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Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923

https://doi.org/10.1007/s12155-021-10340-x

Metabolismo de la xilosa en la producción de bioetanol:Saccharomyces cerevisiae

contra no-Saccharomyceslevaduras

Alfayuset Ochoa‑Chacón1· Alfredo Martínez2· Héctor Mario Poggi-Varaldo1· Lourdes Villa‑Tanaca3·

Ana C. Ramos‑Valdivia1· Teresa Ponce‑Noyola1

Recibido: 1 julio 2021 / Aceptado: 28 septiembre 2021 /Publicado en línea: 16 de octubre de 2021
© Los autores, bajo licencia exclusiva de Springer Science+Business Media, LLC, parte de Springer Nature 2021

Abstracto
La xilosa es el segundo azúcar más abundante en la biomasa lignocelulósica y en el planeta. En el proceso de producción de bioetanol de
segunda generación, es fundamental metabolizar todos los azúcares obtenidos en la hidrólisis de la lignocelulosa para aumentar los títulos
de etanol y los rendimientos de conversión de biomasa en biocombustible y disminuir los costos de producción. Tipo salvajeSaccharomyces
cerevisiaeLas cepas, los microorganismos caballo de batalla en la producción de etanol, no son capaces de fermentar la xilosa. En esta
revisión se realizó una comparación en la producción de bioetanol a partir de xilosa entre levaduras no convencionales y cepas
recombinantes deSaccharomyces, destacando las ventajas y desventajas según los factores más importantes que influyen en el
metabolismo del azúcar a etanol, como la vía de asimilación utilizada, coasimilación con glucosa, niveles de oxígeno, tolerancia a inhibidores
de fermentación, temperatura de proceso, entre otros. La revisión comienza revisando las vías metabólicas de asimilación de xilosa,
seguidas por el desequilibrio de cofactor asociado, la expresión heteróloga de xilosa isomerasa (XI), la regulación de xilosa reductasa (XR) y
xilitol deshidrogenasa (XDH), y la relevancia de los genes involucrados en la pentosa. vía del fosfato (PPP). Asimismo, la importancia de otras
levaduras, como laEstipitis de Scheffersomyces,candida shehatae, yKluyveromyces marxianus, como se destacan las levaduras no
convencionales para producir bioetanol, por su capacidad de fermentar una amplia gama de azúcares, incluida la xilosa, en comparación
conS. cerevisiae.

Palabras claveFermentación de xilosa · Levaduras no convencionales ·Estipitis de Scheffersomyces·candida shehatae·Kluyveromyces

marxianus

Introducción fuentes alternativas, entre las cuales el bioetanol se considera la

alternativa más útil para reemplazar la gasolina convencional. El etanol
El rápido agotamiento global de las reservas de combustibles fósiles y el combustible mezclado con diferentes proporciones de gasolina tiene un
calentamiento global provocado por las emisiones de gases de efecto invernadero alto octanaje y una combustión eficiente. Las materias primas primarias
ha llevado a la búsqueda de nuevas alternativas para la obtención de energías que se utilizan actualmente para producir el llamado etanol combustible
renovables. Como solución a este problema, los biocombustibles han surgido como de primera generación incluyen maíz, azúcar de caña, trigo y remolacha
azucarera. El proceso de etanol combustible de segunda generación (2G)
ha estado bajo investigación durante varias décadas, pero aún así, se
* Teresa Ponce‑Noyola
tponce@cinvestav.mx necesita mucha investigación para la producción comercial. Este alcohol
puede ser producido a partir de biomasa lignocelulósica y residuos
1
Departamento de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de forestales, incluyendo tallos de algodón, bagazo (caña de azúcar y
Investigación y de Estudios Avanzados – IPN, Av. IPN 2508,
agave), paja (trigo y arroz), mazorcas de maíz, rastrojo de maíz, cáscaras
Zacatenco, 07300 Ciudad de México, México
2
de coco, palitos de yute y cascarilla de arroz, entre otros [1,2].
Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de
Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México,
62250 Cuernavaca, Morelos, México Son necesarios varios pasos para convertir los materiales
3 lignocelulósicos en bioetanol. Los principales obstáculos entre ellos son
Laboratorio de Biología Molecular de Bacterias y Levaduras,
Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias la complejidad del sustrato, la hidrólisis eficiente de los azúcares
Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, fermentables polimerizados, los inhibidores de fermentación generados
prol. de Carpio y Plan de Ayala s/n. Col Sto. Tomás, 11340
durante los pretratamientos y la baja utilización de
Ciudad de México, México

