“AÑO DEL FORTALECIMIENTO DE LA SOBERANÍA NACIONAL”

UNIVERSIDAD PRIVADA NORBERT WIENER

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
Genoma y Salud
Análisis de microarreglos para el diagnóstico molecular de
inmunodeficiencias primarias
Integrantes:

● Pacheco Huarhuachi, Dayan Isabel (a2019100831@uwiener.edu.pe)

● Peña Calderón, Diego (a2019101001@uwiener.edu.pe)
● Quinto Garcia, Jean (a2017100310@uwiener.edu.pe)
● Regalado Rodríguez, Jackeline (a2019100689@uwiener.edu.pe)
● Solis Flores, Nazelí Fabiana (a2019101561@uwiener.edu.pe)

Ciclo: Octavo

Sección: MD8T1

Docente: Dr. Marco Antonio Galarza Perez

Fecha de inicio: 25 de noviembre del 2022

Fecha de entrega: 30 de noviembre del 2022

 I. Resumen

El uso de los análisis de microarreglos (microarrays), actualmente está obteniendo

relevancia para el uso diagnóstico de enfermedades, esta herramienta está
expandiendo ampliamente el análisis de la genómica. Aquí se comprende el análisis
de ARN o ADN para diferenciar enfermedades infecciosas, trastornos e incluso el
cáncer, esta tecnología e información ha ido evolucionando con el tiempo. Se han
desarrollado micromatrices y se utilizan para detectar o analizar una amplia gama de
moléculas diana. Se ha realizado una gran cartera de excelentes investigaciones en el
campo.Se ha realizado una gran cartera de excelentes investigaciones en el campo, no
solo relacionadas con la interacción molecular, sino también con el análisis de datos o
la automatización de los pasos del ensayo. Es por eso que en este estudio se puede
lograr determinar simultáneamente. Teniendo en cuenta los pasos que se llevan a
cabo. deben ser seguidos a través de condiciones, siguiendo etapas y respetando el
proceso del microarray. Esta tecnología consiste en colocar miles de secuencias
génicas en lugares determinados sobre un portaobjetos de vidrio llamado chip. Una
muestra que contiene ADN o ARN se pone en contacto con el chip,

Palabras clave: autoanticuerpos, inmunodeficiencias primarias, autoinmunidad,

micromatrices de proteínas, inmunodeficiencia

II. Introducción

Las inmunodeficiencias primarias es un conjunto de enfermedades genéticas en las

que se halla una alteración cuantitativa o funcional de distintos mecanismos
implicados en la respuesta inmunitaria que son congénitos, donde esta se va encontrar
disminuida con lo que lleva a un mayor riesgo de infecciones, desregulación
inmunológica, fenómenos autoinmunes, auto inflamación y neoplasias. Siendo los
cuadros clínicos más graves, más prolongados, y precisando de tratamientos
antibióticos más intensos o prolongados, ataca 1,5 y 18,8 por cada 100 000 habitantes.
Por otro lado hay que aclarar que esta enfermedad está ligada a la autoinmunidad,
recordar que inmunodeficiencia es un estado de subacticacion de la respuesta
inmunitaria a diferencia de autoinmunidad que es un estado de sobreactivación.

Las manifestaciones clínicas de alerta son un patrón de infecciones que se pueden

manifestar como los siguientes: Cuatro o más otitis en un año, dos o más sinusitis en
 un año, dos o más neumonías en un año, abscesos recurrentes en órganos o cutáneos
profundos, aftas persistentes en la boca o candidiasis después del año de vida, dos o
más infecciones profundas, incluyendo la sepsis, dos o más meses tomando
antibiótico con escasos resultado, necesidad del uso de antibióticos intravenosos para
resolver, las infecciones. Dificultad para crecer y ganar peso normalmente y
antecedentes familiares de inmunodeficiencia primaria. La medición de los
autoanticuerpos circulantes viene hacer importante por su crítica para definir y
comprender la enfermedad autoinmune clínica. Desde las perspectivas de diagnóstico
e investigación. En este documento se revisara como los Microarrays de Proteínas
funciona como análisis de Autoanticuerpos en Inmunodeficiencia y sirve para su
diagnóstico.

