergentes coinciden exactamente con los frentes de onda que
inciden convergiendo. Las otras tres superficies reflejan en fase las
ondas incidentes, excepto en el sector de la onda próximo al ángulo
crítico. Debido a la reflexión total interna, en aquel sector las ondas
salen reflejadas con la fase opuesta. En el caso de un material elás-
ticamente duro (b), la transición de ciclo completo en el ángulo críti-
co es abrupta y los frentes de onda reflejados permanecen aproxi-
madamente esféricos. En un material elásticamente blando (c), la
transición es gradual y los frentes de onda reflejados muestran dis-
torsión. En un sustrato con una única capa superpuesta (d), la dis-
torsión es aún mayor. Las ondas reflejadas se comportan de un mo-
do más complicado que el expuesto.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 9

 Con este sistema experimental pue-
den examinarse las faltas de homoge-
neidad en las propiedades elásticas
de los materiales, que resultan, por
ejemplo, de los cambios de composi-
ción en las aleaciones.
ABDULLAH ATALAR, UNIVERSIDAD DE STANFORD
7. AMPLITUD de la señal reflejada proce-
dente del microscopio acústico. Está mos-
trada sobre la pantalla de un osciloscopio en
función del espaciado entre la lente y la su-
perficie reflectora. En el pico de cada una de
estas trazas el reflector está colocado en el
punto focal de la lente. A la izquierda del pi-
co, el reflector queda expuesto a un haz con-
vergente. A la derecha está expuesto a un
haz divergente. Las diferencias de forma de
las porciones oscilantes de estas trazas pro-
ceden de diferencias de las propiedades
elásticas de las superficies reflectoras. La
traza superior corresponde a una superficie
de silicio puro. La central pertenece a una
superficie de silicio cubierta con una capa
de aluminio de un micrometro. La traza infe-
rior está producida por una superficie de si-
licio con una capa de dos micrometros de
aluminio. De este modo, pueden detectarse
hasta cambios extraordinariamente peque-
ños en el espesor.
10
Como ya hemos dicho, en nuestro
microscopio acústico las ondas ultra-
sonoras incidentes son esféricas y
convergentes y el contraste que apa-
rece en las imágenes procede de los
complejos detalles del proceso de refle-
xión en ondas esféricas. En términos
simples, puede decirse que los fren-
tes de onda se reflejan en fase excepto
en el sector de la onda próximo al
ángulo crítico. A causa de la refle-
xión total interna, este sector se re-
fleja con una fase diferente. Las con-
secuencias de este sutil corrimiento
de fase son decisivas.
Consideremos los frentes de onda
después de experimentar la reflexión.
Supongamos que en la transición en
fase cerca del ángulo crítico para
reflectores elásticos los frentes de
onda reflejados se trasladen toda una
longitud de onda, es decir, de una cres-
ta a la siguiente. Para un material
duro, el zafiro, por ejemplo, la tran-
sición será brusca y los frentes de
onda reflejados permanecerán apro-
ximadamente esféricos. En un ma-
terial blando la transición será gra-
dual y los frentes de la onda reflejada
resultarán distorsionados. Mostra-
rán poca relación con las ondas es-
féricas originales. En el caso de un
substrato con una sola capa super-
puesta hay dos interfaces reflectoras
y dos ángulos críticos, el primero
determinado por el material de la ca-
pa superpuesta y el segundo influen-
ciado por el material del substrato.
Ya que los frentes de onda reflejada
deben trasladarse dos longitudes de
onda sucesivas, la distorsión es aún
mayor que con una sola superficie
blanda.
(Para mayor claridad, se ha sim-
plificado la forma de onda en la figu-
ra 6. En realidad, la amplitud de la
onda reflejada nunca es igual a la
amplitud de la onda incidente y, en
consecuencia, el comportamiento real
de las ondas se vuelve más compli-
cado. Aunque no hemos medido la
forma real de las ondas, estamos se-
guros de que este modelo ofrece los
rasgos esenciales de la cuestión.)
¿C ómo detectamos los frentes de
onda distorsionados? Lo hace
el transductor piezoeléctrico. Un
transductor piezoeléctrico de pelícu-
la delgada, con una dimensión trans-
versal que sea mucho mayor que la
longitud de onda, actúa como un de-
tector sensible a la fase. Su respuesta
será máxima para ondas planas con
frentes de onda paralelos al plano del
transductor. En esta situación toda
el área del transductor será excitada
en fase. Si los frentes de onda inci-
den oblicuamente, algunas regiones
de la película transductora estarán
expuestas a componentes de la onda
de fase variable que se anularán con
otras. La lente convertirá las ondas
esféricas reflejadas en ondas planas,
si su centro de curvatura coincide con
el punto local de la lente. Si los fren-
tes de onda están distorsionados, las
ondas planas que llegan al trans-
ductor también lo estarán. Cualquier
variación en la forma de los frentes
de onda alterará la respuesta del
transductor. Es esta variación en la
señal detectada, debida a las faltas
de homogeneidad en las propiedades
elásticas del objeto, la que constituye
la causa del contraste en las imáge-
nes acústicas.
Entre la lente y el punto focal, como
ya hemos indicado, el haz acústico
incidente es esférico y convergente,
mientras más allá de este punto los
frentes de onda son esféricos y diver-
gentes. La curvatura del frente de
onda incidente en la superficie del
objeto reflector cambia al variar el
espaciado entre la lente y el objeto.
Una onda convergente será reflejada
con los cambios de fase que hemos des-
crito. En el punto local, la onda inci-
dente no será ni convergente ni diver-
gente. Más allá del punto focal, la
onda divergente tendrá un carácter
diferente de reflexión. Las trazas osci-
loscópicas procedentes de la respuesta
del transductor, en función del espa-
ciado entre la lente y el objeto reflec-
tor, son reveladoras a este respecto.
Abdullah Atalar, un investigador de
nuestro grupo, ha mostrado que mate-
riales con diferentes constantes elás-
ticas, por ejemplo, producirán trazas
osciloscópicas notablemente dife-
rentes. La diferencia en el ángulo crí-
tico para la reflexión total interna
origina la diferencia en las porciones
oscilantes de dichas trazas.
La respuesta del transductor para
un substrato con una única capa su-
perpuesta produce en el osciloscopio
una traza particularmente intere-
sante. Por ejemplo, hay un gran cam-
bio en la forma de la traza corres-
pondiente a una superficie de silicio
puro cuando se deposita sobre ella
una capa de aluminio de un micro-
metro. El cambio es todavía mayor si
la capa depositada tiene dos micro-
metros de espesor (véase la figura 7).
En este ejemplo hay un espaciado
lente-objeto correspondiente a un pico
en la respuesta para la capa de dos
micrometros y, en cambio, se pre-
senta un valle en la respuesta para
una capa de un micrometro. Con este
método son naturalmente fáciles de
acusar pequeños cambios en el espe-
TEMAS 29
CALVIN F. QUATE, UNIVERSIDAD DE STANFORD

8. UNA SUPERFICIE DE ACERO, tal y como aparece en una micro- yor contraste entre los granos cristalinos individuales en la imagen
grafía acústica (derecha). Se obtiene una imagen completamente acústica debe ser atribuido a ligeras variaciones en las propieda-
diferente de la que produce un instrumento óptico (izquierda). El ma- des elásticas de los granos.
CALVIN F. QUATE, UNIVERSIDAD DE STANFORD

9. UNA ALEACION DE COBALTO Y TITANIO, tal y como aparece en (derecha). Las formas manchadas en la imagen acústica corres-
estas micrografías contrapuestas. Una se ha tomado con el mi- ponden a regiones en las que la aleación tiene una composición
croscopio óptico (izquierda) y la otra con el microscopio acústico diferente.

sor o en las propiedades elásticas de
una película delgada. Por ejemplo,
Robert G. Wilson y Rolf D. Weglein,
de los Laboratorios de Investigación
Hughes, han encontrado que el pro-
ceso acústico da lugar a notables
variaciones de contraste en imágenes
de objetos con múltiples capas, tales
como los circuitos microelectrónicos.
Como hemos mencionado, la lon-
gitud de onda con la que opera el
mejor microscopio acústico es apro-
ximadamente de un micrometro, que
no difiere mucho de las longitudes de
onda de la luz visible. Hasta cierto
punto puede decirse que se trata de
una mera coincidencia. Si la longitud
de onda límite para el sistema sono-
ro hubiera sido de diez micrometros,
el microscopio acústico hubiera lla-
mado poco la atención excepto para
aplicaciones especiales. Si la longi-
tud de onda límite hubiera sido de una
décima de micrometro, la microsco-
pía acústica habría sido preponde-
rante. La importancia de un micros-
copio, por encima de todos los demás
factores, queda definida por la reso-
lución límite. En el microscopio acús-
tico, ¿qué es lo que determina dicho
límite? Se trata de la absorción del
sonido a lo largo del camino acústico
seguido en el líquido. En alguna forma
hay que emplear líquidos si el objeto
debe moverse respecto a la lente.
Aunque los líquidos hacen posible el
uso de longitudes de onda cortas, ab-
sorben energía. Las moléculas de mu-
chos líquidos muestran modos de vi-
bración que son excitados por las
ondas de alta frecuencia. La absor-
ción para tales líquidos es tan intensa
que su empleo está excluido.
Con mucho, el líquido preferido ha
sido el agua. Por fortuna, el agua es
compatible con las muestras biológi-
cas vivas. La velocidad de las ondas
sonoras en el agua es de unos 1500 me-
tros por segundo y la absorción es
menor que en la mayoría de los demás
líquidos, aunque aumenta con las fre-
cuencias elevadas.
El argón es otro líquido interesante
para la microscopía acústica. Sus pro-
piedades acústicas son semejantes a
las del agua, excepto en cuanto a la
velocidad del sonido, pues el argón
tiene una velocidad que es sólo el 60
por ciento de la del agua. El argón
tiene otro inconveniente: sólo existe
en estado líquido en un estrecho mar-
gen de temperaturas en torno a los
85 grados kelvin (menos 188 grados
Celsius). Por tanto, es un líquido crio-
génico y hay que diseñar un equipo
especial para los instrumentos que

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 11


10. ELEMENTOS DE CIRCUITOS MICROELECTRONICOS construidos
sobre la superficie de una pastilla de silicio. Se han reproducido tres
veces: una en forma de una micrografía óptica (izquierda) y dos en
forma de micrografías acústicas obtenidas con el objeto en diferen-
tes posiciones locales (centro y derecha). El dispositivo consta de va-
rios transistores interconectados. Las extensiones semejantes a de-
dos que conectan los transistores son tiras de películas de aluminio
CALVIN F. QUATE, UNIVERSIDAD DE STANFORD
depositadas a partir del vapor. La banda lisa que cruza la parte su-
perior de la imagen es el sustrato de silicio puro; las texturas areno-
sas están ocasionadas por capas superpuestas de silicio policrista-
lino. La inversión de contraste en las imágenes acústicas ayuda a
identificar la estructura detallada sobre la pastilla. El dispositivo fue
proporcionado por el doctor Roderick D. Davies, de la Universidad de
Stanford.

operan con tales líquidos. Así se ha
hecho para el microscopio acústico y
Daniel Rugar, otro investigador de
nuestro grupo, ha obtenido imágenes
de elevada calidad con tal sistema.
El argón líquido es también im-
portante por constituir un escalón
intermedio en el paso de agua a he-
lio líquido. La absorción del sonido
en la fase líquida del isótopo helio 4
es tan pequeña que puede conside-
rarse despreciable. La velocidad del
sonido en tal medio es la octava par-
te de la del agua. En nuestro grupo,
Joseph E. Heiserman está diseñando
un microscopio acústico que emplee
helio líquido como medio transmisor
del sonido. Tiene la esperanza de con-
seguir un poder de resolución supe-
rior al del microscopio óptico.
gados a emplear cierto tiempo en
explicar los detalles sobre su modo
de operar.
Pero la esencia de cualquier pro-
grama de microscopía estriba en con-
seguir las imágenes. Creemos que las
acústicas que acompañan el presente
artículo pueden competir con sus opo-
nentes ópticas. Las imágenes son de
tres clases: de materiales, de circui-
tos de microelectrónica y de células
vivas. El elemento común es el tama-
ño: todos los objetos tienen detalles
cuyas dimensiones se miden en micro-
metros.
A simple vista, metales como el
acero parecen ser uniformes, pero en
realidad tienen estructuras muy com-
plejas, que consisten en granos crista-
linos individuales cementados conjun-
tamente a lo largo de sus bordes. La
ticidad, divergencia que constituye la
causa del contraste en la imagen acús-
tica (véase la figura 9). Las propie-
dades de estas aleaciones dependen
grandemente del tamaño y la distri-
bución de sus fases.
La circuitería microelectrónica
constituye otra buena fuente de ob-
jetos para la micrografía acústica.
Los detalles estructurales de tales
dispositivos a menudo aparecen con
mejor contraste que en las micro-
grafías ópticas, que se ven más uni-
formes (véase la figura 10). Además,
con el instrumento acústico se pueden
obtener varias imágenes diferentes
del mismo objeto, cada una corres-
pondiente a un espaciado distinto
entre el objeto y la lente. Cada una
de dichas imágenes proporciona un
nuevo nivel de detalle. En nuestra

T oda esta información de base cons-

tituye el prólogo de las imágenes
conseguidas. En el pasado, a los visi-
tantes a nuestro laboratorio les eran
mostradas, en primer lugar, las imá-
genes y entonces se les preguntaba
si deseaban ver el instrumento. Esta
manera de proceder nos ahorraba
mucho tiempo. En aquella época las
micrografías acústicas poseían una
calidad inferior a la de las microgra-
fías ópticas y eran examinadas como
una mera curiosidad. Los visitantes
rara vez pedían darse una vuelta por
el laboratorio y ver el instrumento en
funcionamiento. Esto ya no ocurre.
La mejora en calidad de las imáge-
nes ha producido un intenso interés
por el instrumento y nos vemos obli-
micrografía acústica de una superficie
de acero parece completamente dis-
tinta de su oponente óptica (véase la
figura 8). El mayor contraste en la
imagen acústica da una mejor idea
de la orientación relativa de los cris-
tales en la superficie. En nuestro caso,
la superficie ha sido pulida y atacada
de manera que los límites de grano
parecen limpios en la micrografía
óptica, pero este paso no es necesa-
rio con el sistema acústico.
Las aleaciones presentan otra clase
de falta de homogeneidad. En una
aleación de cobalto y titanio, por ejem-
plo, la mezcla puede condensarse en
varias fases, cada una con una pro-
porción entre cobalto y titanio dis-
tinta. Las fases difieren en su elas-
investigación dicha información “en
profundidad” ha motivado un inte-
rés más destacado que cualquier otra
característica.
En el mundo biológico existen mu-
chas estructuras celulares en la es-
cala de los micrometros. De una ma-
nera rutinaria se visualizan con el
microscopio óptico, pero no sin di-
ficultad. A menudo se presenta una
falta de contraste visible. El proble-
ma reside en que las estructuras de
las células son casi completamente
transparentes: sólo absorben una
minúscula parte de luz. Se han rea-
lizado extraordinarios esfuerzos pa-
ra compensar tal deficiencia y aumen-
tar el contraste. El método usual es
el del teñido selectivo de las células.

12 TEMAS 29

11. CELULA AISLADA. Se trata de un fibroblasto obtenido del tejido
conjuntivo de un embrión de pollo. Se ha representado mediante su
imagen óptica (izquierda) y la correspondiente imagen acústica (de-
recha). La célula se hizo crecer sobre un portaobjetos de vidrio con
colágeno y fue fijada con metanol por Randal N. Johnston en Stan-
ford. Ambas micrografías revelan la red de fibras internas que afec-
CALVIN F. QUATE, UNIVERSIDAD DE STANFORD
tan a toda la célula. El contraste en la imagen óptica se obtuvo con
una técnica de tinción selectiva. El contraste en la imagen acústi-
ca procede de variaciones en las propiedades elásticas de las es-
tructuras en la célula. El que la técnica acústica no requiera tinción
sugiere que podemos llegar a visualizar tales estructuras en célu-
las vivas.

Constituye un arte altamente de-
sarrollado y añade color a las imá-
genes, pero requiere tiempo y no pue-
de ser aplicado a las células vivas. Las
técnicas ópticas asociadas con la mi-
croscopía de contraste de fase y la
microscopía de luz polarizada per-
miten introducir cambios sutiles pa-
ra aumentar el contraste, pero toda-
vía queda campo para introducir
nuevas mejoras.
Al emprender esta parte de la in-
vestigación, nuestra ignorancia en-
tonces en las cuestiones biológicas
quedará ilustrada con una anécdota.
Cuando por primera vez pregunta-
mos la manera de obtener glóbulos
blancos de la sangre, en un laborato-
rio biológico de Stanford se nos pidió
que dijéramos cuántos glóbulos deseá-
bamos. Ya que queríamos obtener
unas pocas imágenes, contestamos
que necesitábamos diez glóbulos. Esta
respuesta sólo podía proceder de un
profano en biología. Se nos explicó
que el número mínimo de glóbulos que
podía aislarse era el de un millón, y
todos cabían en un simple portaobje-
tos. En muchos casos sería deseable
estudiar el conjunto de estos glóbu-
los, pero no es fácil. El coste de la
película fotográfica necesaria para
registrar las imágenes de todos estos
glóbulos sería exagerado. En los labo-
ratorios de biología es corriente re-
gistrar unas veinte imágenes de cada
glóbulo. Incluso si se limitase el es-
tudio a sólo el uno por ciento de los
glóbulos, el coste resultaría prohibi-
tivo. Con ayuda de circuitos especia-
les conectados a nuestro instrumento
acústico puede reducirse dicho coste.
Tales imágenes se pueden registrar
directamente en una cinta magné-
tica. El tiempo de reproducción en un
registrador magnetofónico (a una
cadencia de treinta imágenes por
segundo) para 10.000 glóbulos sería
de una hora y el coste, el de la cinta.
Hasta ahora hemos realizado mi-
crografías de tres clases principales
de entidades biológicas: linfocitos
(glóbulos blancos de la sangre), fibro-
blastos (células de soporte de los te-
jidos) y cromosomas. El hecho de
haber obtenido imágenes tan buenas
de distintas estructuras celulares sin
necesidad de emplear tinciones indica
que podremos observar algunas de
tales estructuras en el interior de las
células vivas.
L as imágenes que hemos elegido
para ilustrar el presente artícu-
lo son ideales en muchos aspectos
para la microscopía acústica y de-
muestran lo que todavía puede con-
seguirse. Son muy diferentes de las
imágenes que era obvio elegir cuando
emprendimos este tipo de estudio.
Cuando echamos una mirada hacia
atrás comprobamos que los ejemplos
primitivos, tales como la unión entre
materiales opacos, fueron simples
extensiones del trabajo que se venía
haciendo acerca de la formación acús-
tica de imágenes a frecuencias ul-
trasónicas más bajas. Los ejemplos
que mostramos no estaban incluidos
en nuestra lista original. Han evo-
lucionado de una manera tan natu-
ral como inesperada.
En una ocasión estábamos seguros
de que la reflexión de las ondas sono-
ras en una superficie de zafiro puro
sólo debía venir determinada por el
contorno del haz acústico. Se pre-
sentaría un máximo al colocar el
reflector en el punto local que iría
disminuyendo de acuerdo con el per-
fil del haz a medida que el reflector
fuera separado del plano correspon-
diente. Nada nos hacía suponer que
las propiedades elásticas de la super-
ficie reflectora quedaban codificadas
en las ondas divergentes. En otra oca-
sión, trabajamos intensamente para
perfeccionar un microscopio acústico
del tipo de transmisión. Nunca sos-
pechamos que las imágenes obteni-
das por reflexión, particularmente
de muestras biológicas blandas, pu-
dieran ser tan vigorosas.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
ACOUSTIC MICROSCOPY: BIOMEDICAL AP-
PLICATIONS. Ross A. Lemons y Calvin F.
Quate en Science, vol. 188, n.o 4191, págs.
905-911; 30 de mayo de 1975.
ACOUSTIC IMAGING: CAMERAS, MICROSCO-
PES, PHASED ARRAYS, AND HOLOGRAPHIC
SYSTEMS. Dirigido por Glen Wade. Ple-
num Press, 1976.
ACOUSTIC MICROSCOPY AT OPTICAL WA-
VELENGTHS. V. Jipson y C. F. Quate en
Applied Physics Letters, vol. 32, n.o 12,
págs. 789-791; 15 de junio de 1978.
A N A NGULAR -S PECTRUM A PPROACH TO
CONTRAST IN REFLECTION ACOUSTIC MI-
CROSCOPY. Abdullah Atalar en Journal of
Applied Physics, vol. 49, n.o 10, págs.
5130-5139; octubre 1978.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 13

Microscopios
con sonda de barrido
Estos instrumentos permiten estudiar las características
de los cuerpos con un detalle inasequible
a los microscopio ordinarios, examinándolos a muy corta
distancia con una sonda cuyo espesor puede ser de un solo átomo
H. Kumar Wickramasinghe
L
os objetos cuyas dimensiones
son menores que la longitud de
onda de la luz visible se han
convertido en un campo fundamen-
tal de la ciencia y tecnología con-
temporáneas. Los biólogos estudian
las moléculas de las proteínas o el
ADN; los especialistas en ciencia de
materiales examinan los defectos ató-
micos de los cristales; los ingenieros
microelectrónicos construyen cir-
cuitos cuyo espesor es de escasas de-
cenas de átomos. No hace muchos
años, todo ese mundo diminuto sólo
podía observarse mediante métodos
muy complejos y con frecuencia des-
tructivos, tales como la microscopía
electrónica y la difracción de rayos X,
que alejaban ese estudio fuera del
alcance de instrumentos tan sencillos
y directos como los microscopios óp-
ticos ordinarios.
Una nueva familia de microscopios
abrió este dominio a la observación
directa. Estos dispositivos permiten
cartografiar los cuerpos a escala ató-
mica y molecular, estudiar las pro-
piedades magnéticas y mecánicas de
la materia e incluso poner de mani-
fiesto las variaciones de temperatura
con una resolución mucho mayor de
la que ha sido posible hasta la actua-
lidad, sin necesidad de alterar las
muestras o exponerlas a radiaciones
perjudiciales de alta energía. Este
avance parecía imposible. Al fin y al
cabo, hace más de 100 años, el físico
y óptico alemán Ernst Abbe descri-
bió una limitación fundamental de
cualquier microscopio que se base en
la capacidad de las lentes para loca-
lizar la luz o cualquier otra radia-
ción: la difracción difumina los deta-
lles de los objetos cuyas dimensiones
sean menores que media longitud de
onda de la radiación utilizada.
14
Los nuevos microscopios —repre-
sentados por el microscopio de efecto
túnel, por el cual Gerd Binnig y
Heinrich Rohrer, del laboratorio de
investigación de la empresa IBM en
Zurich, recibieron el premio Nobel
en el año 1986— superaron con facili-
dad la barrera de Abbe. El principio
rector de su funcionamiento ya había
sido descrito en 1956. J. A. O’Keefe,
que por entonces trabajaba en el
Servicio Cartográfico del Ejército de
los Estados Unidos, diseñó un micros-
copio en el que la luz atravesaría un
pequeño orificio para incidir a conti-
nuación sobre una pantalla opaca,
iluminando un objeto situado justo
enfrente de dicha pantalla. La luz
transmitida a través de la muestra o
reflejada a través del orificio queda-
ría registrada durante un barrido de
la muestra. O’Keefe señaló que la
resolución de este “microscopio de
barrido de campo próximo” estaría
limitada únicamente por el tamaño
del orificio y no por la longitud de
onda de la luz. En principio, este dis-
positivo permitiría obtener imáge-
nes de alta resolución, es decir, imá-
genes con detalles de tamaño mucho
menor que la mitad de una longitud
de onda.
O’Keefe era consciente de que no
existía la técnica necesaria para fi-
jar la posición de un objeto o moverlo
con la precisión requerida. Sin em-
bargo, en el año 1972, Eric Ash, del
University College de Londres, adoptó
la estrategia de O’Keefe para supe-
rar la barrera de Abbe recurriendo a
una radiación de longitud de onda
larga. Hizo pasar una radiación de
microondas con una longitud de onda
de tres centímetros a través de un ori-
ficio de tamaño similar al de una
cabeza de alfiler y la dirigió sobre un
objeto situado ante él, registrando
una imagen con una resolución de
150 micras, es decir, una longitud
200 veces menor que la longitud de
onda de la radiación utilizada.
Por aquel entonces se disponía ya
de medios para controlar la posición
y el movimiento de una muestra con
la precisión necesaria para superar
la resolución de un microscopio óptico
ordinario. En el mismo año en que
tuvo lugar la demostración de Ash,
Rusell Young, de la Oficina Nacional
de Pesos y Medidas, consiguió mani-
pular objetos de tres dimensiones con
una precisión del orden del nanóme-
tro (la milmillonésima parte de un
metro). Para ello se sirvió de cerá-
micas piezoeléctricas, que cambian de
tamaño en una escala ínfima cuando
varía el valor del potencial eléctrico
a que está sometido el material. El
control mediante materiales piezoe-
léctricos abrió el camino para el de-
sarrollo, en 1981, del exponente má-
ximo de un microscopio de barrido de
campo próximo, el denominado STM,
o microscopio de efecto túnel [véase
“El microscopio de efecto túnel”, por
Gerd Binnig y Heinrich Rohrer, en
este mismo número].
E n el microscopio de efecto túnel,
la “apertura” es una sonda de
tungsteno pequeña. El extremo de la
misma, finísimo, puede constar de
un solo átomo y medir 0,2 nanóme-
tros de anchura. Los controles pie-
zoeléctricos aproximan la punta hasta
una distancia de uno o dos nanóme-
tros de la superficie de una muestra
conductora, cercanía en que las nubes
electrónicas del átomo del extremo de
la sonda y del átomo más próximo
de la muestra se solapan. Cuando se
aplica un pequeño voltaje a la sonda,
TEMAS 29
 los electrones atraviesan ese interva-
lo (efecto túnel) y dan lugar a la apari-
ción de una minúscula corriente. La
intensidad de la corriente en cuestión
es extraordinariamente sensible al
valor de la distancia de separación;
de manera característica, la intensi-
dad disminuye en un factor 10 cuando
la distancia en cuestión aumenta en
0,1 nanómetros, es decir, la mitad del
diámetro de un átomo.
Los controles piezoeléctricos X e Y
(que gobiernan el movimiento en las
dos dimensiones de un plano) mue-
ven la sonda a lo largo y ancho de la
superficie de la muestra en un barri-
do exhaustivo, de forma tal que las
sucesivas trayectorias paralelas del
barrido están separadas quizá sólo
una fracción de nanómetro. Si la
sonda se mantuviera a una altura
constante, la corriente originada por
el efecto túnel variaría de modo espec-
L as variaciones en el voltaje apli-
tacular, aumentando cuando la sonda
pasara sobre elevaciones del tenor
OLAF WOLTER, IBM, SINDELFINGEN
de los átomos de la superficie de la
muestra y disminuyendo hasta anu-
larse cuando cruzara los intervalos
existentes entre los átomos. Lo que
sucede en realidad es que la sonda se
mueve hacia arriba y hacia abajo
siguiendo la topografía de la mues-
tra. Un mecanismo de retroalimen-
tación detecta las variaciones que se
producen en la corriente originada
por efecto túnel y varía el voltaje apli-
cado a un tercer control Z. El control
piezoeléctrico Z mueve la sonda en
un sentido vertical en la cuantía ne-
cesaria para estabilizar la corriente,
lo cual equivale a mantener cons-
tante la distancia entre el extremo
del microscopio y la superficie de la
muestra.
cado al control piezoeléctrico Z
se traducen electrónicamente en una
imagen del relieve de la superficie.
Si la agudeza de la sonda, la preci-
sión de los controles y la finura del
sistema de barrido son suficientes, las
imágenes del STM pueden llegar a
resolver átomos individuales, cuyo
diámetro es del orden de 0,2 nanó-
metros. Una resolución, pues, extra-
ordinaria: la longitud de onda meca-
nicocuántica de los electrones que
experimentan el efecto túnel en la
sonda —es decir, la “radiación” que
da lugar a la imagen— es de aproxi-
madamente un nanómetro.
El mapa que levantan estas imá-
genes no es de naturaleza topográ-
fica en el sentido literal de la palabra;
antes bien, representan una super-
ficie de efecto túnel equiprobable. La
probabilidad de que se produzca el
efecto túnel no queda unívocamente
determinada por la topografía de la
superficie de la muestra, ya que se ve
afectada también por las variaciones
en la abundancia y energía de los elec-
trones superficiales. Cuando la mues-
tra que se observa sólo contiene un ele-

1. SONDA DE SILICIO de un microscopio de fuerza de láser, afi-
lada hasta alcanzar un espesor de pocos átomos; se cierne so-
bre una superficie. El microscopio, desarrollado en el laboratorio
del autor, proporciona imágenes del relieve de una superficie
barriéndola con una sonda vibrante muy pequeña, situada a es-
casos nanómetros (milmillonésimas de metro) por encima de la
muestra, desde donde “percibe” débiles fuerzas atractivas pro-
venientes de la superficie. Esta microfotografía de 1300 aumentos
muestra una sonda que desarrolló Olaf Wolter en la central ale-
mana IBM en Sindelfingen.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 15

 mento, la probabilidad de que se pro- tricos. Desde aquella fecha, este
duzca el efecto túnel se ajusta estre- microscopio ha permitido obtener
chamente a su topografía, “topogra- imágenes de la superficie de múlti-
fía” que pone de manifiesto también ples sustancias y se han aprovechado
las variaciones en la composición ató- incluso sus propiedades para utili-
mica. Por ejemplo, la presencia de un zarlo a escala nanométrica: la punta
átomo contaminante en una superfi- de la sonda de este instrumento nos
cie, en lo demás uniforme, puede dar faculta para aplicar con gran preci-
lugar a una anomalía en forma de pro- sión un voltaje capaz de disecar molé-
tuberancia o de pozo, en función de sus culas o de estudiar sus propiedades
propiedades electrónicas. electrónicas. Más aún, el STM posibi-
El éxito del STM renovó la confianza litó el nacimiento de toda una fami-
de los investigadores ante la posibi- lia de microscopios con sonda de
lidad de utilizar una sonda para barrido basados en una tecnología
observar una muestra con una pre- similar a la descrita. El primer vás-
cisión del orden del tamaño atómico tago de esta serie tenía por objetivo
sirviéndose de controles piezoeléc- superar una de las principales limita-
PANTALLA
CONTROL
PIEZOELECTRICO
VOLTAJE
ciones de su progenitor: la obtención
de imágenes con el STM está restrin-
gida fundamentalmente a los con-
ductores eléctricos. Con frecuencia,
hasta los materiales conductores o
semiconductores, como el silicio, están
recubiertos por una capa de óxido ais-
lante. Aunque los materiales bioló-
gicos no suelen ser conductores, con
el STM se han podido cartografiar cier-
tas muestras biológicas colocadas en
una superficie conductora y sumer-
gidas en un electrolito.
En el año 1985, Binnig, junto con
Calvin F. Quate, de la Universidad
de Stanford, y Christoph Gerber, de
la IBM de Zurich, diseñaron el micros-
copio de fuerza atómica (AFM), un dis-
positivo con sonda de barrido que no
requería que la muestra fuera con-
ductora. Al igual que el STM , este
microscopio se basa en el movimiento
de una aguja pequeñísima —en este
caso, una punta de diamante de
dimensiones atómicas montada en
una lámina metálica— sobre la mues-
tra sometida al barrido. En lugar de
la corriente producida por efecto
túnel, el AFM registra los perfiles de
la fuerza repulsiva originada por el
solapamiento de la nube de electro-
nes de la punta con las nubes de elec-
trones de los átomos superficiales de
la muestra. De manera similar a la
aguja de un tocadiscos, la punta de
la sonda “lee” la superficie de la mues-
tra. La lámina metálica actúa a modo
de resorte que mantiene la punta de
la sonda en contacto con la superfi-
cie durante su recorrido por la topo-
grafía atómica, siguiendo una serie
de surcos paralelos sucesivos.

GENER
A
DE RE DOR
E n el diseño original del AFM, la me-
dición de la deflexión de la lámina
se llevaba a cabo con la producción
ALIME TRO-
NTACIO de una corriente de túnel entre dicha
N
lámina y la punta de un STM montada
sobre ella. Un mecanismo de retroa-
CORRIENTE limentación respondía a las varia-
SEÑAL DE REFERENCIA DE TUNEL
ciones de la corriente de túnel, ajus-
tando el voltaje aplicado a un control
piezoeléctrico Z que movía la mues-
tra verticalmente. La deflexión y, por
tanto, la fuerza repulsiva, se mante-
nía constante; las variaciones en el
HANK IKEN

voltaje aplicado al control piezoeléc-

trico Z reproducían los rasgos topo-
2. MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL (STM): percibe la topografía de una superficie a es- gráficos de la muestra y servían de
cala atómica por medio de electrones que atraviesan, por efecto túnel, el intervalo entre base para la formación de la corres-
la sonda y la superficie. Una cerámica piezoeléctrica, cuyo tamaño cambia ligeramente pondiente imagen. De este modo,
en respuesta a los cambios en el voltaje aplicado, gobierna la sonda de tungsteno en tres dicha imagen podía resolver átomos
dimensiones. Se aplica un voltaje a la punta de la sonda, que se acerca hacia la superfi- individuales. Al igual que en el STM,
cie (conductora o semiconductora) hasta que se inicia una corriente de túnel. La punta va el poder de resolución del AFM era
peinando la superficie en una serie de surcos sucesivos. La corriente de túnel tiende a muy grande; dicha resolución venía
variar con la topografía; un mecanismo de retroalimentación responde moviendo la pun- limitada únicamente por la acuidad
ta arriba y abajo, siguiendo el relieve de la superficie. Los movimientos de la punta se tra- de la punta de la sonda de diamante
ducen en una imagen. y no por ninguna longitud de onda.

16 TEMAS 29

3. ALINEACION DE LOS ATOMOS, a modo de cuentas de un rosario,
en esta imagen de una muestra de arseniuro de galio, un semicon-
ductor, obtenida con un STM. Esta imagen es compuesta: dado que
los átomos de galio (azul) y de arsénico (rojo) tienen diferentes pro-
piedades eléctricas, sus imágenes se han obtenido por separado,
bajo condiciones diferentes. En el caso de los átomos de galio, la
R. M. FEENSTRA, CENTRO DE INVESTIGACION THOMAS J. WATSON DE IBM
corriente túnel fluía desde la punta —cargada negativamente— ha-
cia la muestra; para los átomos de arsénico, la punta del STM estaba
cargada positivamente y el sentido de la corriente se invertía. Pro-
porcionó esta imagen Randall M. Feenstra, quien la creó en el labo-
ratorio de investigación Thomas J. Watson de la compañía IBM, en
Yorktown Heights.

Aunque el primer AFM era capaz
en principio de proporcionar imáge-
nes de cualquier substancia, conduc-
tora o no, la presión de la punta de
diamante (del orden de una milloné-
sima de gramo) era suficiente para
distorsionar o mover muchas de las
moléculas biológicas. Paul K. Hansma
y sus colaboradores, de la Universidad
de California, redujeron dicha presión
en un factor de 10. Un factor que con-
tribuye a aumentar la presión de la
punta es la delgada película de agua
y contaminantes que inevitablemente
se depositan sobre la punta y sobre
la superficie de la muestra. Cuando la
punta se acerca mucho a la superfi-
cie y las capas de contaminantes
entran en contacto, aparecen unas
fuerzas de adhesión que tienden a
unir la punta con la muestra, con lo
que se refuerza la presión de barrido.
El grupo de Hansma eliminó este
efecto sumergiendo punta y muestra
en una gota de agua.
Se reemplazó también el mecanismo
del STM por un nuevo sistema de detec-
ción de la deflexión de la sonda, de-
sarrollado en el centro de investiga-
ción de IBM Thomas J. Watson, en
Yorktown Heights, Nueva York; con-
siste en un haz de láser que la lámina
refleja. El movimiento de la lámina
altera la trayectoria del haz reflejado,
de tal forma que una célula fotoeléc-
trica colocada en la trayectoria del
haz, a cierta distancia, es capaz de de-
tectar los pequeños movimientos que
experimenta la lámina. La señal pro-
ducida por la célula fotoeléctrica activa
el control piezoeléctrico Z para que la
separación se mantenga constante.
El sensor óptico proporciona una
medida más precisa de la deflexión de
la punta que el sensor basado en el
efecto túnel y ello hace que el contac-
to del AFM sea más consistente y suave.
Como resultado de todas estas mejo-
ras, Hansma y sus colaboradores lle-
garon a obtener imágenes de sustan-
cias biológicas con un detalle casi
atómico. Tomaron incluso instantá-
neas de un proceso molecular a medida
que va transcurriendo; en concreto:
la polimerización de la proteína de
fibrina, uno de los componentes prin-
cipales de los coágulos de la sangre.
A l mismo tiempo que el AFM se iba
desarrollando, mi grupo del de-
partamento de investigación de IBM
en Yorktown Heights investigaba
nuevas formas de controlar la cali-
dad en la fabricación de materiales
microelectrónicos. En su esfuerzo por
construir ordenadores más rápidos y
potentes, los ingenieros disminuyen
constantemente el tamaño de los ele-
mentos de los circuitos y de los dis-

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 17

 positivos de almacenamiento de datos.
La búsqueda de imperfecciones en
los circuitos hace necesario trabajar
con resoluciones al menos 10 veces
menores que el tamaño del menor de
los elementos; las dimensiones de los
propios elementos de los circuitos se
estaban acercando ya por entonces al
límite de resolución teórica de los
microscopios ópticos ordinarios, que
es del orden de 250 nanómetros.
Durante algún tiempo, el micros-
copio electrónico de barrido (SEM) se
convirtió en la herramienta microe-
lectrónica habitual: este instrumento
permite resolver hasta un detalle de
algunos nanómetros. Sin embargo,
el SEM requiere que la muestra esté
revestida por una capa metálica y
que se observe al vacío; su resolución
tridimensional es baja. Por otra parte,
sus electrones de alta energía pue-
den dañar o destruir un dispositivo
de semiconductor, lo que limita el
FOTODIODO
PANTALLA
GENER
A
DE RE DOR
ALIME TRO-
NTACIO
N el alambre y decae su frecuencia de
HANK IKEN
valor del SEM en el control de calidad
de estos dispositivos. Los microsco-
pios con sonda de barrido —sencillos,
directos y potentes— parecían res-
ponder a nuestras necesidades.
Sin embargo, la utilización del STM
exige que la muestra sea conductora,
cuando en los dispositivos microe-
lectrónicos se utilizan materiales
semiconductores y aislantes además
de conductores. El AFM puede pro-
porcionar imágenes de un conjunto
más amplio de materiales; ahora bien,
el propio AFM avanzado, más suave,
contacta con los materiales con fuerza
suficiente para contaminar o dañar
los elementos delicados de los circui-
tos. Por eso, mis colegas y yo desarro-
llamos una nueva familia de micros-
copios con sonda de barrido, capaces
de registrar los perfiles de los dispo-
sitivos electrónicos, cualquiera que
sea su composición, sin necesidad de
rozar su superficie.
LASER
LENTE
CONTROL
PIEZOELECTRICO
El más logrado de ellos fue el mi-
croscopio de fuerza de láser (LFM), in-
ventado en colaboración con Yves
Martin y Clayton C. Williams. La
“fuerza” del LFM es la pequeña in-
teracción atractiva que aparece en-
tre una superficie y una sonda situada
a una distancia de 2 a 20 nanómetros,
un intervalo mucho mayor que en el
STM y el AFM . En los materiales semi-
conductores y aislantes, la fuerza es
consecuencia principalmente de la
tensión superficial del agua que con-
densa entre la punta de la sonda y la
superficie de la muestra, pero inter-
vienen también las fuerzas de van
der Waals (débiles y transitorias inte-
racciones electrostáticas entre los
átomos o las moléculas).
L a fuerza atractiva es ínfima, mil
veces menor que las repulsiones
interatómicas registradas con el AFM.
El LFM detecta la existencia de esta
fuerza a través de su efecto sobre la
dinámica de una sonda vibrante, un
afilado alambre de tungsteno de
medio milímetro de longitud con una
punta vuelta hacia abajo, cuyo diá-
metro queda reducido a 50 nanó-
metros o menos. (Luego se utiliza-
ron sondas de silicio cuyo extremo
es finísimo, de tamaño atómico.) Un
transductor piezoeléctrico situado
en la base del alambre transforma
la corriente variable en una vibra-
ción, La frecuencia base del trans-
ductor se halla por encima mismo
de la frecuencia de resonancia mecá-
nica más baja del alambre (cifrada
en unos 50 kilohertz).
Dado que el alambre en cuestión
está vibrando con una frecuencia muy
próxima a la de resonancia, ampli-
fica la señal de base de forma aná-
loga a la lengüeta de un instrumento
musical. La punta de la sonda puede
oscilar medio nanómetro, aun cuando
el transductor del otro extremo sólo
se esté desplazando una centésima
de nanómetro a lo más. Sin embar-
go, cuando la punta vibrante se apro-
xima a la muestra, las débiles fuer-
zas atractivas que percibe “ablandan”

resonancia, que se aleja entonces de

SEÑAL DE REFERENCIA la frecuencia base, con lo cual dis-
minuye la amplitud de la vibración.
4. MICROSCOPIO DE FUERZA ATOMICA (AFM): barre una muestra con un diamante montado Un sensor de láser detecta el cam-
en un delgado brazo metálico. La nube de electrones de la punta del diamante (que puede bio de amplitud. Esta detección se
acabar en un solo átomo) interacciona con las nubes de electrones de los distintos átomos lleva a cabo por interferometría, téc-
de la muestra, produciendo una fuerza repulsiva que varía con el relieve de la superficie. Es- nica de uso en la medición precisa de
ta fuerza actúa sobre la sonda y los movimientos que produce se recogen mediante un haz distancias con frecuente aplicación,
de láser que se refleja en el brazo que la sostiene y que detecta finalmente en un sensor de por citar dos casos, en astronomía y
fotodiodo. Un mecanismo de retroalimentación responde a los cambios en la trayectoria del geofísica. Un haz de láser se desdo-
haz activando un control piezoeléctrico que ajusta la altura de la muestra de tal forma que la bla en un haz de referencia, reflejado
deflexión del brazo permanezca constante. Los movimientos de la muestra dibujan el perfil por un espejo o un prisma estacio-
de la superficie. El AFM proporciona sin problemas imágenes de materiales aislantes. nario, y un haz de exploración, refle-