Vol.:(0123456789)
906
pentosas en el proceso de fermentación (Fig.1) [2]. La biomasa
lignocelulósica consiste principalmente en lignina, celulosa y
hemicelulosa, de las cuales la celulosa y la hemicelulosa
(holocelulosa) representan del 50 al 80% del material en peso
seco.3,4]. Después del pretratamiento, que incluye álcali, ácido,
explosión de vapor o hidrólisis enzimática, se obtienen
azúcares simples, principalmente glucosa y xilosa.5]. Además,
durante el pretratamiento, según el método utilizado y el
origen del residuo, se generan o liberan algunos inhibidores,
como furfural y 5-hidroximetilfurfural, fenoles y ácidos
orgánicos. Estos compuestos pueden afectar el crecimiento y el
metabolismo de los microorganismos, lo que resulta en bajos
rendimientos y productividades.6,7].
En la hidrólisis de la fracción holocelulósica, la xilosa es el
segundo azúcar más abundante después de la glucosa. La cantidad
de xilosa depende en gran medida de la fuente lignocelulósica; por
ejemplo, su contenido es mayor en la mazorca de maíz (28-35%),
bagazo de caña de azúcar (23-32%) y paja de trigo (18-23%), y
también se encuentra, aunque en menor medida, en maderas
duras y otras materias primas agrícolas (5-20%) [8–10]. Sin
embargo, la viabilidad económica del proceso de producción de
etanol depende de la fermentación de todos los azúcares presentes
en los hidrolizados. A pesar deS. cerevisiaees ampliamente utilizado
en la producción de etanol, no puede fermentar xilosa. Se han
hecho varios esfuerzos para modificar metabólicamenteS.
cerevisiae, con el objetivo de utilizar eficientemente la xilosa [11–13
]. La producción de etanol a partir de la fermentación de xilosa se
ha llevado a cabo con éxito conS. cerevisiaecepas que expresan
genes heterólogos que codifican las enzimas xilosa reductasa (XR) y
xilitol deshidrogenasa (XDH) de los ascomicetos Estipitis de
ScheffersomycesySpathaspora passalidarum [14–21]. Por otro lado,
el genXYLA, que codifica XI (xilosa isomerasa), también se ha
expresado enS. cerevisiaepara la conversión directa de xilosa a
xilulosa, evitando la formación de xilitol y aumentando los
rendimientos de etanol [11,22,
Figura 1Aprovechamiento integral de biomasa lignocelulósica con enfoque de biorrefinería en la producción de compuestos de alto valor añadido
13
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923
23]. Asimismo, la expresión simultánea de ambas vías enS.
cerevisiaeha sido reportado logrando con esto un efecto
sinérgico positivo en los rendimientos de etanol obtenidos a
partir de hidrolizados lignocelulósicos no detoxificados [24].
Además de la bioconversión de xilosa en etanol, es necesario
resolver otros problemas, como la coutilización de azúcares (pentosas y
hexosas), la represión catabólica, la tolerancia a los inhibidores y la
mayor tasa de captación y catabolismo de xilosa. En los últimos años, la
investigación se ha centrado principalmente en mejorar la vía del
metabolismo de la xilosa tanto en laboratorio recombinante como
industrial.S. cerevisiaepresiones [24,25]. Aunque se han aplicado varias
estrategias de ingeniería metabólica enS. cerevisiaepara mejorar la
fermentación de xilosa [26], aún persisten algunos problemas, como la
baja tasa de consumo de xilosa y los bajos rendimientos de etanol.
Además, muchos de estos estudios se han realizado con cepas de
laboratorio, que no son adecuadas para la producción industrial de
etanol. Por lo tanto, es importante seleccionar una cepa de levadura que
no solo muestre altos rendimientos de etanol a partir de la co-