III. Marco teórico

Cabe señalar que las inmunodeficiencias primarias (IDP) son definidos como una
secuencia de patologías genéticas en las existente una variación cuantitativa o servible
de diversos mecanismos implicados en la contestación inmunitaria que puede dar por
sentado, dependiendo de la inmunodeficiencia, un más grande peligro de infecciones,
desregulación inmunológica, fenómenos autoinmunes, autoinflamación y neoplasias.
A efecto de aquel manejo inadecuado la incidencia de infecciones es más grande de lo
común, siendo principalmente más graves, más prolongadas, y precisando de
tratamientos antibióticos más fuertes o prolongados.

Actualmente se cuenta con la tecnología de micromatrices y su descubrimiento ha

revolucionado la investigación científica sobre el ADN y ARN. A diferencia de los
ensayos biológicos comúnes, los microarrays realizan un análisis paralelo de más de
miles de analitos. Para el análisis de ácidos nucleicos, las posibilidades de aplicación
van desde un conjunto enfocado de unidades transcripcionales múltiples para el perfil
transcripcional o fragmentos genómicos para el análisis del número de copias o la
variación genética hasta genomas completos y más. La disponibilidad de secuencias
genómicas completas fue la piedra angular para el desarrollo y uso de tecnologías de
todo el genoma, como las tecnologías de matrices. En el último siglo, la secuenciación
de genomas completos ha sido considerado como un gran descubrimiento para la
sociedad científica y a la vez para el ámbito comercial.
La técnica más utilizada para la producción de microarrays, especialmente en el
campo de las instituciones de investigación y universidades, es la detección robótica:
por ejemplo, detección de proteínas, productos de PCR u oligonucleótidos en soportes
de microarrays, vidrio sólido utilizando agujas divididas o sólidas. Usando agujas
abiertas, el ADN se alimenta a través de fuerzas capilares y se deposita en ubicaciones
designadas en la micromatriz usando robótica. Por lo general, se imprimen productos
de PCR de hasta 1 kb y oligonucleótidos de entre 20 y 100 nt de longitud. La técnica
es asequible y, por lo tanto, se usa a menudo en laboratorios de investigación
individuales.

El diagnóstico molecular comprende una división analítica principal en el diagnóstico

de laboratorio clínico. El análisis de ARN o ADN ayuda a diagnosticar enfermedades
infecciosas e identificar trastornos de origen genético o incluso cáncer. A partir de
pruebas monoparamétricas en los últimos años, han evolucionado tecnologías que
permiten la detección de muchos parámetros en paralelo, por ejemplo, utilizando
técnicas de amplificación de ácidos nucleicos multiplex, micromatrices o tecnologías
de secuenciación de última generación. 

Diseño y fabricación de microarreglos

Los microarrays de proteínas tienen la posibilidad de diseñarse y elaborar de manera

sin dependencia o adquirir comercialmente. La construcción de matrices necesita una
impresora de micromatrices, antígenos de interés purificados (expresados en el
laboratorio o conseguidos comercialmente) y una área de micromatrices sobre la que
imprimir, comúnmente un portaobjetos de microscopio con un revestimiento
particular.

La votación del área sobre la que imprimir debería estar guiada por los requisitos
técnicos de cada laboratorio y además por la química de los antígenos en cuestión.
Técnicamente, ciertos detectores de escáner de micromatrices permanecen localizados
en el lado contrario de la fuente de láser, lo cual impide la utilización de áreas de
micromatrices opacas como la nitrocelulosa. Ambas zonas en las que dichos
laboratorio tiene más vivencia son los portaobjetos de vidrio recubiertos de
nitrocelulosa (Maine Manufacturing) y recubiertos de epoxisilano (SCHOTT).
 La votación del área de la matriz además debería considerar la naturaleza del antígeno
impreso. Los ácidos nucleicos, las proteínas, los carbohidratos y los lípidos poseen
diferentes mecanismos de alianza a los sustratos de la matriz. La química del antígeno
debería dirigir la selección del sustrato de la matriz, como para la alianza idónea de la
molécula al área del portaobjetos como para mantener la composición de la molécula.

Sondeo, detección y escaneo de micromatrices

El sondeo de micromatrices es muy semejante al sondeo y la detección de un ELISA

clásico. Los microarreglos impresos se bloquean en un tampón de bloqueo para
reducir la alianza no específica. El suero se diluye en tampón de sondeo. Con dichas
diluciones, en la mayoría de los casos, únicamente se necesitan de 1 a 5 μl de suero o
plasma por paciente. Se puede usar suero o plasma; no obstante, es fundamental ser
constante en la utilización de suero o plasma y no usarlos indistintamente, debido a
que hay discrepancias clave, especialmente en medio de las reactividades bajas, entre
ambos productos sanguíneos.