18 TEMAS 29
jado en la parte posterior de la punta
de la sonda. Los dos haces reflejados
se recombinan e interfieren entre sí
para dar lugar a un haz cuya fase es
extremadamente sensible a la longi-
tud recorrida por el haz de explora-
ción. La fase se desplaza en un sen-
tido u otro con cada oscilación de la
punta; la cuantía de este desplaza-
miento pone de manifiesto la ampli-
tud de la vibración. El interferóme-
tro puede así detectar cambios de
amplitud mínimos, de sólo 10–5 na-
nómetros.
La amplitud tiende a disminuir
cuando la sonda pasa sobre las pro-
tuberancias topográficas de la mues-
tra, donde las fuerzas atractivas son
más fuertes, y a aumentar cuando
dicha sonda está situada sobre las
depresiones. Tal y como sucede en
los otros microscopios con sonda de
barrido, un mecanismo de retroali-
mentación responde a los cambios
que se producen en el comportamiento
de la punta de la sonda variando el
voltaje aplicado a un control piezoe-
léctrico Z con el fin de estabilizar la
amplitud de la vibración y, en con-
secuencia, la separación existente
entre la sonda y la superficie de la
muestra. Con las fluctuaciones en el
voltaje piezoeléctrico se dibuja el per-
fil de la superficie.
Procediendo de este modo, el LFM
puede detectar el relieve de la super-
ficie con una precisión del orden de
5 nanómetros (equivalente al espe-
sor de unos 25 átomos), y, dada su
capacidad de percibir la topografía de
la superficie desde cierta distancia,
puede inspeccionar la situación en el
interior de grietas profundas y estre-
chas. Este instrumento es válido, en
principio, no sólo para el examen de
microcircuitos terminados, sino tam-
bién para el control de calidad de las
superficies de silicio sobre las que se
construyen. Habida cuenta del ancho
y espesor de las estructuras de los cir-
cuitos, un sustrato que deje de ser per-
fectamente liso en una cuantía algo
mayor que unos cuantos espesores
atómicos puede resultar inaceptable.
Por idéntica razón, la densidad cada
vez más elevada con que se almacena
la información en los discos magné-
ticos significa que los datos deben
escribirse y leerse en una escala más
fina, con cabezales menores que se
acerquen mucho más a los discos.
Para evitar la colisión, tanto los dis-
cos como los cabezales tienen que ser
tan lisos que deben construirse con
una precisión casi atómica.
Una variante del LFM, el micros-
copio de fuerza magnética (MFM), nos
permite verificar las prestaciones de
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
5. CADENAS DE POLIMEROS del aminoácido alanina; forman una estructura rugosa en la pla-
ca de un microscopio sobre la que se depositó y evaporó una disolución de dicho polímero.
En esta imagen de AFM, obtenida por Paul K. Hansma y su equipo de la Universidad de Cali-
fornia, cada protuberancia corresponde a un aminoácido. La imagen muestra una superficie
de tres nanómetros de ancho.
esos cabezales, que se pueden resu-
mir en la definición, uniformidad e
intensidad del campo magnético que
producen. En lugar de la aguja de
tungsteno o silicio, el MFM está pro-
visto de una sonda imantada de níquel
o hierro. Cuando la sonda vibrante
se aproxima a una muestra magné-
tica, la punta se ve sometida a una
fuerza que cambia su frecuencia de
resonancia y, con ello, su amplitud
de vibración. El MFM puede perfilar
la estructura del campo magnético
originado por los cabezales de regis-
tro de datos con una resolución supe-
rior a los 25 nanómetros. Este dis-
positivo permite también estudiar la
estructura de las unidades magnéti-
cas (“bits”) de almacenamiento de
datos en los discos y en otros medios,
proporcionando información tanto
sobre el funcionamiento de los cabe-
zales como sobre la calidad del medio
de almacenamiento.
Y ves Martin, David Abraham y yo
mismo desarrollamos otra ver-
sión especializada del LFM, el micros-
copio de fuerza electrostática. En este
caso, la sonda vibrante posee una
carga eléctrica y la amplitud de vibra-
ción resulta afectada por las fuerzas
electrostáticas que originan las car-
gas de la muestra. Con la ayuda de
este microscopio se pueden describir
las propiedades eléctricas de los
P. K. HANSMA, STA. BARBARA, CALIFORNIA
microcircuitos a muy pequeña escala.
Y, así, para modificar las propieda-
des del silicio, se le suelen añadir
pequeñas cantidades de átomos de
impurezas, conocidas con el nombre
genérico de contaminantes. Estos con-
taminantes proporcionan electrones,
que se mueven con libertad en el seno
del silicio, o capturan electrones, que
dejan “huecos” cargados positiva-
mente, capaces también de moverse
por la red cristalina.
La distribución y concentración
de los átomos contaminantes desem-
peñan un papel crítico para el buen
funcionamiento de una pastilla
(“chip”). Una forma de esquematizar
la situación de estos átomos conta-
minantes consiste en aplicar un volta-
je entre la sonda de un microscopio
de fuerza electrostática y la superfi-
cie de la muestra. El voltaje origina
una migración de los electrones o agu-
jeros de conducción por debajo de la
sonda, apareciendo así una región
cargada que ejerce una fuerza elec-
trostática sobre dicha sonda. Los mo-
vimientos consiguientes de la sonda
proporcionan una medición muy pre-
cisa a pequeña escala de la carga eléc-
trica y, en consecuencia, de los elec-
trones o agujeros involucrados y de
las correspondientes concentracio-
nes de átomos contaminantes.
Los microscopios de fuerza mag-
nética y electrostática son dos de los
19
 sistemas con sonda de barrido que se
LASER han diseñado para registrar otras
propiedades superficiales de los mate-
riales distintas de las meramente
topográficas. Está también el micros-
copio térmico de barrido, que desarro-
llé en colaboración con Williams. La
sonda de este microscopio era quizás
el termómetro más fino del mundo,
sensible a variaciones de tempera-
DIVISOR tura superficial del orden de la diez-
DEL HAZ milésima de grado a una escala de
decenas de nanómetros. La sonda
consistía en un alambre de tungsteno
rematado en una punta cuya sección
mediría unos 30 nanómetros. Un
revestimiento de otro metal, níquel,
cubría la sonda. El níquel quedaba
CELULA DE BRAGG PRISMA separado del tungsteno por una capa
aislante en toda la extensión de la
sonda, salvo en su extremo. La unión
níquel-tungsteno se comporta como
un termopar, generando un voltaje
proporcional a su temperatura.

DETECT
OR
E l microscopio térmico de barrido
fue desarrollado en las primeras
etapas de nuestra búsqueda de la
mejor forma de levantar perfiles de
los dispositivos microelectrónicos,
GENERA antes de la introducción de los AFM
DO
DE RETR R y LFM. En nuestros primeros expe-
ALIMENT O- rimentos, llevados a cabo en 1985,
ACION
encontramos que este dispositivo
podía servir realmente como una
sonda superficial rápida. En primer
lugar, se hacía pasar una corriente a
través de la punta que calentara la
TRANSDUCTOR
PIEZOELECTRICO
sonda; cuando la energía despren-
dida al aire en forma de calor es igual
a la energía suministrada en forma
de corriente, la temperatura de la
MICROPASTILLA punta se estabiliza, alcanzando por
regla general un valor de algunos
grados por encima de la temperatura
del entorno.
Cuando la punta calentada se apro-
xima a una muestra, que por ser un
sólido conduce el calor mucho mejor
que el aire, la tasa de pérdida de calor
aumenta. La disminución que expe-
CONTROL rimenta el voltaje en la unión del ter-
PIEZOELECTRICO mopar a consecuencia del enfria-
HANK IKEN

miento proporciona una medida de

la distancia que separa la punta de la
muestra. (Para reducir la sensibili-
6. EL MICROSCOPIO DE FUERZA DE LASER ofrece una imagen topográfica de una muestra dad del sistema a las fluctuaciones
(típicamente un componente microelectrónico) pasando una sonda de tungsteno o silicio a erráticas de la temperatura, lo que
una altura de pocos nanómetros sobre la muestra en cuestión. La punta vibra con una fre- hacemos en realidad es conferir una
cuencia cercana a su frecuencia de resonancia. Las fuerzas atractivas de van der Waals y vibración a la punta de la sonda de
la tensión superficial del agua que condensa entre la sonda y la muestra actúan sobre la son- amplitud menor que el nanómetro,
da, modificando su frecuencia de resonancia y reduciendo con ello su amplitud de vibración. con una frecuencia del orden de un
La variación de dichas fuerzas y, por tanto, del recorrido de la punta de la sonda responde al kilohertz. El voltaje disminuye cada
relieve de la superficie. Una sonda de láser controla la posición de la punta por medio de un vez que la punta se acerca a la mues-
haz que se desdobla en dos. Uno de estos haces se refleja en un prisma estacionario; el otro tra y aumenta cuando se separa de
atraviesa una célula de Bragg —dispositivo que modifica la frecuencia del haz— y es refle- ella; la amplitud de la fluctuación del
jado por la cara posterior de la sonda. Los dos haces se recombinan y su interferencia pro- voltaje aumenta cuando la distancia
duce una señal (para la frecuencia de la célula de Bragg) que mide la vibración de la sonda. media que separa la punta vibrante

20 TEMAS 29
de la muestra disminuye.) En conse-

PIERRE LEVY
cuencia, la pérdida de calor revela
los detalles de la topografía de la
superficie de dicha muestra conforme
la sonda la va barriendo, de forma
análoga a como sucede en el caso de
la corriente de efecto túnel, la repul-
sión interatómica o las atracciones de
van der Waals en los otros modelos
de microscopios con sondas de barrido.

E l proceso de fabricación no per-

mitía obtener sondas termopares
cuyas dimensiones bajasen más allá
de los 30 nanómetros, lo cual limitaba
el poder de resolución de los micros-
copios térmicos de barrido. La apa-
rición del LFM , cuya resolución es
mucho mayor, desvió la sonda tér-
mica hacia otros usos más especiali-
zados. Con esa sonda se pueden ob-
tener imágenes que muestren las
variaciones de temperatura en las
células vivas, proporcionando así
datos sobre los mecanismos del meta-
bolismo; puede medir el flujo de una
pequeña corriente de líquido o gas
mediante el control de las pérdidas
de calor que se producen cuando la
punta de la sonda se calienta y se
coloca en el seno de dicha corriente.
Posibilita también la utilización de
una técnica analítica conocida por
espectroscopía de absorción fototér-
mica, con un nivel de resolución sin 7. RUGOSIDADES NANOMETRICAS en un surco grabado en una superficie de silicio de una
precedentes. micra de anchura. Pierre Levy, que trabajaba entonces en el centro de investigación de la
La espectroscopía de absorción foto- compañía IBM en Yorktown Heights, obtuvo esta imagen utilizando un microscopio de fuer-
térmica se basa en el hecho de que za de láser, instrumento capaz de reproducir los perfiles topográficos de una superficie a pe-
cada elemento absorbe luz con mayor queña y a gran escala.
eficiencia a una longitud de onda
específica. El procedimiento consiste
en enviar un haz de láser de longi- con una determinada longitud de onda térmica abría el camino de la espec-
tud de onda variable sobre la mues- pone de manifiesto la mayor eficien- troscopía a pequeña escala, la posi-
tra en estudio. Se toma la tempera- cia de la absorción. Una “huella dac- bilidad de cartografiar a pequeña
tura de la muestra conforme se va tilar” completa de las longitudes de escala las variaciones en la compo-
variando la longitud de onda del láser; onda de absorción puede revelar la sición superficial.
una brusca elevación de temperatura composición de la muestra. La sonda Mi grupo incrementó aún más la

YVES MARTIN, C. I. THOMAS J. WATSON DE IBM

8. UNIDADES MAGNETICAS O “BITS” de una micra o dos de diáme-
tro: aparecen en forma de cráteres en estas imágenes obtenidas con
un microscopio de fuerza magnética, un microscopio de fuerza de lá-
ser equipado con una sonda imantada de hierro o níquel, sensible a
los gradientes de fuerza magnética. Los “bits”, que almacenan in-
formación en discos magnetoópticos, se forman exponiendo un dis-
co a un campo magnético al mismo tiempo que un láser altamente
localizado calienta la superficie, permitiendo de este modo que los
dominios magnéticos de la región calentada se reorienten. En estas
imágenes, obtenidas por Yves Martin en el centro de investigación
Thomas J. Watson de IBM en Yorktown Heights, se puede comparar
la estructura magnética de un “bit” normal (izquierda) con la de otro
producido con un láser de baja potencia (centro) y con un campo
magnético muy débil.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 21

HANK IKEN se realiza una serie de barridos suce-
sivos sobre una superficie, al tiempo
que un interferómetro de láser mide
CONTROL la deflexión del brazo de la lámina.
PIEZOELECTRICO
Utilizando esta técnica, los investi-
gadores consiguieron calibrar —por
poner un caso— la resistencia que
ofrecen las irregularidades atómicas
de una superficie de grafito. Su inten-
ción era llegar a determinar de este
TUNGSTENO modo la forma en que ese rozamiento
ELECTRONICA
afectaba a las propiedades macros-
cópicas de los materiales.
NIQUEL

E ntretanto, el grupo de Hansma

había desarrollado un microsco-
pio de barrido de conductancia iónica
(SICM), que barre una muestra no con
AISLANTE
una punta de metal o diamante, sino
con una micropipeta de vidrio que
contiene un pequeño electrodo. Los
investigadores sumergen la muestra
y la pipeta en un baño electrolítico
(verbigracia, una solución salina) y
establecen una diferencia de poten-
cial entre el electrodo de la pipeta y
otro electrodo del baño. Una corrien-
te de iones tiende a fluir entre los
MICROPASTILLA electrodos a través de la abertura de
la pipeta, pero cuando la pipeta se
acerca a la superficie de la muestra,
la corriente se hace más débil. La
corriente se anula cuando la pipeta
de barrido toca la muestra, dado que
9. SONDAS TERMICAS que registran variaciones de temperatura de hasta la diezmilésima este hecho produce la obturación de
de grado en una escala de decenas de nanómetros. La sonda está constituida por un nú- su abertura.
cleo de tungsteno recubierto de níquel, pero aislado del mismo en toda su extensión salvo Equipado con un mecanismo de
en su punta de 30 nanómetros de espesor. Allí se unen estos dos metales para formar un retroalimentación que mantiene una
termopar que genera un voltaje proporcional a su temperatura. Este dispositivo puede car- corriente iónica constante a través
tografiar el relieve de una superficie detectando las variaciones en la pérdida de calor des- de la abertura de la pipeta, el SICM
de la sonda caliente hacia la muestra que va peinando. perfila la topografía de una muestra.
El tamaño de la abertura de la pipeta
limita la resolución del SICM hasta
resolución que permite esta técnica: secuencia de su proximidad a la super- unas 0,2 micras (podría incluso lle-
hasta el nivel de los átomos indivi- ficie) genera un voltaje cuyo valor es garse a los 10 nanómetros). Este dis-
duales. Para alcanzar este objetivo, proporcional a su temperatura. A su positivo resulta más indicado para
prescindimos del termopar, volviendo vez, el valor de la temperatura indica algunas tareas específicas, como
a la punta de tungsteno desnuda, cuánta energía se ha absorbido por puede ser el estudio del comporta-
puntiaguda a escala atómica, propia el átomo sobre el que se encuentra la miento eléctrico de una célula viva.
del STM. Esta punta representa el pa- sonda. La absorción puede ser regis- Cuando se estimula una célula, los
pel de uno de los dos metales de un trada átomo por átomo para cada lon- canales iónicos de su membrana se
termopar; el otro lo es la propia mues- gitud de onda del láser, lo cual per- abren y se cierran, facilitando el paso
tra (si se trata de un metal) o un elec- mite discriminar la composición de de pequeñas corrientes de iones por
trodo de metal sobre el que se depo- la muestra con la más elevada reso- los mismos.
sita dicha muestra. Al principio, el lución. Otro dispositivo de barrido con
instrumento opera de forma análoga La mera enumeración de esos avan- micropipeta representa lo que podría-
al microscopio de efecto túnel. Se esta- ces que se consiguieron en mi labo- mos considerar un retorno a los orí-
blece una diferencia de potencial entre ratorio basta para hacerse una idea genes de la microscopía de barrido de
la punta de la sonda y el metal y se de la extraordinaria versatilidad de campo próximo. Hace ya más de cua-
va acercando la punta hacia la super- la técnica de las sondas de barrido. renta años, O’Keefe concibió la estra-
ficie, hasta que empieza a circular En otros centros se desarrollaron más tegia con la que superar la barrera
una corriente por efecto túnel. variantes de esta misma técnica. Gary de Abbe y mejorar el poder de reso-
A continuación, se interrumpe la McClelland y sus colaboradores del lución de los microscopios ópticos;
corriente y se calienta la superficie centro de investigación Almadén de pero en aquel tiempo no existía la
con la ayuda del láser de longitud de IBM en San José, California, han técnica necesaria para peinar una
onda variable. El pequeño termopar modificado el AFM con el fin de poder muestra con la precisión de una frac-
formado por la superficie calentada medir la fricción a escala atómica. ción de la longitud de onda. Los con-
y la sonda (que se calienta como con- Con la punta de la sonda de un AFM troles con una precisión del orden del

22 TEMAS 29
nanómetro, una innovación adelan-
tada por el STM, abrieron el camino
para construir el microscopio óptico
de elevado poder de resolución con el
que soñaba O’Keefe.
Dos grupos de trabajo, uno dirigido
por Dieter Pohl, de IBM de Zurich, y
el otro por Michael Isaacson, de la
Universidad de Cornell, diseñaron
microscopios ópticos de barrido de
campo próximo. Se ilumina una de las
caras de una muestra muy delgada;
la otra cara se barre con una micro-
pipeta cuyas paredes están recu-
biertas por una lámina de aluminio
opaca. Un fotodiodo situado en el
extremo de la pipeta mide la luz reco-
gida por la punta. Así obtuvieron
microfotografías de luz transmitida
con una resolución (limitada por el
diámetro de la pipeta) del orden de
50 nanómetros, es decir, la décima
parte de una longitud de onda. La
utilización de pipetas todavía más
delgadas puede proporcionar una
resolución de 10 nanómetros, mul-
tiplicando por 25 la que proporcio-
nan los mejores microscopios ópticos
al uso.
Lejos de reemplazar a la microsco-
pía óptica, la tecnología con sonda de
barrido extiende sus posibilidades.
Los microscopistas están ahora en
disposición de transferir los refina-
mientos de los últimos 100 años —téc-
nicas para reforzar el contraste y poner
de manifiesto ciertas características
específicas, tales como el contraste de
polarización, la inmunofluorescencia
y el contraste de fase— a la microsco-
pía óptica de barrido de campo cerca-
no. Gracias a los microscopios con
sonda de barrido podemos “entrar” en
el reino diminuto, nanométrico, de
moléculas y microcircuitos. Aplicada
esa misma técnica a la microscopía
óptica, nos asomamos a ese mundo
sutil en los términos familiares de
luz, sombras y colores.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
VACUUM TUNNELING: A NEW TECHNIQUE
FOR M ICROSCOPY . Calvin F. Quate en
Physics Today, vol. 39, n.o 8, págs. 26-33;
agosto de 1986.
TIP TECHNIQUES FOR MICROCHARACTERI-
ZATION OF MATERIALS. Y. Martin, C. C.
Williams y H. K. Wickramasinghe en
Scanning Microscopy, vol. 2, n.o 1, pági-
nas 3-8; marzo de 1988.
SCANNING TUNNELING MICROSCOPY AND
ATOMIC FORCE MICROSCOPY: APPLICA-
TION TO BIOLOGY AND TECHNOLOGY. P.
K. Hansma, V. B. Elings, O. Marti y C.
E. Bracker en Science, vol. 242, n.o 4876,
págs. 209-216; 14 de octubre de 1988.
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
COLABORADORES DE ESTE NUMERO
Asesoramiento y traducción:
José M.ª Vidal: El microscopio acústico; Amando García: Microscopios con sonda
de barrido; Rodolfo Miranda: El microscopio de efecto túnel y Microscopios
de rayos X; Luis Bou: Microscopía confocal; J. Myro y A Menéndez: Técnicas
de microfotografía; José M.ª Valderas Martínez: Camillo Golgi y la reacción negra;
R. Martínez Murillo: Las primeras observaciones; Esteban Santiago:
Representación visual de embriones humanos.
Portada: D. Keller
INVESTIGACION Y CIENCIA
DIIRECTOR GENERAL José M.ª Valderas Gallardo
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23
El microscopio
de efecto túnel
Este tipo de microscopio revela las estructuras de las superficies átomo
a átomo. Lo describían en Investigación y Ciencia sus propios creadores.
Un año después —en 1986— recibían el premio Nobel de física
Gerd Binnig y Heinrich Rohrer
“L
a superficie fue inventada
por el diablo”, decía el ilus-
tre físico Wolfgang Pauli.
La frustración de Pauli se basaba en
el hecho de que la superficie de un
sólido representa la frontera entre
éste y el mundo exterior. Mientras un
átomo del interior de un sólido está
totalmente rodeado por otros átomos,
uno de la superficie puede interac-
cionar con otros átomos de la misma,
o con los que estén inmediatamente
debajo de ésta. Por tanto, las pro-
piedades de la superficie de un sólido
difieren radicalmente de las del inte-
rior. Así, los átomos de la superficie
a menudo se colocan en una ordena-
ción geométrica diferente de las de
los otros átomos del sólido para mini-
mizar la energía total del sistema. En
virtud de este tipo de procesos, las
estructuras superficiales poseen tal
complejidad que han resistido hasta
ahora una descripción teórica y expe-
rimental suficientemente precisa.
En el laboratorio de investigación
de IBM en Zurich hemos desarrollado
un instrumento que hace posible ca-
racterizar cuantitativamente las com-
plejidades de las superficies: el mi-
croscopio de efecto túnel. Nuestro
microscopio permite “ver” los átomos
de la superficie uno a uno. Puede
incluso resolver estructuras que tie-
nen sólo una centésima parte del
tamaño del átomo. Una herramienta
así tiene aplicaciones importantes,
por ejemplo, en la industria microe-
lectrónica. Al disminuir el tamaño
de la pastilla (“chip”) de silicio —que
es el elemento clave en la arquitec-
tura de los computadores— aumenta
rápidamente su área superficial en
relación a su volumen. Por tanto, la
superficie adquiere creciente impor-
tancia en la operación de la pastilla
y en sus interacciones con otros ele-
24
mentos lógicos. El microscopio de La primera exploración con éxito
efecto túnel probablemente contri- de estructuras atómicas surgió de un
buirá también a la comprensión de descubrimiento básico de la mecá-
otros fenómenos físicos, químicos y nica cuántica: la luz y otras clases de
biológicos. energía exhiben características tanto
La microscopía de efecto túnel es de partículas como de ondas. En 1927,
el producto de una larga evolución. Clinton J. Davisson y Lester H. Ger-
Se acepta que la microscopía comenzó mer, de los laboratorios de la Bell
en el siglo XV cuando se hicieron len- Telephone, confirmaron la natura-
tes de aumento para observar insec- leza ondulatoria del electrón. En-
tos. A finales del siglo XVII, Antony contraron, asimismo, que un electrón
van Leeuwenhoek desarrolló el de alta energía tenía una longitud de
microscopio óptico, que reveló la exis- onda más corta que un electrón de ba-
tencia de células, agentes patógenos ja energía. Un electrón de suficiente
y bacterias. Aunque la microscopía energía presentaría, pues, una longi-
óptica se ha desarrollado hasta con- tud de onda comparable al diámetro
vertirse en una técnica refinada y de un átomo. Este hecho condujo a la
versátil, tiene un límite físico: el invención del microscopio electrónico.
microscopio óptico no puede resolver Con microscopía electrónica se han
estructuras atómicas. La razón es observado proyecciones de filas de
que la longitud de onda promedio de átomos e incluso orbitales atómicos
la luz visible es unas 2000 veces ma- en delgadas películas cristalinas.
yor que el diámetro típico de un átomo,
que es del orden de unos tres angs-
trom. (El angstrom es una unidad de ¿P or qué inventar otro tipo de
microscopio, si el electrónico
longitud igual a una diez mil milloné- tiene tan alto poder de resolución? La
sima de metro, 1 Å = 10–10 m). En otras razón para ello es que la microscopía
palabras, intentar visualizar estruc- electrónica, si bien ha demostrado
turas atómicas con luz visible es como ser fructífera para observar estruc-
pretender descubrir grietas del ta- turas de volumen en materiales cris-
maño de un cabello en una pista de talinos, no puede resolver estructuras
tenis tirando pelotas sobre su super- superficiales excepto en circunstan-
ficie y observando su deflexión. cias muy especiales. Un electrón de
1. EL MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL tiene dos secciones, suspendidas de muelles, que
anidan dentro de un armazón cilíndrico de acero inoxidable. La sección interior contiene el
mecanismo del microscopio. Si se desea producir imágenes de alta resolución de las es-
tructuras superficiales, el microscopio debe ser apantallado de las pequeñas vibraciones
provocadas por los pasos de las personas o por el sonido. Los imanes (sujetos al fondo del
GERD BINNIG Y HEINRICH ROHRER
armazón de acero inoxidable) y las placas de cobre (adheridas al fondo de las secciones ex-
terna e interna) amortiguan las vibraciones. Cualquier perturbación hace que las placas se
muevan hacia arriba y hacia abajo en el campo magnético generado por los imanes. El mo-
vimiento produce corrientes inducidas en las placas. La interacción entre las corrientes in-
ducidas y el campo magnético frena el movimiento de las placas y, por tanto, el de las dos
secciones del microscopio. Para el trabajo en vacío se coloca una campana de acero sobre
el armazón exterior del microscopio.
TEMAS 29
GERD BINNIG Y HEINRICH ROHRER alta energía penetra profundamen-
te en la materia y apenas si revela
pormenor alguno de la estructura su-
perficial.
Un electrón de baja energía se
mueve lentamente y lo desvían con
facilidad los campos eléctricos o mag-
néticos de la muestra. En los años
cincuenta, Edwin W. Müller daba un
gran paso adelante con su invención
del microscopio iónico de emisión de
campo, un instrumento altamente
sensible a las superficies. Por des-
gracia, su campo de aplicación es muy
limitado. La muestra que se desea
estudiar debe tallarse como una fina
aguja de pocos angstrom de radio y
debe ser, también, estable frente a los
elevados campos eléctricos caracte-
rísticos de la técnica.
El principio de operación del mi-
croscopio de efecto túnel permite
obviar estas dificultades. La princi-
pal diferencia entre el microscopio
de efecto túnel y todos los demás es
que no utiliza partículas libres; en
consecuencia, no se necesitan lentes
ni fuentes especiales de electrones o
fotones. Su única fuente de radiación
son los electrones ligados que ya exis-
ten en la muestra sometida a inves-
tigación.
Para comprender este principio ima-
ginemos que los electrones ligados a
PLACA PIEZOELECTRICA
la superficie de la muestra son aná-
logos al agua de un lago. Del mismo
modo que parte del agua se filtra al
SUJECIONES
terreno circundante formando corrien-
ELECTROSTATICAS tes subterráneas, algunos electrones
de la superficie de la muestra se
MUESTRA “fugan” de ésta y originan una nube
PUNTA electrónica alrededor de la muestra.
De acuerdo con la física clásica, esta
nube no podría existir porque la refle-
xión en los límites de las superficies
confina las partículas dentro de ellas.
Sin embargo, esto no es cierto en mecá-
TRIPODE
nica cuántica, donde cada electrón se
(HECHO DE BARRAS
PIEZOELECTRICAS) comporta como una onda: su posición
no está bien definida, se “difumina”.
Se explica así la existencia de elec-
trones allende la superficie de la mate-
ria. La probabilidad de encontrar un
electrón decae rápidamente —de una
manera exponencial— con la distan-
cia de la superficie. Este efecto se
conoce tradicionalmente como “efecto
FUENTE DE VOLTAJE
PARA LAS BARRAS
túnel” ya que los electrones parecen
estar cavando túneles más allá de su
IAN WORPOLE

PIEZOELECTRICAS
frontera clásica.

2. CONSTA EL DISPOSITIVO DEL MICROSCOPIO de una muestra y una aguja para barrer la
superficie. Materiales piezoeléctricos, que se expanden o contraen al aplicarles voltaje, per-
L a primera verificación experi-
mental del efecto túnel fue lle-
vada a cabo hace un cuarto de siglo
miten que el dispositivo resuelva estructuras que tienen tan sólo una centésima parte del ta- por Ivar Giaever, de la General Elec-
maño de un átomo. Un portamuestras piezoeléctrico acomoda la muestra sobre una placa tric Company. Para ello colocó una
metálica horizontal. Un trípode piezoeléctrico barre la punta sobre la superficie de la mues- capa aislante, rígida y delgada, sepa-
tra, simultaneando alta estabilidad y precisión. rando dos placas metálicas llamadas

26 TEMAS 29
electrodos. La distancia entre los elec-
trodos era lo suficientemente pequeña
como para que las nubes electrónicas
asociadas a ellos se solaparan lige-
ramente. Una diferencia de potencial
entre los electrodos —inducida por ELECTRONICA
un voltaje aplicado— hace que algu-
nos electrones fluyan de un electrodo
a otro a través del solapamiento entre
las nubes de carga. Este flujo equi-
vale al flujo de agua subterránea entre
PANTALLA DEL COMPUTADOR
dos lagos adyacentes cuando uno está
más alto que otro.
Hemos construido el microscopio
de efecto túnel haciendo algunos cam-
bios básicos en la típica configura-
ción de túnel. En primer lugar, reem-
plazamos uno de los electrodos por PUNTA MOVIL
la muestra que queremos investigar.
A continuación, sustituimos el otro
electrodo por una punta afilada como
una aguja. Y finalmente reemplaza-
mos la capa aislante rígida por otro
aislante, no rígido, un líquido, un gas NUBE ELECTRONICA
o el vacío, por ejemplo, de modo que
fuera posible desplazar la punta de
la aguja sobre los contornos de la

superficie de la muestra.
Para barrer la superficie empuja-
mos la punta hacia la muestra hasta
que las nubes electrónicas respecti-
vas se tocan suavemente. La aplica-
ción de un voltaje entre la punta y la
muestra induce que los electrones
pasen de una a otra a través de un
estrecho canal en las nubes electró-
nicas. Este flujo se llama corriente
de túnel. Como la densidad de una
nube electrónica decae exponencial-
mente con la distancia, la corriente
de túnel es sumamente sensible a la
distancia entre la punta y la super-
ficie. Un cambio en la distancia en
una cantidad igual al diámetro de un
solo átomo hace disminuir la corriente
de túnel en un factor de 1000.
IAN WORPOLE
SUPERFICIE DE LA MUESTRA
3. EN EL EFECTO TUNEL DE ELECTRONES está basada la operación del microscopio. Una
nube electrónica ocupa el espacio entre la superficie de la muestra y la punta de la aguja
(abajo). La nube es consecuencia de la indeterminación en la localización del electrón (un
resultado de sus propiedades ondulatorias); hay una probabilidad no nula de encontrar al
electrón más allá de la frontera superficial de un conductor ya que el electrón está difu-
minado. La densidad de la nube electrónica disminuye exponencialmente con la distancia.
Un flujo de electrones a través de la nube, inducido por una diferencia de potencial, es, por
tanto, extremadamente sensible a la distancia entre la superficie y la punta. Al barrer es-
ta última la superficie, un mecanismo de realimentación mide el flujo de electrones (lla-
mado la corriente túnel) y mantiene constante la altura de la punta por encima de los áto-
mos de la superficie (arriba). De este modo, la punta sigue los contornos de la superficie.
El movimiento de la punta se lee y procesa por un ordenador y aparece en una pantalla o
en un registrador. Barriendo con la punta un conjunto de líneas paralelas se obtiene una
imagen tridimensional de alta resolución de la superficie examinada.
trom en la superficie. Se ha consegui- etapas —de sección triangular—

A sí pues, nos es dado explotar la

sensibilidad de la corriente túnel
para realizar mediciones precisas
de la posición vertical de los átomos de
la superficie de la muestra. Mientras
la punta va barriendo la superficie,
un mecanismo electrónico de reali-
mentación mide la corriente de túnel
y mantiene la punta a distancia cons-
tante sobre los átomos de la superfi-
cie. De este modo, la punta sigue los
contornos de la superficie. El movi-
miento de la punta es leído y proce-
sado por un computador y aparece en
una pantalla o en un registrador. Se
obtiene una imagen tridimensional
de la superficie obligando a que la
punta barra un conjunto de líneas
paralelas entre sí. Una distancia de
10 centímetros en la imagen viene a
representar una distancia de 10 angs-
do un aumento de 100 millones.
¿Cómo es posible mover la punta
sobre la muestra manteniendo cons-
tante la distancia entre ella y la super-
ficie, que es de menos de 10 angs-
trom, con una estabilidad y precisión
superior a los 0,1 angstrom? En pri-
mer lugar, el microscopio debe ser
apantallado de las vibraciones exter-
nas, como las causadas por el sonido
en el aire o por la gente que anda por
el edificio. En segundo lugar, los movi-
mientos de la punta deben ser muy
precisos. Y, por último, la punta será
tan afilada cuanto lo permitan los
límites de rigidez y estabilidad.
Dos etapas, o secciones, suspendi-
das de unos muelles, anidan en el
armazón de acero inoxidable del
microscopio y protegen de las vibra-
ciones la distancia de túnel. Ambas
están hechas de barras de vidrio. La
segunda sección se desliza en el inte-
rior de la primera, de la cual está sus-
pendida mediante tres muelles. A su
vez, la primera etapa está suspen-
dida del armazón exterior también
mediante tres muelles. La segunda
sección lleva el corazón del micros-
copio: la muestra y el dispositivo de
barrido de la punta.
Cuando el conjunto del microscopio
está en vacío, la resistencia al movi-
miento es mínima y ambas etapas de
suspensión podrían oscilar casi inde-
finidamente bajo cualquier pertur-
bación. El fenómeno del amortigua-
miento por corrientes de Foucault es
lo que utilizamos para detener este
movimiento. Para ello, se colocan unas
placas de cobre en la parte inferior de
ambas secciones que se deslizan entre

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 27

 unos imanes permanentes y sujetos
al armazón exterior. Al deslizarse las
placas arriba o abajo, el campo mag-
nético hace que los electrones de con-
ducción del cobre se muevan indu-
ciendo las llamadas corrientes de
Foucault. La interacción entre las
corrientes inducidas y el campo mag-
nético frena el movimiento de las pla-
cas y protege, por tanto, el microsco-
pio hasta de las vibraciones más
pequeñas.
Una vez eliminadas las vibraciones
externas, se acomoda la muestra. Nos
servimos para ello de un dispositivo
especialmente desarrollado que trans-
porta la muestra a través de una placa
metálica horizontal situada en la
segunda etapa. El cuerpo del porta-
muestras consiste en una lámina de
material piezoeléctrico que se expan-
de o se contrae al aplicarle un voltaje.
El portamuestras posee tres pies
metálicos, dispuestos en un trián-
gulo, que están recubiertos de una
capa delgada de material aislante.
Los pies pueden fijarse a la placa
metálica aplicando un voltaje entre
ellos y ésta.
Movemos el portamuestras de la
manera que a continuación detalla-
mos. Supongamos, por ejemplo, que
fijamos sólo un pie y aplicamos un vol-
GERD BINNIG Y HEINRICH ROHRER
taje al cuerpo del piezoeléctrico, que
así se contrae. Los otros dos pies se
moverán ligeramente. A continua-
ción, fijamos las otras dos patas, sol-
tamos la tercera y quitamos el poten-
cial aplicado de suerte que el cuerpo
se estire de nuevo hasta su tamaño
original. El portamuestras se ha mo-
vido justamente un paso. El tamaño
del paso se puede regular entre 100
L a resolución lateral del microsco-
y 1000 angstrom. El portamuestras
caminará a lo largo de la placa en la
dirección deseada, ya que puede girar
alrededor de cualquiera de sus patas.
Cuando el portamuestras ha lle-
vado la muestra hasta la posición de
túnel elegida, empezamos a barrer
la superficie de la muestra. Para
mover la punta de la aguja de barrido
se emplea un trípode rígido hecho de
tres barras de material piezoeléc-
trico. Cuando aplicamos un voltaje
para expandir o contraer una de las
barritas, las otras dos se tuercen lige-
ramente. En consecuencia, la punta
se mueve en línea recta distancias
de hasta 10.000 angstrom. Más aún,
el movimiento es muy sensible a la
magnitud del voltaje aplicado: un vol-
taje de 0,1 volt produce un movi-
miento de 1,0 angstrom. La precisión
del movimiento del trípode es finí-
sima, hasta el extremo de que la reso-
lución vertical obtenida hoy sobre la
superficie de la muestra queda limi-
tada sólo por las vibraciones. En el
momento actual esta resolución se
halla en el rango de contadas centé-
simas de angstrom.
pio está limitada por lo afilada
que sea la punta. Con respecto a esto,
la naturaleza ha sido generosa con el
microscopio túnel. Es relativamente
fácil hacer una punta afilada que nos
dé una resolución lateral de 6 a 12
angstrom: sólo hace falta pulir la
punta de una aguja, normalmente de
tungsteno.
Ahora bien, si se desea una resolu-
ción lateral de dos angstrom, la aguja
debe tener un solo átomo al final de
la punta. Normalmente ese átomo
viene de la misma muestra. Lo despla-
zan de ella altos campos eléctricos
producidos al aplicar una diferencia
de potencial de entre 2 y 10 volt entre
la muestra y la punta. La suerte
desempeña un papel importante en
este paso final y por eso estamos inten-
tando afilar la punta mediante bom-
bardeo con un haz de iones de alta
energía. Así se pueden eliminar áto-
mos de la superficie de un modo muy
controlado.

4. SUPERFICIE DE SILICIO visualizada por el microscopio de efecto
túnel; consiste en un conjunto de celdas unidad de forma romboi-
dal. Cada celda mide 27 angstrom (un angstrom es una diezmilmi-
llonésima de metro, 1 Å = 10–10 m) de lado. La celda se llama 7 por 7
porque cada lado mide siete distancias atómicas. Cada 7 por 7 con-
tiene 12 protuberancias en dos grupos de seis. Las protuberancias
parecen corresponder a las superficies de los átomos individuales.
Se elevan 1,3 angstrom sobre el resto. La imagen se obtuvo apli-
cando un voltaje para que los electrones pasaran de la punta a la
superficie.

28 TEMAS 29
 Además de delinear la topografía

GERD BINNIG Y HEINRICH ROHRER

atómica de la superficie, el micros- 20
copio de efecto túnel revela la com-
posición atómica. La corriente de
túnel depende de la distancia de túnel
y de la estructura electrónica de la
superficie. Ahora bien, cada elemento
atómico posee una estructura elec-
trónica característica.