fermentación de glucosa y xilosa, sino que también muestre robustez en
su duro entorno de trabajo.18,21,27]. Por otro lado, se ha investigado
muy poco sobre otras cepas de levadura con capacidad natural para
fermentar hexosas y pentosas. Por lo tanto, las levaduras de no
SaccharomycesSe debe explorar este tipo ya que podrían ser una
alternativa en el proceso de producción de bioetanol porque pueden
requerir menos modificaciones genéticas para obtener cepas con
mayores rendimientos de etanol a partir de xilosa o mezclas de xilosa-
glucosa.
Esta revisión se centra en el metabolismo de xilosa a
etanol en recombinantesS. cerevisiaey no-SAccharomyces
levaduras, incluidas las vías de oxidación-reducción e
isomerización. El presente trabajo es un intento de mostrar
las ventajas que poseen los animales silvestres no
Saccharomyceslevaduras y demostrar por qué deben ser
muy estudiados en el contexto del proceso de producción
de bioetanol.
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923
hemicelulosa
La biomasa lignocelulósica representa una materia prima para
la producción de bioetanol; es abundante y es la mayor fuente
de biomasa del mundo. La biomasa lignocelulósica se compone
principalmente de lignina (5–20 %), celulosa (30–60 %) y
hemicelulosa (15–30 %) y pequeñas cantidades de pectina,
proteínas y extractivos. La mayoría de los azúcares de la
fracción hemicelulósica no se utilizan actualmente en el
proceso de fermentación debido a su alto contenido de xilosa
(~ 80%) y arabinosa (~ 10%), y nativoS. cerevisiaecepas no son
capaces de fermentar estas pentosas [28].
La hemicelulosa es el segundo polímero más abundante en
la biomasa lignocelulósica. Es un heteropolímero constituido
por pentosas (xilosa y arabinosa) y hexosas (manosa, galactosa
y glucosa) así como residuos de diferentes ácidos como el
acético y el galacturónico. La hemicelulosa carece de estructura
cristalina debido a su estructura ramificada y grupos acetilo;
esta característica lo hace fácilmente degradable [29]. Una
función importante de la hemicelulosa es mantener juntas las
fracciones de lignina y celulosa en la pared celular de la planta.
Además, actúa como barrera física y bloquea el contacto de las
celulasas con la fracción celulósica. En la producción de
bioetanol, es fundamental liberar y utilizar todos los
componentes (pentosas y hexosas) tanto de la celulosa como
de la hemicelulosa debido a la necesidad de altas
concentraciones de monómeros fermentables para obtener
altos títulos de etanol en el proceso.30,31].
Papel del pretratamiento en la explotación de hemicelulosaLos
azúcares polimerizados contenidos en la hemicelulosa para ser
utilizados como sustrato en un proceso fermentativo deben ser
liberados de la matriz lignocelulósica (pretratamiento) y sometidos a un
proceso de hidrólisis para obtener azúcares libres fermentables [32].
El proceso de pretratamiento tiene como objetivo romper la
estructura compacta de la biomasa lignocelulósica y liberar y
exponer el núcleo de celulosa mediante la eliminación y/o
modificación de la lignina.33]. Un proceso de pretratamiento
ideal involucra las siguientes características: no reducción de
tamaño de la biomasa, eliminando solo la fracción de lignina
preservando las fracciones de celulosa y hemicelulosa, evita la
generación de compuestos tóxicos, bajo costo y baja demanda
de energía [34].
Estos pretratamientos se clasifican en dos grandes grupos: no
biológicos y biológicos. Los métodos de pretratamiento no