Según la naturaleza enormemente multiplexada del ensayo, es importante tener

cuidado para eludir componentes de confusión en el procesamiento y la investigación.
Continuamente que es viable, analizamos muestras el mismo día y en paralelo.
Incluso, la aleatorización del orden en que se prueban los controles y las muestras
ayuda a reducir la probabilidad de efectos por lotes, que tienen la posibilidad de ser
generados por discrepancias en los tiempos de incubación.

Desde el sondeo, los microarrays se lavan y se aplica un anticuerpo secundario

fluorescente. Generalmente, utilizamos un anticuerpo secundario específico de IgG
Fc; no obstante, tienen la posibilidad de medir varios isotipos y subclases diferentes
por medio de la utilización de anticuerpos secundarios específicos de isotipo.

IV. Análisis de microarreglos para el diagnóstico molecular de inmunodeficiencias

primarias
4.1 Tecnologías de micromatrices de proteínas
Los microarreglos de ADN innovaron el análisis y la ciencia en el estudio de la
expresión génica. Al principio se detectaba las características del de nucleótidos de
ADNc con una impresora tipo robótica en un piso plano, actualmente se emplea
fotolitografia donde las matrices se lavan y un escáner láser detecta la unión de
características. Una de las ventajas de los microarreglos de ADN es que es
multiplexada, además permitieron la creación de Gene Expression Omnibus, un
depósito de base de datos de todos los datos de micromatrices publicados como un
recurso público enriquecido.
Tiempo después los primeros micromatices fue proteínas que se emplearon de manera
parecida al hallar moléculas de unión a proteínas y también se incluyeron los
autoanticuerpos en el suero de pacientes con enfermedades autoinmunes. Estos
microarreglos de proteínas se han usado como herramientas con el objetivo de
subclasificar a los individuos con padecimiento de enfermedades autoinmunes, para
vigilar la actividad de la enfermedad y para el descubrimiento de nuevos
autoanticuerpos.

4.2 Diseño e implementación de microarreglos de proteínas

Existen tres pasos relevantes para la detección y análisis reactivación de los

autoanticuerpos con es uso de micro matices, el primero es el diseño y fabricación de
matrices; el segundo sondeo, detección y exploración de matrices; y pro ultimo
tenemos el tercero que es el procesamiento de imágenes y análisis de datos.
Figura 1: En la sección A tenemos la Tecnología de microarrays de proteínas. Un
esquema de microarrays de proteínas para encontrar los autoanticuerpos. Luego los
antígenos se imprimen en una superficie de portaobjetos especialmente recubierta y
los anticuerpos séricos que esta de color verde donde se detectan mediante
anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia que esta de color púrpura.
Continuando con el escáner de la micromatriz y se analizan las imágenes utilizando
el software de micromatriz. Se calcularon los valores a partir de de la intensidad de
fluorescencia media y se analizaron estadísticamente si esto corresponde a cada
antígeno. En los datos se observa una representación de mapa de calor. En la sección
B se detalla el Esquema simplificado del mapa de inmunodeficiencia primaria
propuesto.

4.3 Procesamiento de imágenes y análisis de datos

Estas imágenes deben ser de alta calidad para poder hacer un análisis adecuado,
también dentro de ello se usa un software para el procesamiento de estas imágenes. |
Estos microarreglos de ADN, hacen posible analizar simultáneamente el nivel de
expresión de miles de genes durante condiciones múltiples; no obstante, la gran
cantidad de datos generados representa un reto para su análisis y los hace un
candidato ideal para el procesamiento masivo paralelo. El empleo y abordamiento de
este procedimiento debe realizarse necesariamente en buenas condiciones, siempre y
cuando tenemos que tener en cuenta los posibles fallos que puedan haber ocurrido
durante el proceso.
4.4 Conocimiento actual del panorama de autoanticuerpos en inmunodeficiencias
primarias.
Actualmente se tiene una referencia compleja en el contexto de la autoinmunidad y
los trastornos de inmunodeficiencia, la existencia de los microarrays y su ayuda para
el diagnóstico a través de biomarcadores es aún un campo no tan bien abarcado,
teniéndose así poca información de la gama de autoanticuerpos en la
inmunodeficiencia primaria. De igual manera, el colegio Americano de Genética
Médica (ACMG, 2010), indica que es preferible y debe usarse como test de primera
línea para una ayuda diagnóstica de distintas anomalías, siendo estas congénitas,
también para personas que padecen de discapacidad intelectual o un retraso
sindrómico o no sindrómico (Por ejm: El espectro autista).
Sin embargo estos estudios han traído ventajas de cambio para el paradigma junto a
los microarreglos de ADN, ello tuvo mucha utilidad gracias a su naturaleza
multiplexada, sus requisitos mínimos para la entrada de muestras, esto mismo
permitió una pantalla imparcial para la expresión génica relevante. La
reproducibilidad y la escalabilidad de las micromatrices de ADN también permitieron
la creación de Gene Expression Omnibus, un depósito de base de datos de todos los
datos de micromatrices publicados como un recurso público enriquecido.
Se obtuvieron estudios e informes de enfermedades individuales y los anticuerpos
frecuentes, encontrándo así en uno de ellos elevación de deficiencia de DOCK8, entre
otros.