ANGSTROM [001]
La capacidad del microscopio para
resolver tanto la topografía como la
estructura electrónica lo hace útil 10
para la investigación en física, quí-
mica o biología. Estudiamos en pri-
mer lugar un caso simple: las estruc-
turas topográficas de monocristales
caracterizados por una estructura
superficial homogénea. Los cristales
constan de capas atómicas idénticas
que se apilan ordenadamente unas
sobre otras. Resultados de experi-
mentos de difusión de electrones o 0
0 10 20
átomos indicaban que la capa supe-
rior difería de las otras y era más ANGSTROM [110]
compleja, pero resultaba difícil deter-
minar la estructura detallada de esta [110]
capa superficial.
La estructura de superficie más Z [001]
conocida es la celda unidad de sili-
cio. La celda unidad tiene forma de
rombo; cada borde de la celda mide
siete distancias atómicas, por lo que
la celda se denomina 7 por 7. Cada 7
por 7 contiene 12 protuberancias, que
no se habían visualizado antes. Cada
protuberancia corresponde manifies- [110]
tamente a un solo átomo. Aunque de
estética agradable, la disposición de Y [010]
los átomos de la superficie reviste
suma complejidad. En cambio, las X
estructuras de las capas interiores [100]
del silicio son relativamente simples. [001]
Su celda unidad es 49 veces menor
que la 7 por 7 y contiene sólo dos áto-
mos. Otra diferencia radica en el he-
cho de que la capa superficial es mu-
cho más rugosa que cualquier capa
del volumen. Aunque ahora se conoce
3,5 ANGSTROM

la estructura superficial y ha sido

posible obtener una gran cantidad
de información sobre ella a través de
otros experimentos, se ignora por qué
razón la superficie forma esta estruc-
tura y no otra cualquiera.
IAN WORPOLE

Otro cristal cuya superficie se com-
prende ahora mejor es el de oro. Hemos
encontrado que, al cortar el cristal en
una dirección paralela a sus capas
atómicas, la cara resultante es plana.
En cambio, un corte en una dirección
diagonal a las capas atómicas pro-
duce una superficie más rugosa. Así
como el estudio actual de la corteza
terrestre nos ayuda a comprender que
ésta se formó hace millones de años,
el estudio de las superficies nos permi-
te entender cómo se modificaron desde
que se cortaran. Las teorías actuales
ROM
NGST
5,0 A
5. OXIGENO ADSORBIDO en níquel (arriba) observado en escala atómica. Los átomos de oxíge-
no (color) están separados 3,5 angstrom en una dirección, llamada [001], y 0,5 angstrom en la
-
otra [110]. El modelo del cristal de níquel cúbico centrado en las caras (abajo) sugiere la razón
para ello. La geometría del modelo predice que si la distancia entre dos átomos de níquel con-
-
tiguos a lo largo de la dirección [001] es de 3,5 Å el espaciado a lo largo de la dirección [110]
será de 2,5 Å. Sin embargo, la repulsión electrónica entre dos átomos de oxígeno es demasia-
do grande para permitirles permanecer establemente en puntos de la red separados tan sólo
-
2,5 angstrom. Por tanto, los átomos de oxígeno que caigan a lo largo de la dirección [110] dis-
tarán entre sí, por lo menos, dos veces el parámetro de red, lo que corresponde a la distancia
observada de 5,0 angstrom. A veces se observan separaciones de cinco veces el parámetro
de red, pero nunca de tres o cuatro veces. Habrá que investigar la causa de esta anomalía.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 29

 predicen que la superficie cortada dia-
gonalmente adquiere una estructura
dentada porque esa configuración
tiene una energía menor que la con-
figuración plana y, consecuentemente,
es más estable.
U na rama más exótica de la física,
el estudio de la superconduc-
tividad, se ha beneficiado también
de la aplicación de la microscopía de
efecto túnel. El material supercon-
ductor se caracteriza por su completa
falta de resistencia eléctrica. El uso
de cables superconductores libres de
pérdidas por calentamiento ahorra-
ría cantidades enormes de energía
eléctrica. Así, por ejemplo, el acele-
rador para la colisión de haces de par-
tículas del Fermilab utiliza imanes
superconductores para alcanzar ele-
vados campos magnéticos ahorrando
energía. Hay un inconveniente, sin
embargo. Se sabe que la supercon-
ductividad sólo ocurre en algunos
conductores cuando han sido enfria-
HEINRICH ROHRER
6. EL COLLAR DEL VIRUS Ø 29 conecta la cabeza del microorga-
nismo a su cola. Gracias a micrografías electrónicas sin procesar
como ésta ofrecida aquí, se ha logrado poner de manifiesto la es-
30
dos por debajo de una temperatura
crítica, unos pocos grados por encima
del cero absoluto (–273,15 grados cen-
tígrados).
Un grupo de investigadores de la
Universidad de Stanford, dirigidos
por Calvin F. Quate, ha desarrollado
un microscopio de efecto túnel que
opera a bajas temperaturas. Usaron
su microscopio para visualizar la
estructura electrónica de las super-
ficies de varios conductores a tem-
peratura ambiente. Enfriaron luego
los conductores por debajo de la tem-
peratura crítica de cada uno y estu-
diaron los cambios en su estructura
electrónica. Este grupo puede pre-
sentar pruebas experimentales del
crecimiento de las regiones super-
conductoras en las superficies.
El microscopio de efecto túnel ha
posibilitado una comprensión más
detallada de ciertas reacciones quí-
micas. Nuestro grupo ha observado
en una escala atómica la adsorción
de oxígeno en níquel (véase la figu-
tructura del collar. El conocimiento detallado de dicha estructura
resulta decisivo para controlar la propagación de ciertas infec-
ciones víricas.
ra 5). Nuestras observaciones con-
firman resultados previos de expe-
rimentos de difusión: la distancia
entre los átomos de oxígeno adsor-
bidos sobre la superficie del níquel
varía con la dirección. En particular,
los átomos de oxígeno que están a lo
largo de una cierta dirección, lla-
mada [001], están separados por una
distancia igual al parámetro de red;
esto es, la distancia entre dos átomos
de níquel contiguos a lo largo de esa
dirección. En cambio, los átomos de
oxígeno a lo largo de la dirección
- per-
pendicular, llamada [11 0], están
separados dos o cinco parámetros de
red, pero nunca uno, tres o cuatro.
Sospechamos que esta anomalía la
causa algún tipo de efecto de apan-
tallamiento entre las cargas eléctri-
cas del níquel y del oxígeno, pero se
requiere una investigación exhaus-
tiva para determinar los detalles de
la interacción real.
Todas las aplicaciones que hemos
examinado hasta ahora se basan en
TEMAS 29
la capacidad del microscopio para
detectar estructuras cuyas dimen-
siones se miden en fracciones de angs-
trom. Tan alta resolución no siempre
es necesaria. Hay algunos campos de
investigación donde, si bien la reso-
lución del microscopio de efecto túnel
sea tan sólo de algunas decenas de
angstrom, podemos esperar, en vir-
tud de resultados ya obtenidos, que
su uso producirá información nueva
y valiosa y estimulará progresos sig-
nificativos. En particular, para mu-
chas aplicaciones, la posibilidad de
operar el microscopio de efecto túnel
en aire a presión atmosférica com-
pensará con creces la pérdida de reso-
lución que hubiere.
U na de estas aplicaciones se en-
cuentra en el estudio de la fric-
ción. Para minimizar las pérdidas de
energía asociadas al rozamiento, los
investigadores están interesados en
conocer mejor la estructura y las cau-
sas de la rugosidad superficial del
material industrial. Recientes estu-
dios sugieren que el microscopio de
efecto túnel resulta especialmente
adecuado para este tipo de trabajo.
Nuestro microscopio ha demostrado
también su utilidad en biología, aun-
que sólo alcance hoy resoluciones late-
rales de unos 10 angstrom. Este es
otro caso en que la relativamente baja
resolución del microscopio queda más
que compensada por su capacidad
para suministrar un método directo
y no destructivo de visualizar mues-
tras biológicas.
Otros microscopios destruyen par-
cialmente las muestras enfocadas.
Así, en microscopía electrónica con-
vencional, las muestras deben recu-
brirse con una delgada capa metálica
y, ya que se estudian en vacío, se
secan. Este proceso podría alterar las
muestras de un modo indeseable —e
incontrolable— pues las moléculas
de agua constituyen parte esencial de
las substancias biológicas. En el
microscopio de efecto túnel puede
incluso usarse agua como barrera ais-
lante entre la muestra y la aguja de
sondeo. (El agua es un conductor rela-
tivamente pobre, a no ser que con-
tenga iones como los que se forman
cuando se disuelve cloruro sódico en
ella.) Explotando la sensibilidad del
microscopio de efecto túnel hemos
barrido la superficie del ácido nucleico
ADN con la ayuda de E. Courtens, del
laboratorio de investigación de IBM
en Zurich, y de H. Gross y J. Sogo,
del Instituto Politécnico Federal.
Hemos observado una serie de zigzags
correspondiente a la estructura heli-
coidal del ADN.
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
En un esfuerzo cooperativo con los
físicos españoles Arturo Baró, Nicolás
García y Rodolfo Miranda, de la Uni-
versidad Autónoma de Madrid, y el bió-
logo José L. Carrascosa, del Centro de
Biología Molecular, hemos confirmado
que la cabeza del virus conocido como
Ø 29 mide 400 × 300 × 200 angstrom.
Ha quedado desvelada la estructura
de la conexión entre la cabeza y la cola
del virus, llamada collar, que parece
desempeñar un papel significativo en
el proceso de infección. El resultado
está de acuerdo con lo que se conocía
a partir de microfotografías de micros-
copio electrónico procesadas.
Además de producir imágenes, la
punta de sondeo servirá para com-
probar circuitos electrónicos. En
efecto, las sondas que verifican los
componentes electrónicos deben ser
miniaturizadas al mismo ritmo que
los propios componentes. La punta
puede valer de sonda local del voltaje
así como de fuente de corriente.
En todas las aplicaciones descritas
es vital que el proceso de obtención
de la imagen no destruya ni altere el
objeto. Pero el microscopio de efecto
túnel promete también ser una herra-
mienta para estimular procesos quí-
micos específicos. Una de las carac-
terísticas notables del microscopio es
poseer un haz de electrones de baja
energía extremadamente bien foca-
lizado: su corriente túnel. La ener-
gía del haz puede estar precisamente
en el rango de energías de la mayo-
ría de los procesos químicos. Por tan-
to, ajustando el haz a energías especí-
ficas, los investigadores pueden
provocar a voluntad ciertas reaccio-
nes. Este modo de operación del
microscopio y las otras capacidades
del instrumento parecen abrir una
gama de posibilidades de investiga-
ción completamente nueva.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
ENERGY GAP IN SUPERCONDUCTORS MEA-
SURED BY E LECTRON T UNNELING . Ivar
Giaever en Physical Review Letters, volu-
men 5, n.o 4, págs. 147-148; 15 de agos-
to de 1960.
(111) FACETS AS THE ORIGIN OF RECON-
STRUCTED AU(110) SURFACES. G. Binnig,
H. Rohrer, Ch. Gerber y E. Weibel en Sur-
face Science, vol. 131. n.o 1, págs. L379-
384; agosto, 1983.
REAL-SPACE OBSERVATION OF 2 X 1 STRUC-
TURE OF C HEMISORBED O XYGEN ON
NI(110) BY SCANNING TUNNELING MI-
CROSCOPY. A. M. Baró, G. Binnig, 11.
Rohrer, Ch. Gerber, E. Stoll, A. Baratoff
y F. Salvan en Physical Review Letters,
vol. 52, n.o 15, págs. 1304-1307; 9 de abril
de 1984.
31
 Microscopía
confocal
Esta técnica microscópica
no tiene rival para la producción de imágenes nítidas,
sean planas o en tres dimensiones
Jeff W. Lichtman
M
arvin Minsky es el padre de
la inteligencia artificial.
También es autor de otro im-
portante logro. En los años cincuenta
construyó un microscopio óptico revo-
lucionario, que le permitía observar
con claridad capas sucesivas de una
muestra sin tener que rebanar el espé-
cimen en finos cortes. Minsky no reci-
bió el debido reconocimiento cuando
patentó su “microscopio de barrido por
etapas, de doble enfoque”. En los die-
cisiete años de vigencia de la patente
no percibió derechos ni royalties, y no
se fabricó ningún instrumento de con-
cepción similar.
Treinta años después, su método
—hoy denominado “microscopía con-
focal”— ha prendido con fuerza y se
ha tomado la revancha, hasta conver-
tirse en uno de los progresos más
notables de la microscopía óptica de
nuestro siglo. No está claro si el inte-
rés que suscita ha sido encendido por
JEFF W. LICHTMAN
32
el redescubrimiento de los primeros microscopía óptica ordinaria a la iden-
trabajos de Minsky o por la reinven- tificación de las sutiles intercone-
ción de su idea por otros. Sea como xiones de las neuronas de un corte
fuere, el feliz resultado es que ahora cerebral se tropieza con un grave obs-
contamos con docenas de tipos de táculo técnico.
microscopios confocales, en una gama En los microscopios ópticos, cuando
que va desde lo rudimentario hasta el objetivo enfoca luz tomada de pla-
lo barroco. nos situados por debajo de la super-
Minsky desarrolló la técnica mien- ficie del tejido cerebral (o de cual-
tras reflexionaba sobre el funciona- quier material grueso y translúcido),
miento del cerebro. Razonó que, si la imagen se torna rápidamente
fuera posible cartografiar las cone- incomprensible. Tratar de ver ele-
xiones entre todas las neuronas, el mentos nerviosos profundos de tal
diagrama circuital revelaría indicios tejido equivale a tratar de localizar
del modo en que opera el cerebro. Por un objeto hundido en una charca cena-
desdicha, al aplicar las técnicas de la gosa proyectando sobre el agua una
1. GRANOS DE POLEN de girasol (arriba) y de pino (serie inferior). Estos “retratos” han sido
preparados a partir de imágenes obtenidas con un microscopio confocal de planos sucesi-
vos de cada grano. Un ordenador digitalizó dichas imágenes —llamadas secciones ópticas—
y las combinó. Tales reconstrucciones digitales pueden observarse en cualquier orientación;
el polen de pino se muestra (de izquierda a derecha) en vista lateral, en vista lateral opues-
ta, girado 72 grados respecto a la primera posición, y desde arriba.
TEMAS 29
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 33
MATTHEW H. CHESTNUT

2. UNA MICROCAPSULA DE POLIMERO rellena de fluido (esfera
grande), de 0,1 milímetros de diámetro. La imagen se obtuvo a par-
tir de una pila de secciones ópticas, entre las que se contaban las
esferas menores aquí mostradas. Las imágenes fueron preparadas
por Matthew H. Chestnut para comparar la integridad estructural
de esta cápsula con la de otras con diferente composición. Se dis-
tingue la cápsula (en verde) del fluido que la llena marcando estos
componentes con tintes diferentes. El análisis detallado de muchas
vistas no reveló roturas en la cápsula, pero sí ciertas fugas del flui-
do interior.

linterna: la luz es reflejada por tan-
tas y tan diminutas partículas que
resulta imposible distinguir el objeto
de su entorno.
Para conseguir una represen-
tación nítida de un plano individual
de una muestra, lo ideal sería recoger
luz reflejada del plano de interés y
sólo desde él. Pero el material
situado por encima y por debajo de
ese plano también devuelve luz,
creando imágenes borrosas. Al mis-
mo tiempo, el fenómeno de disper-
sión puede reducir el contraste. La
dispersión se produce al incidir la
luz sobre partículas diminutas y
reflejarse de ellas, incidiendo de
nuevo en otras partículas y así hasta
alcanzar la superficie detectora. Las
señales producidas por esta luz des-
viada al azar no aportan informa-
ción; crean un resplandor difuso que
tiende a encubrir la luz procedente
del plano de interés.
C on unas pocas modificaciones en
el microscopio normal Minsky
minimizó la difuminación de la ima-
gen y reforzó el contraste. Evitó que
se produjera gran parte de la dis-
persión; para ello hizo pasar la luz
de iluminación a través de un obje-
tivo que enfocaba los rayos en un haz
bicónico, cuya forma recuerda un reloj
de arena. Después llevó el foco de este
haz (la angostura en el reloj de arena),
que es un punto de luz nítido e intenso,
sobre una porción mínima de la mues-
tra, a la profundidad deseada. Tal
proceder garantizaba que esa zona
sería la más intensamente iluminada
del espécimen y, por tanto, la que
reflejase más luz. Igual de impor-
tante es que, al enfocar un área,
Minsky garantizaba que el resto de

34 TEMAS 29

3. LA RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL de una neurona es la
“estrella” de esta secuencia de fotogramas. La estructura que ve-
mos en los sucesivos cuadros está girada unos 10 grados en tor-
no a un eje vertical con respecto a cada cuadro anterior. La se-
la muestra apenas recibi-
ría iluminación, supri-
miendo con ello la disper-
sión. La microscopía óptica
al uso iluminaría la mues-
tra entera y se desviaría la
luz incidente.
La estrategia de enfocar
la iluminación sobre una
región circunscrita limitaba
la dispersión total. Pero no
impedía que la luz fuese
devuelta y dispersada por
el tejido iluminado supra-
yacente e infrayacente a la
zona de interés (el tejido
que se encuentre dentro de
las porciones cónicas del
haz iluminador). Gracias a
un segundo ajuste Minsky
impidió también que gran
parte de esta luz espuria
alcanzase la superficie de-
tectora; sabía que la luz
devuelta era enfocada por
el objetivo en un plano
situado muy por encima de
la muestra. Colocó en ese
plano una máscara con una
abertura diminuta, que dis-
puso de modo que la luz de
retorno pasara a su través
hasta la superficie detec-
tora. El resultado fue impre-
sionante: la señal proce-
dente del punto iluminado
pasaba íntegra a través del
orificio de la pantalla y al-
canzaba la superficie de-
tectora; al propio tiempo,
la máscara eliminaba casi
toda la luz procedente del
tejido exterior al punto. Se
formaba así una imagen
casi perfecta del punto,
esencialmente no pertur-
bada por la dispersión ni
difuminada por la luz pro-
cedente de zonas no enfo-
cadas.
El problema obvio que
planteaban las dos prime-
ras fases del método de
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
JEFF W. LICHTMAN
cuencia constituye una película de la célula, vista en rotación.
Para ver la neurona en tres dimensiones, deberá mirar con los
ojos bizcos un par de imágenes; cada ojo tiene que estar enfo-
cado en una imagen diferente.
Minsky era que éstas pro-
porcionaban una imagen
nítida, sí, pero sólo de un
punto diminuto. Para pro-
ducir una representación
del plano entero, añadió
una característica más: la
exploración secuencial por
líneas, o “barrido”. Corrió
la muestra poquito a poco,
barriendo el plano de enfo-
que con el punto luminoso
a lo largo de líneas parale-
las inmediatas. Al final, ca-
da una de las áreas yacen-
tes a una profundidad dada
visitaba el haz iluminador
fuertemente concentrado,
enviando en secuencia una
señal clara a través del ori-
ficio filtrante hasta el de-
tector. Minsky maniobraba
la muestra con dos diapa-
sones electromagnéticos de
horquilla. Uno lo desplaza-
ba a lo largo de cada línea
y el otro lo hacía pasar de
una línea a la siguiente
paralela del plano.
P ara ver la imagen com-
pleta de un plano, ha-
cía que la luz que atrave-
saba el orificio incidiera en
un detector fotomultipli-
cador. Este detector, a su
vez, generaba un flujo de
STEPHEN J. SMITH Y MICHAEL E. DAILEY
señales eléctricas con las
que se confeccionaba una
imagen en una pantalla de
larga persistencia, tomada
de un radar. Subiendo o
bajando el objetivo y repi-
tiendo el proceso de barrido,
aparecía en la pantalla otro
4. NEURONAS ACTIVAS (objetos coloreados) resaltadas en este cor- plano de la muestra. La
te de tejido cerebral de un roedor. La figura es una compilación, ge- elección de una pantalla
nerada por ordenador, de tres imágenes confocales realizadas, con grande fue un error táctico.
12 segundos de diferencia, por Michael E. Dailey y Stephen J. Smith. Cuando Minsky les pedía a
Cada punto temporal se codificó mediante un color, rojo primero, ver- sus colegas que examinaran
de luego y por fin azul. La imagen nos revela que las neuronas se ex- el artilugio, éstos solían
citaron en instantes distintos y se mantuvieron activas durante dos tener dificultad para inter-
de los pulsos (así la célula amarilla) o durante los tres (blanca). pretar la imagen que esta-
35
JARED SCHNEIDMAN/JSD (dibujos), JEFF W. LICHTMAN Y SUSAN CULICAN (fotografías)

Así funciona la microscopía confocal

os microscopios confocales consiguen elevada resolu-
L ción en un plano seleccionado merced a tres procesos
fundamentales. En el primero, se enfoca luz (amarilla en a)
mediante una lente objetivo, creando un haz bicónico cuyo
vértice o foco ilumina una zona de la muestra, a la profun-
didad deseada. A continuación, la luz reflejada por esa área
(azul) es enfocada y concentrada en un punto, permitién-
dosele que pase en su totalidad a través de una abertura
de una máscara situada frente a un dispositivo detector. Las
regiones opacas que rodean al orificio de filtrado cierran el
paso a los rayos reflejados por la regiones suprayacentes
(en rojo en b) e infrayacentes (en naranja) del plano de inte-
rés. Por último, la luz se traslada de una zona a otra hasta
explorar el plano por completo. La nitidez que esta técnica
proporciona resulta evidente en las fotografías al pie, obte-
nidas, respectivamente, con un microscopio tradicional
(izquierda) y con uno confocal (derecha). Ambas imágenes
corresponden a un mismo músculo de ratón, marcado por
fluorescencia para resaltar los puntos que entran en con-
tacto con una neurona motora. Para acelerar el barrido, se
incorpora un disco provisto de cientos de finos orificios, a
través de los cuales se envía y recoge la luz (c).

a
a PINHOLE cc
APERTURE DETECTOR
DETECTOR

ORIFICIO
FINO BEAM- DES-
ESPEJO
SPLITTING
DOBLADOR
MIRROR
DEL HAZ

LIGHT
FUENTE
SOURCE
LUMINOSA
LENS
LENTE
BEAM-SPLITTING
ESPEJO DESDOBLADOR
DEL HAZ
MIRROR

FUENTE
LIGHT b
b
SOURCE
LUMINOSA

DISCO
SPINNING
OBJECTIVE
OBJETIVO GIRATORIO
DISK

OBJECTIVE
OBJETIVO

PLANE
PLANO DE OF FOCUS
ENFOQUE

SPECIMEN
MUESTRA
SPECIMEN
MUESTRA

36 TEMAS 29

5. LA TEXTURA SUPERFICIAL de una pastilla (“chip”), mostrada en
una micrografía óptica normal (izquierda) y en una imagen confocal
compuesta (derecha). En esta última se han superpuesto los barri-
ban viendo. Como Minsky dedujo más
tarde, la imagen presentada era exce-
sivamente grande.
“Les mostré el microscopio confocal
a muchos visitantes, pero nunca pare-
cieron muy impresionados con lo que
veían en la pantalla de radar”, cuenta.
“No caí en la cuenta hasta mucho des-
pués de que no basta sólo con que un
instrumento posea elevado poder de
resolución; es preciso también que la
imagen parezca nítida. Tal vez el cere-
bro humano precise de cierto grado
de compresión foveal para aplicar sus
facultades visuales más sobresalien-
tes. En cualquier caso, debí haber uti-
lizado película fotográfica ¡o cuando
menos, haber instalado una pantalla
más pequeña!” Pero Minsky no hizo
ni lo uno ni lo otro.
I nvestigadores y fabricantes han
ideado muchos métodos para com-
binar las características esenciales de
la microscopía confocal: iluminación
de una pequeña porción de la mues-
tra, filtrado de la luz de retorno a tra-
vés de una abertura alineada con la
región iluminada y barrido del espé-
cimen. La muestra suele permanecer
quieta; en casi todos los dispositivos
es el haz luminoso el que viaja. Para
acelerar la velocidad de adquisición
de la imagen, algunos microscopios
desplazan el haz con espejos osci-
lantes, que obligan a la luz incidente
en ellos a fluir raudamente a través
de una muestra, que es barrida como
barre el rayo electrónico la pantalla
de un televisor. Estos espejos per-
miten reconstruir una imagen en
menos de un segundo. Tales instru-
mentos exigen fuentes luminosas de
más brillo que las que Minsky tenía
a su disposición; después de todo, han
de producir de cada zona una señal
que sea detectable casi instantánea-
mente. Los láseres, muy intensos y
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
dos a tres profundidades. El nivel más profundo es verde; el más al-
to, rojo. Se obtiene así información que no es posible captar en la mi-
crofotografía ordinaria.
fáciles de enfocar en zonas pequeñí-
simas, se utilizan para este propósito.
Para ahorrar tiempo se emplean
también múltiples puntos de luz que
exploren simultáneamente diferentes
regiones de la muestra. Algunos de
estos dispositivos incorporan discos
giratorios provistos de muchas aber-
turas, a través de las cuales pasa la
luz de iluminación y la de retorno.
Otros equipos se valen de sistemas
de rendija, que abrevian el tiempo de
barrido iluminando líneas en vez de
puntos. Las técnicas de barrido rápido
han permitido la observación de pla-
nos completos de un espécimen en
tiempo real, muchas veces, directa-
mente a través de un ocular.
Casi todos los microscopios con-
focales modernos sacan partido de
otro avance revolucionario: el proce-
samiento digital de imágenes. Con-
forme un microscopio confocal barre
planos sucesivos de la muestra, pro-
duce una pila de imágenes, cada una
de las cuales constituye una sección
óptica; tales secciones vienen a ser
imágenes de finos cortes. Los pro-
gramas de procesamiento de imáge-
nes no sólo registran el brillo de cada
zona de cada sección, sino también
la ubicación de esa área en la mues-
tra, o sea, su localización en un plano
individual (las coordenadas x e y) así
como la profundidad de éste (la coor-
denada z). Los lugares definidos
mediante la terna de coordenadas se
llaman “vóxeles”, equivalentes en tres
dimensiones de los elementos de ima-
gen, o “píxeles” de una imagen bidi-
mensional.
Los programas de procesamiento de
imágenes compilan vóxeles y prepa-
ran con ellos reconstrucciones tridi-
mensionales de objetos microscópicos.
También manipulan vóxeles, lo que
permite hacer girar alrededor de un
eje las imágenes reconstruidas y
JEFF W. LICHTMAN
observarlas desde todos los ángulos.
Gracias a esta técnica nos es dado
efectuar rápidamente observaciones
que de otra forma hubieran resul-
tado sumamente caras y laboriosas.
Por ejemplo, en investigación cere-
bral, los sistemas de microscopios
confocales conectados a ordenadores
han resultado valiosísimos para des-
cubrir la estructura del sistema ner-
vioso, y en ellos se apoya la observa-
ción de tejidos cerebrales vivos.
L a microscopía confocal se ha con-
vertido en una aglutinación ul-
trarrefinada de láseres, instrumen-
tos ópticos, sistemas electromecáni-
cos de barrido y de procesamiento
informático de imágenes. Ha dado a
la microscopía la capacidad de ver el
interior de los objetos y de crear, casi
a voluntad, imágenes estereoscó-
picas. El sueño de Minsky —la carto-
grafía microscópica de los circuitos
cerebrales— parece estar cobrando
realidad.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
AN EVALUATION OF CONFOCAL VERSUS
CONVENTIONAL IMAGING OF BIOLOGICAL
STRUCTURES BY FLUORESCENCE LIGHT
MICROSCOPY. J. G. White, W. B. Amos y
M. Fordham, en Journal of Cell Biology,
volumen 105, n.o 1, páginas 41-48; julio
de 1987.
M EMOIR ON I NVENTING THE C ONFOCAL
SCANNING MICROSCOPE. M. Minsky en
Scanning, vol. 10, n.o 4, páginas 128-138;
julio/agosto de 1988.
HIGH-RESOLUTION IMAGING OF SYNAPTIC
STRUCTURE WITH A SIMPLE CONFOCAL
MICROSCOPE. J. W. Lichtman, W. J. Sun-
derland y R. S. Wilkinson en New Biolo-
gist, vol. 1, n.o 1, páginas 75-82; octubre
de 1989.
CONFOCAL MICROSCOPY. Recopilación de
Tony Wilson. Academic Press, 1990.
37
Microscopios
de rayos X
Los trabajos en microscopía de rayos X blandos culminaron en el decenio
de 1980 con la construcción de instrumentos cuya resolución
decuplicaba la del microscopio óptico. En este artículo de 1991,
algunos de sus creadores detallan la historia de ese logro
Malcolm R. Howells, Janos Kirz y David Sayre
C
ada adelanto en las técnicas
microscópicas ha proporcio-
nado a los científicos nuevas
perspectivas sobre el funcionamiento
de los organismos vivos y la natura-
leza de la propia materia. La inven-
ción del microscopio de luz visible a
finales del siglo XVI mostró un reino
antes desconocido de plantas y ani-
males unicelulares. El desarrollo de
la cristalografía de rayos X a princi-
pios del siglo XX ofreció las primeras
imágenes precisas de la materia con
“resolución atómica”. Durante las
décadas siguientes, los microscopios
electrónicos han proporcionado imá-
genes directas de virus y minúsculas
estructuras superficiales. Ahora, otro
tipo de microscopio que utiliza ra-
yos X en vez de luz visible o electro-
nes aporta un modo diferente de exa-
minar los detalles diminutos.
Los microscopios de rayos X tienen
una resolución bastante mejor que la
de los microscopios ópticos. Sirven,
además, para trazar mapas de la dis-
tribución de ciertos elementos quími-
cos. Algunos pueden formar imáge-
nes en tiempos brevísimos, y los hay
incluso que prometen capacidades
tan especiales como la de obtener
imágenes tridimensionales. A diferen-
cia del microscopio electrónico con-
vencional, el microscopio de rayos X
permite mantener los especímenes
al aire y en agua, lo que significa que
las muestras biológicas pueden ser
estudiadas bajo condiciones simila-
res a las de su estado natural. La ilu-
minación usada, rayos X “blandos”
en el rango de longitud de onda de 20
a 40 angstroms (un angstrom es la
diezmilmillonésima parte de un
metro), es, además, lo suficientemente
penetrante como para producir en
muchos casos imágenes de células
38
biológicas sin alterar. Debido a la lon-
gitud de onda de los rayos X emplea-
dos, los microscopios de rayos X
blandos nunca alcanzarán una reso-
lución más alta que la posible con
microscopios de electrones. Pero sus
propiedades especiales harán viables
investigaciones que complementen
las realizadas con instrumentos ba-
sados en la luz visible y en los elec-
trones.
El sueño de construir un micros-
copio de rayos X data de 1895, cuando
Wilhelm Röntgen, de la Universidad
de Würzburg, descubrió los rayos X.
La capacidad de los rayos X para pe-
netrar en objetos sólidos aportó un
motivo de peso para utilizarlos en
microscopía. Sin embargo, los cien-
tíficos descubrieron rápidamente que
no se podía refractar o reflejar rayos
X del mismo modo que se hacía con
la luz visible. Las primeras imáge-
nes se realizaron, por contra, me-
diante la proyección de rayos X a tra-
vés de un espécimen puesto en
contacto con una película fotográfica
ordinaria. Los rayos X que atravesa-
ban el espécimen impresionaban la
película; la imagen resultante podía
examinarse con un microscopio óptico.
Esta forma de microscopía de rayos
X, conocida como microrradiografía
de contacto, se sigue empleando toda-
vía hoy en día.
A principios del siglo XX se conocía
la naturaleza de los rayos X: ondas
electromagnéticas que tan sólo dife-
rían de la luz visible en que tenían
una longitud de onda mucho más
corta. Este descubrimiento implicaba
que la microscopía de rayos X ofre-
cía un posible camino hacia la alta
resolución. La longitud de onda de la
luz visible limita la máxima resolu-
ción del microscopio óptico a unos
2500 angstrom. Los microscopios ópti-
cos construidos hace más de un siglo
ya se aproximaban mucho a ese límite.
Los biólogos se dieron cuenta de que,
para comprender la organización y
función de las células, se necesitaba
una mejor resolución y pensaron que
los rayos X, con una longitud de onda
más corta, podrían servirles.
Por desgracia, el gran tamaño de
grano de las películas fotográficas
ponía un freno a la microrradiogra-
fía de contacto. El microscopio óptico
utilizado para examinar la película
impresionada limitaba aún más esta
técnica. Por culpa de estas limita-
ciones la primitiva microscopía de
rayos X no pudo igualar, ni mucho
menos superar, la resolución de la
microscopía óptica ya existente. Se
necesitaba un sistema que pudiera
producir una imagen de rayos X foca-
lizada. El desarrollo de tal sistema
resultó ser una tarea difícil, que sólo
se está consiguiendo actualmente.
E n 1923, Arthur H. Compton mos-
tró que los rayos X podían ser
eficientemente reflejados por super-
ficies muy bien pulidas, si los rayos
incidían sobre ellas con un ángulo
rasante pequeño. Con una superficie
de forma apropiada, los rayos X po-
dían focalizarse y, así, producir imá-
genes ampliadas similares a las obte-
nidas mediante sistemas ópticos
convencionales. A finales de los años
cuarenta, Paul H. Kirkpatrick y su
grupo de la Universidad de Stanford
decidieron construir un microscopio
de rayos X de alta resolución basado
en este principio, pero su esfuerzo
por obtener una resolución mejor que
la del microscopio óptico fracasó. Las
aberraciones y las pequeñas tole-
rancias en la manufactura de las
TEMAS 29
superficies que este diseño requería
planteaban serias limitaciones.
Mientras que las prestaciones de los
microscopios de rayos X no mejora-
ban, un competidor —el microscopio
electrónico— efectuaba rápidos pro-
gresos. Así, durante los años cuarenta,
los microscopios electrónicos alcan-
zaban rutinariamente una resolución
mejor que la obtenida con microsco-
pios de luz visible. La comunidad de
biólogos, por su parte, empezó a de-
sarrollar las técnicas de preparación
de especímenes necesarias para apro-
vechar las capacidades del microsco-
pio electrónico. Desde entonces, la
microscopía electrónica se ha con-
vertido en una herramienta habitual
para toda una generación de biólo-
gos, impulsando avances extraordi-
narios en la comprensión de la fun-
ción y estructura celulares. El éxito
de la microscopía electrónica llevó a
una interrupción temporal en el de-
sarrollo del microscopio de rayos X.
E n los últimos decenios el interés
por la microscopía de rayos X
resurgió gracias, en gran parte, a va-
rios avances técnicos importantes. El
más significativo de ellos ha sido el
desarrollo de nuevas fuentes de ra-
yos X. Para lograr imágenes de alta
resolución, algunos tipos de micros-
copios de rayos X necesitan fuentes
de un brillo sin precedentes. El dece-
nio de 1980 fue testigo de rápidos
progresos en el brillo de las fuentes
de rayos X basadas en la radiación
de sincrotrón (radiación emitida por
partículas cargadas al ser acelera-
das por un campo magnético).
Como resultado de lo anterior, el
brillo disponible hoy en día es millo-
nes de veces mayor que el obtenido
mediante los tubos de rayos X que fue-
ron las únicas fuentes de rayos X
blandos disponibles durante la mayor
parte de este siglo. También se ha
producido un gran progreso en el de-
sarrollo de láseres de rayos X y de
plasmas emisores de rayos X, que son
capaces de producir pulsos de ra-
yos X de intensidad suficiente como
para formar una imagen en un nano-
segundo (una milmillonésima de
segundo) o menos.
Los detectores de rayos X también
han experimentado drásticas mejo-
ras. Se han introducido detectores
electrónicos y resinas fotosensibles
(materiales formados por una fina
capa de plástico cuya resistencia a
ataques químicos cambia cuando se
expone a la acción de haces de elec-
trones o rayos X), que han reempla-
zado a la película fotográfica en
muchas aplicaciones. Las resinas
han demostrado ser detectores de ra-

ERIK ANDERSON, DIETER KERN

1. PLACA ZONAL DE FRESNEL formada por anillos concéntricos de tes para rayos X análogas a las utilizadas en microscopios de luz vi-
oro sobre una membrana de nitruro de silicio de tan sólo 1200 angs- sible. La anchura del menor espaciado entre anillos (que es aproxi-
trom de espesor. Los rayos X que atraviesan las zonas interanulares madamente igual a la resolución máxima alcanzable por el micros-
son difractados y focalizados. Gracias a ello, se pueden construir len- copio empleando la placa) es de unos 300 angstrom.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 39

 yos X baratos, idóneos y con resolu- rior a la óptica mediante el uso de “pla- aumentar la distancia desde el cen-
ción casi 100 veces mejor que la de la cas zonales de Fresnel”. Estos dispo- tro. Las ondas se difractan cuando
película fotográfica. sitivos son redes de difracción circula- atraviesan los anillos transparentes.
Merece reseñarse otro avance im- res formadas por anillos concéntricos, De este modo, cada parte del rayo
portante: se consiguió finalmente transparentes alternados con opa- incidente sufre una deflexión apro-
focalizar rayos X con precisión supe- cos, cuyo espaciado disminuye al piada para que las ondas converjan
hacia un punto focal común. Las len-
tes de placas zonales se han utili-
zado para focalizar luz, ondas de
MICRORRADIOGRAFIA DE CONTACTO
radio, sonido e incluso neutrones.
HAZ DE RAYOS X
En 1960, Albert V. Baez, entonces
en el Observatorio Astrofísico Smith-
MUESTRA
soniano de Harvard, propuso que
tales placas podrían focalizar tam-
bién rayos X.
La fabricación de placas zonales
RESINA (PMMA) PERFIL DEL RELIEVE de alta resolución es un problema téc-
DE LA RESINA nico complejo. La mejor resolución
posible para una placa dada viene a
2. DIAGRAMA DE DAÑOS producido en la resina como resultado del paso de los rayos X a ser igual al tamaño más fino de su
través de la muestra (izquierda). Un revelador ataca las regiones dañadas por la radiación espaciado zonal. Para conseguir una
(derecha). resolución mejor que la del micros-
copio óptico se necesita, por tanto,
crear zonas cuyos espaciados sean
HAZ DE RAYOS X MICROSCOPIO DE VISUALIZACION DE RAYOS X mucho menores que la longitud de
onda de la luz. Las técnicas de fabri-
MUESTRA cación óptica convencionales no están,
naturalmente, a la altura de este
PLANO cometido. Sin embargo, se han cons-
IMAGEN
truido placas zonales con espaciados
de sólo 300 angstrom, en torno a la
MICROPLACA
CONDENSADOR ZONAL vigésima parte de la longitud de onda
DETECTOR de la luz visible, aplicando métodos
DE PLACA ZONAL
desarrollados para la manufactura
3. LAS PLACAS ZONALES DE FRESNEL sirven como objetivo y lente condensadora de ra- de microcircuitos.
yos X. La primera placa focaliza el haz sobre la muestra; la segunda amplía la imagen sobre Un método para abordar este pro-
un detector. blema, iniciado por Gunter Schmahl
y Dietbert Rudolph, de la Universidad
de Gotinga, consiste en la utilización
MICROSCOPIO DE BARRIDO DE RAYOS X PORTAMUESTRAS de técnicas holográficas de ultravio-
CON BARRIDO
PLACA ZONAL MUESTRA EN LAS DIREC- leta (generalización de las técnicas
HAZ DE
CIONES X-Y usadas en la creación de hologramas
RAYOS X de luz visible) para imprimir un dia-
grama de placas zonales en una pelí-
cula de resina fotosensible. El método
holográfico ha tenido un éxito impre-
FUENTE CONTADOR sionante, pero está limitado por la
PUNTUAL DIAFRAGMA DE RAYOS X
DE APERTURA difracción de la luz ultravioleta a
anchuras de la zona externa de unos
4. HAZ DE RAYOS X FOCALIZADO, que barre toda la muestra, de lado a lado y de arriba aba- 500 angstrom.
jo; los rayos que inciden en cada punto se miden en un detector de rayos X de cómputo pro-
porcional.
O tra técnica, más precisa, consiste
en utilizar haces de electrones
para “dibujar” el diagrama de placas
HOLOGRAFIA DE RAYOS X (TIPO GABOR)
HOLOGRAMA zonales en la resina. Los métodos de
GRABACION RECONSTRUCCION
microfabricación posibilitan la trans-
RECONSTRUCTOR
HAZ DE RAYOS X

ferencia de estos diagramas a estruc-

COHERENTE

turas de oro, níquel o germanio. La

IMAGEN
REAL
HAZ

técnica del haz de electrones fue ya

MUESTRA utilizada en 1974 en el laboratorio de
Dieter Kern en el Centro de Investi-
GABOR KISS

DETECTOR gación Thomas J. Watson de IBM,

DE RESINA IMAGEN VIRTUAL donde todavía se siguen fabricando las
mejores placas zonales disponibles
5. INTERFERENCIA entre los haces de rayos X incidentes y dispersados. La interferencia gra- (hoy las prepara allí Erik Anderson,
ba un holograma en una lámina de resina (izquierda). La imagen se reconstruye (derecha) del Centro para Optica de rayos X del
iluminando el holograma con luz de láser digitalizando el holograma y tratándolo matemáti- Laboratorio berkeleyano Lawrence,
camente. bajo la dirección de David Attwood).

40 TEMAS 29
J. GILBERT, J. PINE, CH. BUCKLEY (izquierda), P. GUTTMAN (centro) Y P. C. CHENG, O. C. WELLS (derecha) Imágenes con resolución superior a la del microscopio óptico
obtenidas con tres técnicas de microscopía de rayos X diferentes

MICROSCOPIO
MICROSCOPIO DE BARRIDO DE VISUALIZACION MICRORRADIOGRAFIA DE CONTACTO

6. IMAGEN DE UNA CELULA DE TEJIDO CONJUNTIVO de un em-
brión de pollo (izquierda) obtenida por John Gilbert, Jerome Pine y
Christopher Buckley con el microscopio de barrido de rayos X en
el Laboratorio Nacional de Brookhaven. En la imagen se aprecian
dos núcleos, cada uno con dos nucléolos, así como numerosos grá-
nulos demasiado pequeños para observarse bajo el microscopio
óptico. La imagen está tomada manteniendo la célula en ambien-
te húmedo y sin recurrir al proceso de tinción. Usando el micros-
copio de visualización de rayos X de Gotinga en el anillo de alma-
cenamiento de BESSY en Berlín, el profesor Peter Guttman y sus
colaboradores obtuvieron una imagen de la estructura filamento-
sa de un cromosoma perteneciente a una larva de mosquito tam-
bién en ambiente húmedo y sin tinción previa (centro). P. C. Cheng
y O. C. Wells mediante microscopía de contacto (derecha) obtu-
vieron la imagen de una célula seca de tejido conjuntivo huma-
no, en la que se muestran fibras de sostén fuera del núcleo de la
célula. La imagen muestra la superficie de la resina sensible a los
rayos X ampliada por un microscopio electrónico.