biológico se dividen en tres tipos, físicos, químicos y fisicoquímicos,
que incluyen métodos de molienda, microondas, ácido diluido,
álcali suave, líquidos iónicos, agua caliente líquida y amoníaco,
entre otros (Tabla1). Por otro lado, los métodos biológicos se basan
en el uso de enzimas ligninolíticas u hongos que degradan la
lignina [28,41]. En el proceso de producción de bioetanol 2G, el
pretratamiento debe ser
907
capaz de mantener una gran parte de la fracción de hemicelulosa y
evitar la formación de inhibidores de la fermentación utilizando
procesos de bajo costo [42].
Debido al impacto económico del pretratamiento sobre la
viabilidad del proceso de bioetanol, se utiliza principalmente el
pretratamiento químico porque elimina el mayor contenido de
lignina en la biomasa y permite el fraccionamiento de lignina,
hemicelulosa y celulosa para su uso en una biorrefinería. Sin
embargo, este tipo de pretratamiento elimina una gran
cantidad de hemicelulosa (20-50%) [43]. Una alternativa es el
uso de pretratamientos con ácido diluido y agua caliente, que
son efectivos para la recuperación de hemicelulosa. Además,
con la selección adecuada de los pretratamientos y la
secuenciación de sus operaciones, se puede lograr un
fraccionamiento efectivo [44].
Sacarificación de la Fracción de HolocelulosaEl proceso de
sacarificación es necesario para obtener azúcares fermentables a partir
de biomasa lignocelulósica. Los procesos de sacarificación incluyen ácido
diluido e hidrólisis enzimática. El primero utiliza ácido para obtener
azúcares simples, pero en este tipo de hidrólisis se liberan muchos
inhibidores de la fermentación. En el segundo método se evita la
liberación de inhibidores porque las celulasas atacan específicamente a
su sustrato y liberan monómeros. Vale la pena mencionar que los
procesos termoquímicos son más rápidos que los procesos enzimáticos
porque las enzimas requieren temperaturas y pH suaves, lo que resulta
en tiempos de hidrólisis más prolongados. Sin embargo, algunas
levaduras pueden tolerar ciertos niveles de inhibidores, y se puede
utilizar la sacarificación ácida, lo que representa una disminución de
costos y tiempo.45–47].
En la sacarificación enzimática de la celulosa se utiliza un
complejo celulolítico compuesto por actividades endoglucanasa,
exoglucanasa y β-glucosidasa. Estas enzimas trabajan en sinergia
para obtener principalmente glucosa en el mejor de los casos; sin
embargo, la celobiosa y los celo-oligosacáridos también se
acumulan al final del proceso de sacarificación.48].
De la misma manera, la hemicelulosa es hidrolizada por la
acción de varias enzimas, como la xilanasa, β-xilosidasa,
glucuronidasa, acetilesterasa, galactomananasa y glucomananasa.
49]. Esta fracción requiere más actividades enzimáticas debido a su
naturaleza heterogénea y ramificada. La xilosa es el principal
monosacárido que se obtiene, pero también se liberan otros
azúcares y ácidos, como la arabinosa y el ácido acético.50]. La
acción combinada de las enzimas mencionadas anteriormente, el
consumo de azúcar y la posterior fermentación a etanol por
levadura se muestra en la Fig.2.
Otro tipo de proceso que permite obtener xilosa a partir de la
fracción de hemicelulosa es la combinación de ácido diluido
(0,2-1%) con explosión de vapor. Este proceso es un pretratamiento,
pero su relevancia es que la xilosa (como el monómero y el
oligómero) presente en la fracción líquida resultante se puede
recuperar hasta en un 85–95 %. Este proceso tiene la ventaja
13
908 Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923