4.5 Autoanticuerpos anti citoquinas

Se ha encontrado que ACAA está fuertemente asociado con un pequeño número de

deficiencias inmunológicas. Quizás los ACAA altamente sensibles y específicos
mejor descritos incluyen aquellos que antagonizan el interferón gamma en
micobacterias atípicas u otras infecciones oportunistas en el sudeste asiático. Un
segundo ejemplo clave es el ACAA contra el interferón tipo I, que puede verse con o
sin ACAA contra IL-17A e IL-22 en el síndrome poliendocrino autoinmune tipo I
(APS-1). El uso de enfoques proteómicos para estudiar los ACAA tiene el potencial
de ser muy útil en estudios de inmunodeficiencia multifacéticos. Primero, el
descubrimiento de nuevos ACAA tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión
de la fisiopatología de la enfermedad. En segundo lugar, los enfoques proteómicos
han abierto nuevas vías para el descubrimiento de biomarcadores. En tercer lugar,
sugieren oportunidades terapéuticas potenciales basadas en la biología de las
citoquinas.

Cabe señalar que la presencia de autoanticuerpos, incluso en patrones muy

específicos, no prueba que estos autoanticuerpos desempeñen un papel patológico. De
hecho, hay una variedad de autoanticuerpos bien estudiados que se consideran
marcadores de enfermedad pero que no contribuyen al proceso de la enfermedad. El
papel de los ACAA contra GM-CSF en la proteinosis alveolar es quizás la
demostración más convincente de un papel patológico directo, con una participación
global de las citoquinas GM-CSF en el proceso de la enfermedad y la transferencia
pasiva de autoanticuerpos purificados del suero de los pacientes. La enfermedad
recapitula el fenotipo de la enfermedad en primates no humanos. Sin embargo, para la
gran mayoría de los ACAA descritos, la asignación de efectos patológicos es
puramente especulativa y se necesita más investigación.

4.6 Autoanticuerpos en individuos sanos

Para comprender los autoanticuerpos en cualquier estado alterado, como una
enfermedad, primero debemos comprender el estado subyacente en individuos sanos.
Desafortunadamente, la prevalencia y el papel de los autoanticuerpos en la
homeostasis inmune en individuos sanos no se conocen bien. Clínicamente, se
reconoce ampliamente que la serología "específica" para enfermedades reumáticas
tiene niveles de especificidad muy variables. Sin embargo, se sabe poco sobre la
naturaleza y función de los autoanticuerpos en individuos sanos.

Varios estudios han encontrado niveles elevados de ACAA en individuos sanos,

incluso en preparaciones de inmunoglobulina intravenosa. Mientras que algunos
ACAA son específicos de la enfermedad en algunas enfermedades, otros ACAA
pueden tener una penetración variable de la enfermedad, actuando en conjunto con
otros ACAA u otros factores para afectar la enfermedad. Se necesitan más
experimentos para responder preguntas sobre la prevalencia de ACAA en individuos
sanos y si los ACAA o los programas de ACAA están asociados con genotipos o
fenotipos específicos. En particular, las pantallas grandes de ACAA de individuos
sanos en diferentes etapas del desarrollo humano y bajo diferentes perturbaciones
naturales o experimentales, como la vacunación, pueden ser muy informativas.