Todas las microfotografías de barrido
de rayos X mostradas en este artícu-
lo se tomaron usando placas zonales
producidas por este equipo. Pambos
Charalambous, que trabaja en el grupo
de Ronald Burge del King’s College
londinense, también ha realizado pla-
cas zonales de precisión mediante una
técnica afín. Las placas zonales de
más alta resolución fabricadas tienen
anchos de zona externa entre 200 y
300 angstrom.
Las placas zonales para rayos X
son bastante pequeñas, alrededor de
0,1 milímetros de diámetro, y de pe-
queño espesor, para que trabajen me-
jor con rayos X de longitudes de onda
mayores que unos cinco angstrom.
aspectos importantes. En primer
lugar, las resinas fotosensibles em-
pleadas como detectores (general-
mente PMMA, la materia prima del
plexiglás) permiten una resolución
superior a la de las películas foto-
gráficas que se utilizaban en un co-
mienzo. En segundo lugar, la imagen
grabada en el material detector es
visualizada por instrumentos de más
alta resolución, principalmente el
microscopio electrónico. Ambos avan-
ces surgen de un artículo publicado
en 1956 por William A. Ladd y sus
colaboradores, de la Columbian Car-
bon Company de Nueva York.
Los pioneros de la microscopía que
utiliza detectores de resinas fueron
Ralph Feder y Eberhard Spiller, de
IBM. Aunque el método de contacto
posee muchas ventajas, incluidas una
relativa simplicidad y comodidad, la
resolución de las imágenes de contacto
está limitada por la fidelidad de los
procedimientos de lectura disponibles
y por la falta de nitidez de la imagen
debido a fenómenos de difracción,
auténtico problema a la hora de estu-
diar especímenes gruesos.
El microscopio de visualización de
rayos X utiliza óptica de localización
para formar una imagen ampliada en
CH. JACOBSEN, M. R. HOWELLS Y S. S. ROTHMAN

L os avances técnicos han permiti-

do que los microscopios de ra-
yos X alcancen resoluciones que van
más allá del límite del microscopio
óptico. Cuatro métodos de rayos X
que lo logran son la microscopía de
contacto, la microscopía de visuali-
zación, la microscopía de barrido y la
holografía. Cada una tiene sus pecu-
liares ventajas.
La microscopía de contacto es la 7. HOLOGRAMA DE RAYOS X (izquierda), que proporciona la información para generar las
técnica más socorrida. La microsco- dos imágenes reconstruida, de un agrupamiento de vacuolas secas de almacenamiento de
pía de contacto moderna difiere de la enzimas. Una de ellas muestra la imagen con contraste de intensidad (centro) y la otra con
primitiva microrradiografía en dos contraste de fase (derecha).

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 41

C. BUCKLEY, Y. ALI

8. TENDON HUMANO ENFERMO estudiado por Christopher Buc- por debajo (izquierda) y por encima (centro) de 350 eV, valor al cual
kley y Yusuf Ali con el microscopio de barrido de rayos X del La- el calcio aumenta bruscamente su absorción de rayos X. Restan-
boratorio Nacional de Brookhaven. Las imágenes de secciones do la primera imagen de la segunda, obtenemos la imagen dife-
del tendón sin teñir fueron tomadas con rayos X de energía justo rencia (derecha).

unos pocos cientos de veces, que puede
ser grabada a continuación por un
detector de resolución modesta. Los
dispositivos de más alta resolución
emplean lentes de placas zonales de
Fresnel como elemento focalizador.
El dispositivo de grabación puede ser
una película fotográfica sensible a los
rayos X o un detector electrónico. El
grupo de Schmahl en Gotinga cons-
truyó un microscopio de este tipo que
alcanza resoluciones de 550 angstrom,
utilizando el tipo de placas zonales
creadas holográficamente a las que nos
hemos referido antes.
Los microscopios de visualización
de rayos X ofrecen múltiples venta-
jas; la principal: toda la muestra es
iluminada y visualizada al mismo
tiempo. Esto permite tomar la ima-
gen rápidamente, lo que ayuda a eli-
minar la falta de nitidez de las imá-
genes que provenga del movimiento
y minimiza el daño que la radiación
pueda infligir a las muestras bioló-
gicas. Se evita, además, la necesidad
de fuentes de rayos X avanzadas con
un gran grado de coherencia, u orga-
nización de fase. Estos microscopios,
sin partes móviles, resultan en prin-
cipio muy fiables y susceptibles de
comercialización. Un consorcio de las
K. GONCZ, S. S. ROTHMAN
universidades de Gotinga y Aquis-
grán, junto con la compañía de óptica
Carl Zeiss, desarrolló un instrumento
de este tipo (véase la figura 11).
El grupo de Gotinga mostró cómo
obtener una imagen cuyo nivel de
gris fuera proporcional al cambio de
fase de los rayos X producido por la
transmisión a través del espécimen.
Este microscopio de “contraste de
fase” permitirá, tarde o temprano,
una mayor flexibilidad en la longitud
de onda, dosis menores de rayos X y
una mayor resolución, quizá.
Durante años, los microscopios de
visualización y de contacto llevaron
ventaja sobre otros diseños en tér-
minos del número de microfotogra-
fías de rayos X producidas. Pero la
situación cambió merced a la apari-
ción en escena de varios nuevos
microscopios de rayos X de barrido.
En los microscopios de barrido, se
forma la imagen elemento (píxel) a
elemento, igual que si se tratara de
la imagen de una pantalla de tele-
visión. El proceso comienza con el uso
de una placa zonal que focaliza el
haz de rayos X en un punto iluminado
de la muestra. Algunos rayos atravie-
san la muestra; la fracción del haz
incidente que pasa a través de él de-
termina el tono de gris asignado a es-
te píxel. El punto localizado barre la
muestra en líneas de lado a lado y de
arriba abajo, grabando sucesivos píxe-
les. El tamaño del haz determina la
resolución.
Aunque parezca lento y laborioso,
el método de barrido tiene claras ven-
tajas. La técnica se presta fácilmente
a la grabación de imágenes basada
en ordenadores y al análisis químico
punto a punto. Por otra parte, per-
mite mantener la muestra en aire,
mientras que casi todo el recorrido
del haz de rayos X se encuentra en
vacío. Además, el barrido minimiza
el tiempo de exposición del espéci-
men a la radiación dañina. Sin em-
bargo, este método, cuando se lleva
a cabo con una placa zonal de Fresnel,
requiere un haz de rayos X blandos
coherente, que sólo puede ser sumi-
nistrado por una gran instalación de
radiación de sincrotrón.
E l primer microscopio de barrido
de rayos X que alcanzó resolución
superior a la del óptico fue construido
en 1982 por uno de nosotros (Kirz),
Harvey Raback y John Kenney, de la
Universidad estatal de Nueva York
en Stony Brook. Está emplazado en
la Fuente Nacional de Radiación de
Sincrotrón (NSLS), en el Laboratorio

Nacional de Brookhaven. Se acaba

de reconstruir para mejorar su reso-
lución e incrementar su velocidad en
la toma de imágenes, lo que permiti-
rá aprovechar las características de
una nueva fuente de rayos X, llamada
9. VACUOLA DE ALMACENAMIENTO DE ENZIMAS de una célula pancreática. La secuencia ondulador. Este dispositivo obliga a
de imágenes muestra cambios de tamaño y densidad a medida que la vacuola va descar- seguir a los electrones, mediante cam-
gando su contenido proteínico. Esta secuencia, producida por Kaaren Goncz y Stephen S. pos magnéticos, una trayectoria sua-
Rothman con el microscopio de barrido de rayos X de Brookhaven, da una medida cuantita- vemente ondulada, lo que provoca la
tiva de dichos cambios. emisión de un haz estrecho de gran

42 TEMAS 29
brillo. Con tal haz, el microscopio pro-
duce imágenes en un tiempo aproxi-
mado de un minuto. En su reforma
intervino un amplio grupo de inves-
tigadores; entre otros: Christopher
Buckley, Mark Rivers y Deming Shu,
así como físicos de Stony Brook, del
NSLS y del Centro para óptica de ra-
yos X. Un microscopio similar cons-
truido por el King’s College opera en
el laboratorio Daresbury en Cheshire.
Entre sus metas fundamentales,
la microscopía de rayos X se propu-
so la de examinar material biológico
en condiciones próximas a las de su
estado natural. Esto requiere que las
muestras estén intactas y, por tanto,
que posean cierto grosor. En el estu-
dio de tales objetos es apropiada la
utilización de rayos X blandos, puesto
que tienen aproximadamente el poder
de penetración adecuado. Persiste el
interés en el uso de la holografía
mediante rayos X, una técnica rela-
cionada con el método empleado en
la fabricación de placas zonales, para
visualizar tales muestras en tres
dimensiones.
La holografía tridimensional con
rayos X requiere una resolución mejor
que la actualmente posible. Pero los
microscopistas consiguen imágenes
holográficas bidimensionales deta-
lladas. La holografía presenta la
característica adicional, como ocurre
en la microscopía de contacto, de no
precisar mecanismo de enfoque.
La visualización holográfica fue pro-
compleja. Ni la intensidad de las fuen- cen diferentes aspectos de la estruc-
tes coherentes de rayos X ni la reso- tura de la muestra.
lución de las emulsiones fotográficas En general, los microscopios de
disponibles estaban a la altura del rayos X y los electrónicos tienen ven-
proyecto. Esas limitaciones tecnoló- tajas complementarias. Los segun-
gicas se superan a finales de los años dos hace mucho tiempo que supera-
ochenta; Dennis Joyeux en Francia, ron la resolución de los microscopios
Sadao Aoki en Japón, James Trebes ópticos y, para muchas muestras,
y Ian McNulty en EE.UU., junto a sus
respectivos colaboradores, produjeron
a
hologramas de alta resolución me-
DIOXIDO 12,5
diante rayos X. DE SILICIO ALUMINIO MICRAS
E n 1987, Chris Jacobsen, traba-
jando con Kirz y Stephen S. Roth-
man del Laboratorio Lawrence de la
Universidad de California en Ber-
keley y con uno de nosotros (Howells),
mostró el primer microscopio holo-
gráfico con resolución superior a la SILICIO DOPADO CON BORO
del microscopio óptico. Usaron un
ondulador, como fuente de rayos X,
y detectores de alta resolución, que b
inicialmente producían hologramas
tras una hora de exposición propor-
cionando una resolución promedio en
la imagen mejor que 1000 angstrom.
Se redujo el tiempo de exposición
a un minuto y mejoró la resolución
hasta los 600 angstrom, pero la obten- c
ción de imágenes tridimensionales
requiere una resolución proxima a la
resolución intrínseca de la resina,
unos 100 angstrom para PMMA.
Cuando los microscopios de rayos X
son una realidad, la atención se di-
rigió a sus más fructíferas aplicacio-
nes. Se utilizaron microscopios de d

H. ADE, J. KIRZ, E. JOHNSON, S. HULBERT, E. ANDERSON, D. KERN

puesta en 1948 por Dennis Gabor, de
la Compañía Británica Thomson
Houston. Se fundamenta en el hecho
de que la radiación electromagnética,
ya sea en el rango visible o en otros,
es un fenómeno ondulatorio sujeto a
interferencia, de manera parecida a la
producida en las ondas en el agua.
Cuando dos ondas interfieren, las cres-
tas de las ondas coinciden en ciertos
lugares (reforzándose entre sí), mien-
tras que en otros lugares una cresta
coincide con un valle (cancelándose
entre sí). El resultado neto es un dia-
grama de máximos y mínimos for-
mado cuando la onda difundida por
la muestra se combina con el haz ori-
ginal que iluminó a ésta. Gabor llamó
holograma a la grabación de este dia-
grama. Un holograma almacena infor-
mación sobre la amplitud y la fase de
la onda difundida, proporcionando
datos suficientes para reconstruir una
imagen de la muestra con caracte-
rísticas tridimensionales.
Baez propuso en 1952 un esque-
ma de microscopio holográfico de
rayos X carente de lentes. El diseño
era conceptualmente sencillo, pero
su realización técnica resultaba muy
rayos X para examinar una amplia
variedad de muestras, desde lombri-
ces de tierra contaminadas con meta-
les pesados hasta células humanas
cancerosas, desde pelos de la epi-
dermis a carbón, dispositivos semi-
conductores o cemento. Gran parte de
las investigaciones se centraron en
estudiar la capacidad de los micros-
copios y su aplicabilidad al estudio
de diferentes clases de muestras. Ante
la corta historia de los microscopios
de rayos X de alta resolución, había
que mostrarse cauteloso a la hora de
juzgar qué aplicaciones pueden o no
beneficiarse de su uso.
Los resultados obtenidos con los
actuales dispositivos de rayos X con-
firmaron, como se esperaba, que las
imágenes de rayos X y las microfoto-
grafías electrónicas de la misma mues-
tra no se parecen. Los microscopios
de rayos X son sensibles a la concen-
tración de ciertos elementos, a menudo
carbono y nitrógeno, mientras que los
electrónicos suelen recoger la distri-
bución de grupos químicos en la mues-
tra que se han enlazado con la tintura
productora del contraste. Ninguna de
las dos imágenes es errónea. Sólo ofre-
e
10. COMPOSICION QUIMICA de una mues-
tra microfabricada (a) estudiada por Harald
Ade y colaboradores usando un microscopio
de barrido de fotoelectrones en el que los fo-
tones de rayos X arrancan electrones pro-
venientes de los átomos cercanos a la su-
perficie de la muestra. Seleccionando
energías de electrones característicos aso-
ciados con aluminio (b), silicio (e) y oxígeno
(d), podemos identificar y situar espacial-
mente cada elemento. La imagen (e) permi-
te apreciar que el silicio que se encuentra li-
gado al oxígeno formando dióxido de silicio
presenta un desplazamiento en energía al
compararlo con la energía correspondiente
a la del silicio puro. Así podemos identificar
dos estados químicos del Si.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 43

RADIOMICROSCOPISTAS DE LA UNIV. DE GOTINGA Y AQUISGRÁN (izquierda), KING’S COLLEGE (derecha)
11. MICROSCOPIO COMPACTO de visualización (izquierda) de-
sarrollado en las universidades de Gotinga y Aquisgrán que in-
corpora una fuente de rayos X de plasma; tiene una resolución
comprobada de 1000 a 2000 angstrom. La fotografía de la derecha
pueden ahora proporcionar resolu-
ciones de entre 2 y 20 angstrom. Por
otra parte, la resolución de los mi-
croscopios de rayos X usuales es del
orden de unos pocos cientos de angs-
trom, y el límite fundamental im-
puesto por la difracción (semilongi-
tud de onda) restringe la posibilidad
de futuras mejoras. Los microscopios
considerados en este artículo, que
usan rayos X blandos, nunca alcan-
zarán resoluciones por encima de los
10-20 angstrom.
L a principal contribución de los
microscopios de rayos X no es la
de romper barreras en cuanto a reso-
lución, sino la de realizar medidas
cuantitativas de objetos biológicos
bajo pequeñas o nulas modificaciones,
en condiciones muy próximas a las de
su estado natural. Tales muestras no
se pueden estudiar mediante micros-
copía electrónica convencional sin
producir alteraciones físicas o quí-
micas considerables. En algunos
casos, la preparación y la irradiación
con rayos X para tomar la imagen
parece ser lo suficientemente inocua
como para que la muestra pueda res-
ponder a la aplicación de ciertos es-
tímulos. En estos casos se puede to-
mar una secuencia de imágenes que
permita estudiar las respuestas o dis-
tinguirlas de los efectos producidos
por la iluminación mediante el haz
de rayos X.
Rasgo peculiar de los microsco-
pios de rayos X es que pueden resal-
44
muestra el microscopio de rayos X de barrido utilizado por el King’s
College de Londres. Este instrumento se encuentra situado en la
línea del ondulador de la fuente de radiación de sincrotrón de Da-
resbury en Cheshire.
tar o suprimir la visibilidad de un
elemento particular presente en la
muestra. Cada elemento absorbe los
rayos X de manera distinta. Para
los rayos X de longitud de onda entre
23 y 44 angstrom, el oxígeno, y por aña-
didura el agua, es mucho más trans-
parente que el material orgánico. Este
hecho abre la posibilidad de distin-
guir estructuras a través del agua
que forma alrededor de las 3/4 par-
tes de la masa de las células. Esta zona
del espectro de los rayos X se deno-
mina ventana del agua; reviste inte-
rés en microscopía biológica.
La forma en que los rayos X inte-
raccionan con la materia permite a
los microscopios de rayos X realizar
medidas cuantitativas de la densi-
dad y composición química de una
muestra. Para cada elemento exis-
ten ciertas energías críticas de los
rayos X, los bordes de absorción, en
éstas, los rayos X poseen exactamente
la energía suficiente como para libe-
rar un electrón. Sólo los rayos X que
tengan al menos la energía crítica
serán absorbidos con eficacia por cada
elemento dado. Se puede aprovechar
esta propiedad haciendo imágenes
con energías justo por debajo y por
encima mismo del borde de absor-
ción. La diferencia entre ambas imá-
genes elimina la señal que proviene
de todos los elementos, excepto la del
que tenga su borde de absorción
situado a esa energía particular. De
esta forma los microscopios de ra-
yos X pueden trazar mapas de la dis-
tribución espacial de un elemento
químico sobre la muestra.
E l problema del daño por radia-
ción limita las aplicaciones tanto
de la microscopía de rayos X como de
la electrónica. Los cambios introdu-
cidos por la irradiación pueden ser
importantes desde el punto de vista
biológico, aun cuando sólo afectaran
a una pequeña porción de moléculas
de la célula. Por tanto, en imágenes
con resolución superior a la óptica de
células inicialmente vivas tomadas
por medio de cualquier radiación ioni-
zante, siempre pueden aparecer al-
teraciones significativas a nivel bio-
lógico.
Como microscopistas, nuestra vi-
sión del daño por radiación difiere de
la de los biólogos. Nosotros queremos
saber el grado de daño producido a
la imagen para una resolución dada,
con referencia a lo que esperábamos
aprender. Por su parte, los biólogos
están interesados primordialmente en
el daño infligido sobre el organismo
y sus diferentes sistemas (por ejem-
plo, el sistema reproductor). En cual-
quiera de los dos enfoques, entender
la interacción entre la sonda radia-
tiva y las muestras es un problema
complejo.
Las imágenes de rayos X pueden
alcanzar un mejor contraste (rela-
ción señal-ruido) con las técnicas de
utilización del borde de absorción y,
al contrario que las producidas con
microscopios electrónicos, no están
TEMAS 29
sujetas a distorsión por ciertos efec-
tos de fondo, como la dispersión múl-
tiple de electrones. La limpieza de la
señal obtenida con métodos de ra-
yos X permite que la tarea de tomar
imágenes microscópicas se acometa
sin producir tanto daño a la muestra
como los métodos de visualización
basados en electrones u otras par-
tículas cargadas. La utilización de
rayos X es compatible con técnicas de
visualización rápida (flash), lo que
proporciona otro modo de amortiguar
los daños por radiación.
Estas ventajas, unidas a los modes-
tos logros en la mejora de la resolu-
ción de los microscopios de rayos X
con respecto a la microscopía elec-
trónica, permiten que los rayos X sean
utilizados para estudios de material
biológico en su estado natural, sin
proteger. En muchos casos los micros-
copios de rayos X pueden proporcio-
nar imágenes que no están degrada-
das por el daño por radiación y que
poseen una resolución que trasciende
la que se puede obtener con el micros-
copio óptico.
Se puede obtener una resolución
que supere los límites impuestos por
los detectores PMMA. Supongamos,
por ejemplo, que el diagrama de di-
fracción de rayos X se mide sin el uso
de una onda de referencia, como se
hace en cristalografía de rayos X. En
un experimento así, el patrón de in-
tensidad de los haces difractados per-
mitiría al investigador deducir la
estructura del objeto que ha disper-
sado los rayos X. La calidad de la
resolución que se puede obtener por
este método está determinada por el
rango de ángulos en que se puedan
medir los haces difractados. En el
caso extremo, la medida sobre toda
la esfera permitiría una completa
visualización tridimensional y una
resolución del orden de la semilon-
gitud de onda de los rayos X, que pa-
ra las radiaciones aquí considera-
das significaría una resolución de 10 a
20 angstrom.
En experimentos iniciados por uno
de los autores, Sayre, junto con Kirz,
Wenbing Yun, del Laboratorio Na-
cional de Argonne, y Mark Sharnoff,
de la Universidad de Delaware, se
tomaron diagramas de difracción
registrando la señal hasta 15 grados
fuera de eje con respecto al haz in-
cidente; esto corresponde a una re-
solución en la imagen de 70 angs-
trom, valor mejorable con un haz de
rayos X de mayor coherencia.
La microscopía de rayos X se ha
abierto camino más allá de las cien-
cias de la vida hacia la ciencia de
superficies y el análisis de trazas quí-
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
micas. En ciencia de superficies no
se estudian los rayos X, sino los elec-
trones arrancados por ellos de los áto-
mos que están cerca de la superficie
de la muestra. La técnica para medir
la energía de los electrones libera-
dos, denominada espectroscopía de
fotoelectrones, ha entrado ya en un
nivel de rutina. Con la combinación
de la espectroscopía e imágenes de
alta resolución de microscopía de
rayos X cabe en principio identificar,
y trazar, la distribución de los dife-
rentes elementos, así como determi-
nar su estado de ligadura química
cerca de la superficie de la muestra.
Ese es el camino para la investiga-
ción en superficies heterogéneas, como
las de catalizadores y dispositivos
semiconductores. Harald Ade, junto
con Erik Johnson y Steven L. Hubert,
del NSLS, y en colaboración con An-
derson, Kern y Kirz, alcanzaron reso-
lución por debajo de la micra. El y sus
colegas del NSLS realizaron los análi-
sis químicos antes citados con un
microscopio de fotoelectrones basado
en la utilización de lentes de placa
zonal. Trabajos similares se realiza-
ron en Hamburgo, Stanford, Wisconsin
y en otros lugares del mundo.
T ras casi un siglo de investigación,
las técnicas de microfabricación
han convertido el sueño de un micros-
copio de rayos X en realidad. Los estu-
dios con rayos X representan una
oportunidad valiosa para ampliar el
conocimiento humano sobre el mundo
natural. Esperamos con optimismo
que el progreso en este campo conti-
núe y que las promesas basadas en
el uso de estos instrumentos se satis-
fagan plenamente.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
X-R AY M ICROSCOPY . Dirigido por G.
Schmahl y D. Rudolph. Springer-Verlag,
1984.
X-R AY M ICROSCOPY II. Dirigido por
D. Sayre, M. Howells, J. Kirz y H. Rar-
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X-RAY MICROSCOPY. A. G. Michette en
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n.o 12, páginas 1525-1606; diciembre de
1988.
MODERN MICROSCOPIES: TECHNIQUES AND
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SOFT X-RAY IMAGING FOR THE LIFE SCIEN-
CES. M. R. Howells en Synchrotron Ra-
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S. S. Hasnain. Ellis Horwood, 1990.
X-R AY M ICROSCOPY III. Dirigido por
A. Michette, G. Morrison y C. Buckley.
Springer-Verlag, 1992.
45
La física
de superficies
Los avances de la física de superficies
han producido una avalancha de conocimientos,
básicos y aplicados, sobre el comportamiento atómico
en el universo en dos dimensiones de las superficies sólidas
Rodolfo Miranda
E
l ser humano se ha sentido
siempre fascinado por la super-
ficie de las cosas. Es fácil ras-
trear en los antiguos testimonios de
primitivos científicos, como los adi-
vinos sumerios o los alquimistas me-
dievales, su preocupación por enten-
der el papel de las superficies en el
comportamiento cotidiano de las co-
sas. En el Museo Británico de Lon-
dres se guarda lo que probablemente
constituye la prueba escrita más anti-
gua de esta atávica curiosidad: una
tablilla de la época de Hammurabi,
en la que se encuentra, grabada en
escritura cuneiforme, una descrip-
ción detallada de las formas cam-
biantes de la interfase entre aceite y
agua que los adivinos sumerios uti-
lizaban para predecir el curso futuro
de campañas guerreras u operacio-
nes comerciales.
Las aplicaciones prácticas de este
conocimiento empírico son, asimismo,
antiguas. Ya Plinio describió, con
todo pormenor, cómo calmar las olas
del mar arrojando pequeñas canti-
dades de aceite sobre su superficie.
Los primeros ensayos sistemáticos
que señalaban la importancia de los
tratamientos superficiales estaban
relacionados con la orfebrería, como
la relatada en el manuscrito De pro-
prietatibus rerum, redactado aproxi-
madamente en 1252: “Si se desea unir
rígidamente una placa de oro con otra
de plata, antes de golpearlas con el
martillo, debe uno precaverse contra
el viento, el polvo y la humedad, por-
que si alguna de estas tres cosas se
introdujera entre el oro y la plata, no
se podrá juntarlas”.
En el curso del enorme avance cien-
tífico que tuvo lugar en el siglo pasado
se pusieron las bases para dos de las
46
aplicaciones más importantes, toda-
vía hoy, de la ciencia de superficies.
En 1833, Michael Faraday realizó
unos cuidadosos experimentos que le
permitieron adelantar una explica-
ción del misterioso efecto que pro-
ducía el platino sobre la reacción entre
el hidrógeno y el oxígeno, inducién-
dola a temperaturas muy inferiores
a la de combustión. Faraday sentó
así los fundamentos de nuestra com-
prensión actual de la acción catalí-
tica de las superficies sólidas. En
1873, Karl Ferdinand Braun observó,
por su parte, que la unión entre una
punta afilada metálica y cristales
de semiconductores compuestos (el
sulfuro de hierro o plomo) presenta-
ba propiedades rectificadoras, esto
es, que la corriente eléctrica circula-
ba mejor en una dirección que en la
opuesta. El joven Braun (tenía 24 años
en ese momento) atribuyó ese com-
portamiento a la existencia de una
capa delgada en la interfase entre
ambos materiales. Este descubri-
miento es la base de los diodos y tran-
sistores presentes en toda la elec-
trónica moderna. Braun recibió el
premio Nobel de física en 1909, junto
con Marconi, por el desarrollo de los
rectificadores de estado sólido que
condujo a la telegrafía sin hilos.
Ya en nuestro siglo se produjeron dos
avances importantísimos en el de-
sarrollo de la física de superficies, Phi-
lip Lenard puso a punto técnicas es-
pectroscópicas que aprovechaban el
efecto fotoeléctrico (descubierto por
Hertz en 1887 y cuya explicación le
valió a Einstein el premio Nobel en
1921) y Clinton Davisson descubrió la
difracción de electrones (por lo que fue
galardonado con el Nobel en 1937).
Ambos fenómenos están relacionados
con notables propiedades de la super-
ficie, como ya sus respectivos descu-
bridores observaron. De hecho, hoy en
día, constituyen el fundamento de dos
técnicas habituales para determinar
la estructura electrónica y geométrica,
respectivamente, de las superficies:
la espectroscopía de fotoelectrones y
la difracción de electrones de baja ener-
gía [véase “Estructuras atómicas de
superficies sólidas”, por P. M. Echeni-
que y M. H. van Hove; INVESTIGACIÓN
Y CIENCIA, abril de 1979].
Sin embargo, es Irving Langmuir,
ilustre físico estadounidense que reci-
bió el premio Nobel en 1932, el que es
considerado padre de la física de super-
ficies moderna. En efecto, en las déca-
das entre las dos guerras mundiales,
Langmuir realizó una ingente labor
creando los métodos experimentales
de alto vacío, los cuales le permitie-
ron abordar problemas básicos, como
la reducción en la función de trabajo
producida por la absorción de meta-
les alcalinos sobre superficies metá-
licas, la emisión termoiónica o los
mecanismos de quimisorción. Sus
amplios intereses científicos le lleva-
ron a brillantes aplicaciones de sus
descubrimientos, como las lámparas
incandescentes de atmósfera inerte,
básicamente idénticas a las que se
emplean hoy en día. Suya es la princi-
pal responsabilidad de haber elevado
la física de superficies a la categoría
de disciplina con entidad propia.
S i éste fue el nacimiento de la espe-
cialidad, el acontecimiento deci-
sivo que desencadenó un enorme inte-
rés por la física fundamental de las
superficies de semiconductores recayó
en el descubrimiento del transistor
de contacto puntual por Bardeen y
TEMAS 29
1. NUESTRA APRECIACION de la estructu-
ra superficial se modifica drásticamente al
observarla a magnificaciones crecientes.
Los científicos han desarrollado continua-
mente instrumentos que nos permiten
observar las superficies que nos rodean
con un nivel de detalle cada vez mayor. To-
da una generación de microscopios han si-
JOAQUIN IBAÑEZ, CENIM (arriba y centro), AMADEO L. VAZQUEZ DE PARGA, LASUAM (abajo)

do los responsables fundamentales de es-

ta tarea. Una oblea de silicio monocristalina
(arriba), utilizada en la industria microelec-
trónica, presenta a simple vista el aspecto
de un espejo perfecto. En el microscopio
electrónico de barrido, la superficie de un
monocristal de semiconductor (centro) es
una sucesión de terrazas planas de varias
micras de tamaño promedio. Por fin, el mi-
croscopio de efecto túnel, el más exquisito
de los microscopios disponibles, nos mues-
tra a la escala atómica los detalles estruc-
turales de una superficie de un monocristal
metálico (abajo) que ha sido recubierta con
una sola capa atómica de azufre. En esta
imagen se observa una colección asom-
brosamente regular de átomos.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 47

LASUAM la existencia de campanas de vacío
comerciales, en las que, por primera
vez, era posible limpiar la superficie
y mantenerla en condiciones contro-
ladas. En 1969 Harris introdujo la
espectroscopía de electrones Auger,
que permite determinar la composi-
ción química de una superficie con una
sensibilidad del orden del 1 por ciento
de una capa atómica.

D esde la década de los setenta, la

2. SISTEMA DE ULTRAALTO VACIO (UAV) típico. Una serie de bombas de vacío eliminan las
moléculas del ambiente hasta conseguir una presión en el interior de la campana del or-
den de 10–13 atmósferas (equivalente a la presión en la superficie de la Luna) de modo que
la superficie de la muestra pueda ser mantenida limpia durante el tiempo necesario para
realizar los experimentos.
Brattain, seguido por el del transis-
tor de unión p-n por Shockley en
diciembre de 1947. En la posguerra,
atraídos por la indudable importan-
cia de las aplicaciones prácticas, los
físicos teóricos del estado sólido tra-
taron de comprender las propieda-
des de las superficies de los sólidos.
Así, mientras Nevill Mott (premio
Nobel en 1977) sugería una explica-
LASUAM
ción de los fenómenos en la unión
metal-semiconductor, Nicolás Cabre-
ra, entonces en la Universidad de
Bristol, con la ayuda de su colabora-
dor W. K. Burton, elaboró en 1949 una
teoría refinada del crecimiento cris-
talino, todavía utilizada. Pero fue,
sin duda, el desarrollo técnico deri-
vado de la carrera espacial lo que
posibilitó en la década de los sesenta
física de superficies ha emergido
como un ejemplo emblemático de revo-
lución científica según el conocido
arquetipo de Thomas Kuhn, historia-
dor de la ciencia. El cambio en nues-
tra visión del mundo que comporta
toda revolución científica es, en este
caso, la aparición de la región mate-
rial de la interfase entre dos medios
como una entidad autónoma. Un es-
tado de la materia con sus propias
leyes, composición química, estruc-
tura geométrica, estados electróni-
cos y dinámica atómica. Este cambio
conceptual ha ido acompañado en la
década de los ochenta por un altísimo
refinamiento de las técnicas experi-
mentales y un número creciente de
investigadores dedicados a ella, por
la realización de cuantiosas inver-
siones y por la proliferación de espe-
cialidades científicas (física de la
materia condensada, ciencia de mate-
riales, microelectrónica, optoelec-
trónica, catálisis, quimicofísica, elec-
troquímica, etcétera) que se han visto
enriquecidas por los desarrollos re-
cientes de la física de superficies.
Pero, ¿qué es una superficie? Entre
dos medios cualesquiera (sólido-gas,
sólido-líquido, sólido-sólido, etcétera)
siempre existe una zona superficial
o interfacial que los separa. Esta
región tiene propiedades mecánicas,
de composición o electrónicas distin-
guibles de los medios que la flan-
quean. El espesor de la zona que debe-
mos considerar superficie o interfase
depende del tipo de propiedades a
que nos estemos refiriendo. A veces
puede ser estrictamente una sola capa
atómica, mientras que en otras oca-
siones puede extenderse decenas o
incluso cientos de capas. Si nos ceñi-
mos a la interfase sólido-vacío, de la
que poseemos mayor información en
la actualidad, es sabido que tanto la
disposición geométrica de los átomos
de la superficie del sólido como los

estados electrónicos pueden diferir

notablemente de los del volumen. La
3. MODELO SIMPLIFICADO de una superficie cristalina. En ella pueden encontrarse dis- región de la superficie puede tener
tintos tipos de defectos: átomos que faltan (vacantes), escalones de altura atómica que una composición química distinta de
flanquean las terrazas planas de tamaño irregular y pequeñas islas en las terrazas. Hay, la del interior del sólido. La superfi-
además, átomos y moléculas de contaminantes que se encuentran adsorbidas en la su- cie expuesta a la atmósfera, por ejem-
perficie o que están incorporados a la misma. plo, está cubierta por capas de con-

48 TEMAS 29
taminación debido a las reacciones con

RIBER
los gases y vapores de ésta. Normal-
mente se forman óxidos y a menudo
sulfuros, carbonatos u otros com-
puestos, según sean el substrato y el
ambiente. Además, la superficie pue-
de presentar trazas de materiales
que han estado en contacto previo
con ella. Así, una superficie ordina-
ria, aunque esté limpia a simple vista,
es, en realidad, un complejo sistema
de componentes químicos y restos de
impurezas. Por ello, se acostumbra
distinguir las superficies “reales” de
las “ideales”, atómicamente limpias,
en el sentido de no tener material
extraño adherido a ellas.

L a naturaleza de las superficies

reales reviste un enorme interés
práctico. La mayoría de las aplicacio-
nes en que están comprometidas las
superficies (lubricación, corrosión o
rozamiento) requieren una compren-
sión de las propiedades de las su-
perficies reales. Con este fin se han
desarrollado múltiples métodos no
destructivos de análisis químico que
permiten obtener la composición ató-
mica de la superficie de un material
sólido con alta resolución lateral
(véase la figura 4).
Sin embargo, la explosión de acti-
vidad en la física de superficies regis-
trada desde los años setenta ha tenido
como objetivo fundamental el estu-
dio de superficies monocristalinas y
atómicamente limpias. ¿Por qué se
estudian estas superficies casi idea-
les? ¿Por qué se ha desarrollado para
ello un amplio abanico de técnicas
experimentales de refinada comple-
jidad? En primer lugar, porque nues-
tra capacidad para preparar super-
ficies altamente perfectas ha abierto
la posibilidad de explorar un universo
en dos dimensiones. Esto es algo fas-
cinante. Según se cree hoy, la dimen-
sionalidad desempeña un papel clave
en la teoría moderna de muchos fenó-
menos colectivos. Por ejemplo, en una
transición de fase continua el com-
portamiento crítico depende sólo de
la simetría del sistema, la dimensio-
nalidad del parámetro de orden y la
dimensionalidad del espacio. Esta
propiedad se llama universalidad y
sugiere que pueden suceder cosas
interesantes en la superficie donde
la dimensionalidad efectiva es dos, no
tres. De hecho, gracias al método del
grupo de renormalización [véase “Pro-
blemas físicos con muchas escalas de
longitud”, por Kenneth Wilson; INVES-
TIGACIÓN Y CIENCIA, octubre de 1979],
es posible calcular con exactitud los
exponentes críticos en transiciones de
fase bidimensionales y comparar
4. EN UN MICROSCOPIO AUGER DE BARRIDO se pueden obtener mapas de composición
química de la superficie de una muestra con excelente resolución lateral. En la figura se
muestra la superficie de una oblea monocristalina de silicio, de las empleadas usualmen-
te en la industria microelectrónica, sobre la que se han evaporado partículas de oro. Se
presentan imágenes de la distribución lateral de oro, oxígeno y silicio, así como la imagen
conjunta. Los aglomerados de oro aparecen en la imagen superior derecha como islas bri-
llantes. En la imagen inferior derecha se observa una acumulación de oxígeno en las pro-
ximidades de las islas de oro, probablemente como resultado de la acción catalítica de es-
te metal sobre la oxidación del silicio.
nuestros modelos teóricos con la rea- mos cuyo papel se desee determinar.
lidad exterior. En los últimos años, Esto se consigue trabajando en con-
la física en dos dimensiones nos ha diciones de ultraalto vacío (UAV), don-
deparado ya algunos descubrimien- de la muestra pueda ser limpiada
tos inesperados; entre otros, la natu- adecuadamente y mantenida en este
raleza especial de la fusión superfi- estado el tiempo suficiente para rea-
cial o el efecto Hall cuántico, por el lizar los experimentos planeados.
cual Klaus von Klitzing recibió el pre- Habitualmente, la presión necesaria
mio Nobel en 1985. es muy reducida, del orden de 10–13
Si sólo fuera ésa la razón para estu- atmósferas, equivalente a la presión
diar superficies de sólidos, nuestra en la superficie de la Luna, y se con-
especialidad no habría pasado de ser sigue bombeando con una variedad
una curiosidad académica. La razón de dispositivos un recipiente de acero
fundamental del florecimiento de la inoxidable con ventanas y puertas
física de superficies reside en su utili- removibles. La limpieza de la mues-
dad práctica en algunos campos tec- tra una vez en UAV se consigue por
nológicos de primerísima importancia bombardeo iónico con un gas noble o
económica como la microelectrónica, por rotura en vacío.
la catálisis, los tratamientos super-
ficiales por implantación iónica o láser
y la ingeniería atómica de materia-
les que permite la fabricación de mate-
D etengámonos en las reconstruc-
ciones superficiales. Lo mismo
la posición geométrica de los átomos,
riales artificiales con propiedades que la distribución energética de los
ajustadas a nuestros deseos. estados electrónicos en las proximi-
Para avanzar en nuestro conoci- dades de la superficie de un cristal,
miento de estos complejos procesos, difieren, en general, de su posición y
conviene comenzar con una superfi- distribución en el interior del volu-
cie ideal y depositar sobre ella, de un men. Débese ello a la rotura de la
modo controlado, las impurezas o áto- simetría y a la distinta coordinación

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 49

J. ALVAREZ, E. G. MICHEL Y M. C. ASENSIO una superficie semiconductora pue-
den modificarse depositando átomos
de otra especie química sobre ella.
Así, al adsorber media monocapa de un
metal alcalino, como potasio o cesio,
sobre la cara (100) de silicio, se pro-
duce una drástica disminución de la
función de trabajo. Este fenómeno es
esencial para la construcción de detec-
tores de radiación electromagnética
en la región de los infrarrojos.