tabla 1 Condiciones de pretratamiento en la producción de hidrolizados y conversión de xilosa a partir de diferentes biomasas lignocelulósicas

Biomasa pretratamiento Proceso de hidrólisis Xilosa (g/L) Producto Referencia

Elote Autohidrólisis 209 °C, Ninguno 26,0 Etanol [18]

55 min+1,5% H2ENTONCES4,
121 °C, 45 minutos

Elote Secado, fresado+ auto- Ninguno 26.7 Etanol [24]

hidrólisis 205 °C,
70 min+1,5% H2ENTONCES4,
121 °C, 165 minutos

Roble de madera dura Ácido diluido 1% p/v H2ENTONCES4, 16 FPU Celic CTec2, 19.9 Etanol [35]
microondas 180 °C, 20 min 50 °C, 72 horas

Paja de arroz Ácido diluido 1% p/v H2ENTONCES4, 5.5 FPU Cellic CTec2, 25.2 Etanol
121 °C, 30 minutos 50 °C, 72 h
Bagazo de caña de azúcar Hidrotermal 190 °C, 2% H2ENTONCES4, 120 °C, 20 minutos 47.7 Etanol [36]
10 minutos

Sorgo Ácido diluido 0,2 MH2ENTONCES4, Xilanasa 23.6 Etanol [37]

121 °C, 2 horas

Bagazo de caña de azúcar Molienda+ agua caliente liquida 30 FPU Celic CTec2, 9.42 Etanol [38]
180 °C, 10 minutos 50 °C, 72 horas

paja de trigo y maíz Ácido diluido 0,2% H2ENTONCES4, 10 FPU Celic CTec3, 54.3 Etanol y xilitol [39]
rastrojo TA, 20 min+ vapor 45 °C, 96 horas

catalizado 190 °C, 5 min

Bambú Peróxido de hidrógeno-acético 30 FPU Celuclast 1,5 L, 50 18.6 Etanol, xilulosa y [40]
ácido 30% peróxido:ácido FPUT. reesei, 45 °C, 48 horas xilitol
acético glacial 1:1, 85 °C, 2 h

de ser rápido, entre 5 y 15 min, lo que representa una disminución
en el tiempo requerido para el proceso global [39,51].
Además de la xilosa, la arabinosa también está presente en la
hemicelulosa sacarificada, pero su concentración es mucho menor,
y muchos microorganismos no asimilan ni fermentan fácilmente
este azúcar.52]. Por lo tanto, esta revisión se centra principalmente
en el metabolismo de la xilosa como pentosa representativa para
producir bioetanol a partir de hemicelulosa.
Vías catabólicas de xilosa
Una vez dentro de la célula, la xilosa debe convertirse en xilulosa y
luego fosforilarse en xilulosa 5-fosfato para incorporarse a la ruta
de las pentosas fosfato (PPP). La principal diferencia entre
procariotas y eucariotas en las vías del metabolismo de la xilosa es
que las bacterias emplean una enzima única para convertir la xilosa
en xilulosa, mientras que las levaduras

Figura 2Representación
esquemática de la sacarificación
de holocelulosa por celulasas (EG,
EXG y BGL) y hemicelulasas (XYL y
BXL) para la posterior
fermentación de azúcares
(celobiosa, glucosa y xilosa) por
levaduras nativas o diseñadas