4.7 Contenido Antigénico

En los últimos tiempos se pudo conseguir un progreso en micromatrices de proteínas
con respecto a un incremento en la sensibilidad de detección, la cantidad de
propiedades que están impresas en cada micromatriz y en variedad de moléculas que
se pueden imprimir. Estos en primeras instancias van a estar impresos con ácidos
nucleicos, donde existe una extensión de los microarreglos para poder perfeccionar
mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, lípidos y carbohidratos.
Existen diferentes laboratorios sin experiencia en equipos de impresión de
microarrays, comercializan microarrays de proteínas, péptidos, lípidos y
carbohidratos, estos productos comprenden un espectro que empieza desde
micromatrices altamente dirigidas con una alta cobertura de un organismo o antígeno
específico productos de coberturas más amplias con capacidad de poder abarcar todo
el proteoma. Algunos ejemplos se encuentran las micromatrices de Arrayit y estas
imprimen proteínas clave de patógenos específicos como Plasmodium falciparum o
Staphylococcus aureus.
 También existen microarrays de amplia cobertura que incluyen ProtoArray que tiene
más de 9000 proteínas humanas de longitud completa que están expresadas de
construcciones de cDNA en el sistema de expresión de insectos.
Otros ejemplos incluyen proteínas de alta densidad los cuales son las micromatrices
de péptidos de PEPperPRINT.PEPperPrint los cuales producen péptidos prefabriadas
mediante síntesis combinatoria mediante impresión de láser.

V. Conclusión

● Existen instalaciones centrales, laboratorios y empresas que también ofrecen

impresión de microarrays con función de envío, esto lo ofrece la University of
texas Southwestern Genomics and Microarray Core Facility lo cual también
ofrece un servicio completo de impresión, procesamiento y análisis.

● Los anticuerpos monoclonales purificados permiten la realización de

experimentos in vitro e in vivo para poder así hallar la necesidad y la
suficiencia de un anticuerpo. Estos en primera instancia se van aislar los
anticuerpos monoclonales, los microarrays de proteínas y estas se podrán
reutilizar para poder identificar un antígeno.

VI. Referencias Bibliográficas:

1. Pere P. Inmunodeficiencias primarias . Congreso de Actualización Pediatría

[Internet] 2020 [consultado 30 nov 2022]: 311-320. Disponible
en:https://www.aepap.org/sites/default/files/documento/archivos-adjuntos/
congreso2020/311-320_inmunodeficiencias.pdf
2. Seoane E.Diagnóstico y manejo de lasinmunodeficiencias primarias en niños.
Inmunología Clínica de la SEICAP [Internet] 2019 [consultado 30 nov 2022];
42(2): 415-35. Disponible en:
https://www.aeped.es/sites/default/files/documentos/28_imunodeficiencias_pri
marias.pdf
3. Lemuth K, Rupp S. Microarrays como herramientas de investigación y
dispositivos de diagnóstico [Internet] 2015 [consultado 30 nov 2022].
Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7120549/
4. Serrano O. Microarrays, autoanticuerpos e inmunodeficiencia [Internet] 2015
[consultado 30 nov 2022]. Disponible en:
http://articulos.sld.cu/inmunologia/archives/2524
5. Instituto Nacional de Estadística e Informática. Encuesta Nacional
Especializada de Discapacidad [Internet]; 2012. Disponible en:
https://www.inei.gob.pe/media/MenuRecursivo/publicaciones_digitales/Est/
Lib1171/ENEDIS2012-COMPLETO.pdf
6. Cigudosa J.C.. La revolución de los microarrays en la investigación
biosanitaria: tipos de plataformas, usos y perspectivas en oncología. Anales
Sis San Navarra [Internet]. 2004 Abr [citado 2022 Dic 01] ; 27( 1 ): 11-20.
Disponible en: http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1137-
66272004000100002&lng=es.
7. PubMed Central (PMC) [Internet]. Protein Microarrays: A New Tool for the
Study of Autoantibodies in Immunodeficiency; [consultado el 1 de diciembre
de 2022]. Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4387933/#:~:text=A
%20single%20microarray%20chip%20can,a%20significant%20clinical
%20diagnostic%20need
8. Gallego A, Pediatra I, Cs T, Soler-Palacín P. Aepap.org. [citado el 30 de
noviembre de 2022]. Disponible en:
https://www.aepap.org/sites/default/files/documento/archivos-adjuntos/
congreso2020/311-320_inmunodeficiencias.pdf