106 104 102 100 98

ENERGIA DE ENLACE (eV)
96
L os detectores ópticos han consti-
tuido un área de investigación
privilegiada ya desde la época de
Langmuir. Un detector eficiente de
radiación infrarroja es el corazón de
RAYOS X cualquier sistema de visión nocturna,
X1/2 de detección de tumores o de astro-
nomía infrarroja. Puede fabricarse
SiO2 Si
X1/2
un detector semejante mediante un
substrato semiconductor (silicio o ar-
106 104 102 100 98 96 seniuro de galio) en el cual se ha hecho
ENERGIA DE ENLACE (eV) disminuir la función de trabajo por
evaporación de óxidos de metales al-
calinos sobre su superficie. La dismi-
nución debe ser tal que el nivel de
106 104 102 100 98 96 energía del vacío en el exterior de la
ENERGIA DE ENLACE (eV) superficie se encuentre por debajo de
la banda de conducción en el volumen.
Esto es lo que se conoce como afini-
5. ESPECTROS DE FOTOEMISION con rayos X del nivel 2p de silicio. El espectro de la parte dad electrónica negativa ( AEN ). En
inferior izquierda corresponde al óxido que crece espontáneamente al exponer un cristal de estas condiciones, un fotón de ener-
silicio a la atmósfera (óxido nativo). El de la parte superior izquierda, a un óxido térmico cre- gía mayor que el intervalo prohibido
cido por el procedimiento habitual en la industria. El pico a mayor energía de ligadura se ori- del semiconductor produce, al ser
gina en átomos de silicio ligados químicamente a oxígeno, mientras que el de la derecha re- absorbido por el material, un par elec-
fleja silicio unido a silicio. La distancia en energía entre ambos picos indica que la composición trón-hueco. Los electrones pueden
química del óxido es SiO2. La altura relativa de ambos picos indica el espesor del óxido en emitirse al exterior del dispositivo.
cada caso. El panel de la izquierda muestra el proceso de crecimiento de un óxido de silicio De este modo, se transforma la ra-
mediante oxidación catalítica promovida por potasio. Los datos prueban que el óxido así pre- diación infrarroja en corriente eléc-
parado tiene una composición química idéntica al industrial. Los espectros han sido obteni- trica, que puede luego manipularse
dos por J. Alvarez, E. G. Michel y M. C. Asensio en el LASUANI. de manera conveniente hasta resul-
tar en la imagen visible de la fuente
de radiación (véase la figura 8).
de los átomos de la superficie con res- encuentran en la superficie se des- En el curso de una investigación
pecto a los del volumen. Si nos ima- plazan bastante de las posiciones destinada a aclarar la estructura
ginamos un cristal metálico como un equivalentes a las que ocuparían en microscópica de estos fotocátodos,
conjunto de bolas de acero unidas con el volumen. En el caso de la superfi- Eva Oellig y Enrique G. Michel, enton-
muelles y cortamos éstos a lo largo cie (100) del silicio, los átomos se jun- ces estudiantes de doctorado del labo-
de un plano para formar una super- tan de dos en dos formando dímeros, ratorio de física de superficies de la
ficie, no es difícil entender intuiti- lo cual reduce a la mitad el número Universidad Autónoma de Madrid
vamente que los átomos de la super- de enlaces insatisfechos. Los enlaces (LASUAM), demostraron que los me-
ficie puedan moverse con respecto a no satisfechos que quedan forman tales alcalinos actuaban como cata-
las posiciones de equilibrio del volu- estados electrónicos de superficie den- lizadores de la oxidación de semi-
men, ya que ahora no tienen vecinos tro del intervalo prohibido de ener- conductores, acelerando la cinética y
hacia el exterior del cristal. Los cam- gías del semiconductor (véase la figu- haciendo disminuir la temperatura
bios estructurales que ocurren en la ra 6). Estos estados de superficie del proceso. Los átomos del cataliza-
región superficial pueden implicar a acumulan carga eléctrica e influyen dor podían, además, eliminarse por
varias capas atómicas. Se dice que la en el funcionamiento de los disposi- completo de la superficie mediante un
superficie se ha reconstruido. tivos electrónicos. Son, entre otras breve calentamiento a temperatura
Este efecto se produce también en cosas, los responsables del fenómeno moderada. Esto ha sugerido la posi-
las superficies de los semiconducto- de fijación (“pinning”) del nivel de ble aplicación práctica de este nuevo
res, aunque por distintas razones. Al Fermi, esto es, la independencia de la método para la producción de óxidos
cortar un cristal de un semiconduc- función de trabajo (mínima energía de puerta de espesor controlado en
tor para formar una superficie, apa- requerida para extraer un electrón del las próximas generaciones de dispo-
recen enlaces direccionales rotos, que cristal) del silicio con respecto al ni- sitivos microelectrónicos. Para ello,
representan una enorme energía. vel de dopado del volumen. es necesario comprobar la composi-
Para rebajarla, los átomos que se Las propiedades electrónicas de ción y microestructura de los óxidos

50 TEMAS 29
de silicio así producidos y comparar-
SEMICONDUCTOR Evac
los con los desarrollados por los méto-
dos habituales en la industria. Esup
c
La composición química de estos
óxidos, como la de cualquier mues- Ø
tra sólida, puede ser objeto de aná-
lisis por espectroscopía de fotoelec- Evol
c
trones. En esta técnica, heredera EF
– –
directa del efecto fotoeléctrico, se en- –
vía un haz monocromático de rayos X ESTADOS DE
(por ejemplo, la radiación Mg Kα con SUPERFICIE
una energía de 1253,6 electronvolt)

R. MIRANDA Y ANTONIO ARAGON MINGUELL

Esup
v
sobre la muestra, donde arranca elec- +
+
trones de los niveles electrónicos pro- +
fundos. La energía cinética de los Evol
v
fotoelectrones es la diferencia entre
la energía de los fotones y la energía
de ligadura de los electrones en el
sólido. Estas son características del VACIO
elemento químico al que pertenece
el electrón y de su estado químico. Por
6. LA ENERGIA POTENCIAL DE UN ELECTRON en un semiconductor presenta un intervalo
tanto, midiendo la energía de los foto-
prohibido, donde no existen estados cuánticos permitidos para el electrón. En la figura se in-
electrones emitidos al vacío se obtiene
dican los bordes de la banda de valencia y de conducción de un semiconductor dopado con
un espectro con picos a ciertas ener-
impurezas que introducen electrones (tipo n), así como el nivel de Fermi. La posición de és-
gías, cuyas alturas relativas reflejan
te en el volumen puede modificarse a voluntad cambiando el dopaje. La presencia de esta-
la composición de la muestra anali-
dos electrónicos de superficie en la zona prohibida de energía modifica la distribución de
zada. En el caso que nos ocupa, el
carga. La carga acumulada en estos estados se origina en la zona de vaciado que se extiende
óxido de silicio producido por oxida-
hacia el interior del cristal. Como resultado de esta transferencia de carga, las bandas elec-
ción catalítica tiene una composición
trónicas se curvan cerca de la superficie y el nivel de Fermi queda fijado en el centro de la
química (SiO2) idéntica a la del óxido
región prohibida. Al variar el dopaje en el volumen, cambia la curvatura de las bandas pero
térmico preparado a alta tempera-
no la posición del nivel de Fermi en la zona prohibida. La función de trabajo (distancia entre
tura en atmósfera de oxígeno.
el nivel de Fermi y el de vacío) es independiente del dopaje volúmico.
El microscopio de efecto túnel (STM),
inventado por Binnig y Rohrer (por
lo que fueron galardonados con el pre-
mio Nobel en 1985) nos ofrece una vi-
sión sorprendente de la microestruc-
tura de los óxidos preparados por
oxidación catalítica. La imagen de la
figura 7, tomada por Amadeo L. Váz-
quez de Parga y Carmen Ocal, sugie-
re que el óxido de silicio catalítico ha
crecido a través de una reacción quí-
mica de estado sólido entre los óxi-
dos del metal alcalino y el substrato
de silicio. La reacción de transferen-
cia del oxígeno entre el metal alca-
lino y el cristal semiconductor tiene

AMADEO L. VAZQUEZ DE PARGA Y CARMEN OCAL

un fuerte carácter local, que da lu-
gar a la aparición de los aglomera-
dos circulares visibles en la imagen
del STM.
Como consecuencia inesperada del
esfuerzo realizado para controlar la
activación de fotocátodos, se han he-
cho recientemente avances muy im-
portantes en nuestra comprensión
del proceso de formación de la barrera
Schottky en la interfase metal-semi- 7. EL MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL (STM) muestra sorprendentes diferencias entre dos
conductor. Esta barrera energética es óxidos crecidos sobre una oblea de silicio. Los óxidos tienen el mismo espesor promedio me-
responsable de la actividad rectifi- dido por espectroscopía Auger. Ambos no presentan, además, diferencia alguna con res-
cadora de la unión metal-semicon- pecto a otros contaminantes. La imagen de la izquierda corresponde a un óxido nativo. El otro
ductor descubierta por K. F. Braun ha sido preparado mediante oxidación catalítica del silicio a través de un método desarro-
hace más de un siglo. La explicación llado en el laboratorio del autor que consiste en evaporar potasio sobre el substrato, expo-
microscópica de la formación de la ner a oxígeno y calentar brevemente el cristal de silicio dentro del sistema de vacío. En tan-
barrera Schottky se había convertido to que el óxido nativo reproduce, básicamente, la estructura de terrazas del substrato
en una piedra de toque para la física monocristalino, el óxido catalítico presenta un aspecto de núcleos redondeados de unos
de superficies. En efecto, las pruebas 50 angstrom de tamaño promedio, propio de una reacción química local.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 51

RODOLFO MIRANDA Y ANTONIO ARAGON MINGUELL de carácter aislante. Los resultados
experimentales demostraron que, si
bien la presencia de defectos en sufi-
Evol
c
– – ciente densidad podía fijar el nivel de
Fermi, éstos no eran necesarios en
Evac absoluto para explicar lo que ocurría.
El carácter metálico de la capa de-
positada sobre la superficie semi-
conductora perfecta era, de hecho, la
hν
condición básica requerida.
ØB La mayoría de los semiconductores
EF
usados en la tecnología moderna son,
– –
de hecho, monocristales, razón por
+ – la cual la aplicación directa de los
Evol
v MIGS descubrimientos de la física básica de
superficies resulta casi inmediata.
VACIO En cambio, la mayoría de los meta-
les de uso cotidiano, desde un tene-
dor hasta las pistas de metalización
GaAs TIPO p Cs+O2+Cs
de un circuito integrado, son poli-
cristales: sus superficies están cons-
tituidas, pues, por una variedad de
8. ORIGEN DE LA BARRERA SCHOTTKY. Algunas superficies de semiconductores, como la planos cristalinos. A pesar de ello,
cara (110) del AsGa, no tienen estados electrónicos de superficie en la zona prohibida. En los investigadores han conseguido
este caso las bandas electrónicas son planas hasta la superficie. Al depositar una capa de desarrollar (“crecer” en el argot) en
cesio metálico sobre la superficie, la función de onda de los electrones deslocalizados del los laboratorios monocristales metá-
metal se extiende al interior de la zona prohibida del semiconductor. Así se inducen esta- licos y cortarlos adecuadamente para
dos electrónicos denominados MIGS (siglas de “Metal Induced Gap States”) que fijan el ni- exponer una sola cara cristalina. La
vel de Fermi aproximadamente en el centro de la zona prohibida con independencia del ti- información obtenida de este modo es
po de dopaje volúmico. Las bandas del semiconductor quedan curvadas, dando origen a crucial para comprender el funcio-
una barrera energética para el transporte de carga entre semiconductor y metal que se namiento de las superficies reales,
conoce como barrera Schottky, φB. Si depositamos un aislante que no tenga niveles elec- incluso en propiedades tan comple-
trónicos en ese rango de energías, por ejemplo, óxido de cesio, no aparecen estados en la jas como la actividad catalítica.
región prohibida. El nivel de Fermi queda libre dentro del intervalo, “gap” y su posición de- Los catalizadores de reacciones
pende ahora del tipo de dopaje. Una nueva evaporación de cesio sobre la muestra devuelve heterogéneas están compuestos por
el carácter metálico a la interfase, fijando de nuevo el nivel de Fermi en el centro de la zo- pequeños aglomerados metálicos dis-
na prohibida y curvando las bandas. La figura ilustra el principio de funcionamiento de un persados, para aumentar su superfi-
fotocátodo sensible al infrarrojo. cie, sobre substratos de alúmina o
zeolita. En la práctica, los cataliza-
dores son “promovidos” por aditivos
experimentales indicaban que una nando Flores, de la UAM. Esta propo- que contienen metales alcalinos, espe-
sola capa atómica de metal deposi- nía que el simple hecho de tener un cialmente potasio, con el fin de mejo-
tada sobre la superficie del semicon- metal en contacto con un semiconduc- rar la selectividad o la reactividad
ductor bastaba para producir la tor inducía estados electrónicos en el del catalizador. Entre los ejemplos
misma barrera Schottky encontrada intervalo de energía prohibido. El ca- bien conocidos de reacciones así cata-
en los diodos y dispositivos comer- rácter metálico de la capa absorbida lizadas citaremos la síntesis Fischer-
ciales. Los investigadores habían con- sería, por tanto, determinante. Tropsch de hidrocarburos a partir de
cluido que, en la interfase, había unos mezclas de CO y H2, o la eliminación
estados electrónicos, localizados en
el intervalo de energía, en el interior
de la zona prohibida del semicon-
U n elegante experimento diseñado
y realizado por José Enrique Or-
tega, del LASUAM, en colaboración con
del CO y NO de los gases de los tubos
de escape de los automóviles. El papel
exacto de los promotores alcalinos ha
ductor; éstos fijaban la posición ener- Clemens Laubschat, Mario Priestch sido muy debatido en los últimos años.
gética del nivel de Fermi, determi- y Gunter Kaindl, del centro de radia- Las técnicas de la física de superfi-
nando así la altura de la barrera. ción de sincrotrón BESSY en Berlín, cies han hecho algunas importantes
Ahora bien, ¿cuál era el origen de ha arrojado luz sobre la cuestión deba- aportaciones a nuestra comprensión
estos estados? Un largo contencioso tida. Para evitar la formación de de- de los procesos catalíticos.
se había estado desarrollando entre fectos, era preciso asegurarse de que En un trabajo del autor en colabo-
dos escuelas de pensamiento. Una de la adsorción del metal no dañaba la ración con el grupo de Gerhard Ertl,
ellas, representada por Bill Spicer, red del semiconductor; para compro- entonces en la Universidad de Mu-
de la Universidad de Stanford, con- bar el papel de la metalicidad, se nich, se ha desarrollado un método
sideraba que los estados que fijaban requería una capa depositada cuyo para determinar la orientación de
la posición del nivel de Fermi esta- carácter metálico pudiera encenderse moléculas quimisorbidas sobre subs-
ban producidos por defectos introdu- y apagarse a voluntad. La primera tratos metálicos. Para ello es nece-
cidos en el substrato durante la depo- condición se conseguía evaporando sario emplear las propiedades únicas
sición del metal. La otra escuela se cesio a baja temperatura sobre arse- de la radiación de sincrotrón [véase
originó en una idea de Volker Heine, niuro de galio; la segunda, adsor- “La radiación de sincrotrón” por
de la Universidad de Cambridge, de- biendo oxígeno sobre la capa metá- Herman Winick; I NVESTIGACIÓN Y
sarrollada y perfeccionada por Fer- lica, lo que producía óxidos de cesio CIENCIA, enero de 1988]; en particu-

52 TEMAS 29
lar, el hecho de que esta radiación se
halle totalmente polarizada en el
plano de la órbita de los electrones.
Al enviar fotones de una energía dada
sobre la muestra, se extraen elec-
trones de cada uno de los orbitales
moleculares accesibles. Estos fo-
toelectrones son colectados por un
analizador bidimensional que mide
cuántos electrones de cierta energía
cinética se emiten en cada dirección
del espacio.
los apropiadamente. Recientemente,
siguiendo una sugerencia de Félix
Ynduráin, de la UAM, que ha calcu-
lado que la interacción electrónica
entre cobalto y cobre es extremada-
mente pequeña, se ha realizado este
experimento desarrollando epita-
xialmente películas de un material
magnético (cobalto) sobre un subs-
trato monocristalino de un material
no magnético (cobre).
El número de capas atómicas depo-
sitadas sobre el substrato se puede
de átomos que se han depositado.
Cuando el cristal del substrato se ha
preparado de una manera cuidadosa,
es posible desarrollar capas bidi-
mensionales de alta perfección estruc-
tural. Así, Juan José de Miguel, del
LASUAM , en un trabajo conjunto con
el grupo de J. Kirschner, de la Uni-
versidad Libre de Berlín, ha deter-
minado la temperatura de Curie de
capas ultradelgadas de cobalto de es-
pesor variable crecidas epitaxial-
mente sobre cobre. Han obtenido unos

L as reglas cuánticas de selección

obligan a que el estado inicial y
final del proceso de fotoemisión ten-
gan una simetría adecuada. Supon-
gamos una molécula con un eje de si-
metría (como el monóxido de carbono,
CO), adsorbida perpendicularmente
a la superficie. En ese caso, no se emi-
tirían fotoelectrones, desde los orbi-
tales moleculares, a lo largo de las
direcciones espaciales correspon-
dientes al plano perpendicular al vec-
tor campo eléctrico de la radiación
incidente. Así se ha determinado que
el monóxido de carbono se adsorbe
con su eje C–O perpendicular a la
superficie de un cristal de paladio lim-
pio. Al depositar potasio sobre la
superficie del paladio, las moléculas
de CO adsorbidas en las proximida-
des de los átomos del promotor se
encuentran notablemente inclinadas
con su eje formando un ángulo de más
de 20 grados con respecto a la normal
a la superficie. Estos resultados indi-
can que el papel de los promotores
podría ser el de inclinar el eje inte-
ratómico de las moléculas adsorbi-
das, lo cual alarga su distancia inter-
determinar con precisión exquisita,
midiendo la intensidad reflejada de
un haz de átomos de helio que se hace
incidir sobre la superficie del cristal,
mientras éste está creciendo. La téc-
nica se muestra extraordinariamente
sensible al orden superficial, ya que
los átomos de helio, al ser neutros,
no pueden penetrar dentro de la
superficie y rebotan como bolas de
billar sobre ella. La intensidad refle-
jada oscila durante la evaporación,
siendo máxima cuando se completa
una capa atómica y mínima justo
cuando se ha depositado media mono-
capa. Basta, pues, contar las oscila-
ciones para saber el número de capas
NUMERO DE CAPAS
DEPOSITADAS
0,4
resultados sorprendentes. La tem-
peratura de Curie de películas del-
gadas es mucho menor que la del
material masivo y, además, varía no-
tablemente con el espesor evaporado.
Se necesitan de cinco a seis capas de
átomos para alcanzar la temperatura
de Curie del volumen. Más sorpren-
dente aún es el hecho de que una
extrapolación lineal de los datos ex-
perimentales sugiera que la tem-
peratura de Curie de una sola capa
atómica de cobalto sea de cero gra-
dos Kelvin; esto es, una capa estric-
tamente bidimensional no presen-
taría orden magnético a ninguna
temperatura finita.
1,0

JULIO FERRON Y JOSE M. GALLEGO (LASUAM) Y ANTONIO ARAGON MINGUELL

nuclear, debilita su enlace y facilita
su disociación.
Como hemos mencionado antes,
cabe esperar que las propiedades co-
lectivas (superconductividad, magne-
INTENSIDAD REFLEJADA I/I0

tismo) de la superficie difieran bastan- 1,0

te de las mismas en el volumen.
Una de las magnitudes que definen
las propiedades magnéticas de un só-
lido es la temperatura de Curie, Tc.
Por encima de ella, el material deja
de comportarse como un imán, esto
es, la magnetización se hace cero. La
temperatura de Curie puede medirse
experimentalmente determinando a
qué temperatura desaparece el ciclo
de histéresis característico de un
material ferromagnético. Es posible
explorar el efecto de la dimensiona-
lidad en el comportamiento magné-
tico estudiando las propiedades, por
ejemplo la temperatura de Curie, de
capas muy delgadas de material ferro-
magnético en función de su espesor.
Para ello es preciso seleccionar los
materiales adecuados y preparar-
0,5
0 1 2
9. OSCILACIONES DE LA INTENSIDAD DEL HAZ ESPECULAR de átomos de helio reflejado por
la superficie de un cristal de cobre durante su crecimiento a partir de un vapor de átomos de
cobre. El crecimiento del cristal se lleva a cabo por evaporación térmica de cobre sobre el
substrato mediante epitaxia de haces moleculares. Las oscilaciones reflejan la perfección
estructural del cristal durante el proceso de crecimiento epitaxial. Cuanto mayor es el orden,
mayor es la intensidad reflejada por la superficie. Dependiendo de la temperatura del subs-
trato, el cristal crece por propagación de sus escalones naturales (en cuyo caso la intensi-
dad reflejada no oscila) o por nucleación de islas bidimensionales sobre las terrazas. Este
modo de crecimiento, propuesto por Cabrera y Burton en 1949, ha sido confirmado por los
datos de dispersión de átomos de helio y por simulaciones de Monte Carlo realizadas por Ju-
lio Ferrón y José M. Gallego, del laboratorio de superficies de la UAM.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 53

LASUAM
Estos resultados nos han permi-
tido explorar un terreno de gran inte-
rés práctico. En efecto, la industria
que utiliza el almacenamiento mag-
nético de información demanda el
desarrollo de soportes materiales que
puedan contener cada vez mayor can-
tidad de información. En particular,
sería muy conveniente poder alma-
cenar información magnética en tres
dimensiones. Para ello deberíamos
disponer de nuevos materiales con
alta anisotropía estructural y mag-
nética [véase “Materiales electróni-
cos y magnéticos” por Prahaven
Chaudhari, INVESTIGACIÓN Y CIENCIA,
diciembre de 1986]. Una estrategia
extendida en la actualidad consiste
en desarrollar, en condiciones de ul-
traalto vacío, cristales sintéticos de
periodicidad artificial: las superredes.
Una superred metálica está formada
por capas delgadas alternadas de dos
metales A y B, de distintas propie-
dades. En el caso que nos ocupa, A se-
10. ORIENTACION de moléculas adsorbidas; puede ser determinada experimentalmente uti- ría un material magnético y B un me-
lizando las reglas de selección que gobiernan el proceso de fotoemisión desde orbitales mo- tal no magnético. Los átomos de
leculares de simetría bien definida. Las moléculas de monóxido de carbono se adsorben per- ambos metales se evaporan cuida-
pendicularmente a la superficie en un metal limpio, con el átomo de carbono cerca de la dosamente sobre un soporte elegido,
superficie. Las moléculas adsorbidas se inclinan fuera de lo normal en las proximidades de para que el crecimiento de ambos sea
átomos de metales alcalinos (representados por la bola azul en la figura) como resultado epitaxial y sus periodicidades verti-
de interacciones electrostáticas de corto alcance. Esta modificación parece ser un paso in- cales bien definidas. De este modo,
termedio crucial en el proceso de rotura catalítica de la molécula. se consigue desarrollar cristales con
las periodicidades deseadas de fases
que no existen en la naturaleza o que
Co/Cu (100) son metaestables. La exploración de
las propiedades magnéticas de estos
1400 nuevos materiales no ha hecho más
Tc VOLUMEN que comenzar, y ya nos ha suminis-
trado varias sorpresas, indicio de que
TEMPERATURA DE CURIE (GRADOS KELVIN)

1200 algo excitante se esconde en la natu-

M
raleza cuando nuestro control sobre
ella alcanza este nivel de refina-
1000 miento.

800
H

M
E n un esfuerzo reciente del labo-
ratorio de superficies de la UAM,
A. Cebollada y J. M. Gallego han de-
600
sarrollado multicapas cristalinas de
cobalto/cobre por evaporación al-
RODOLFO MIRANDA Y ANTONIO ARAGON MINGUELL

ternada sobre la cara (100) de mo-

H
400 nocristales de cobre. El espesor de
cobalto repetido periódicamente ha
superado siempre la cifra de seis ca-
200 pas atómicas, de suerte que cada uni-
dad estructural de la superred alcan-
zase las propiedades magnéticas del
0 1 2 3 4 5 6 volumen. El número de capas evapo-
RECUBRIMIENTO DE COBALTO (CAPAS ATOMICAS) radas y su perfección estructural se
han determinado mediante la técni-
11. LA TEMPERATURA DE CURIE, Tc, de películas delgadas epitaxiales de cobalto crecidas ca de oscilaciones en la intensidad
sobre un substrato monocristalino de cobre depende muy fuertemente del espesor de la ca- reflejada de haces de helio descrita
pa de cobalto. Como muestra la figura, el valor experimental de Tc se ha determinado com- más arriba,
probando a qué temperatura desaparece el ciclo de histéresis característico de un material Las propiedades magnéticas de
ferromagnético. Nótese que la extrapolación de los datos indica que tan sólo son necesarias estas superredes metálicas, estudia-
entre cinco y seis capas atómicas para que la película de cobalto se comporte como el vo- das en colaboración con J. L. Martínez
lumen. Por otro lado, la extrapolación sugiere que una sola capa atómica de cobalto podría mediante difracción de neutrones en
no presentar orden magnético a ninguna temperatura finita. el Instituto Laue-Langevin, han resul-

54 TEMAS 29
RODOLFO MIRANDA Y ANTONIO ARAGON MINGUELL

LA
LA+LB

LB

Cu

Co

12. SUPERRED METALICA compuesta por dos metales distintos, A y B, crecidos alterna-
damente con una periodicidad LA y LB, respectivamente. La periodicidad cristalina de la su-
perred es LA + LB. Para obtener una superred cristalina es preciso elegir los metales A y B
de modo que sus constantes de red no sean muy distintas y evaporarlos en condiciones
controladas de ultraalto vacío. En superredes de cobalto y cobre crecidas epitaxialmente
se observa que, en ausencia de campo magnético externo, el vector magnetización de las
capas de cobalto (flechas) se alinea antiparalelamente en capas próximas. La superred en
su conjunto tiene un orden antiferromagnético y una magnetización nula. Bajo un campo
magnético suficientemente elevado, los vectores magnetización de todas las capas de co-
balto apuntan en la misma dirección. Para campos intermedios, la magnetización de cada
capa de cobalto gira en el plano un cierto ángulo para minimizar su energía, de manera
que, a determinados campos magnéticos, aparecen complejos ordenamientos tridimen-
sionales del vector magnetización que sugieren la posibilidad de almacenar información
magnética en tres dimensiones.

tado ser inesperadas. En ausencia de está abriendo por primera vez un

un campo magnético exterior, la su-
perred se comporta como un material
antiferromagnético, esto es, el vector
magnetización de las capas de cobalto,
que se encuentra siempre en el plano
de éstas, está ordenado antiparale-
lamente en capas consecutivas (véase
la figura 12). En estas condiciones,
la superred en su conjunto no presenta
magnetización alguna.
Al aplicar un campo magnético
exterior de intensidad elevada en la
dirección paralela al plano de las
capas, éstas se ordenan magnética-
mente en la dirección del campo
externo y la superred se convierte en
ferromagnética. Sin embargo, lo más
interesante ocurre cuando el campo
externo se aumenta de una manera
suave. Para ciertos valores bien defi-
nidos de éste, la magnetización de la
superred parece crecer de una manera
discreta. Esto sugiere que, aplicando
un campo magnético exterior de esta
magnitud, es posible crear complejos
patrones de magnetización en la supe-
rred. La aplicación práctica de estos
descubrimientos para el almacena-
miento de información no está aún a
la vista, pero es indiscutible que nues-
tra capacidad de explorar la física de
sistemas de baja dimensionalidad
mundo fascinante a nuestros ojos.
Los ejemplos reseñados en este ar-
tículo describen parte del esfuerzo
realizado en los últimos años en el
laboratorio de superficies de la UAM.
Aunque no cubren toda la riqueza de
la física de superficies e interfases,
sí pueden considerarse represen-
tativos de la fase explosiva de creci-
miento que ésta atraviesa desde hace
unos años en todo el mundo. Benevo-
lentemente, podría calificarse la si-
tuación actual de esta disciplina como
de adolescencia. Los próximos años
conducirán, con toda probabilidad, a
una etapa de madurez en la que la
comprensión y el control de la natu-
raleza, en su nivel atómico, que es-
tamos alcanzando, fructificará en
nuevos y espectaculares desarrollos
básicos y aplicados.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
LOW ENERGY ELECTRONS AND SURFACE
CHEMISTRY. G. Ertl y J. Küppers. Chemie
Verlag, 1987.
PHYSICS AT SURFACES. Andrew Zwangwill.
Cambridge Unversity Press, 1988.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 55

Técnicas
de microfotografía
Con un equipo sencillo y económico
se pueden sacar microfotografías claras, brillantes
a las que no les falten interés científico y gran belleza
Jearl Walker
E
l mundo oculto que revela el
microscopio ha fascinado a
muchos científicos aficiona-
dos. Durante los últimos 20 años, va-
rios de estos animosos investigado-
res han llegado a adquirir una notable
habilidad para fotografiar lo que ob-
servaban a través del microscopio.
Analizaremos aquí algunas técnicas
que permiten a los diestros en el uso
del microscopio sacar tales imágenes
fotográficas.
Podemos encontrar información
sobre la microfotografía en diferen-
tes fuentes. La mía es James Bell, de
Allston, Massachusetts. Nos ha sumi-
nistrado diversas muestras de lo que
su técnica microfotográfica es capaz
de conseguir (las hemos reproducido
en las dos páginas siguientes). La
variedad de especímenes que pueden
observarse y fotografiarse es casi infi-
nita, de ahí que los ejemplos de Bell
los demos sólo a título de introduc-
ción. Aunque los fotógrafos profesio-
nales suelen trabajar con equipos
muy complejos y caros, las fotogra-
fías realizadas por Bell muestran que
hasta con un equipo sencillo y eco-
nómico pueden hacerse fotografías
de sorprendente belleza y de gran
interés científico.
Bell trabajó con un microscopio
monocular Bausch and Lomb fabri-
cado en 1915, equipado con unos vie-
jos objetivos Leitz de 10 y 100 aumen-
tos y unos oculares con un poder de
aumento de 10, 7 y 2,5. Disponía de un
espejo para dirigir la luz hacia un con-
densador, el cual hacía que toda la
luz convergiera sobre la muestra. Bell
quitó el objetivo de su cámara Asa-
hiflex de 35 milímetros, e incorporó
la misma al microscopio con un adap-
tador especial para microscopio, que
se encuentra en las tiendas del ramo
y que sirve para evitar el paso de la
luz del exterior. Enfocó el microsco-
pio de manera que la imagen se for-
56
mara sobre el cristal del fondo de la
cámara. Para evitar los movimientos
a la hora de hacer las fotos, Bell accio-
naba la cámara con un cable dis-
parador. Sacó las fotos con veloci-
dades de obturación entre 1/500 y
1/25 segundos, empleando películas
Ektachrome-X o Ektachrome-64.
Hay que usar luz muy intensa, pues
sólo una pequeña parte de ella llega
a la película. Bell se servía para la
iluminación de un proyector de dia-
positivas normal con una lámpara de
400 watt. Para colimar la luz susti-
tuyó el objetivo del proyector por otro
que concentraba la luz. En caso de tra-
bajar con menos luz que la empleada
por Bell, es necesario incrementar el
tiempo de exposición en un segundo
o incluso más. Más difícil resulta obte-
ner fotografías claras con objetos en
movimiento; lo más probable es que
sólo consigamos un borrón. Si para
una fotografía en particular, la luz
es demasiado intensa, Bell la atenúa
colocando filtros de transparencia
uniforme en la trayectoria de los rayos
procedentes del proyector. Dichos fil-
tros pueden comprarse en las casas
de artículos fotográficos o pueden ser
fabricados fotografiando una hoja de
papel blanco y revelando el negativo.
El componente infrarrojo del rayo
de luz puede dañar a las muestras,
sobre todo si se trata de organismos
vivos. Para eliminar dicho compo-
nente nocivo de los rayos, puede colo-
carse un recipiente con agua (de caras
paralelas para evitar reflexiones) o
bien diversas piezas de cristal óptico
en la trayectoria del rayo de luz. El
proyector puede incorporar un sis-
tema de refrigeración con idéntica
finalidad práctica.
La iluminación con fondo claro es
la más común de los diversos tipos de
iluminación que se pueden emplear,
pero tiene el inconveniente de que
destaca poco los detalles de las mues-
tras. Bell logra este tipo de ilumina-
ción orientando el espejo de manera
que el condensador situado debajo
del soporte del espécimen en el micros-
copio haga que toda la luz converja
en dicha muestra. Obrando así, se
verá la luz transmitida a través del
espécimen. Esta técnica no podrá apli-
carse, pues, ni con especímenes grue-
sos ni opacos, e incluso con muestras
delgadas no siempre se distinguirá
bien su estructura interna. Por otra
parte, los colores naturales de los ele-
mentos u organismos a observar, se
pierden frecuentemente con el fondo
claro. De todos modos, esta técnica
puede resultar útil para fotografiar
muestras finas en blanco y negro.
Si se quiere obtener la mayor re-
solución posible, aspecto crucial en
trabajos de mucho aumento, deben se-
cundarse las directrices que se indi-
can, respecto a la iluminación Köhler,
en el libro Photography through the
Microscope, auténtica biblia de la
microfotografía. Dicho libro ha sido
publicado por la Eastman Kodak
Company. El manual le dirá cómo
ajustar el espejo, el colector y el con-
densador, de manera que el filamento
de la lámpara esté enfocado sobre el
condensador y éste a su vez enfoque
la imagen del colector sobre el soporte
de la muestra. (El colector es la lente
situada entre el espejo y la fuente de
luz.) Con este método de enfoque la
muestra queda uniformemente ilu-
minada y no se ve la imagen enfocada
del filamento.
L a fotografía de Bell que aparece
en la figura 1 constituye un ejem-
plo de la técnica de fondo claro. Bell
empleó 1100 aumentos para foto-
grafiar células vivas del alga de agua
dulce Elodea, poniendo de manifiesto
los distintos cloroplastos. Momentos
después de haber tomado la fotogra-
fía, los cloroplastos comenzaron a
TEMAS 29
1. Alga fotografiada con la técnica de campo brillante de James Bell. 2. Cristales de éster de colesterol.

3. Embrión de caracol. 4. Colonia rotífera de Conochilus.

JAMES BELL

5. La pulga de agua Simocephalus. 6. El copépodo Cyclops.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 57

 7. Cristal de vitamina C. 8. El mismo cristal visto a través de celofán polarizador.

9. Cristales de ácido hipúrico. 10. Cristales de resorcinol.

JAMES BELL

11. Cristal líquido nemático. 12. Ala de mariposa.

58 TEMAS 29
girar dentro de las células conforme

MICHAEL GOODMAN
CAMARA
iba produciéndose en ellos la foto-
síntesis a partir de la luz procedente
del proyector. Aunque algunos deta-
lles salen en la fotografía, la imagen
no es tan nítida como en otras foto-
grafías, debido en parte a que ese ele-
vado aumento redujo la profundidad
de campo.
ADAPTADOR
Puede obtenerse un buen contraste AL MICROSCOPIO
en la foto si colocamos la muestra
sobre un fondo negro. Para conseguir SEGUNDO
dicho fondo mientras el objeto a obser- POLARIZADOR
var seguía estando iluminado, Bell COLOCADO DEBAJO
puso un punto negro en un filtro de DEL ADAPTADOR
cristal blanco, que situó justo debajo
del condensador instalado bajo el por-
taobjetos. Tenía bien abierto el dia-
fragma del condensador de suerte
que suministrara un ancho cono de
luz. El punto negro tenía por misión
proyectar una sombra sobre la mues-
tra a fotografiar. La luz que sobre-
salía por los bordes del punto ilumi-
OBJETIVOS
naba la muestra con luz blanca, por CABLE DISPARADOR
lo que sus colores naturales seguían
viéndose. Cuando el portaobjetos está
vacío, los rayos de luz que llegan al
objetivo del microscopio han sufrido
una divergencia tal que no entra nin-
guna luz por el tubo; ello determina MUESTRA
que ni el observador ni la cámara SITUAR EL
vean más que un campo obscuro. Con PRIMER
CONDENSADOR
la muestra en el portaobjetos, la luz POLARIZADOR
se dispersa desde él hacia el interior AQUI
ESPEJO
del tubo, permitiendo que el espéci-
men pueda contemplarse. Esta téc-
nica requiere una intensa fuente lumi-
nosa, ya que sólo llegará a la cámara
una pequeña parte de la luz inicial.
El filtro para producir el fondo negro
se construye pegando un pequeño
círculo opaco de cartulina negra so-
bre un filtro de cristal transparente. CONDENSADOR DEL PROYECTOR
El diámetro del círculo debe ser de cin-
co milímetros o algo más. Conviene 13. Sistema experimental de Bell.
determinar el tamaño óptimo pro-
bando varios en su propio microsco-
pio. El campo debe verse obscuro opaco. Para trabajar según la técnica rentes de una misma muestra en
cuando no haya nada en el portaob- de Bell con grandes aumentos, habría situaciones diversas, de acuerdo con
jetos, y aparecerá iluminado cuando que comprar un condensador de fondo su comportamiento característico.
coloquemos un espécimen para su obscuro, que proporciona un cono de Así, podemos fotografiar una hidra
observación. obscuridad más fino. comiendo. Dándole pequeños gusa-
Con su técnica de fondo obscuro, nos de agua o bien diminutos trozos

B ell domina la técnica de la ilumi-

nación con fondo obscuro con sólo
su objetivo de bajo aumento (10 diá-
metros). Un aumento mayor da lugar
a fotografías con un contraste menor
debido a la dificultad de mantener la
lente que hace de objetivo dentro del
cono obscuro proyectado por el punto
opaco. Para enfocar correctamente,
los objetivos de muchos aumentos
deben aproximarse bastante a la
muestra; la lente empieza luego a
interceptar algunos rayos de luz que
provienen de los bordes del punto
Bell fotografió un espécimen de Hydra
y algunas colonias de Volvox que había
encontrado en estanques locales. Se
puede encontrar una relación com-
pleta de las muestras útiles para su
observación en libros especializados
que suelen venderse en los museos
de historia natural. (Puede consul-
tarse, con provecho, el Atlas de micros-
copía, de J. Bernis Mateu.)
Puesto que la técnica fotográfica de
Bell puede aplicarse a organismos
vivos, si uno tiene suficiente pacien-
cia puede obtener fotografías dife-
de carne cruda, se puede conseguir
que abra la boca y despliegue sus ten-
táculos. Headstrom refiere que con
una pequeña cantidad de ácido acé-
tico o verde de metilo consigue pro-
vocar que la hidra descargue uno de
sus nematocistos. Estos tubos llenos
de púas son lanzados con tal fuerza
que pueden penetrar incluso en la
presa del animal.
Los Volvox forman una colonia esfé-
rica gelatinosa, constituida por cien-
tos de organismos flagelados. Si se
mira desde muy cerca a una de estas