13
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923
y los hongos llevan a cabo la transformación utilizando dos enzimas en
un proceso de oxidorreducción (Fig.3) [53,54].
La conversión de D-xilosa a D-xilulosa es un paso crítico en la
mayoría de las levaduras fermentadoras de xilosa, y el consumo de
xilosa se lleva a cabo en presencia de oxígeno, mostrando una relación y
regulación por el metabolismo aeróbico. Por ejemplo, cuando se usa la
vía de oxidorreducción, la fermentación de xilosa se lleva a cabo de
manera eficiente en condiciones de oxígeno limitado para promover la
producción de etanol en lugar del metabolismo aeróbico que da como
resultado el crecimiento celular.55].
Vía de OxidoreducciónLos hongos filamentosos y algunas
levaduras utilizan la vía oxidorreductora, que implica dos
reacciones. Primero, la xilosa se reduce a xilitol por la acción de la
XR dependiente de NADPH. En segundo lugar, el xilitol se oxida a
xilulosa por un NADH+-XDH dependiente. En tercer lugar, por la
acción de la xilulosa quinasa (XK), la xilulosa-5-P se integra en la
PPP. La mayoría de las levaduras presentan esta vía, pero no todas
son capaces de catabolizar xilosa a etanol debido a la preferencia
diferencial de cofactores entre las reacciones catalizadas por XR y
XDH. En las levaduras que no producen etanol a partir de xilosa, XR
suele preferir NADPH como cofactor, mientras que XDH prefiere
NAD.+. Estas preferencias generan un desequilibrio entre los
cofactores disponibles para la segunda enzima y, por lo tanto, se
acumula xilitol.55,56]. este cofactor
Fig. 3Metabolismo de la xilosa
en levaduras. XI, xilosa
isomerasa; XR, xilosa reductasa;
XDH, xilitol deshidrogenasa; XK,
xilulosa quinasa; PPP, ruta de
las pentosas fosfato; G3P,
gliceraldehído-3-fosfato; PDC,
piruvato descarboxilasa; ADH,
alcohol deshidrogenasa; ALD,
aldehído deshidrogenasa
909
El desequilibrio está presente en levaduras comoC. utilis,C.
intermediay algunos recombinantesS. cerevisiaeexpresando XR y
XDH (Tabla2). A diferencia de,Estipitis de Scheffersomyces, conocida
como fermentadora de xilosa, no tiene desequilibrio de cofactores
ya que esta levadura posee una XR con doble preferencia de
cofactores. Este XR puede usar tanto NADPH como NADH,
resolviendo el desequilibrio del cofactor y generando suficiente
NAD+para ser utilizado por XDH [63,64].
Se han hecho varios esfuerzos para resolver el desequilibrio
de cofactor porque es uno de los problemas significativos
asociados con la fermentación de pentosa. La principal
distinción entre NADP+/NADPH y NAD+/NADH es que la primera
vía está vinculada a vías anabólicas y la segunda vía está
vinculada a vías catabólicas. El catabolismo de las pentosas en
los hongos, principalmente en las levaduras, requiere ambos
cofactores para las reacciones catabólicas de conversión de
xilosa en xilulosa, a excepción deStipitis, que posee un XR con
doble preferencia [56,sesenta y cinco]. Fermentación de xilosa a
cantidades equimolares de etanol y CO2en condiciones
anaeróbicas es teóricamente posible y esencial en el contexto
de la biotecnología. Sin embargo, en la práctica, la aireación
durante la fermentación debe controlarse con éxito o producirá
xilitol y CO.2en exceso [66–68].
Dado que NADPH se regenera principalmente en la rama
oxidativa de la PPP, donde la reducción de NADP+está acoplado
13
910 Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923

Tabla 2 También se dan levaduras con actividades XR y XDH con diferente preferencia de cofactores y condiciones de aireación.

Levadura Condiciones de aireación Actividad específica (U/mg) Referencia

XR XDH
NADPH NADH NAD+ NADP+

Estipitis de ScheffersomycesNRRL Y-7124 Oxígeno limitado NR 6.59 5.44 NR [57]

candida guillermondiiIFT 20.037 candida anaeróbico 0.27 0,62 0.78 NR [58]
shehataeC81015 candida tenuisNRRL Y-1498 Oxígeno limitado 1.70 3.25 2.60 NR [59]
Spathaspora arborariaeNRRL Y-48658 Oxígeno limitado 0.27 NR 0.28 NR [60]
Spathaspora passalidarumNRRL Y-27907 Oxígeno limitado 1.86 0.77 0.12 NR
Kluyveromyces marxianusYZJ088 Estipitis de Oxígeno limitado 0,46 0,60 0.21 NR
SchefferomycesATCC 58.376 Spathaspora Oxígeno limitado 0.35 0.10 0.30 0,45 [61]
passalidarumATCC MYA 4345 anaeróbico 0.73 0,65 0.31 NR [62]
anaeróbico 0.24 0.86 0.44 NR

NR, no reportado

a la producción de CO2, este último afecta el equilibrio redox.
Cuando CO extra2en esta vía se produce, la fermentación de
pentosas deja de ser redox neutra. Para abordar el exceso de
NADH, se acumula xilitol; se requiere aireación, lo que resulta
en más CO no deseado2; o se implementa una combinación de
ambos procesos [69].
Las cepas que expresaban XR y XDH modificadas mostraron una
disminución en la acumulación de xilitol y una mayor producción de
etanol. Además, se ha informado que la adición de agentes
reductores, como el ácido acético y la acetoína, resuelve
parcialmente el desequilibrio del cofactor. Esta estrategia permite la
reoxidación del cofactor, manteniendo la retroalimentación entre
XR y XDH (Fig.3) [70].
Vía de isomerizaciónEn esta vía, XI es la enzima que realiza
la conversión de xilosa a xilulosa. Esta enzima no requiere
cofactores y es activa en condiciones anaeróbicas, a
diferencia de la vía de oxidorreducción que requiere
oxígeno. La vía de isomerización elimina el desequilibrio de
cofactores y la acumulación de xilitol.71,72]. Esta vía está
presente en organismos procarióticos comoE. coli,
B. subtilis,ruminococo, y algoStreptomycesespecies [73–75]. Se
han realizado esfuerzos para expresar estas enzimas en
levaduras para la producción de bioetanol. Sin embargo, se han
logrado bajos niveles de expresión, y XI con baja actividad y
bajo consumo de xilosa es problemático cuando se expresa XI
de organismos procarióticos.24].
Sin embargo, durante la última década, la presencia de XI en
hongos filamentosos comoOrpinomicessp. ypiromices sp. Ha
sido reportado. Esta es una oportunidad para expresar XI
funcional en levaduras [13,23,76,77]. Mesa3resume algunos
trabajos en los que varias xilosa isomerasas se expresaron
heterólogamente enS. cerevisiae.
Levaduras de fermentación de xilosa
En esta sección, se discuten algunas investigaciones recientes sobre las
levaduras fermentadoras de xilosa utilizadas en la producción de
bioetanol, así como sus ventajas y desventajas en este proceso.
Saccharomyces cerevisiaeAlbergue del metabolismo heterólogo
de la xilosala levaduraS. cerevisiaeutilizado en la industria para
producir etanol fermenta ni celobiosa ni xilosa, azúcares que se
encuentran durante el proceso de sacarificación de los residuos
lignocelulósicos. La mayoría de los estudios actuales se centran en
la expresión de las enzimas involucradas en el metabolismo de la
xilosa enS. cerevisiaecomparando los rendimientos entre las vías de
oxidorreducción e isomerización. Diferentes técnicas para mejorar
la asimilación de xilosa porS. cerevisiaeha sido usado. La
combinación de mutagénesis química y evolución adaptativa en
cepas deS. cerevisiaeexpresando elXYL1 yXYL2genes deStipitis
permitió obtener una cepa que consumió 95 y 65 % de xilosa en
condiciones anaeróbicas y de oxígeno limitado, respectivamente. El
rendimiento de etanol en condiciones limitadas de oxígeno fue de
0,313 g.etanol/gramoxilosa, que fue 1,6 veces mayor que en
condiciones aeróbicas. Según la investigación mencionada
anteriormente, la vía de oxidorreducción requiere la presencia de
oxígeno para convertir la xilosa en xilulosa. Sorprendentemente, en
este trabajo, las actividades XR y XDH permanecieron sin cambios
en la cepa evolucionada en comparación con las de la cepa
parental, lo que sugiere que esos procedimientos pueden haber
creado otros cambios genéticos que favorecen el metabolismo de la
xilosa, como modificaciones en la PPP o genes involucrados en el
transporte de azúcar. [83].
Por otro lado, la modificación de la expresión de algunos
genes implicados en la PPP ha sido objeto de estudio debido a
la importancia de evitar la producción de xilitol, la excesiva

13
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923 911

Tabla 3Algunas xilosa isomerasas expresadas heterólogamente enSaccharomyces cerevisiae

a b
fuente de enzimas Sustrato (%) qxilosa XI actividad (U/ Yetanol/azúcar C máx.etanol C qetanol
d
Referencia
mg de proteína)

piromicessp. Glucosa (6.5) 1.340 0.530 0.450 47.50 0.395 [22]