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 59

 colonias, puede apreciarse que su
superficie está como bordada por fla-
gelos, que son los apéndices en forma
de latiguillo mediante los cuales los
individuos flagelados pueden auto-
propulsarse. Headstrom recomienda
recolectar muestras de este tipo con
un tubo de cristal. Una vez que haya
localizado una muestra en el agua de
un estanque o de una charca, para lo
cual quizá sea conveniente ayudarse
con una lupa, introduzca el tubo en
el agua manteniéndolo tapado con el
dedo. Cuando el espécimen esté lo
suficientemente cerca de la boca del
tubo, quite el dedo; probablemente,
la muestra se verá arrastrada hacia
el interior del tubo por la corriente
de agua que se forma al llenarse.
Vuelva a tapar el tubo con el dedo y
sáquelo del agua. A continuación, con
mucho cuidado, vierta el agua sobre
el portaobjetos del microscopio hasta
LUZ NO LUZ LINEALMENTE
POLARIZADA
LAMPARA PRIMER FILTRO
DEL PROYECTOR POLARIZADOR
EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE MEDIA ONDA
MICHAEL GOODMAN
EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE UN CUARTO DE ONDA
14. Cambios de polarización debidos a la birrefringencia.
60
que el espécimen quede depositado
sobre el mismo. Para estas operacio-
nes conviene usar portaobjetos espe-
ciales que tienen una pequeña con-
cavidad donde queda recogida la
muestra con una pequeña cantidad
de agua.
Algunas muestras contrastan mejor
con un fondo de color que con un fondo
obscuro. Para conseguir este tipo de
colorido (llamado iluminación par-
cial Rheinberg), Bell sustituyó el
punto opaco negro por un punto trans-
parente de color. Por ejemplo, para
conseguir un buen contraste con una
muestra roja, Bell utilizaba un punto
azul o verde, que recortaba de unos
filtros de plástico de dichos colores.
El espécimen continúa apareciendo
con su color natural, ya que es ilu-
minado principalmente por la luz
blanca procedente de la zona exte-
rior al punto.
PORCION DE
LA MUESTRA
LUZ LINEALMENTE
POLARIZADA POLARIZADA
CELOFAN
SEGUNDO FILTRO
EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE UNA ONDA
A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA
LUZ LINEALMENTE
POLARIZADA
A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA
LUZ ELIPTICAMENTE
POLARIZADA
A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA
Un fondo azul sirvió a Bell para
fotografiar unos cristales de un éster
de colesterol que habían recristalizado
bajo el cubreobjetos. El fondo per-
mite ver la interfase entre los cris-
tales y las grietas provocadas por las
tensiones internas dentro de cada
cristal. Para fotografiar embriones
del caracol de agua dulce cuando aún
se encuentran dentro del huevo, Bell
empleó un punto verde con un aumen-
to de 80 diámetros. Estos delicadí-
simos detalles se hubiesen perdido
totalmente con una iluminación con
fondo brillante.
Con una iluminación Rheinberg
completa, Bell puede seleccionar cual-
quier color para iluminar la muestra
y puede elegir un color diferente para
el fondo. El único cambio que debe
sufrir el método es pegar un anillo de
plástico ligeramente coloreado alre-
dedor del punto más obscuro. La luz
PELICULA
NO LLEGA LUZ DEL
POLARIZADOR COLOR CONSIDERADO
A LA PELICULA
LUZ LINEALMENTE
POLARIZADA
LUZ ELIPTICAMENTE
POLARIZADA
TEMAS 29
que atraviesa el punto da entonces el
color del fondo, mientras que la luz pro-
cedente del anillo colorea la muestra.
A 120 aumentos, Bell fotografió con
un punto azul y un anillo amarillo una
colonia de rotíferos Conochilus. En
una carta que el propio Bell me envió,
me decía que los rotíferos habrían
sido punto menos que invisibles con
una técnica de iluminación de fondo
brillante: el contraste de colores
resulta fundamental para distinguir
sus contornos y su estructura interna.
B ell asegura que la técnica más efi-
caz para obtener el mejor con-
traste de colores es hacer las foto-
grafías usando luz polarizada. Esta
técnica de trabajo sólo sirve con mate-
riales birrefringentes, tales como los
cristales, los músculos y algunos
pequeños organismos pluricelulares.
Se coloca un filtro polarizador en el
proyector de diapositivas (como si
fuera una diapositiva normal), con lo
que el aparato suministra luz pola-
rizada. Se introduce un segundo fil-
tro en el ocular del microscopio, de
manera que se pueda girar hasta que
el campo de visión a lo largo del
microscopio sea o bien obscuro o bri-
llante, según que el filtro bloquee o
deje pasar la dirección de polariza-
ción de la luz que viene a través del
aparato.
Cuando se introduce un material
birrefringente en el portaobjetos, la
luz polarizada producida por el pri-
mer filtro altera su polarización
cuando pasa a través del material. Si
la alteración es adecuada, parte de la
luz puede pasar entonces a través del
segundo filtro polarizador, en el ocu-
lar, aun cuando el filtro bloquearía
la luz. En resumen, la luz se trans-
mite a través de este material cuando
parte de la misma está polarizada a
lo largo de un eje y la otra polarizada
a lo largo de un eje perpendicular.
Ambos ejes son perpendiculares al
rayo de luz. La velocidad de la luz es
mayor en uno de los sentidos de pola-
rización que en el otro. En razón de
esta diferencia, los dos sentidos de po-
larización pueden salir procedentes
del material fuera de fase. La pola-
rización emergente está determinada
por la combinación de dos sentidos de
polarización: en consecuencia, la luz
que sale podría estar polarizada de
varias formas.
Si los dos sentidos de polarización
salen con una diferencia de fase de
media longitud de onda, la luz que
emerge está otra vez linealmente
polarizada, pero ahora lo estará a lo
largo de un eje perpendicular a la
dirección de polarización de la luz
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
OBJETIVO
DEL MICROSCOPIO
RAYOS DE LUZ
DISPERSADOS
POR LA MUESTRA
AREA ILUMINADA
EN EL FILTRO
15. Preparación de un fondo obscuro.
incidente. Esta luz que sale puede
ser transmitida o bloqueada por el fil-
tro polarizador situado en el ocular,
según la orientación de éste.
Si la birrefringencia ha obligado a
las direcciones de polarización que
salen a estar desfasadas un cuarto de
longitud de onda, la luz que emerge
estará polarizada elípticamente: ello
significa que la punta del vector de
polarización gira alrededor del rayo
de luz, describiendo una elipse. Esta
luz pasará por el filtro situado en el
ocular, con independencia de la orien-
tación de éste. Si los sentidos de pola-
rización emergentes coinciden, la luz
transmitida estará polarizada de la
misma forma que la luz incidente. La
orientación del segundo filtro deter-
minará entonces si se ve o no luz alguna.
E l que se obtenga un resultado u
otro depende del espesor y birre-
fringencia de la muestra y de la lon-
gitud de onda de la luz. Para una
región concreta de la muestra, el
extremo rojo del espectro de la luz
blanca incidente sobre él puede aca-
bar siendo bloqueado por el segundo
filtro polarizador, mientras que puede
transmitirse el azul. Esta zona apa-
recerá de color azul para el observa-
dor. Puede aparecer otra zona de color
amarillo cuando estén bloqueados los
otros colores de la luz blanca inci-
dente. La ventaja de usar así luz pola-
rizada estriba en que la variación de
color que se produce en la muestra,
MICHAEL GOODMAN
MUESTRA
CIRCULO OPACO NEGRO
QUE PROPORCIONA
EL FONDO OBSCURO
que de otra forma sería incolora, per-
mite al observador distinguir sus per-
files y su estructura.
Bell me ha enviado dos fotografías
hechas con luz polarizada. En la pri-
mera, tomada a 120 aumentos, se
aprecian cristales de ácido hipúrico
que se habían disuelto en isopropa-
nol y se recristalizaron luego en la dia-
positiva. La muestra era lo suficien-
temente birrefringente y no uniforme
como para producir muchos colores.
En el otro ejemplo (a 150 aumentos)
se había disuelto cristales de re-
sorcinol en acetona, que se quemó
después para facilitar la recristali-
zación rápida.
Se pueden producir más contras-
tes de color poniendo uno o más tro-
zos de papel de celofán o de cinta
adhesiva transparente en el soporte
del filtro por debajo de la muestra.
Ambos son materiales birrefringen-
tes que alteran la polarización de la
luz. En lugar de celofán podemos usar
un trozo de mica fina que puede
sacarse fácilmente de un fragmento
mayor con una cuchilla. Se supone que
cualquiera de estos materiales actúa
como filtro retardador, porque obliga
a que un sentido de polarización quede
detrás del sentido perpendicular. Un
filtro de retardo es útil para aumen-
tar la variación de color en un modelo
débilmente birrefringente. No todos
los tipos de celofán habrán de valer,
por lo que será preciso probar varios
hasta dar con el adecuado. También
61
podrían usarse hojas de plástico del
tipo de las que se emplean para envol-
ver alimentos.
B ell ha presentado algunos otros
ejemplos de cómo usa la luz po-
larizada. Hizo una fotografía de 100
aumentos a una pulga de agua viva
con su cría poniendo un punto azul
de fondo y con celofán y filtros pola-
rizadores para destacar la estructura
interna del animal. La mancha del
ojo queda en negro, y el tubo diges-
tivo en naranja.
A 50 aumentos, fotografió de una
forma similar el copépodo Cyclops,
con la diferencia de que usó un punto
negro para proporcionar un fondo
obscuro. El animal aparece con la
mancha de los ojos en rojo, dos ban-
das musculares en amarillo y el tubo
digestivo en marrón. Los dos sacos
laterales de forma de pera contienen
huevos. Muchos de estos detalles se
hubieran perdido en un campo ilu-
minado normalmente.
Puede comprobarse el efecto del
celofán en dos fotografías de Bell,
ambas de ácido ascórbico (vitami-
na C) recristalizado por él. Las fo-
tografías muestran los dos mismos
cristales adyacentes, y se tomaron
exactamente igual, con la salvedad
de que se utilizó celofán para la
segunda fotografía. Adviértase que en
la última el color adicional se debe
a la birrefringencia del celofán.
Bell preparó los cristales disol-
viendo ácido ascórbico en isopropa-
nol, puso luego un poco de esta solu-
ción en un cristal portaobjetos y
quemó después el alcohol. Los cris-
tales se formaron a los pocos segun-
dos. Una vez sacada una serie de foto-
grafías, puede volverse a disolver el
ácido ascórbico y empezar de nuevo.
Esta técnica produce cristales lo sufi-
cientemente finos como para que
resulten transparentes; por tanto,
pueden fotografiarse fácilmente. Otro
método de obtención de cristales es
dejar que el disolvente se evapore
lentamente.
El lector puede conseguir también
una cristalización fundiendo la sus-
tancia en un portaobjetos sobre una
llama. Aquélla cristalizará al en-
friarse. Bell no es muy partidario de
esta técnica, porque el punto de fusión
de algunas sustancias es demasiado
alto, y ello hace que se rompan muchos
portaobjetos. Sin embargo, señala que,
si se quieren estudiar ciertos tipos de
cristales líquidos, habrá que recurrir
a dicha técnica, enfriando la sustan-
cia lentamente desde su punto de fu-
sión para conseguir el estado de líqui-
do cristalino. La fotografía de Bell de
62
un cristal líquido nemático se sacó a
100 aumentos, a temperatura ambien-
te, tras haber disuelto el material en
acetona. El movimiento en esta recris-
talización fue tan rápido que tuvo que
disparar la fotografía a 1/500 segun-
dos para retener la actividad.
Debido a su espesor algunas mues-
tras no pueden fotografiarse con luz
transmitida; el obstáculo se salva con
luz reflejada. Para ello, Bell apoya el
proyector en unos libros y ajusta el án-
gulo de la luz incidente hasta que
obtiene la iluminación adecuada en
la muestra. Un ejemplo del resultado
es su fotografía del ala de una mari-
posa. Muchos de los colores que se ven
en las alas de las mariposas, en los
élitros de los escarabajos y en las plu-
mas de las aves no se deben a la pig-
mentación, sino a la interferencia de
las ondas de luz. Algunas alas de ma-
riposa están formadas por capas de
cutícula transparente. Cuando se
refleja la luz de una de las capas,
parte de ella procede de la reflexión
en su superficie externa y otra parte
proviene de su superficie posterior,
después de haber atravesado la capa
en cuestión. Los dos rayos emergen-
tes pueden interferir entre sí para
producir colores, como ocurre en las
pompas de jabón. Quizás el observa-
dor quiera ver varios tipos distintos
de alas de mariposa. Estas pueden
comprarse en casas dedicadas a mues-
tras empleadas en prácticas de cien-
cias naturales y en tiendas de obje-
tos de regalo de muchas ciudades.
La interferencia de colores resul-
taría ser muy débil si el ala estuviera
iluminada sólo con la luz transmi-
tida. Los colores tendrían que apa-
recer, entonces, como consecuencia de
la interferencia entre la luz trans-
mitida por la capa similar a la cutí-
cula (sin reflexión interna) y la luz
doblemente reflejada en el interior de
la capa, antes de salir. Esta luz será
tan débil, con relación a la luz no
reflejada, que producirá poca inter-
ferencia (y, por tanto, poco color).
Para encontrar la exposición ideal
hay que controlar los disparos con
una gama de tiempos de exposición
o bien incorporar un medidor de luz
en el microscopio. Bell usa un medi-
dor de luz casero compuesto por un
voltímetro digital capaz de detectar
hasta varios milivolt y una fotocé-
lula de silicio. Bell montó la célula
en una carcasa de cartón que se enca-
jaba sobre el punto de mira de la
cámara. A medida que cambia la in-
tensidad de luz con la muestra y el
modo de iluminación, la resistencia
de la fotocélula varía inversamente.
A través de los circuitos intermedios,
estas variaciones modifican la lec-
tura en el contador de milivolt. Tras
varios experimentos, Bell consiguió
construir una tabla de lecturas de
manera que fuera posible interpre-
tarlas inmediatamente en función
del tiempo de exposición. (En el
número de junio de 1977 de la revista
Popular Electronics aparecía dise-
ñado un medidor de luz simple, aun-
que muy sensible, que podía cons-
truirse sin gran complicación con un
fotorresistor de sulfuro de cadmio.)
S i se quiere obtener una buena re-
producción de los colores natu-
rales de un modelo, conviene atinar
en la elección del tipo de película de
color que se use; debe estar ajustada
a la distribución de colores de la lám-
para. Todas las lámparas parecen
blancas para el ojo humano, pero la
distribución real de intensidades a
través del espectro visible depende
de la temperatura de la superficie
emisora de la lámpara. Una lámpara
de luz blanca, de baja temperatura,
tiene menos bajas frecuencias de luz
visible (es decir, el final azul del espec-
tro) que una lámpara de tempera-
tura más alta. Las distintas pelícu-
las de color se han ajustado de alguna
forma para compensar esta diferen-
cia de distribución del color de la luz
blanca. Sin embargo, puede haber
alguna discrepancia entre los colo-
res reales de un modelo y lo que se
ve en una fotografía en color. Se puede
remediar la situación poniendo un
filtro de color delante del proyector
(o cualquier otra fuente de color). El
libro de Kodak explica qué filtros
deben emplearse.
Bell tenía una lámpara DAT de 400
watt en su proyector. La tempera-
tura de la superficie del filamento
emisor es tan alta que la luz semeja
la luz solar en cuanto a la distribu-
ción de color. Por ello utilizaba pe-
lícula de color especial para la luz
solar en vez de las películas que tie-
nen un equilibrio de colores calcu-
lado para lámparas de tungsteno que
funcionen a temperaturas super-
ficiales inferiores.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
PHOTOGRAPHY THROUGH THE MICROSCOPE.
Eastman Kodak Company, 1974 (con re-
ediciones posteriores).
ADVENTURES WITH A MICROSCOPE. Richard
Headstrom. Dover Publications, Inc.,
1977.
ATLAS DE MICROSCOPÍA. J. Bernis Mateu.
Jover, D. L., varias ediciones entre 1976
y 1986.
TEMAS 29
OBSERVACIONES

RICHARD JONES
Camillo Golgi
y la reacción negra
La voluntad y el rigor intelectual estuvieron en el origen
de los descubrimientos de este gran médico que le llevaron,
desde un hospital provinciano, hasta el reconocimiento
internacional y al premio Nobel

Paolo Mazzarello

E
l 26 de octubre de 1906, Camillo
Golgi, a la sazón profesor de
histología y patología general
de la Universidad de Pavía, recibió
un telegrama del director del Instituto
Karolinska de Estocolmo donde se le
comunicaba la concesión del premio
Nobel de medicina y fisiología. Fue
el primer italiano que recibía el má-
ximo reconocimiento científico inter-
nacional, galardón que coronaba una
aventura intelectual iniciada en el
Hospital de Beneficencia de Incura-
bles de Abbiategrasso, un nosocomio
de enfermos crónicos, lejos del circui-
to académico.
Camillo Golgi nació el 7 de julio de
1843 en Corteno (hoy Corteno Golgi),
una aldea de las montañas de la alta
Valcamonica. Hijo de médico rural,
creció con el ejemplo diario que le
brindaba su progenitor, siempre dis-
puesto a partir en medio de la noche
para auxiliar a un enfermo grave o
para asistir un parto en una choza
perdida en las montañas. Concluidos
los estudios primarios y secundarios,
Golgi se matriculó en la facultad de
medicina de la Universidad de Pavía,
sin más ambición que licenciarse para
ejercer la profesión paterna.
Por aquella época, el de Pavía era
el único ateneo de Lombardía y en él
encontró Golgi una verdadera efer-
vescencia cultural. Después de la pri-
mera fase de la unificación italiana,
los estudios en medicina de Pavía se
habían transformado y vivificado con
elementos didácticos que incluían
nuevas materias, como las revolucio- cado el mapa de Italia se entrelaza- momento de organización y estruc-
narias conquistas de la biología ale- ban con las nuevas teorías sobre la turación particulares de la materia,
mana, la patología celular de Rudolf constitución de los organismos, so- destinada cíclicamente a terminar
Wirchow o la teoría celular de Ma- bre los procesos patológicos y sobre por transformarse merced al impulso
thias Jacob Schleiden y Theodor la naturaleza de los fenómenos bio- de las fuerzas que actuaban sobre los
Schwann, que despertaban el entu- lógicos. compuestos químicos. No en vano El
siasmo de los estudiantes. De esta En este marco conceptual, la vida, ciclo de la vida era el título de uno
forma, las ideas que habían modifi- la psíquica incluida, no era sino un de los textos fundamentales del posi-

64 TEMAS 29
 nocido ya desde que a los veinte años
escribió un ensayo titulado Sobre la
locura de Cardano, terminó por deci-
dir la suerte de Camillo Golgi. La
atención a los enfermos ya no era el
ideal al que sentía debía dedicar su
vida. Mucho más fascinante le re-

INSTITUTO DE PATOLOGIA GENERAL DE LA UNIVERSIDAD DE PAVIA

sultaba el estudio del cerebro y de los
fenómenos nerviosos, un campo de
investigación clave para la filosofía
materialista que reducía la psiquia-
tría a neuropatología y que no con-
sideraba el cerebro como órgano del
alma sino de la psique. Después de
un período de incertidumbre profe-
sional, Golgi ingresa como asistente
hospitalario en la clínica psiquiátrica
de Pavía y empieza a apasionarse por

GIACOMO GROSSO, MUSEO DE ANTROPOLOGIA CRIMINAL DE TURIN

la investigación científica.
El meticuloso Golgi bien pronto
descubriría en la personalidad de
Lombroso todas sus extravagancias
y sus deficiencias metodológicas. De
hecho sólo en apariencia seguía el
axioma epistemológico positivista que
oficialmente abrazaba, según el cual
una verdad científica es la que se
deriva de hechos, a partir de los cua-
les se establecen leyes mediante in-
ducción. En realidad Lombroso se
nutría más de intuiciones repentinas
que de sólidas deducciones. Al servi-
cio de estas intuiciones destellantes
ponía toda su energía creadora, selec-
cionando el dato experimental si le
convenía y despreciándolo si no se
ajustaba a sus teorías.
Golgi, insatisfecho por la falta de
rigor de Lombroso, comenzó a frecuen-
tar el Instituto de Patología General
en el tiempo libre que le dejaba su
labor asistencial. El antropólogo Paolo
Mantegazza había organizado el ins-
tituto pocos años antes en el palacio
del jardín botánico; en aquella época
lo dirigía Giulio Bizzozero. Tres años
más joven que Golgi, Bizzozero era
la personalidad emergente de la inves-
tigación lombarda. Con el microsco-
pio por emblema, consideraba la cien-
cia escrita en alemán un espejo en el
1. PALACIO DEL JARDIN BOTANICO de Pa- que mirarse. Se había licenciado en
vía, donde estaba ubicado el Instituto de Pa- medicina en 1866 a la edad de veinte
tología general dirigido por Giulio Bizzozero años; después de breves estancias de
(abajo, a la derecha). Arriba, a la izquierda, estudio en los laboratorios de Heinrich
Camillo Golgi en la época en que se aplicó al Frey en Zurich y de Rudolf Virchow
estudio de la biología de la infección de ma- en Berlín, había pasado directamen-
laria. Arriba, a la derecha, retrato de Cesare te del banco estudiantil a la cátedra
Lombroso. de patología general. Su estilo de
investigador riguroso y de docente efi-
tivismo científico de la época, escrito las enajenaciones mentales prepa- caz contrastaba con la picaresca de
por el filósofo materialista holandés rada por Golgi. En la mente del joven Lombroso.
Jakob Moleschott y traducido al ita- laureado, el grado constituía el pun- Si al psiquiatra se debe reconocer
liano por Cesare Lombroso, entonces to de partida para el ejercicio de una el haber inflamado el espíritu de Golgi
profesor de psiquiatría en la Univer- honesta profesión médica. Pero la por el estudio del sistema nervioso,
sidad de Pavía. El 7 de agosto de 1865 fascinación contagiosa que emanaba es mérito de Bizzozero el haber des-
fue Lombroso el ponente de la tesina de una personalidad tan ecléctica y pejado el camino científico del futuro
de licenciatura sobre la etiología de entusiasta como la de su mentor, co- premio Nobel, la vía histológica hacia

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 65

la neurobiología. Golgi empezó así a
publicar sus primeros trabajos cien-
tíficos. Entre éstos deben mencio-
narse un ensayo sobre las causas de
las enfermedades mentales y un tra-
bajo notable sobre la estructura de
la glía, el tejido que sirve de sostén
al sistema nervioso.

Un hospital provinciano
y un microscopio

A principio de los años setenta,

Golgi era ya un virtuoso del mi-
croscopio. La investigación histológica
era para él la verdadera vocación a
la que entregarse. Se empezaba a re-
conocer su talento, como prueba el
hecho de que se le encargara, sin retri-
bución, la docencia de técnicas micros-
cópicas, pero en la Universidad de
Pavía escaseaban las posibilidades
de encontrar trabajo. El padre de Ca-
millo se impacientaba por que su hijo
soñador, que trabajaba mucho y ga-
naba poco (y además pagaba de su bol-
sillo la impresión de su labor cientí-
INSTITUTO DE PATOLOGIA GENERAL DE LA UNIVERSIDAD DE PAVIA

fica), encontrara finalmente un puesto

seguro y bien remunerado. A princi-
pios de 1872, se convocó un concurso
para un puesto de médico general en
el Hospital de Beneficencia de In-
curables de Abbiategrasso. Animado
por el padre, Golgi vaciló si partici-
par y resultó a la postre el ganador.
Llegados a este punto de su vida,
nada permitía imaginar un futuro de
premio Nobel. El hospital de cróni-
cos carecía de instrumental cientí-
fico y no estaban contemplados más
gastos que los derivados del aloja-
miento y tratamiento de los pacien- copio. Estoy feliz porque he encon-
tes. Para un joven médico que ya trado una reacción nueva que demues-
había probado el placer de la inves- tra también las estructuras de la es-
tigación científica, la situación debía troma intersticial de la corteza
ser, desde cualquier punto de vista, cerebral. Añado nitrato de plata a las
deprimente. En la correspondencia muestras de cerebro endurecidas en
que intercambió por entonces con un bicromato potásico. Ya he conseguido
amigo oculista, Niccolò Manfredi, resultados muy buenos y espero obte-
Golgi lamenta “las pequeñas moles- ner bastantes más”. Es el primer
tias”, que le producen “un torpor inte- anuncio conocido de la reacción negra
lectual tan grande” que le limitan (“reazione nera”) que cambiaría el
“completamente la capacidad de tra- curso de la neuroanatomía y de la
INSTITUTO DE PATOLOGIA GENERAL DE LA UNIVERSIDAD DE PAVIA

bajo”, sumiéndole en una “inercia ver- neurohistología de finales del siglo XIX,
gonzosa”. Pero hacia finales del año, permitiendo una descripción topo-
Golgi ya se estaba rehaciendo. En la gráfica precisa de la estructura del
cocina del pequeño apartamento que sistema nerviosos central. No se
tenía asignado en el hospital había conoce qué camino siguió Golgi hasta
organizado un rudimentario labora- dar con la reacción (se podría hablar
torio formado básicamente por un tanto del descubrimiento de un fe-
microscopio. Utilizando una cuchi- nómeno bioquímico, como de la in-
lla, realizaba finos cortes de tejido ner- vención de una técnica de investiga-
vioso y había reiniciado su trabajo ción). A partir de las escasas alusiones
de investigación. contenidas en sus escritos y de algún
El 16 de febrero de 1873, escribe testimonio, es lícito suponer que
con renovado ánimo a su amigo Man- durante su período de formación en
fredi: “Ahora he retomado la labor Pavía había recibido alguna indica- 2. REACCION NEGRA en la médula espinal,
que había abandonado hace meses. ción indirecta. De su descubrimiento, en una preparación original del laboratorio
Trabajo muchas horas con el micros- Golgi sólo proporciona una frase: de Camillo Golgi.

66 TEMAS 29
 el mundo, ha sido el único que ha

MUSEO DE LA HISTORIA DE LA UNIVERSIDAD, PAVIA

4. MICROSCOPIO
utilizado por permitido observar a la célula ner-
Camillo Golgi en viosa en toda su integridad. A pesar
sus investigaciones. de ello, la importancia de este des-
cubrimiento sólo se empezó a reco-
nocer una quincena de años más
tarde, cuando hicieron un extenso
uso del método el padre de la histo-
logía del siglo diecinueve, Albert
Kölliker, el neuroanatomista español
Santiago Ramón y Cajal y el biólogo
sueco Gustaf Retzius.

El axón

A provechando las enormes posi-

bilidades para la investigación
que brindaba la nueva técnica, Golgi
hizo algunos descubrimientos que
revolucionaron la fisiología celular
del sistema nervioso de la época. Según
el modelo dominante de Joseph Ger-
lach, el elemento celular fundamen-
tal de la transmisión nerviosa era la
dendrita (entonces conocida como pro-
ceso protoplasmático). Sus ramifi-
caciones permitían la interrelación
compleja entre distintos grupos ner-
viosos, tal como se suponía dada la
variabilidad de las funciones del encé-
falo. Las dendritas de las distintas
células se fundirían en una red sin-
citial extendida por todo el sistema ner-
vioso; en ella se originarían las fibras
de la sustancia blanca. Golgi demos-
tró que el axón (entonces llamado cilin-
droeje o prolongación nerviosa) está
ramificado y excluyó la posibilidad de
que las dendritas de las células ner-
viosas se fundieran en una red.
Quedaba, pues, desmentido el reti-
3. GOLGI, en la foto de recuerdo de los dis- cularismo de Gerlach: para explicar
tinguidos honoris causa por la Universidad la complejidad de las
de Cambridge (1898), pocos meses después uniones nerviosas bas-
del descubrimiento del aparato reticular in- taban las ramificaciones
terno (aparato de Golgi). De izquierda a de- de los axones. Por tanto,
recha, Étienne-Jules Marey, Anton Dohrn, era el axón y no las den-
Camillo Golgi, Ernst Haeckel, Ambrosius dritas el elemento por el
Arnold Wilhelm Hubrecht, Wilhelm Kühne, que viajaba la transmi-
Henry Bowditch, Hugo K. Kronecker. sión nerviosa a distan-
cia. Pero Golgi no abandonó
del todo el paradigma reticular.
había llegado a él estudiando las Paul Broca había demostrado en
impregnaciones metálicas en mues- 1861 la localización cortical de la
tras fijadas de muy diversa manera, célula nerviosa, con todas sus pro- capacidad lingüística humana, pero
tras una larga serie de tentativas. longaciones y ramificaciones. hacia 1870 la opción holística con-
La reacción negra se compone de La ventaja del método reside en servaba aún su influencia, desde que
una primera fase de fijación y endu- que, por motivos aún desconocidos, a mediados de siglo Marie-Jean Pierre
recimiento de los tejidos en bicromato el precipitado colorea en el campo Flourens formulara su teoría de que
potásico que dura un período varia- microscópico sólo un pequeño por- las funciones de la corteza cerebral
ble, de quince días a más de un mes. centaje de las células (entre el uno y se producían por una actividad cor-
A continuación viene un paso por el cinco por ciento). De esta manera, tical global. La hipótesis era terreno
nitrato de plata a lo largo de un tiempo de la laberíntica complejidad del sis- abonado para un modelo celular de
mínimo de veinticuatro a cuarenta y tema nervioso emerge la silueta de “vasos comunicantes”, donde cada
ocho horas (aunque a veces la reac- una sola célula, que aparece como un elemento estaba unido a todos los
ción es observable a las dos o tres árbol sacado con todas sus ramas de demás a través de una red sincitial
horas). Como resultado se obtiene la un bosque inextricable. Durante gran y donde la transmisión nerviosa no
precipitación de una sal, el cromato parte de este siglo, el método de Golgi, fluía a través de vías aisladas sino que
de plata, que tiñe de color negro la utilizado en los laboratorios de todo se propagaba, por contigüidad, por

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 67

5. CLAUSTRO DEL ANTIGUO monasterio de

LA “HABIATE”, VOL. 2, 1978-1979

Santa Clara, luego habilitado como Hospital
de Beneficencia de Incurables, en Abbia-
tegrasso.

todo el sistema nervioso. Influido por

esta interpretación, cuando Golgi se
asomaba a sus portaobjetos con la
reacción negra, debió pensar que, si
la red no estaba formada por las den-
dritas, debía sostenerse en las rami-
ficaciones de los axones. La compleja
arquitectura nerviosa avalaba la teo-
ría reticular como si de un hecho se
tratara. Nacía así la teoría de la red
nerviosa difusa, una enorme red inte-
raxonal por la cual los impulsos ner-
viosos se transmitían de forma difusa.

La lucha contra la malaria

E n 1874 Golgi descubría ciertas le-

siones en el cuerpo estriado en
un enfermo de corea que había muerto
en Abbiategrasso y publicó trabajos
notables sobre la estructura del ce-
rebelo y de los bulbos olfatorios. En
1876 volvía a Pavía primero como
profesor extraordinario de histología
y luego, tras escasos meses en la cáte-
dra de anatomía de Siena, como pro-
fesor ordinario. Dos años más tarde
descubría en el espesor de los tendo-
nes dos corpúsculos sensitivos: los
órganos musculotendinosos, que lle-
van su epónimo, encargados de la
transducción de la tensión muscular,
y los corpúsculos de Golgi-Mazzoni,
que señalan estímulos de presión.
En la ciudad lombarda, organizó un
laboratorio que pronto se convirtió
en un centro italiano de estudios bio-
lógicos de primera magnitud. Allí tra-
bajaron, entre otros, Giovan Battista
Grassi, descubridor del vector de la
malaria, el mosquito Anopheles, y a
quien se distinguiría con la medalla
Darwin de la Regia Sociedad de
Londres; Emilio Veratti, que identifi- premio Nobel de la paz en 1922), el En el hospital del Espíritu Santo
có el retículo sarcoplasmático; Adelchi suizo Albert Kölliker, el ruso Sergej de Roma, Ettore Marchiafava y An-
Negri, descubridor, en el cerebro infec- Soukhanoff, el norteamericano Hen- gelo Celli habían confirmado y am-
tado por el virus de la rabia, de los ry Herbert Donaldson (que seleccionó pliado notablemente las observacio-
cuerpos que llevan su nombre; Anto- la cepa de los famosos ratones albi- nes de Alphonse Laveran, médico
nio Carini, que identificó en Brasil nos Wistar, empleados en laborato- militar que, en Constantine (Argelia),
el Pneumocystis carinii, responsable rios de todo el mundo). había descubierto en la sangre de
hoy en día de infecciones graves en En 1881, Golgi fue nombrado pro- pacientes con malaria un microor-
los enfermos de sida; Carlo Martinotti, fesor ordinario de patología celular. ganismo y lo había reconocido como
que descubrió las células con axones Conservaba también la plaza de his- agente etiológico de la enfermedad.
ascendentes de la corteza cerebral tología y había asumido la dirección Golgi pasó algunos días en septiem-
(células de Martinotti); Aldo Perron- de un pequeño grupo médico en el bre de 1885 con Marciafava y Celli y
cito, que estableció las etapas fun- antiguo hospital de San Mateo de Pa- se convenció de lo acertado de sus
damentales en el mecanismo de re- vía. En 1885 recogía gran parte de deducciones y de las de Laveran. Pero
generación del nervio periférico. sus investigaciones neuroanatómi- las formas de malaria que predomi-
Visitaron durante algún tiempo el cas en el libro Sobre la anatomía fina naban en Roma eran irregulares en
laboratorio de Golgi también algu- de los órganos centrales del sistema su presentación y los accesos febri-
nos investigadores extranjeros, como nervioso. Después encauzó su interés les no se repetían con la precisa caden-
el noruego Fritjof Nansen (zoólogo, hacia otros asuntos, en particular el cia temporal que sí se observaba en
explorador de las regiones polares y mecanismo patogénico de la malaria. Pavía. En la ciudad lombarda se veían

68 TEMAS 29
MUSEO DE LA HISTORIA DE LA UNIVERSIDAD, PAVIA
INSTITUTO DE PATOLOGIA GENERAL DE LA UNIVERSIDAD DE PAVIA
sobre todo casos de fiebre cuartana
(llamada fiebre larga) y de terciana.
En la primera los accesos febriles de
presentan en ciclos sucesivos de cua-
tro días, de tres en la segunda.
De regreso a Pavía, Golgi estable-
ció la relación de las distintas for-
mas de desarrollo del parásito den-
tro de los glóbulos rojos con las fases
del ciclo febril y diferenció claramente
el protozoo de la fiebre terciana del
de la cuartana. Aún más importante,
estableció la relación de la fase febril
con la “esporulación” o multiplica-
ción de los parásitos en la sangre (ley
de Golgi). Sus investigaciones sobre
la malaria continuaron hasta 1892 con
estudios diversos sobre el momento
más adecuado para administrar qui-
nina a los enfermos, junto con varias
contribuciones sobre el papel de la
fagocitosis en el curso de la enferme-
dad y en la patogénesis de las fiebres
irregulares. En aquel período Golgi
dio pruebas de su extraordinario ta-
lento para la experimentación al de-
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
6. LA IMAGEN en margarita
del parásito de la malaria en
el período inmediatamente
anterior al acceso febril (a la
izquierda). La anotación es
de Golgi. Abajo, el aparato de
Golgi en los ganglios espina-
les, en una preparación ori-
ginal del laboratorio de Ca-
millo Golgi. A la derecha,
dibujo realizado por Golgi del
aparato reticular interno en
células nerviosas de los gan-
glios espinales de un caballo.
sarrollar también un método de estu-
dio de la nefrona, que le permitió acla-
rar la histogénesis del glomérulo re-
nal y de identificar la peculiar relación
que el túbulo contorneado distal del
riñón establece con el polo vascular
del corpúsculo de Malpighi.
Mientras tanto, sus estudios neu-
rohistológicos empezaban a alcanzar
cierta difusión y consideración inter-
nacionales. Mucho mayor era la velo-
cidad con la que estaba cambiando el
modelo conceptual bajo el que se con-
sideraba el sistema nervioso. Los sui-
zos August-Henri Forel y Wilhelm
His propusieron en 1886 y 1887 que
también este tejido debía respetar
los cánones de la teoría celular: que
estuviera compuesto de células indi-
viduales y aisladas, no en una red
difusa. En 1891 el alemán Wilhelm
Waldeyer propuso dar a estas célu-
las el nombre de neurona. El español
Santiago Ramón y Cajal comenzaba
por entonces a trabajar de forma sis-
temática con la reacción negra y
DE CAMILLO GOLGI, OPERA OMNIA, HOEPLI, MILAN, 1903
lograba notables pruebas indirectas
que confirmaban la reciente teoría
de la neurona. Golgi, ocupado en la
malaria, se sentía incordiado por este
oscuro profesor español que, con su
mismo método, demolía publicación
tras publicación su teoría de la red
nerviosa difusa. La polémica entre
ambos tuvo su punto álgido en Es-
tocolmo en 1906, cuando por ironía
de la fortuna, ambos recibieron de
forma simultánea el premio Nobel,
indisolublemente unidos “como dos
gemelos siameses están unidos por la
espalda”, según escribió Ramón y
Cajal en su autobiografía.
El huidizo aparato de Golgi
E ntre 1892 y principio de 1893
Golgi descubrió, de forma inde-
pendiente a lo observado por el sueco
Eric Müller, los canalículos intrace-
lulares de las células parietales de las
glándulas gástricas (canalículos de
Müller-Golgi), pocos meses después
de ser nombrado rector de la Univer-
sidad de Pavía, cargo que mantendría
hasta 1896, con el consiguiente re-
traso en su trabajo de laboratorio.
En 1897 volvió a dedicarse con todas
sus energías al estudio del sistema
nervioso. Con una variante de la reac-
ción negra, descubrió en el citoplasma
de las células de los ganglios nervio-
sos espinales una red de filamentos
claramente separada de la membrana
plasmática y del núcleo. El hallazgo
69

7. MICROFOTOGRAFIA de fluorescen-
cia de un cultivo epitelial en el que se
observan los núcleos (verde) y el apa-
rato de Golgi (rojo).
aún no era reproducible y Golgi esperó
a publicar las observaciones hasta
que su colaborador Emilio Veratti
logró confirmarla en las células que
forman el origen del cuarto nervio
craneal. En el ínterin, él mismo repro-
dujo las observaciones de forma cons-
tante en las células de Purkinje.
Algunos preparados microscópicos
mostraban también un involucro peri-
celular. Así, en abril de 1898 Golgi
describía estas dos particularidades
a la sociedad médico-quirúrgica de
Pavía: la red intracelular, que por su
localización y aspecto denominó apa-
rato reticular interno, y el involucro
pericelular. Esta última observación
permaneció completamente olvidada
hasta hace pocos años y es ahora
cuando está adquiriendo una impor-
tancia creciente en las investigacio-
nes neurocitológicas modernas.
Golgi incitó a sus discípulos a bus-
car el aparato intracelular (que a par-
tir de 1910 empezó a ser conocido
como aparato de Golgi) también fue-
ra del sistema nervioso. De esta for-
ma Antonio Pensa, Adelchi Negri y
Edoardo Gemelli lo observaron en
varias categorías de células y pronto
quedó claro que dicho orgánulo celu-
lar no era exclusivo del campo de la
neurocitología, sino que se trataba
de un elemento fundamental de la
célula eucariota.
El descubrimiento no fue acepta-
do de forma unánime por la comuni-
dad científica y no tuvo implicación
en la justificación oficial de otorgar-
le el Nobel. Para muchos citólogos se
trataba de un artefacto derivado de
la gelificación de los coloides intra-
celulares.
El poder de conocimiento que deriva
de la reacción negra es verdadera-
70
mente extraordinario cuando se de-
sarrolla de forma adecuada. Pero a
pesar de los intentos de definirlo en
términos fisicoquímicos, el método
sigue siendo bastante azaroso. Entre
bromas y veras, se atribuían propie-
dades especiales al agua de Pavía,
suponiendo que su composición habría
facilitado la reacción en la ciudad
lombarda y justificado los errores en
medio mundo. En efecto, el agua de
Pavía era particularmente rica en
sales ferrosas y dióxido de azufre.
Cabría, por tanto, la posibilidad de
que esta última substancia haya ejer-
cido una acción reductora adicional.
Golgi estuvo siempre profunda-
mente convencido de la existencia del
orgánulo que descubriera y en 1909
intuía, con gran visión, su implica-
ción en los procesos de secreción celu-
lar. La controversia sobre la exis-
tencia del aparato de Golgi se resolvió
en 1954 con la aparición del micros-
copio electrónico. El mismo instru-
mento que, al demostrar la existen-
cia de las sinapsis nerviosas había
demolido para siempre la red ner-
viosa difusa de Golgi, por una curiosa
y singular némesis histórica fue tam-
bién el medio por el que se demostró
finalmente la realidad citológica del
aparato reticular interno. Gracias a
este descubrimiento Golgi tal vez sea
el científico más mencionado en la
bibliografía biológica internacional
y su nombre se ha convertido en sinó-
nimo del orgánulo que descubrió.
Después de 1900, Golgi dirigió su
atención a temas sociales y de polí-
tica sanitaria, en particular a la lu-
cha contra la malaria. En 1900 fue
nombrado senador del reino y de 1901
a 1909 nuevamente rector de la Uni-
versidad de Pavía. Durante la Gran
UNIVERSIDAD DE ILLINOIS EN URBANA-CHAMPAIGN
Guerra dirigió el hospital militar
que se organizó cerca del Colegio
Borromeo de Pavía y se ocupó de la re-
habilitación de los heridos de guerra.
En su larga vida obtuvo distinciones
honoris causa por las universidades
de Cambridge, Ginebra, Atenas, Os-
lo y París. Luchó duramente contra
el proyecto auspiciado por Luigi
Mangiagalli por la creación de una
segunda universidad lombarda en
Milán, porque temía que este nuevo
ateneo podría hacer superfluo el de
Pavía.
Cuando murió el 21 de enero de
1926 este hombre que había alcan-
zado tan altos honores y gloria había
perdido las principales batallas a las
que se dedicó la segunda parte de su
vida: la lucha contra Ramón y Cajal
y los partidarios de la teoría neuro-
nal que estaban triunfando en los
tratados de neurología y neurobiolo-
gía y la que sostuvo contra Mangia-
galli, que logró en 1924 fundar la
Universidad de Milán.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
LA STRUTTURA NASCOSTA. LA VITA DI CA-
MILLO GOLGI. Paolo Mazzarello. Cisalpi-
no-Monduzzi; Bolonia, 1996. (Edición
inglesa revisa y corregida The Hidden
Structure. The Life of Camillo Golgi. Ox-
ford University Press, Oxford, 1999.)
THE BLACK REACTION. Ennio Pannese, en
Brain Research Bulletin, número 41, pá-
ginas 343-349; 1996.
T HE C ENTENARIAN G OLGI A PPARATUS .
Paolo Mazzarello y Marina Bentivoglio,
en Nature, vol. 392, págs. 543-544; 1998.
G OLGI ’ S S CIENTIFIC B IOGRAPHY . Paolo
Mazzarello, en Journal of the History of
the Neurosciences, volumen 8, número 2,
páginas 121-131; 1999.
TEMAS 29
Cajal y la estructura
histológica del sistema
nervioso
La mitificación de Cajal ha conducido a una imagen
típica basada en varios supuestos que falsean
gravemente la realidad
José M. López Piñero
C
ajal es todo lo contrario de un
“clásico” científico olvidado,
tanto en España como en la
comunidad científica internacional.
En nuestra sociedad se ocupan con-
tinuamente de él libros, artículos
periodísticos y trabajos de revistas
especializadas, ha sido el tema de
películas y series de televisión, tiene
dedicadas calles en casi todas las
poblaciones del país, se le han erigido
numerosos monumentos y su men-
ción resulta obligada en cuanto se
habla de la investigación en España
y de otros temas afines.
Su mitificación ha conducido a una
imagen tópica del genial neurohistó-
logo basada en varios supuestos que
falsean gravemente la realidad. Uno
de ellos es que fue un investigador
sin raíces en la historia científica de
nuestro país, “surgido por generación
espontánea”, como llegó a decir Ortega
y Gasset. Ello significa, por un lado,
desconocer la tradición micrográfica
española y, por otro, ignorar el am-
biente, encabezado por Maestre de
San Juan, en el que Cajal se inició en
la observación microscópica. Otro de
los supuestos minimiza la llamada
Escuela Histológica Española, surgi-
da en torno a la obra del gran inves-
tigador aragonés, y olvida los distintos
grupos que la integraban, comenzan-
do por no distinguir entre sus discí-
pulos propiamente dichos y los auto-
res influidos por él de forma menos
directa.
Por otra parte, la pervivencia de la
obra de Cajal en la comunidad cien-
tífica internacional se debe a una
razón muy clara: lo mismo que
Darwin, Pasteur, Virchow, Mendel o
Claude Bernard, Cajal creó uno de los
72
modelos que hoy sirven de núcleos
de cristalización a las ciencias bioló-
gicas. Concretamente, formuló el
vigente en la actualidad acerca de la
estructura del sistema nervioso y los
mecanismos básicos de su funciona-
miento.
De forma directa, la obra cajaliana
constituye uno de los fundamentos de
los saberes acerca de la anatomía, la
fisiología y las enfermedades nervio-
sas y, de modo indirecto, una de las
contribuciones centrales en las que se
apoyan la concepción de los organis-
mos vivos y las ciencias de la con-
ducta. Por ello, no resulta extraño que
sea una figura familiar para cualquier
cultivador de las neurociencias y cono-
cida, en mayor o menor grado, por los
que se dedican a otras tareas de la bio-
logía, la medicina o la psicología.
La tradición micrográfica
española
L os primeros micrógrafos españoles
fueron varios miembros del movi-
miento novator que, en el último ter-
cio del siglo XVII, introdujo en España
la ciencia moderna. Destacó entre ellos
el valenciano Crisóstomo Martínez,
coetáneo de Malpighi, Leeuwenhoek
y Hooke, el importante “microscopista
clásico” de las estructuras óseas. A lo
largo del siglo XVIII, la anatomía tex-
tural y la observación microscópica se
cultivaron en nuestro país de modo
continuado, desde los variados enfo-
ques que expone María Luz Terrada
en su monografía sobre el tema. Por
el contrario, el profundo colapso que
la vida científica española sufrió
durante la guerra de la Independencia
y el reinado de Fernando VII (1808-
1833) redujo la actividad en este campo
a la mera recepción libresca de las
nuevas corrientes europeas.
El paso de esta asimilación pura-
mente libresca a la recuperación de
la micrografía práctica, de acuerdo
con las nuevas teorías y los nuevos
recursos técnicos, se inició en España
en los años centrales del siglo XIX y
se afianzó en la década siguiente.
A dicho proceso contribuyeron nota-
blemente personas y grupos científi-
cos de vanguardia, situados más o
menos al margen del mundo acadé-
mico oficial. Aprovechando la com-
pleta libertad docente implantada
por la revolución democrática de 1868,
algunos de ellos fundaron institu-
ciones privadas que contaron desde
el principio con laboratorios o cáte-
dras de anatomía microscópica. Como
ejemplos típicos anotaremos el Ins-
tituto Biológico de Rafael Martínez
Molina, quien fue el primero que
apoyó la carrera científica de Cajal,
y el Museo Antropológico de Pedro
González de Velasco, en cuyo edifi-
cio se instalaría a comienzos del si-
glo XX el laboratorio en el que traba-
jaron el gran neurobiólogo y sus
discípulos.
1. “ESQUEMA de la estructura del cerebe-
lo. Cortes transversal y longitudinal de una
lámina cerebelosa”. Lámina mural diseña-
da por Cajal y pintada por R. Padró. Biblio-
teca y Museo Historicomédicos, Valencia.
Cajal la diseñó con motivo de la serie de
conferencias que pronunció en marzo de
1892 en la Academia de Ciencias Médicas,
de Barcelona, bajo el título general de
“Nuevo concepto de la histología de los
centros nerviosos”.
TEMAS 29
 BIBLIOTECA Y MUSEO HISTORICOMEDICO DE VALENCIA

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO

73
BIBLIOTECA Y MUSEO HISTORICOMEDICO DE VALENCIA
2. RECONSTRUCCION del laboratorio de Cajal instalado en su domicilio de Valencia (1884).
La importancia de los grupos extra-
oficiales no debe hacer olvidar que
algunos profesores de las universi-
dades oficiales participaron tem-
pranamente en el esfuerzo de incor-
porar de modo práctico las nuevas
corrientes histológicas.
Sobresalió entre todos ellos Aure-
liano Maestre de San Juan (1828-
1890), cabeza de la histología uni-
versitaria española anterior a Cajal.
Maestre de San Juan se consagró a
la histología a partir de 1860, fecha
en la que pasó a ocupar una de las
cátedras de anatomía de la Facultad
de Medicina de Granada. Entre 1863
y 1867, completó su formación en di-
ferentes laboratorios de Francia, Ale-
mania y Gran Bretaña. Su prestigio
pesó de modo decisivo en la dotación
en dicha Facultad de la primera cá-
tedra oficial española de histología
(1873). Nombrado titular de la mis-
ma por concurso, Maestre realizó
desde ella una labor didáctica ejem-
plar, no solamente doctrinal sino,
sobre todo, práctica. En su labora-
74
torio, tomaron contacto con las téc-
nicas histológicas numerosos médi-
cos españoles, entre ellos, el propio
Ramón y Cajal.
De los demás cultivadores espa-
ñoles de la anatomía microscópica
coetáneos de Cajal que iniciaron su
actividad en esta época, anotaremos
únicamente la trayectoria inicial de
Luis Simarro Lacabra (1851-1921).
Simarro trabajó en el laboratorio
micrográfico del Museo Antropológico
de González de Velasco y enseñó en
su Escuela Libre de Medicina y
Cirugía. Más tarde, completó su for-
mación asistiendo a los cursos y a las
sesiones de la Sociedad Histológica
Española fundada por Maestre. Desde
1880 a 1885 trabajó en París junto a
figuras como Charcot y Magnan y se
especializó en neuropsiquiatría. Fue
entonces también discípulo de Ran-
vier, que orientó el punto de partida
de su labor neurohistológica. De re-
greso a España, Simarro montó en
Madrid un laboratorio histológico
que, como vamos a ver, influyó de
modo decisivo en la trayectoria de
Cajal.
La obra neurohistológica
de Cajal
N acido en la aldea de Petilla de
Aragón el año 1852, Santiago
Ramón y Cajal fue hijo de un ciru-
jano rural que con grandes esfuerzos
llegó a conseguir el título de médico.
Su niñez discurrió en una serie de
pequeñas localidades del Alto Aragón.
Tras estudiar el bachillerato en Jaca
y Huesca, cursó medicina en una mo-
desta “escuela provincial” creada en
Zaragoza al amparo de la libertad
docente implantada por la revolución
democrática de 1868. Poco después
de graduarse (1873) ganó unas opo-
siciones a médico militar y estuvo
ocho meses en el ejército que operaba
en Cataluña contra los carlistas. A con-
tinuación fue trasladado a Cuba, don-
de participó en la guerra colonial
hasta su regreso a la península, a
mediados de 1875.
Recuperado del paludismo que había
contraído en Cuba, la influencia de su
padre, que le había ya inclinado a con-
vertirse en médico, pesó también en
su decisión de dedicarse a la docencia
universitaria de la anatomía. Su pri-
mer contacto con la histología se pro-
dujo en 1877, con ocasión de cursar en
Madrid los estudios de doctorado.
“Sugestionado —según el propio
Cajal— por las “bellas preparaciones
micrográficas” que le enseñaron
Maestre de San Juan y López García,
decidió dedicarse a la disciplina y, a
su regreso a Zaragoza, gastó todos sus
ahorros en instalar un modesto labo-
ratorio micrográfico. Contra lo que
suele afirmarse con frecuencia, su rela-
ción con Maestre y López García no se
redujo a este contacto inicial. Volvió
varias veces a su laboratorio en el
curso de la siguiente década y durante
la fase inicial de su obra fue un fiel
seguidor de las ideas de Maestre, a
quien dedicó en sus memorias un
recuerdo muy expresivo.
Cajal fracasó en sus primeras opo-
siciones a cátedra en 1880, en las que
sólo tuvo el apoyo de Martínez Molina,
pero en 1883 ganó la de anatomía de
la Facultad de Medicina de Valencia.
Durante los casi cuatro años que
estuvo al frente de la misma, Cajal se
orientó en el mundo de la investiga-
ción. Publicó trabajos sobre diferen-
tes tejidos, así como un Manual de His-
tología, cuyo primer fascículo apareció
en 1884. Con motivo de la vacunación
anticolérica de Jaime Ferrán, se ocupó
también de cuestiones bacteriológi-
cas en 1885. No obstante, acabó cen-
trándose en la neurohistología, sobre
TEMAS 29
todo después de una estancia en
Madrid en 1887 como miembro de un
tribunal de oposiciones. Visitó enton-
ces los principales laboratorios micro-
gráficos de la capital, entre ellos el de
Luis Simarro, quien le enseñó el mé-
todo de impregnación cromoargénti-
ca de Camillo Golgi.
En el mismo 1887, la histología
pasó del doctorado a la licenciatura.
Se crearon nuevas cátedras de la
materia y Cajal ocupó la de Barcelona
hasta que, en 1892, fue trasladado a
la de Madrid, de la que fue titular
hasta su jubilación. En 1901, cuando
ya era una figura de primera impor-
tancia en el mundo científico inter-
nacional, se le encargó la dirección
del Laboratorio de Investigaciones
Biológicas, creado por el peso que
tuvieron los premios y distinciones
concedidas a su labor en el extran-
jero, que culminarían más tarde en
la concesión del premio Nobel con-
juntamente con Golgi (1906).
El nuevo concepto
de la histología
de los centros nerviosos
S iendo ya catedrático de histolo-
gía, primero en Barcelona (1888-
1892) y después en Madrid, Cajal con-
virtió el método de Golgi en la primera
arma técnica de su obra de investiga-
dor, sobre todo después de introdu-
cir la modificación que denominó
“proceder de doble impregnación”,
que permitía obtener tinciones más
complejas. Por otra parte, consideró
como “resorte principal” y “causa ver-
daderamente eficiente” de sus espec-
taculares descubrimientos la utili-
zación del método ontogénico, es decir,
el estudio de los centros nerviosos de
embriones de ave y mamíferos, en lu-
gar de comenzar directamente con
los animales adultos, como hasta
entonces se había hecho.
Explicó esta alternativa con una
metáfora muy expresiva: “El (medio)
más natural y sencillo al parecer,
pero en realidad más difícil, consiste
en explorar intrépidamente la selva
adulta, limpiando el terreno de arbus-
tos, plantas parásitas, y aislando cada
especie arbórea tanto de sus parási-
tos como de sus congéneres. (...) Mas
semejante táctica resulta poco apro-
piada en la dilucidación del problema
propuesto, a causa de la enorme lon-
gitud y extraordinaria frondosidad
del ramaje nervioso, que inevitable-
mente aparece mutilado y casi indes-
cifrable en cada corte. (...) Puesto que
la selva adulta resulta impenetrable
e indefinible, ¿por qué no recurrir al
estudio del bosque joven, como si dijé-
ramos, en estado de vivero? (...). Es-
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
cogiendo bien la fase evolutiva (del
embrión), las células nerviosas, rela-
tivamente pequeñas, destacan ínte-
gras dentro de cada corte; las rami-
ficaciones terminales del cilindroeje
dibújanse clarísimas y perfectamente
libres; los nidos pericelulares, esto
es, las articulaciones interneurona-
les, aparecen sencillos, adquiriendo
gradualmente intrincamiento y ex-
tensión; en suma, surge ante nues-
tros ojos, con admirable claridad y pre-
cisión, el plan fundamental de la
composición histológica de la sustan-
cia gris”.
Sobre estas bases, Cajal se dedicó
a la investigación, “no ya con ahínco,
sino con furia”. Su actividad cientí-
fica durante 1888 y 1889 fue tan
intensa que, para dar a conocer sus
trabajos, además de enviar artículos
a diferentes publicaciones periódi-
cas, tuvo que editar a su costa una
Revista Trimestral de Histología
Normal y Patológica, de la que sola-
mente aparecieron tres números. Sin
embargo, los diez trabajos que publicó
en ella abrieron una nueva etapa en
el conocimiento de la estructura del
sistema nervioso.
En el trabajo que inició dicha serie,
titulado “Estructura de los centros
nerviosos de las aves”, Cajal demos-
tró por vez primera con datos ine-
quívocos que las ramificaciones de
las neuritas no acaban en la sustan-
cia gris en una red difusa, sino
mediante arborizaciones libres. Lo
consiguió, en concreto, al estudiar el
axón de las llamadas células estre-
lladas pequeñas de la capa molecu-
lar del cerebelo. A esta observación
crucial añadió, tres meses después,
otros dos hallazgos de parecida impor-
tancia, en el artículo “Sobre las fibras
nerviosas de la capa molecular del
cerebelo”: el primero fue el descu-
brimiento del axón de los granos,
diminutas células de la corteza cere-
belosa, que se divide a diversas altu-
ras en ángulo recto, produciendo unas
larguísimas proyecciones, que deno-
minó fibras paralelas por discurrir
paralelamente al sentido de la circun-
volución cerebelosa; el segundo, el de
las fibras trepadoras que, proceden-
tes de los ganglios de la protuberan-
cia, cruza sin ramificarse las capas
de los granos para contactar con las
células de Purkinje, elementos de
grueso soma piriforme descritos por
este gran histólogo checo en 1838.
Ambos hallazgos volvieron a confir-
mar que la transmisión de los impul-
sos nerviosos se hacía por contacto,
desmintiendo de modo terminante la
teoría reticular.
Casi simultáneamente, en dos tra-
bajos aparecidos en mayo y agosto de
1888, Cajal consiguió también redu-
cir a los nuevos supuestos la estruc-
tura de la retina, que continuaría
después investigando varios años
hasta la aparición de su clásica mono-
grafía sobre el tema, primero en fran-
cés (1892) y luego en alemán (1894).
El tercer territorio en el que demos-
tró la individualidad de las células
nerviosas y la terminación por con-
tacto de sus prolongaciones fue la
médula espinal, en la que concentró
sus esfuerzos durante 1889.
Cajal se preocupó inmediatamente
de difundir internacionalmente los
resultados de sus investigaciones,
con clara conciencia de que no bas-
taba enviar ejemplares de su revista
o separatas de sus artículos a desta-
cadas figuras científicas europeas.
Por ello, a finales de 1889 y comien-
zos de 1890, publicó traducciones
francesas de tres trabajos suyos donde
exponía los hallazgos más impor-
tantes que había conseguido acerca
de la estructura del cerebelo, la retina
y la médula espinal. Sin embargo, la
acogida que tuvieron estas publica-
ciones no pudo ser más decepcionan-
te. La condición marginal de la ac-
tividad científica española en la
biomedicina europea de la época y
también las dificultades que la mayo-
ría de los histólogos habían tenido al
utilizar el método de Golgi contri-
buyeron, sin duda, a que los trabajos
de Cajal fueran inicialmente reci-
bidos con desconfianza. No obstante,
la principal dificultad residía en la
misma importancia de sus descubri-
mientos y en el hecho de que contra-
dijeran frontalmente las ideas gene-
ralmente admitidas.
Para superar dicha desconfianza,
Cajal decidió aprovechar el congreso
que la Sociedad Anatómica Alemana
iba a celebrar en Berlín a comienzos
de octubre de 1889, mostrando en él
las preparaciones más claramente
demostrativas de sus descubrimien-
tos. En dicho congreso, tras la lectura
y discusión de las ponencias y comu-
nicaciones orales, se dedicó un día a
las demostraciones prácticas, sección
en la que estaba inscrito Cajal. Según
el testimonio de Van Gehuchten, Cajal
estaba solo, “no suscitando en torno
suyo sino sonrisas incrédulas. To-
davía creo verlo tomar aparte a Kölli-
ker, entonces maestro incontestable
de la histología alemana, y arras-
trarlo a un rincón de la sala de demos-
traciones, para mostrarle en el micros-
copio sus admirables preparaciones
y convencerle al mismo tiempo de la
realidad de los hechos que pretendía
haber descubierto. La demostración
75
fue tan decisiva que, algunos meses
más tarde, el histólogo de Würzburg
confirmaba todos los hechos afirma-
dos por Cajal”.
El escepticismo inicial de Kölliker
se convirtió en vivo interés cuando
observó las clarísimas imágenes de
las preparaciones del aragonés y éste
le explicó —según anota en sus
Recuerdos— “en un francés chaba-
cano, menuda y pacientemente, todos
los pequeños secretos de manipula-
ción de la reacción cromo-argéntica”.
Inmediatamente después, Kölliker
realizó una serie de trabajos de con-
firmación, utilizando la técnica de la
doble impregnación, que le hicieron
abandonar la teoría reticular y acep-
tar plenamente las concepciones de
Cajal. Los dos primeros, dedicados
al cerebelo y la médula espinal, apa-
recieron en 1890 en su propia revista,
una de las más influyentes de la mor-
fología de la época.
Kölliker se encontraba entonces en
la cumbre de su prestigio científico,
tras casi medio siglo de ejemplar dedi-
cación a la investigación histológica.
Su Handbuch der Gewebelehre des
Menschen —cuya edición original apa-
reció en 1852, el mismo año del naci-
miento de Cajal— fue el primer tra-
tado moderno de la disciplina. En
consecuencia, no resulta extraño que
su terminante respaldo a las contri-
buciones del investigador español
pesara decisivamente en la trayec-
toria científica de éste.
3. ILUSTRACIONES de la comunicación de Cajal al Congreso Médico Farmacéutico Regional
celebrado en Valencia en 1891, en la que expuso por vez primera la ley de la polarización di-
námica de las neuronas.
76
Poco después que Kölliker, casi
todas las grandes figuras de la neu-
rohistología europea asimilaron los
hallazgos de Cajal y aceptaron su
nueva concepción de la estructura
del sistema nervioso.
Estimulado por la acogida que su
labor estaba obteniendo, Cajal trabajó
de modo casi frenético durante 1890,
año en el que publicó nada menos que
diecinueve artículos, seis de los cua-
les aparecieron en francés en dife-
rentes revistas morfológicas euro-
peas. Entre otras aportaciones de
menor interés, expuso en ellos sus
primeras investigaciones sobre el
cerebro de los mamíferos, la demos-
tración de que la estructura de las vías
olfatorias se ajustaba a la teoría de
la neurona y, sobre todo, una serie
de observaciones acerca del desarro-
llo embrionario de las células y las
fibras nerviosas de la médula espi-
nal y el cerebelo.
Polarización dinámica
D urante 1891 y los primeros meses
de 1892, Cajal continuó reali-
zando trabajos de carácter analítico,
principalmente sobre la retina, el
cerebro y los ganglios simpáticos.
Formuló también entonces la ley de
la polarización dinámica de las neu-
ronas —una de sus aportaciones teó-
ricas más perdurables— y ofreció una
síntesis de su concepción de la estruc-
tura del sistema nervioso que alcanzó
difusión internacional.
El problema de la dirección del
impulso nervioso dentro de la neurona
lo había examinado ya con anterio-
ridad, pero no llegó a una formula-
ción doctrinal madura hasta 1891,
cuando dispuso de sólidas series de
datos en que basarla y bajo el es-
tímulo de un comentario de Van Ge-
huchten a sus opiniones sobre la mate-
ria. La expuso por vez primera en
una comunicación que presentó al
Primer Congreso Médico-Farmacéu-
tico Regional celebrado en Valencia
en julio de dicho año y que se publicó
después en sus Actas. La tituló “Co-
municación acerca de la significación
fisiológica de las expansiones proto-
plasmáticas y nerviosas de las célu-
las de la sustancia gris” y es actual-
mente considerado un texto clásico
crucial de las neurociencias contem-
poráneas. El propio Cajal también le
concedió gran relieve dentro de su
trayectoria científica y resumió la
teoría de la polarización dinámica
que se defiende en ella de la siguien-
te forma: “La transmisión del movi-
miento nervioso tiene lugar desde las
ramas protoplásmicas hasta el cuer-
po celular, y desde éste a la expan-
sión nerviosa. El soma y las dendri-
tas representan, pues, un aparato de
recepción, mientras que el axón cons-
tituye el órgano de emisión y re-
partición”.
La síntesis a la que nos hemos refe-
rido la ofreció Cajal en una serie de
conferencias que pronunció en marzo
de 1892 en la Academia de Ciencias
Médicas, de Barcelona, bajo el título
general de “Nuevo concepto de la his-
tología de los centros nerviosos”. Su
texto apareció originalmente en varios
números de la Revista de Ciencias
Médicas de Barcelona y luego fue reu-
nido en un folleto. Casi inmediata-
mente se publicó una traducción ale-
mana por iniciativa de His y con un
prefacio suyo. Poco después lo hizo
una traducción francesa, precedida
de un prólogo de Mathias Duval, que
tuvo tal éxito que se agotaron en un
trimestre dos copiosas ediciones. El
traductor fue en este caso Léon Azou-
lay, el mismo que se encargaría dos
décadas después de la versión de la
Textura del sistema nervioso, la prin-
cipal obra de Cajal. La acogida que
tuvo esta primera síntesis fue preci-
samente uno de los factores que más
pesaron en su decisión de escribir el
gran tratado.
En 1892, el mismo año de su tras-
lado a Madrid, apareció la versión
francesa del principal estudio mono-
gráfico que Cajal dedicó a la retina.
Fue publicado por la revista belga La
Cellule con el título de La rétine des
TEMAS 29
vertébrés e incluía, ampliados e ilus-
trados con nuevas figuras, todos los
hallazgos sobre el tema que había ido
dando a conocer hasta entonces en
artículos en castellano. Durante sus
cinco primeros años de estancia en
la capital continuó investigando con
el método de Golgi la estructura de
otras zonas del sistema nervioso. El
resultado general fue comprobar, en
todas ellas, la teoría de la neurona
—es decir, el contacto entre somas y
arborizaciones nerviosas—, así como
la ley de la polarización dinámica.
En 1896, un año en el que se dedicó
de manera particularmente intensa
al trabajo de laboratorio, comenzó a
utilizar el método de Ehrlich, técnica
que permite teñir en vivo, o casi en
vivo, las fibras y células nerviosas.
Con las imágenes clarísimas de color
azul intenso que obtuvo aplicándolo,
consiguió contrarrestar la descon-
fianza de algunos histólogos escép-
ticos que habían insinuado la posi-
bilidad de que algunas tinciones con
el cromato de plata fuesen “arte-
factos”.
Trabajos teóricos
R edactó también entonces algunos
trabajos de carácter teórico, el
más importante de los cuales fue la
comunicación Consideraciones gene-
rales sobre la morfología de la célula
nerviosa, que envió al Congreso Inter-
nacional de Medicina celebrado en
Roma en 1894. Su tesis central es que
la ontogenia (o desarrollo embriona-
rio) del sistema nervioso reproduce
de modo abreviado, con algunas sim-
plificaciones y saltos, su filogenia (o
desarrollo evolutivo de las especies).
Se trata, por lo tanto, de una aplica-
ción directa de la ley biogenética fun-
damental, núcleo de la morfología
darwinista.
Cajal afirmó que, a lo largo del de-
sarrollo filogénico de los vertebra-
dos, se advierte siempre la presencia
simultánea de un sistema nervioso
sensorial y otro cerebro-cortical, per-
feccionándose este último no sólo por
extensión sino por diferenciación
estructural y morfológica de sus ele-
mentos. De acuerdo con este modelo
de progreso morfológico, “la excelen-
cia intelectual (...) no depende de la
talla o caudal de las neuronas cere-
brales, sino de la copiosidad de sus
apéndices de conexión, o en otros tér-
minos, de la complejidad de las vías
de asociación a cortas y a largas dis-
tancias”. Tres años más tarde reela-
boró este modelo evolucionista en un
artículo titulado “Leyes de la morfo-
logía y dinamismo de las células ner-
viosas”, en el que expuso, además, una
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
nueva formulación de la ley de la pola-
rización dinámica de las neuronas.
El propio Cajal consideró en su
madurez que, en estos trabajos teó-
ricos, “la elaboración especulativa
sigue muy de cerca al hecho de obser-
vación” y que los modelos que defien-
den corresponden a “legítimas induc-
ciones o hipótesis plausibles”. En
cambio, se arrepintió de otro artículo
suyo de 1895 sobre “el mecanismo
histológico de la asociación, ideación
y atención”, al que llamó “aventura-
dísima lucubración en la que cam-
pea, muy a su sabor y talante, la loca
de la casa”.
La obra de Cajal, que había ya
alcanzado amplia difusión y presti-
gio en los ambientes científicos del
continente europeo, recibió en 1894
el reconocimiento formal de la comu-
nidad científica británica. A comien-
zos de dicho año fue invitado a pro-
nunciar la “Croonian Lecture” por la
Royal Society. En Londres se hos-
pedó en la casa de Charles Scott
Sherrington, que estaba entonces ini-
ciando la labor de investigación que
lo convertiría en la máxima figura de
la neurofisiología del siglo XX . Sus
aportaciones fisiológicas se basaron
de modo sistemático en la obra de
Cajal acerca de la estructura del sis-
tema nervioso, hasta el punto de que
varios términos hoy generalmente
utilizados para designar algunas de
las concepciones básicas del histó-
logo aragonés fueron neologismos
acuñados por él. El más importante,
el de sinapsis, lo propuso inicialmente
en 1897, al resumir las ideas de Cajal
acerca de la conexión por contacto y
no por continuidad entre las células
nerviosas.
En su madurez, Sherrington reco-
noció en los siguientes términos el
apoyo de la neurofisiología en la obra
de Cajal: “¿Sería mucho decir que fue
el anatómico del sistema nervioso
más grande que se ha conocido? Du-
rante mucho tiempo esa materia fue
el tema favorito de los mejores inves-
tigadores; antes de Cajal se hicieron
descubrimientos, pero éstos a menudo
dejaban al médico más confuso que
antes, aumentando el desconcierto.
Cajal, en cambio, hizo posible, incluso
para un bisoño, reconocer con una
ojeada la dirección que toma la
corriente nerviosa en la célula viva
y en la cadena compleja de células
nerviosas. Resolvió de una vez el gran
problema de la dirección de las
corrientes nerviosas en su recorri-
do a través del cerebro y la médula
espinal...”.
En su “Croonian Lecture”, Cajal
resumió sus hallazgos e ideas en fran-
cés, con el título de La fine structure
des centres nerveux. Como solía
hacerse con los invitados a esta con-
ferencia, fue nombrado doctor hono-
ris causa por la Universidad de
Cambridge. La ceremonia de inves-
tidura se hizo de acuerdo con la devo-
ción inglesa por lo tradicional. El elo-
gio del nuevo doctor pronunciado en
latín por el orator terminó con un
juego de palabras en honor de las tin-
ciones argénticas de Cajal: el poeta
hispanorromano Marcial, nacido tam-
bién en Aragón, ya había “aprendido
por experiencia que en la vida no
puede hacerse casi nada sin plata”
(“expertus didicit fere nihil in vita
sine argento posse perfici”).
La “Textura del sistema
nervioso del hombre
y de los vertebrados”
E n 1897, Cajal inició la publica-
ción, por una parte, de la Revista
Trimestral Micrográfica y, por otra,
del gran tratado Textura del sistema
nervioso del hombre y de los verte-
brados. La primera se convirtió desde
entonces en el principal medio que fue
dando a conocer su labor de investi-
gación personal y la de su escuela.
Apareció hasta 1901, fecha en la que
fue continuada por Trabajos de La-
boratorio de Investigaciones Bioló-
gicas de la Universidad de Madrid,
que se editó con presupuesto oficial
a partir de la fundación del centro de
este nombre. La Textura del sistema
nervioso fue su libro más importante,
“mi obra magna”.
El proyecto de redactar este libro,
tal como adelantamos, fue en buena
parte consecuencia de la extraordi-
naria acogida que tuvieron las edi-
ciones castellana, alemana y fran-
cesa de su síntesis de 1892. Concibió
entonces el proyecto de “escribir un
libro extenso donde se estudiara sis-
temática y minuciosamente la tex-
tura del sistema nervioso de todos
los vertebrados y se diera cuenta, con
los necesarios desarrollos, de la to-
talidad de mi obra científica”. La Tex-
tura del sistema nervioso del hombre
y los vertebrados —principal aporta-
ción de nuestro idioma a los grandes
textos clásicos de la ciencia contem-
poránea— fue publicado en Madrid,
entre 1897 y 1904, por la Imprenta y
Librería de Nicolás Moya, una de las
empresas editoras de libros médicos
más importantes de la España de la
época. Consta de dos volúmenes, el
primero de casi seiscientas páginas
y el segundo de más de mil doscien-
tas. Como muchos otros textos cien-
tíficos de este período, entre ellos el
77
4. ENTRE LOS NUMEROSOS trabajos que Cajal y sus discípulos rea-
lizaron con el método del nitrato de plata reducido —que permite ver
la estructura interna de las células nerviosas— figura el dedicado a
los ganglios terminales del nervio acústico de las aves (1908), al que
corresponde este grabado. Dibujado, como de costumbre, por el pro-
pio Cajal, es una de las más bellas cromolitografías que aparecieron
en su revista: 1, corte frontal de la región acústica bulbar de un em-
brión de pollo de seis días. 2, Corte frontal de ganglios cocleares de
un gorrión de quince días. 3, Corte frontal de ganglios acústicos de un
gorrión de quince días. 4, Neuronas del núcleo de grandes células.
5, Células estrelladas procedentes de la región cefálica de dicho nú-
cleo. 6, Detalles de plexos terminales en el foco laminar.

Manual de Histología del propio Cajal,
fue apareciendo por fascículos desde
1897 a 1904. Cinco años después de
esta última fecha comenzó a publi-
carse en París la traducción francesa
de la gran obra de Cajal, con el título
de Histologie du système nerveux de
l’homme et des vertébrés (1909-1911).
Se trataba de un texto “revisado y
puesto al día por el autor”, que tra-
dujo Léon Azoulay, quien ya había
vertido al francés otras obras del neu-
rohistólogo aragonés, como sabemos.
La principal novedad técnica en el
lapso de tiempo transcurrido entre
ambas ediciones fueron los llamados
métodos de tinción neurofibrilares. De
su aplicación proceden fundamen-
talmente los cambios, casi siempre
adiciones, que introdujo Cajal en la
edición francesa.
En esta colosal síntesis de neu-
rohistología comparada, Cajal conti-
nuó fiel a los supuestos básicos de la
morfología evolucionista, desarro-
llando las formulaciones a las que
hemos aludido al comentar sus tra-
bajos teóricos anteriores. Como en
el caso de John Hughlings Jackson
—creador de otro de los paradigmas
de las neurociencias del siglo pa-
sado— la fuente intelectual básica
del evolucionismo de Cajal es la obra
de Herbert Spencer. Entre las edi-
ciones de sus libros que cita figuran,
por supuesto, las traducciones cas-
tellanas de Miguel de Unamuno.
La estructura interna
de la célula nerviosa.
La degeneración
de los nervios
C uando terminó la publicación de
su gran obra La textura del sis-
tema nervioso, en 1904, Cajal había
alcanzado brillantemente la meta que
se había propuesto con el examen sis-
temático de todos los territorios ner-
viosos con el método de Golgi: demos-
trar la individualidad de las neuronas,
aclarar su comportamiento genético
y ofrecer un modelo estructural del
funcionamiento del sistema. Sin em-
bargo, se le había planteado poco
antes la necesidad de conocer la
estructura interna de la célula ner-
viosa, problema para el que le resul-
taba necesaria una nueva técnica.
Dicha necesidad pasó a primer
plano porque se hicieron críticas fron-
tales a la teoría de la neurona, refor-
mulando la teoría reticular sobre la
base de que las neurofibrillas que
existían en el seno de las células ner-
viosas formaban una red continua
interneuronal que sería responsable

78 TEMAS 29
de la propagación del impulso ner-
vioso. Aunque desde hacía tiempo se
venía hablando de forma imprecisa
de tal urdimbre neurofibrilar, la cues-
tión no se planteó en estos términos
hasta los primeros años del siglo pa-
sado, tras los trabajos en invertebra-
dos del húngaro István Apáthy y, so-
bre todo, a partir de las indagaciones
sobre las neurofibrillas del sistema
nervioso de los vertebrados realiza-
das por el profesor de Estrasburgo
Albrecht Bethe, quien se convirtió en
la cabeza del nuevo reticularismo,
con el apoyo algo posterior de Hans
Held, traductor de la primera sínte-
sis de Cajal. Muchos neurohistólogos
pusieron en duda la teoría de la neu-
rona y algunos la abandonaron abier-
tamente, situación a la que aludió
Golgi en su conferencia Nobel.
Convencido de que la solución del
problema residía en “contemplar las
susodichas neurofibrillas en prepa-
raciones irreprochables”, cosa que en
modo alguno habían conseguido Bethe
y sus seguidores, Cajal trabajó inten-
samente en busca de la técnica de
tinción apropiada. Tras numerosos
ensayos infructuosos la encontró, por
fin, en octubre de 1903, partiendo del
“proceder fotográfico” original de Luis
Simarro, que había conseguido con él
impregnar las neurofibrillas median-
te las sales fotográficas de plata. Ideó
de esta forma el célebre método del
nitrato de plata reducido, consistente
básicamente en la inmersión directa
de los tejidos nerviosos en nitrato de
plata, mantenimiento de los mismos
en estufa durante cuatro días, y reduc-
ción en bloque y en la oscuridad de
la sal argéntica mediante un baño de
ácido pirogálico.
El método del nitrato de plata redu-
cido fue utilizado sistemáticamente
durante una década por Cajal y sus
discípulos, dando como primer re-
sultado el conocimiento de la dis-
posición de las neurofibrillas en el
protoplasma nervioso y en las arbo-
rizaciones pericelulares. En el trie-
nio 1905-1907, Cajal lo aplicó asi-
mismo al estudio de la regeneración
y la degeneración de los nervios y de
las vías nerviosas centrales, tema
que había sido una de las principa-
les fuentes de los argumentos de los
autores opuestos a la teoría neuro-
nal. Defendían éstos que la rege-
neración del segmento distal de un
nervio seccionado se debe a la trans-
formación de las células de revesti-
miento del mismo que habían per-
sistido tras la degeneración de sus
fibras. Frente a esta hipótesis, Cajal
demostró que las fibras nuevas que
aparecen en dicho segmento distal
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
son brotes axónicos procedentes del
cabo central, cuyas fibras mantienen
su vitalidad porque siguen unidas al
soma neuronal. Sus investigaciones
sobre esta cuestión fueron más tarde
recogidas en dos volúmenes titula-
dos Estudios sobre la degeneración y
regeneración del sistema nervioso
(1913-1914).
A partir de 1907, Cajal aplicó su
técnica de tinción a investigaciones
comparadas de la textura del cerebelo
y del bulbo raquídeo, al estudio de la
génesis de los nervios motores y sen-
soriales y las expansiones neurona-
les en el embrión, así como al aná-
lisis de la estructura del núcleo
neuronal. Como consecuencia de tan
amplia labor, el neuronismo logró
superar por completo las críticas que
le habían planteado los nuevos defen-
sores del reticularismo.
Ultimas aportaciones.
Los centros nerviosos
de los insectos.
Testamento científico
C uando ya había cumplido los se-
senta años, en 1912 y 1913, Cajal
ideó todavía dos nuevos métodos de
tinción: la técnica del formol-urano y
la del oro-sublimado. Con la primera
consiguió precisar numerosos deta-
lles acerca de la disposición, fases evo-
lutivas y conexiones del aparato de
Golgi, retículo endoneuronal que el
histólogo italiano había observado
por vez primera a finales del siglo XIX.
Con la segunda resolvió el problema
de la impregnación de un tipo de neu-
roglía, es decir, del tejido que forma
la sustancia de sostén de los centros
nerviosos, que era especialmente difí-
cil de teñir con los métodos anterio-
res: la llamada neuroglía protoplás-
mica o de radiaciones cortas. Esta
innovación resultaría decisiva para
las investigaciones que sobre la glio-
arquitectónica desarrollaron después
Nicolás Achúcarro y Pío del Río Hor-
tega, otras dos grandes figuras de la
neurohistología española.
Entre sus trabajos posteriores des-
tacan las investigaciones que realizó
a partir de 1915 en torno al ojo y la
retina de los insectos, que realizó en
gran parte en colaboración con Do-
mingo Sánchez. Su resultado, junto
a la crisis experimentada por el dar-
winismo durante el período de en-
treguerras, le condujo a un cierto
distanciamiento de la explicación dar-
winista de las formas anatómicas a
lo largo de la serie filogénica: “No
debo ocultar —afirmó en sus Recuer-
dos— que en el estudio de la retina
sentí por vez primera flaquear mi fe
darwinista (hipótesis de la selección
natural), abrumado y confundido por
el soberano ingenio constructor que
campea, no sólo en la retina y en el
aparato dióptrico de los vertebrados,
sino hasta en el ojo más ruin de los
insectos”.
La principal ilusión científica de
Cajal, durante la fase final de su vida
fue la publicación de una tercera edi-
ción, ampliada y actualizada, de su
gran libro Textura del sistema ner-
vioso. Llegó incluso a redactar las
condiciones de publicación de la
misma, para la que fue reuniendo
abundantes materiales y notas que
desaparecieron por razones no bien
aclaradas, pérdida que aceleró su
muerte. Llegó, sin embargo, a redac-
tar un amplio trabajo de conjunto
sobre la teoría de la neurona, de ca-
si cien páginas, con destino al pri-
mer volumen del Handbuch der
Neurologie dirigido por O. Bumke y
O. Foerster. La publicación de este
texto, verdadero testamento cientí-
fico de Cajal, se retrasó más de lo pre-
visto, con gran contrariedad de su
autor. Por ello publicó en 1933 una
nueva redacción en castellano en la
revista Archivos de Neurobiología,
con el título de “¿Neuronismo o reti-
cularismo? Las pruebas objetivas de
la unidad anatómica de las células
nerviosas”, apareciendo además una
versión francesa de la misma al año
siguiente en el anuario del Labora-
torio de Investigaciones Biológicas.
El texto original traducido al alemán,
Die Neuronenlehre, lo hizo de forma
póstuma en 1935, tal como temía
Cajal. En la conclusión de esta sín-
tesis, que coronaba una labor de medio
siglo, subrayó que el principal resul-
tado general de la misma era supe-
rar el último y más difícil reducto que
se oponía al modelo celularista de
organismo, a su concepción como “aso-
ciación de células relativamente autó-
nomas”: “No temamos, pues, que al
embate de los reticularistas, la vieja
y genial concepción de Virchow sufra
quebrantos”.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
CAJAL Y SU LABOR HISTOLÓGICA. Jorge
Francisco Tello. Universidad Central,
1935.
SANTIAGO RAMÓN Y CAJAL O LA PASIÓN POR
E SPAÑA . Agustín Albarracín Teulón.
Labor, 1978.
CAJAL. ANTOLOGÍA. Edición y estudio in-
troductorio por José M. López Piñero. Pe-
nínsula, 1986.
RAMÓN Y CAJAL. José M. López Piñero.
2a edición. Salvat, 1988.
79
Las primeras
observaciones
La repetición de los experimentos que realizaron
los primeros microscopistas muestra lo que ellos
percibieron con sus rudimentarios instrumentos
constituidos por una sola lente

Brian J. Ford

E
n 1674 Antony van Leeuwen-
hoek descubría, mientras mi-
raba a través del microscopio
que había construido, un mundo nuevo,
fascinante. Nuestro holandés aficio-
nado a la ciencia se sorprendió cuando,
observando la baba que había reco-
gido de la superficie de un lago, halló
organismos desconocidos: “Quedé ma-
ravillado ante el número de animálcu-
los que se movían raudos por el agua,
de aquí para allá, arriba y abajo”.
Con Leeuwenhoek, que vivió de
1632 a 1723, se inauguró la micro-
biología. Antes de que floreciera la
ciencia de la óptica, Leeuwenhoek
talló con sus manos más de 500 mi-
croscopios. Con ellos, registró, ade-
más de los “animálculos” o microorga-
nismos, muchas estructuras celulares,
eritrocitos y espermatozoides. Descri-
bió bacterias, protozoos, rotíferos,
células vegetales y hongos.
Pese a todo, muchos contemporá-
neos le despreciaron y tildaron de dile-
tante y fantasioso. Su perspicacia no
prendió. Hasta mediados del siglo XIX
—la época de Louis Pasteur— no se
aceptó la idea de microorganismo.
Incluso hoy no faltan quienes niegan
que Leeuwenhoek viera lo que afir-
maba haber visto con su rudimentario
instrumento de una sola lente. La
investigación moderna se ha servido
de un microscopio de Leeuwenhoek
para aducir que con los aumentos de
sus aparatos no podía lograr la finura
de detalle a la que arriba en sus notas.
Por ejemplo, de los eritrocitos sólo
podía ver manchas borrosas.
Los detractores de Leeuwenhoek
han esgrimido recriminaciones simi-
lares contra Robert Brown. En 1827,
el joven cirujano escocés dio testi-
monio de un fenómeno que hoy lleva
su nombre: el movimiento browniano.
Observó en el seno celular el movi-
miento incesante de partículas mi-
núsculas. Unos años después, Brown
dio con otro fenómeno inédito mi-
rando por su microscopio monocular.
En su viaje a Australia en busca de
plantas exóticas se prendó de las
orquídeas que herborizaba. Después
de examinar una y otra vez diferen-
tes células vegetales, llegó a la con-
clusión de la existencia de una estruc-
tura que se repetía en todas ellas: “En
cada célula de la epidermis... apa-
rece una areola circular, más opaca

1. CELULAS LUMINOSAS de Tra-

descantia virginiana, traídas a pri-
mer plano con un microscopio de
Robert Brown, cuando las baña la
luz solar (página siguiente, arriba).
Con el microscopio de Antony van
Leeuwenhoek, que se conserva en
la Universidad de Utrecht, se distin-
gue de forma nítida los hematíes (iz-
quierda); incluso el núcleo lobulado
de un leucocito podría identificarse
con ese aparato elemental. Un mi-
croscopio monocular moderno
ofrece también imágenes impresio-
nantes: células de levadura (centro)
y esporas fúngicas (derecha).
170× 466×

80 TEMAS 29
BRIAN J. FORD
110×
que la membrana”. Brown no tardó
en establecer que se trataba de un
rasgo común de las células de muchos
organismos. Con el tiempo, le impuso
el nombre que todavía perdura: “el
núcleo celular”.
Igual que ocurrió con Leeuwenhoek,
los trabajos de Brown no recibieron
el aprecio debido. En manuales con-
temporáneos se lee que Brown observó
sólo el movimiento de granos de polen,
pero no el movimiento mucho más
sutil del interior celular. En una
reciente revisión de la capacidad del
microscopio de Brown se concluía que
ese instrumento pudo haber sido útil
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
para la disección, pero en ningún caso
para resolver estructuras de la par-
vedad del núcleo.
He empleado los microscopios ori-
ginales de ambos genios y he cons-
truido mis propios monoculares. Con
ellos, he recreado los experimentos
pioneros de Leeuwenhoek y Brown.
No es tarea fácil, si tenemos en cuenta
que carecemos de cualquier informe
detallado sobre los métodos que si-
guieron; además, debe realizarse con
sumo cuidado el ajuste de los micros-
copios y acomodarse fielmente a su
proceder. Pues bien, frente a lo que
muchos objetaban, con un microsco-
500×
pio simple se observan bacterias,
núcleos celulares y movimiento brow-
niano. Con el microscopio de Brown,
reconocí mitocondrias, que son cien-
tos de veces más pequeñas que el
núcleo celular. Leeuwenhoek y Brown
no engañaron en sus notas.
Las imágenes que presentamos no
se han manipulado. Revelan la exci-
tación y maravilla que provocaron
las primeras observaciones. Y ponen
de manifiesto cómo el más humilde
de nuestros útiles, aquí microscopios
simples del XVII y el XIX, puede cam-
biar nuestra concepción de la reali-
dad para siempre.
81
2. LAS ESPORAS ESPINOSAS de una trufa (Tuber me-
lanosporum) sirven para someter a prueba la calidad
de resolución del microscopio de Leeuwenhoek. Las
minúsculas esporas son del tamaño de una célula,
las espinas del tamaño de bacterias. Pese a su sim-
plicidad, el viejo microscopio de 300 años puede cap-
tar ambas estructuras con nitidez.
3. LA BELLEZA DE LA CABEZA DE UN PIOJO puede observarse a
través de una lente pulida por Horace Dull de Luton, en el marco
de una investigación sobre claridad y poder de resolución de un
microscopio del siglo XVII. La antena y los ojos oscuros pardos del
insecto, enojosamente familiares para los biólogos de entonces,
aparecen con nitidez. Estas lentes mantienen al mínimo la aberra-
ción cromática.

600× 460×

4. LOS PRIMEROS MICROSCOPIOS SIMPLES del último tercio

del XVII eran como el fabricado por Leeuwenhoek (abajo), he-
cho a mano y de latón. Dos tornillos de rosca fijaban y enfo-
caban la muestra. La lente solitaria de aumento, algo mayor
que la cabeza de un alfiler, bastaba para distinguir incluso bac-
terias. El diseño alcanzó su perfección 150 años después (de-
recha) en los talleres de la firma londinense Dollond, suminis-
tradora de instrumentos de laboratorio. Robert Brown poseyó
uno de estos hermosos aparatos. Hay un control de foco fino
en la parte superior del cuerpo de la columna; dos tornillos ope-
ran una platina mecánica. Entre los accesorios está la lente,
de 800x. Ambos prototipos miden unos 7,6 centímetros. PLATINA
BANDEJA LENTE CIRCULAR
DE LENTES
PORTAOBJETO
MECANICO
MANDO
DE FOCO
FINO
MANDO DEL
TORNILLO PORTAOBJETO
PARA MOVER MECANICO
EL PORTA-
MANDO OBJETO
DE ENFOQUE

SOPORTE ESPEJO
DE LA MUESTRA CONCAVO

LENTE
TORNILLO
PARA SITUAR
LA MUESTRA

82 TEMAS 29
5. PAREDES CELULARES de la raíz del helecho Os- 6. HASTA BACTERIAS VIVAS podían captarse
munda regalis, según se aprecian con un micros- con el microscopio simple de Leeuwenhoek. Es-
copio monocular de comienzos del siglo XVIII. La cla- ta imagen del Spirillum, una de las especies des-
ridad de la imagen ofrecida no tiene nada que critas por nuestro holandés, pone de manifiesto
envidiar a la alcanzada por la mayoría de los mi- su destreza investigadora; las bacterias no se
croscopios ópticos modernos. ven si no sabemos colocar bien la fuente lumi-
nosa y el foco.

220× 1200×

7. LA LABOR MICROSCOPICA realizada por Brown se llevó a

cabo con potentes aparatos, de pequeña talla, fabricados por
la firma londinense Bancks and Son. Este magnífico ejem-
plar, de unos 15 centímetros, forma parte de la colección de
los Reales Jardines de Kew. Está diseñado con un doble con-
trol focal (de ajuste aproximado y de ajuste fino), montados
en la columna y con un espejo de doble superficie. Con su
lente se consiguen de 30 a más de 150 aumentos.

CONTROL LENTE
DE LA POSICION
DE LA LENTE PLATINA
MOVIL
REGLAJE
APROXIMADO
ESPEJO
DE DOBLE
REGLAJE CARA
FINO
RICHARD JONES

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 83

 Representación
visual de embriones
humanos
La microscopía de resonancia magnética
nos revela los secretos escondidos en los primeros
estadios del desarrollo embrionario

Bradley R. Smith

U
n nuevo horizonte biológico se me abre cada mañana a mi llegada al
laboratorio de microscopía in vivo, del hospital clínico de la Universidad
de Duke. Me aguarda la contemplación de imágenes tridimensio-
nales, precisas y esclarecedoras, del interior de embriones humanos con-
servados in vitro, obtenidas mediante microscopía de resonancia magnética
(MRM). Este tipo de embriones “virtuales” me permite emprender viajes
simulados por ordenador por cualquiera de los sistemas recién pergeñados
del cuerpo. Con estas imágenes puedo generar secuencias animadas del
desarrollo embrionario, impensables hasta hoy.
Aumenta la demanda de información de ese tipo por los biólogos que se
afanan en comprender las etapas del desarrollo normal y patológico, así como
los factores que indican cada proceso a seguir. Nuestro conocimiento se debe
en buena medida al estudio de cortes bidimensionales de embriones de ani-
males normales y de embriones de animales sometidos a manipulación gené-
tica. No obstante, la mejora del diagnóstico y del tratamiento de las mal-
formaciones y enfermedades congénitas del hombre requiere que se establezca
Microfotografía con luz visible

Feto temprano (64 días)

1. FETO HUMANO de 64 días. Se ha obtenido su representación visual mediante microsco-

pía de resonancia magnética (MRM) y microscopía óptica (recuadro superior). En esta eta-
pa, el embrión tiene una longitud aproximada de 30 milímetros. Las técnicas de representa-
ción por ordenador pueden convertir en translúcidas unas partes del embrión y dejar opacas
otras. Al ajustar así la opacidad del espécimen, podemos observar estructuras internas a di-
ferentes profundidades y en su entorno natural sin dañar la muestra (a-c). Podemos enfocar,
girar o alejar la imagen del embrión (d-f ), o usar el método de representación por segmen-
tación para enfocar órganos específicos, como la formación de los pulmones (g-k).

a b c d e

84 TEMAS 29
 BRADLEY R. SMITH

f g h i j k

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 85

 BRADLEY R. SMITH
Etapa Carnegie 18 (44 días)

2. TUBO NEURAL de un embrión de 47 días

(en su saco amniótico, en la micrografía
óptica de la parte inferior izquierda), so-
metido a examen mediante la técnica de
MRM. Al manipular las imágenes digitales
podemos crear secuencias de ordenador
(evolución interna o “inmersiones”) del tu-
bo neural, precursor del cerebro y la mé-
dula espinal. En esta evolución interna se
hace girar al embrión (a-c); el observador
parece entrar en el tubo neural (d) para
emprender un viaje virtual por las vesícu-
las craneales, que se convertirán en ven-
trículos del cerebro. El recorrido continúa
por el romboencéfalo, por el techo del
cuarto ventrículo y, de ahí, por el mesen-
céfalo (e-h), antes de salir del ventrículo
(i, j) y mostrar los hemisferios cerebrales.

Etapa Carnegie 19 (47 días)

3. CORTES DE UNA IMAGEN TRIDIMENSIONAL para mostrar en fino detalle el interior de un

embrión de 44 días, correspondiente a la etapa Carnegie 18 (en la parte superior se puede ver
una imagen obtenida con microscopía óptica). El embrión, del tamaño de una alubia, aún tie-
ne unidos los dedos de manos y pies. Pero presenta cerebro con dos hemisferios, precurso-
res de vértebras (estructuras con forma de guión a la derecha) y órganos internos. La MRM
permite cortar una misma muestra por varios planos diferentes, lo que proporciona una in-
formación interna muy valiosa sin tener que destruir el espécimen. BRADLEY R. SMITH

a b c

86 TEMAS 29
 una relación entre la información
obtenida de estos modelos animales
y las etapas correspondientes del
desarrollo embrionario humano.
Así las cosas, el Instituto Nacional
de Salud Infantil y Desarrollo Hu-
mano (NICHD) me ofreció en 1996 un
contrato para crear una base de datos
de embriones virtuales a partir de la
Colección Carnegie de Embriones
Humanos. La Colección Carnegie, de
enorme valor e instalada en el Museo
Nacional de Salud y Medicina del
Instituto de Patología de las Fuerzas
Armadas (Washington, D.C.), guarda
embriones humanos de cada etapa
del desarrollo, de un día a embriones
de ocho semanas y fetos tempranos
(un embrión se transforma en feto a
las ocho semanas de la concepción).
La muestra más pequeña mide unos
0,2 milímetros; la mayor tiene una
longitud de unos 30 milímetros, el
tamaño de una almendra. El grueso
de la Colección Carnegie está for-
mado por productos de aborto (espon-
táneo o provocado) recogidos entre
1887 y 1917 por Franklin Paine Mall.
La colección ha venido creciendo con
la inclusión de embriones descubier-
tos en autopsias de mujeres encinta.
La colección divide el desarrollo
embrionario en 23 etapas, definidas
por hitos específicos, verbigracia, el
momento en que aparece el botón de
una extremidad. La NICHD me
encargó la creación de imágenes MRM
de embriones desde la etapa Carne-
gie 10 (22 días después de la concep-
ción) —cuando aparece el primer arco
faríngeo, que después pasa a formar
parte de la mandíbula— hasta la pri-
mera semana del desarrollo fetal.
(Dale S. Huff, del Hospital Infantil
de Filadelfia, revisó la colección para
escoger los mejores especímenes a
representar.) Biólogos y médicos inte-
d e
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
resados en el desarrollo embrionario
pueden recurrir al trabajo realizado, j
así como el público curioso, a través
de las páginas de Internet, donde
encontrarán las imágenes de la etapa
Carnegie 13 a la 23.
Para crear esas imágenes sin pre-
cedentes, coloco cuidadosamente el
embrión en el interior de un tubo,
que después introduzco en un imán
superconductor. La técnica MRM es
semejante a la de formación de imá-
genes por resonancia magnética
(IRM), prueba rutinaria en los hos-
pitales. Ambas técnicas aprovechan
la energía en la banda de radiofre-
cuencia para excitar y detectar pro-
tones en el agua del interior de los
tejidos. Sin embargo, la MRM revela
detalles cuya finura trasciende la idó- i
nea para el diagnóstico clínico.
Aunque la IRM puede producir imá-
genes con una resolución de vóxel
(elemento de volumen) de un milili-
tro cúbico, la MRM registra vóxeles
que son un millón de veces menores.
Resoluciones que sólo se consiguen
mediante imanes potentes, gradien-
tes de perturbación del campo mag-
nético intensos y bobinas de forma-
ción de imágenes capaces de acomodar
muestras diminutas.
Las técnicas de MRM, desarrolla-
das en la Universidad de Duke por
el grupo de G. Allan Johnson, no h
dañan a los embriones. Con la micros-
copía tradicional, por contra, hay que
seccionar las muestras en centena-
res de cortes finísimos. La MRM ge-
nera embriones tridimensionales
virtuales, sin deformaciones, en una
fracción del tiempo que haría falta
para crear reconstrucciones a partir
de la microscopía óptica. Podemos
producir datos tridimensionales de
un embrión en menos de dos horas,
en comparación con los cientos de
f g
87
 BRADLEY R. SMITH

4. MERCED A TECNICAS DE PSEUDOCOLORACION asignamos colores a las imá-

Etapa Carnegie 19 (47 días)
genes de MRM para resaltar las estructuras; por ejemplo, los órganos en de-
sarrollo de este embrión de 47 días. En las imágenes coloreadas de esta pági-
na, la retina en desarrollo brilla con un naranja amarillento. Los óvalos ámbar
marcan los ganglios espinales, de donde emergen los nervios espinales; el hí-
gado luce en el abdomen en color verde intenso, y el oído en desarrollo apare-
ce en un resaltado color verde por encima de los hombros. Las imágenes reve-
lan también la formación de las costillas cartilaginosas debajo del brazo y una
pequeña reducción de la membrana interdigital.

88 TEMAS 29
 Etapa Carnegie 17 (41 días)

5. EL EMBRION DE 41 DIAS que se muestra arriba, envuelto en el saco vitelino,

bajo la luz de un microscopio óptico, posee tejidos diferenciados, que se pue-
den contemplar en estas imágenes obtenidas mediante tres técnicas de MRM
diferentes: Peso-T1, Peso-T2 y Peso-difusión. Técnicas que permiten contem-
plar el agua de las muestras de tres maneras distintas, según la interacción en-
tre agua y otras moléculas. (Esta característica es diferente para cada tejido.)
Peso-T1 y Peso-T2 reflejan dos modos de detectar el tiempo de relajación, que
mide cómo se reajustan los protones del agua después de ser perturbados por
la energía de radiofrecuencia que se usa para excitarlos. En la imagen T1, los
grandes vasos sanguíneos, las cámaras del corazón y el hígado aparecen des-
tacados. La imagen T2 refleja tejidos no vasculares, pero sin contraste. La for-
mación de imágenes por difusión aprovecha la difusión selectiva del agua en
muchos tejidos; es una técnica particularmente informativa para el estudio de
estructuras neurales como la corteza cerebral (finas líneas blancas que perfi-
lan la parte superior derecha de la imagen de la derecha).

BRADLEY R. SMITH

T1 T2 Difusión

horas que se requiere con el micros-
copio óptico.
Aunque la MRM obtiene datos tri-
dimensionales minuciosos, se cuenta
con programas informáticos para pre-
sentar los resultados. Para crear imá-
genes como las aquí ofrecidas, nos
apoyamos en un programa de repre-
sentación volumétrica que va super-
poniendo las imágenes MRM de los
cortes —128 en total y cada uno con
256 × 256 píxeles— hasta formar un
cubo de 8,4 millones de vóxeles. En
cada vóxel se representa una porción
de embrión. El programa nos permi-
te rotar la matriz de vóxeles, retirar
capas de ellos e incluso colorear o
ajustar la escala de grises de los vóxe-
les en función de la intensidad de la
señal u otros criterios. Mediante algo-
ritmos de ordenador, provocamos el
paso de rayos de luz virtuales a tra-
vés de cada matriz, procediendo de
atrás adelante. Los rayos, modifica-
dos por los vóxeles que encuentran
en su camino, forman una imagen en
la pantalla del ordenador. Podemos
realizar secciones digitales de las
imágenes en cualquier orientación y
volver transparente la superficie de
la muestra para que nos revele su
estructura interna. Y podemos aislar
un sistema de órganos para su ins-
pección y medida.
El Embrión Humano Multidimen-
sional pone la Colección Carnegie al
alcance de los investigadores de cual-
quier punto del planeta. La disponi-
bilidad de este recurso en Internet
ayuda a los clínicos a descubrir defec-
tos congénitos mediante IRM y ultra-
sonidos. Aporta información gráfica
solvente a los laboratorios de inves-
tigación que carecen de experiencia
en embriología y a las aulas de embrio-
logía básica. Y, con el procesamiento
de estas imágenes, preservaremos
para la posteridad una insólita e
insustituible colección de embriones
humanos.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
ATLAS OF HUMAN EMBRYOS. Raymond F.
Gasser. Harper & Row, 1975.
DEVELOPMENTAL STAGES IN HUMAN EM-
BRYOS: INCLUDING A REVISION OF STREE-
TER’S HORIZONS AND A SURVEY OF THE
CARNEGIE COLLECTION. Roman O’Ra-
hilly y Fabiola Müller. Carnegie Institu-
tion of Washington, Washington, D.C.,
1987.
Las páginas de “Multidimensional Human
Embryo Web” están disponibles en la ubi-
cación embryo.soad.umich.edu.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 89

Aplicaciones biológicas
del microscopio
de fuerzas
Como quien se mueve a ciegas, y se sirve del tacto
para reconocer las formas de los objetos, este instrumento
emplea una punta afilada para sentir y revelar las formas
de moléculas biológicas en soluciones acuosas
Carlos Bustamante y Ricardo García
E
l progreso de la biología ha ido
de la mano del avance de la téc-
nica microscópica. Desde su
aparición, en el siglo XVII, el microsco-
pio ha sido en buena parte responsa-
ble de los grandes descubrimientos
biológicos. Robert Hooke advertía en
1655, sirviéndose de un microscopio
óptico rudimentario, que la corteza
de corcho la formaban en realidad
muchas “células”, es decir, celdas pe-
queñas e independientes. Pero la ver-
dadera observación de los últimos
componentes de los tejidos, de las
células, no llegaría hasta el primer
tercio del siglo XIX , de la mano, tam-
bién, de dos microscopistas: Matthias
Schleiden y Theodore Schwann. En
el último tercio de esa centuria, San-
tiago Ramón y Cajal enunciaba la
teoría de la neurona, apoyándose en
las observaciones con su microscopio
óptico.
En 1876, Heinrich Abbé desarro-
lló la teoría de difracción de imáge-
nes. Demostró que el microscopio
óptico no puede resolver objetos meno-
res que la mitad de la longitud de
onda de la luz utilizada para ilumi-
nar la muestra. Usando luz de color
verde, cuya longitud de onda es apro-
ximadamente de 0,5 micrometros
(μm), el microscopio óptico sólo puede
resolver objetos próximos si entre
ellos media al menos una distancia
de 0,25 μm.
Hasta 1931 no se produce otro sal-
to decisivo en el progreso de la mi-
croscopía. Se trata de la introducción
del microscopio electrónico que ex-
tendería la resolución espacial a la
escala nanométrica (1 nanómetro
equivale a 10–9 m) y posibilitaría la
90
descripción ultraestructural de la
célula.
Ello no supuso el arrumbamiento
del microscopio óptico, que continuó
siendo un instrumento imprescindi-
ble en las investigaciones biológicas
porque, a diferencia del microscopio
electrónico, permite visualizar mues-
tras inmersas en soluciones acuosas.
O lo que es lo mismo, posibilita la
observación de procesos biológicos en
tiempo real.
Durante muchos años, los biólogos
han tratado de combinar la alta reso-
lución del microscopio electrónico con
el funcionamiento en agua del micros-
copio óptico. La invención en 1981
del microscopio de efecto túnel por
Gerd Binnig y Heinrich Rohrer, galar-
donados ambos con el premio Nobel
de física, abrió nuevas rutas para la
visualización de moléculas biológi-
cas en medios acuosos. El microsco-
pio de efecto túnel constituye el pri-
mer ejemplo de una nueva clase de
microscopios de alta resolución, lla-
mados genéricamente microscopios
de campo próximo. Los microsco-
pios de este grupo comparten un prin-
cipio de funcionamiento común: la
imagen se obtiene a partir de la inte-
racción entre una punta (sonda en
lenguaje técnico) y la muestra. La
interacción puede ser, por ejemplo,
una fuerza mecánica, la corriente
eléctrica, la radiación electromag-
nética o el flujo de calor.
El microscopio de fuerzas, conocido
también por microscopio de fuerza
atómica, se ha convertido en una
herramienta poderosa de la investi-
gación biológica. Hace más de quince
años se construyó el primero. Paul
Hansma, que ha trabajado en el de-
sarrollo del microscopio de fuerzas,
cuenta una curiosa anécdota. Cierto
día en que Binnig se distraía obser-
vando el relieve de la pintura de las
paredes de su casa, se preguntó por
qué todos los microscopios basaban
su funcionamiento en la interacción
entre un haz de ondas, o partículas
(fotones, electrones, o sonido), y la
muestra. ¿Podría, se planteó, obte-
nerse la imagen de una superficie
midiendo la fuerza entre los átomos
de la superficie y los de una punta
muy afilada unida a una palanca elás-
tica, que actuara de muelle?
M eses más tarde, Binnig comen-
tó la idea con su colaborador
Christofer Gerber y con Calvin Quate,
profesor de física de la Universidad
de Stanford. Cuando determinaron el
valor de las constantes de fuerza que
mantienen unidos a los átomos en
un cristal, comprobaron, sorprendi-
dos, que podrían construir palancas
elásticas con constantes de fuerza
menores que la existente entre dos
átomos. En efecto, las frecuencias de
vibración de los átomos en superfi-
cies sólidas es de unos 1013 hertz; si
se admite una masa de 10 –25 kilo-
gramos por átomo se obtienen cons-
tantes de fuerza del orden de 10 new-
ton por metro. En cambio la constante
de un trozo de aluminio doméstico de
5 milímetros de largo por 1 milíme-
tro de ancho es sólo de 1 newton por
metro. Es decir, requiere diez veces
menos fuerza deformar el trozo de
aluminio que desplazar los átomos
de la superficie del cristal. Ante tales
resultados, supusieron que, si aña-
TEMAS 29
 C. BUSTAMANTE
FOTODIODO LASER

A B

C D

UNIDAD DE
CONTROL

1. ESQUEMA de un microscopio de fuerzas

(izquierda). Se ilustran los componentes bá-
sicos: transductor de fuerzas (palanca elás-
tica), sistema de detección óptico (diodo lá-
ser y fotodiodo) y cristal piezoeléctrico para
efectuar los desplazamientos en las direc-
ciones espaciales. Arriba se esquematiza
Z una zona de interacción entre átomos de
punta y de la muestra. Este dibujo ilustra una
CRISTAL propiedad del microscopio de fuerzas, su ca-
Y
PIEZOELECTRICO rácter local. Cada dato de información es el
ORDENADOR X resultado de la interacción de grupos locali-
zados de átomos.

Electromicrografía de una punta

usada en el microscopio de fuerzas.
Estas puntas suelen tener radios de
curvatura entre 10-20 nm.

100 nm
20 Kv 17 mm
X. ZHU

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 91

 C. BUSTAMANTE focaliza en la parte posterior de la
a b palanca. La luz reflejada se recoge en
un fotodiodo de cuatro segmentos.
Los cambios en la distribución de luz
en cada uno de los segmentos per-
miten determinar las fuerzas que se
aplican. La muestra se coloca sobre
un cristal piezoeléctrico que posibi-
lita su desplazamiento con respecto
a la punta en las tres dimensiones
espaciales.
2. DOS MODOS DE UTILIZAR EL MICROSCOPIO DE FUERZAS. a) Modo de contacto. La pun-
El microscopio de fuerzas puede
ta se desplaza sobre la muestra manteniendo una deflexión de la palanca constante, es de-
funcionar en dos modos distintos, lla-
cir, una fuerza entre punta y muestra constante. La fuerza que existe entre los átomos de
mados de contacto y oscilante. En el
la punta y la muestra provoca la deflexión de la palanca. b) Modo oscilante. Punta y mues-
primer modo, la muestra y la punta
tra se encuentran separadas por una distancia de varios nanómetros. La frecuencia de os-
se hallan en contacto directo mien-
cilación de la palanca depende de las fuerzas de largo alcance entre punta y muestra, y
tras se mueve una con respecto a la
por tanto, variará con la topografía. El sistema de retroalimentación se encarga de des-
otra. Los accidentes topográficos de
plazar la muestra para mantener constante la frecuencia de resonancia.
la muestra producen deflexiones de la
palanca, que se detectan midiendo
dían una punta de diamante a un de detección óptico y un cristal pie- la reflexión de un rayo láser que incide
extremo del trozo de aluminio, éste zoeléctrico. El transductor de fuerzas sobre la parte posterior de la palanca
podría funcionar como un transduc- consiste en una palanca elástica en y se recoge sobre un fotodiodo con
tor de fuerzas. En contacto con la cuya parte anterior se encuentra una cuatro segmentos. En este modo de
superficie, el transductor se defor- punta piramidal. Palanca y punta se funcionamiento, las regiones eleva-
maría siguiendo la topografía de la fabrican de manera integrada em- das de la muestra producen grandes
misma, transformando en movi- pleando técnicas de microelectrónica. deflexiones de la palanca y experi-
miento la interacción de los átomos Suelen ser de silicio o nitruro de sili- mentan, por tanto, fuerzas más inten-
de la punta con los átomos de la super- cio. Las dimensiones típicas son de sas. Para evitar tales altibajos, existe
ficie de la muestra. Así crearon en 100 μm de longitud, 30 μm de ancho un sistema de retroalimentación que
1986 el primer prototipo de un micros- y 3 μm de espesor. La punta sobre- se encarga de acercar o alejar la mues-
copio de fuerzas, cuya característica sale unos 5 μm de la base de la tra mediante un cristal piezoeléc-
principal reside en su versatilidad, palanca. trico, de suerte que la deflexión de la
pues opera en vacío, en aire o en un El sistema de detección óptico per- palanca (y, por consiguiente, la fuerza
medio líquido. mite medir las deflexiones de la aplicada a la muestra) se mantenga
Un microscopio de fuerzas consta palanca y transformar éstas en valo- constante. Se va obteniendo la ima-
de tres componentes básicos. Un res de fuerza. Consta de un diodo gen de la superficie conforme quedan
transductor de fuerzas, un sistema láser que emite un haz de luz que se registrados los desplazamientos del

7,50
0,600 nm

2 2,50

4
J. TAMAYO Y R. GARCIA

8 nm 0
0 2,50 5 7,50 nm

3. IMAGENES DE RESOLUCION ATOMICA de una superficie de mi-
ca. La mica es un material de estructura laminar y muy estable en
condiciones ambientales. A la izquierda se ofrecen las posiciones
atómicas de la mica obtenidas manteniendo la fuerza entre punta y
muestra constante. En el centro las mismas posiciones, aunque mi-
diendo las fuerzas laterales que los átomos de la superficie de la
muestra ejercen sobre la palanca. Estas fuerzas laterales indican
que los átomos de la punta se enganchan y desenganchan sucesi-
vamente de los átomos de la muestra. Tal observación permite el
estudio de mecanismos de disipación de energía a escala atómica

92 TEMAS 29
 cristal piezoeléctrico para mantener
constante la deflexión de la palanca
en cada posición de la superficie.
En este modo las fuerzas que típi-
camente se detectan entre punta y
muestra varían entre 1 nanonewton
y 100 nanonewton. Estas fuerzas pue-
den producir modificaciones irreversi-
bles en muestras blandas. Esto se evi-
ta empleando los modos oscilantes.
E n el segundo modo, la punta sobre-
vuela la muestra al tiempo que
oscila sobre ella. La frecuencia de
resonancia del sistema formado por
la palanca y la punta no depende sola-
mente de la geometría de la palanca
y del material de que está hecha, sino
también de las fuerzas existentes
entre punta y muestra. Dicho en otros
términos, la frecuencia de resonan-
cia variará con la distancia entre pun-
ta y muestra, y, por tanto, de acuerdo
con el perfil de la superficie. Los cam-
bios operados en la frecuencia de osci-
lación (o equivalentemente en la am-
D. KELLER
10 20
(fricción). La punta y la muestra se mueven solidariamente hasta que la fuerza acumulada
en la palanca supera la fricción de la muestra y la punta se suelta de golpe. La fotografía
de la derecha, cedida por D. Keller, es una imagen de basófilos de rata obtenida en aire
usando el modo de contacto. Estas imágenes ilustran el amplio rango de dimensiones de
las muestras accesibles al microscopio de fuerzas.
A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO
plitud de oscilación) se detectan óp-
ticamente mediante la deflexión del
rayo láser en la superficie de la pa-
lanca. También aquí existe un siste-
ma de retroalimentación, que se em-
plea, lo mismo que en el caso anterior,
para modificar la distancia entre
punta y muestra, con el objeto de que
se mantenga constante la frecuencia
de resonancia.
La resolución espacial del micros-
copio depende de la geometría de la
muestra. Se pueden obtener imáge-
nes con resolución atómica a partir
de muestras planas, ya sea en aire o
sumergidas en agua o etanol. Con
muestras biológicas, la resolución
está determinada por la relación entre
el tamaño de la punta y el objeto y la
magnitud de las fuerzas que se apli-
can. La resolución suele variar entre
5 y 10 nanómetros.
El microscopio de fuerzas posee
una finísima sensibilidad. Para su
correcto funcionamiento se exige,
pues, el apantallamiento de las vibra-
30 40 μm
H. G. HANSMA
4. IMAGEN de una molécula de ADN obteni-
da en contacto en propanol. Se puede dis-
tinguir una periodicidad conmensurable con
la de la doble hélice. La barra representa una
longitud de 15 nm.
ciones externas (las del edificio o las
de personas que deambulan por el
laboratorio). Hay un parámetro que
mide el grado en que las vibraciones
externas dejan de condicionar la ope-
ración del microscopio. Se trata de la
relación entre la frecuencia de la vi-
bración externa, ν, y la frecuencia de
resonancia más baja del instrumento,
νo. Así, una vibración de amplitud A
se atenúa en el microscopio de fuer-
zas por un factor ( ν / ν o) 2. Si la fre-
cuencia de resonancia más baja del
microscopio es 40 kilohertz, las vibra-
ciones externas menores de 100 hertz
(las habituales en los edificios) y con
una amplitud de micrometro sólo pro-
ducirán un movimiento de la punta
respecto a la muestra de 0,01 nanó-
metros. Los microscopios en los que
se ha procurado maximizar el ren-
dimiento apantallan las vibraciones
externas con una construcción rígi-
da y compacta, especialmente de la
cámara que contiene la palanca, la
muestra, el láser y el fotodiodo.
E n la adaptación del microscopio
de fuerzas para la observación de
biomoléculas han intervenido físicos,
químicos y biólogos. Las primeras
aplicaciones biológicas del microsco-
pio de fuerzas se centraron en la molé-
cula de ADN. A pesar de que su estruc-
tura molecular está perfectamente
determinada por difracción de ra-
yos X y por métodos bioquímicos, hay
numerosos procesos todavía por desen-
trañar en los que participa el ADN.
Para su observación, las moléculas
de ADN han de depositarse sobre una
superficie plana a escala atómica, de
suerte que la superficie de soporte
no enmascare la topografía de la molé-
cula a examinar. El material de mica
93
R. GARCIA, J. TAMAYO, M. VALLE, J. L.CARRASCOSA (izda.); C. BUSTAMANTE (dcha.)

4000 nm

100
200
300
400
nm

5. IMAGENES de complejos ADN-proteínas obtenidas en modo
oscilante en aire. A la izquierda, una topografía tridimensional
de un ADN circular ligado a la proteína del conector del bacte-
riófago φ29, las proteínas aparecen como objetos que sobresa-
len del filamento de ADN. A la derecha, imágenes de fragmen-
tos de ADN (681 pares de bases) y la proteína ARN-polimerasa.
El doblamiento del ADN depende de la secuencia del ADN. Es
probable que la deformación de la molécula de ADN por la po-
limerasa durante la transcripción permita la interacción de es-
te complejo con otras moléculas de proteínas encargadas de
regular la velocidad con la que se mueve la proteína sobre el
ADN.

cumple ese requisito. Sin embargo,
fracasaron los primeros intentos de
observar ADN depositado en mica.
Las imágenes del ADN aparecían
borrosas o desaparecían después de
sucesivas tomas.
Se demostró más tarde que, ade-
más de las fuerzas perpendiculares
existentes entre la punta y la mues-
tra (fuerzas que suelen emplearse
para formar la imagen), la punta ejer-
cía también fuerzas laterales sobre
la muestra, superiores incluso a las
que unen las moléculas a la mica. Si
las moléculas no se hallan bien ancla-
das en la mica, la punta las despla-
zará. Para obviar ese inconveniente,
se han desarrollado varias estrate-

10,0 nm

5,0 nm
20,0 nm

0,0 nm

400
10,0

300

200
0

100
0
100
200
C. BUSTAMANTE

300 0
400
nm

6. IMAGEN obtenida en aire de complejos de ADN-HSF2, usando tura de “lazo” requerida para la activación del proceso de trans-
el método oscilante. Se ilustran dos complejos. Uno de ellos mues- cripción. El otro complejo muestra una HSF2 unida a HSE del ADN,
tra que dos HSF2 (flechas) son necesarios para formar la estruc- sin formar lazo.

94 TEMAS 29
gias. Así, existen tratamientos de la
superficie de mica que modifican el
signo de la carga superficial y aumen-
tan la densidad de aquélla; este pro-
ceso refuerza el enlace electrostático
con el ADN, que es una molécula
polar. De igual forma, se han de-
sarrollado nuevos modos oscilantes
de funcionamiento que minimizan el
contacto con la muestra y reducen
las fuerzas laterales que la punta
ejerce sobre el espécimen.
Para aliviar el problema de las fuer-
zas laterales se procura también redu-
cir la humedad ambiental. En efecto,
entre la punta y la muestra se crea
un menisco de agua. La fuerza de ca-
pilaridad atractiva que de ello resulta
puede deformar o desplazar las bio-
moléculas. Conviene, pues, efectuar
los experimentos en líquidos. Cuando
así se procede, el microscopio de fuer-
zas proporciona imágenes con reso-
lución molecular incluso en solucio-
nes fisiológicas.
Existe ahora un especial interés
por estudiar proteínas y ácidos nuclei-
cos que participan en la formación
de complejos moleculares, y que, por
sus dimensiones y topología, quedan
a menudo fuera del alcance de las
técnicas de cristalografía de rayos X
y resonancia magnética nuclear.
Las interacciones ácido nucleico-
proteína son la base molecular de
procesos celulares relacionados con
la síntesis de ADN, la formación de
ARN mensajero o la síntesis de pro-
teínas a partir del ARN mensajero.
En ese ámbito, el microscopio de fuer-
zas permite caracterizar la geometría
de los complejos de proteína-ADN,
los cambios estructurales del ADN y
de las proteínas que resultan de la
interacción, y la estequiometría de los
complejos, es decir, el número de molé-
culas de proteína por molécula de
ADN en el complejo.
ceso de transcripción. La geometría
observada resulta coherente con lo que
nos dice la bioquímica, a saber, que el
movimiento de la polimerasa sobre
el ADN no es continuo, sino que se-
meja el ciclo de extensión y contrac-
ción de una oruga. Presumiblemen-
te, durante la fase de contracción de
este ciclo la proteína deforma y do-
bla el ADN. Es posible que estos cam-
bios conformacionales de la polime-
rasa y el ADN tengan una función
importante en los mecanismos de
regulación del proceso de trans-
cripción.
Un ejemplo del poder del micros-
copio de fuerzas para determinar la
estequiometría de complejos de ADN-
proteína lo encontramos en el lazo
que se forma en la molécula del ácido
nucleico por inducción de factor 2 de
choque térmico (HSF2), una proteí-
na activadora del proceso de trans-
cripción en células humanas. Estas
proteínas activan el proceso de trans-
cripción en un doble paso: se unen al
ADN en secuencias especializadas
a b
c d
del mismo, los denominados ele-
mentos de choque térmico (HSE), y
se ponen en contacto con el promotor
o lugar del ADN en el que se engarza
la ARN-polimerasa para iniciar la
transcripción.
Los HSE pueden encontrarse cerca
o lejos del promotor. La máxima acti-
vación requiere la interacción de
varias proteínas HSF2, proceso que
va acompañado a menudo de la for-
mación de lazos. Con los métodos tra-
dicionales de microscopía electrónica
no se había podido determinar si la
formación de estas estructuras pre-
cisan dos secuencias HSE y sendas
moléculas de proteína HSF2 unidas
a ellas, o si una sola molécula de HSF2
se engarzaba simultáneamente a dos
HSE y al promotor. La cuestión se diri-
mió con el microscopio de fuerzas,
cuyas imágenes han revelado que la
formación de los complejos de acti-
vación implica la unión de dos molé-
culas de HSF2 a sus respectivos ele-
mentos de choque térmico.
Una de las principales ventajas del

T omemos, por ejemplo, el conector

del virus bacteriófago φ29 y una
zona de ADN circular; el polipéptido
conector sirve de enlace entre la
cabeza del virus (donde se empaqueta
el ADN) y el cuello del mismo. Si lle-
C. BUSTAMANTE Y M. GUTHOLD

vamos el complejo ADN-conector al

microscopio de fuerzas, las imágenes
nos revelan la geometría de las inte-
racciones entre el conector y el ADN,
y de ellas es posible inferir que la
interacción del ADN circular con el
conector se realiza por el exterior del 7. IMAGENES DE FRAGMENTOS DE ADN en solución acuosa depositados sobre mica. Las
mismo. En cambio, la interacción con fotografías a y c se han sacado inmediatamente después de que se introdujera una solu-
ADN lineal se realiza preferente- ción de ARN-polimerasa en la celda de fluidos. Las fotografías b y d corresponden a los
mente a través de un canal interno. mismos fragmentos y se obtuvieron unos 45 segundos más tarde. Nótese que una sola mo-
Se sabe gracias al microscopio de fuer- lécula de polimerasa se ha unido a cada fragmento (flechas). El área de las imágenes es
zas que la ARN-polimerasa deforma 300 nm × 300 nm, dimensiones que semejan las del menor elemento de imagen que cabe
la molécula de ADN durante el pro- obtener con un microscopio óptico.

A TRAVÉS DEL MICROSCOPIO 95

 microscopio de fuerzas
reside en su capacidad
para adquirir imágenes
en líquidos. Existen varios
motivos para efectuar los
experimentos en líquidos.
En primer lugar, la for-
mación de imágenes en
líquidos permite reducir
las fuerzas entre la mues-
tra y la punta. En segundo
lugar, si las imágenes se
hacen en medios salinos,
las moléculas presentan
estructuras más cercanas
a las que muestran en los
procesos celulares. Por
C. BUSTAMANTE Y M. GUTHOLD
experimentos han corro-
0_min_1 6_min_1 borado que el microscopio
de fuerzas constituye una
valiosa herramienta para
la manipulación mecá-
nica de moléculas indi-
viduales.
El desarrollo de micros-
copios que no requieren
lentes para la formación
de imágenes, como los mi-
12_min_1 18_min_1
croscopios de campo pró-
ximo, ha abierto numero-
sas y originales vías de
investigación en la quí-
mica y física de superficies
y en la biología. El micros-

último, los medios líqui- copio de fuerzas es capaz

dos abren la puerta al de trabajar con muestras
estudio de procesos diná- sumergidas en medios
micos. Los tipos de proce- acuosos como el microsco-
sos dinámicos accesibles pio óptico, pero con la reso-
al microscopio de fuerzas lución del microscopio
dependen de los tiempos 8. SECUENCIA DE IMAGENES de la digestión de una molécula de ADN electrónico. En los pocos
de adquisición de imáge- con nucleasa de micrococo. La imagen fue obtenida en una solución de años transcurridos desde
nes, que suelen variar en- pH 7,6, usando el modo oscilante. La imagen muestra que la deposición su invención, esta técnica
tre 10 y 200 segundos; es de las moléculas sobre la superficie de mica no obstaculiza la inte- ha dejado de ser un ins-
decir, puede abordar pro- racción bioquímica entre la enzima y el substrato. Area de los recua- trumento exótico en el
cesos rápidos como la for- dros: 300 nm × 300 nm. laboratorio de biología y
mación de complejos mole- se está convirtiendo poco
culares o lentísimos como a poco en una herramien-
la división celular. tener también imágenes de proteí- ta necesaria.
Un ejemplo de ensamblaje de com- nas de la membrana celular en solu- Sin embargo, los ejemplos ante-
plejo biomolecular que podemos ciones salinas. riores no son las únicas aportaciones
seguir y caracterizar a través de imá- La interacción del microscopio de que estas técnicas pueden ofrecer a
genes obtenidas con el microscopio de fuerzas con la muestra es de carác- la biología. Unos experimentos donde
fuerzas es el de la unión de una molé- ter local. Gracias a esa propiedad, el se combinaron luz y un microscopio
cula de ARN-polimerasa a una mo- control de la posición de la punta per- de fuerzas han demostrado que es po-
lécula de ADN. Así, ha sido posible mite introducir micromodificacio- sible obtener simultáneamente imá-
observar primero el fragmento suelto nes, fabricar dispositivos a escala genes de biomoléculas, así como inte-
de ADN y, luego, la unión de éste con nanométrica o determinar fuerzas rrogar espectroscópicamente y de
la enzima polimerasa. Asimismo, el intermoleculares. Así ha ocurrido, forma individual a las mismas. A tra-
microscopio de fuerzas ha permitido por ejemplo, con la determinación de vés de estos desarrollos es posible
seguir procesos bioquímicos como la la fuerza necesaria para separar el que el investigador del siglo XXI dis-
digestión de un fragmento de ADN complejo de una proteína, la avidina, ponga de nuevas herramientas para
por una nucleasa de restricción. Y ob- cuando se une a una molécula de vi- explorar procesos biológicos en tiempo
tamina B12 (biotina). Para ello, un real y con resolución espacial y espec-
grupo de científicos alemanes, en- troscópica molecular.
cabezado por Hermann Gaub, recu-
brió la punta con moléculas de avi-
dina y la puso en contacto con una
superficie recubierta por biotina. El
acercamiento de la punta y la mues- BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
tra promovió la formación de enla-
ces no covalentes avidina-biotina. ATOMIC FORCE MICROSCOPY. D. Rugar, P.
Luego, alejando la muestra de la K. Hansma, en Physics Today, vol. 43,
pág. 23, 1990.
punta, se determinó la fuerza nece- SCANNING FORCE MICROSCOPY. D. Sarid.
saria para romper estos enlaces. Un Oxford University Press, Nueva York,
histograma de las fuerzas medidas 1991.
muestra distintos picos con periodi- BIOCHEMICAL AND STRUCTURAL APPLICA-
cidad de 160±20 piconewton. Este TIONS OF SCANNING FORCE MICROSCOPY.
30 nm
C. Bustamante, D. A. Erie, D. Keller, en
JAN HO

valor se ha identificado, por tanto,

como la fuerza requerida para rom- Current Opinions in Structural Biology,
vol. 4, pág. 750, 1994.
9. IMAGEN DE LA SUPERFICIE extracelu- per un solo enlace molecular biotina- S CANNING F ORCE M ICROSCOPY IN B IO -
lar de un desmosoma aislado de la superfi- avidina. Siguiendo un procedimiento LOGY. C. Bustamante, D. Keller, en Phy-
cie de una célula de hígado de rata. La ima- similar, ha sido posible también deter- sics Today, vol. 48, n.o 12, página 32,
gen fue obtenida en una solución salina de minar la fuerza que une las cadenas 1995.
fosfato, usando el modo de contacto. complementarias del ADN. Estos

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