Xilosa (5.5)
piromicessp. Xilosa (2) 0.0126 0.094 0.490 6.50 0.054 [74]
Orpinomicessp. Xilosa (4) 0.077 0.834 0.453 15.00 0.312 [76]
piromicessp. glucosa (2) 0.110 0.550 0.390 8.35 NR [78]
Xilosa (1)
Orpinomicessp. Xilosa (3) 0.039 0.780 0.347 9.36 0.130 [79]
Ruminococcus flavefaciens glucosa (8) NR 1.410 0.44 48.60 0.500 [80]
Xilosa (4)
Celobiosa (2)
piromicessp. Xilosa (4) 1.866 0.044 0.410 17.00 0.566 [81]
Bacteroides vulgatus Xilosa (4) 0.662 1.250 0.419 16.67 0.300 [82]
Orpinomicessp. Xilosa (4) 0.721 0.250 0.409 13.82 0.246

aTasa de consumo específico de xilosa (gxilosa/g CCW*h)

bRendimiento de etanol (getanol/gramoazúcar)

CConcentración máxima de etanol (getanol/L)

CProductividad de etanol (getanol/L*h)
NR, no
reportado

uso de NADPH+y NADP+cofactores, o inhibición de otras proteínas
por sus productos. Por ejemplo, el nocaut del GRE3El gen, que
codifica una aldosa reductasa no específica que produce xilitol a
partir de xilosa, ha sido un enfoque importante en los últimos años.
dieciséis,71,74,80]. Esta modificación permitió obtener etanol a
partir de xilosa con un rendimiento de 0,347 getanol/gramoxilosa, 9%
superior a la de la cepa control después de 72 h de cultivo, y una
reducción de casi el 85% en el rendimiento de xilitol. Según Tanino
et al. [79], nocaut de la GRE3El gen da como resultado una opción
para evitar la acumulación de xilitol en levaduras recombinantes
que albergan la ruta de isomerización porque el xilitol actúa como
un inhibidor de XI y puede truncar la fermentación de xilosa.
Asimismo,PH13, que codifica una fosfatasa alcalina, se ha
estudiado debido a la importancia del balance de ATP en el
metabolismo de la xilosa en presencia o en combinación con
otras fuentes de carbono. Aeling et al. [80] obtuvo una cepa de
S. cerevisiaeque expresa xilosa isomerasa y celobiosa
fosforilasa deRuminococcus flavefaciens, con capacidad para
cofermentar glucosa, celobiosa y xilosa en condiciones
anaerobias. La actividad XI se mejoró mediante mutagénesis
dirigida al sitio y optimización de codones, alcanzando 4,8 veces
más actividad que la enzima nativa. Además, expresaron los
transportadores de celobiosa, GAL2yXKS1, genes y alterados
PH13yGRE3. Estas modificaciones permitieron la co-
fermentación de tres azúcares, obteniendo la cepa BF3645 con
un rendimiento de etanol de 0,44 g.etanol/gramoazúcary una
concentración de etanol de 48,6 getanol/l La cepa BF3645
consumió toda la glucosa y la mitad de xilosa y celobiosa
después de 96 h. En este estudio, el
Los autores intentaron resolver el problema de la fermentación de
varias fuentes de carbono al mismo tiempo, pero encontraron que
la glucosa se consumía rápidamente seguida por la xilosa y la
celobiosa. Sin embargo, el problema con el balance de ATP asociado
con la co-fermentación de diferentes sustratos aún estaba presente.
Si bien se expresó una celobiosa fosforilasa en lugar de una β-
glucosidasa, se esperaba que el uso de ATP disminuyera debido a
que la celobiosa fosforilasa usa solo una molécula de ATP para
fosforilar solo una de las unidades de glucosa que componen este
disacárido. Por lo tanto, es necesario realizar más estudios sobre
este tema energético, ya que en condiciones anaeróbicas aún no es
posible obtener una cepa que consuma todos los azúcares,
manteniendo el balance completo de ATP.
Por otro lado, Lee et al. [74] integró la ruta de isomerización
de la xilosa enS. cerevisiaecepa BY4741, sobreexpresó el gen de
la transaldolasa (TAL1), y noqueó alGRE3 gen. Esta levadura fue
transformada con varias versiones mutadas de laXILUn gen del
hongo piromicessp. para obtener cepas con una tasa de
crecimiento mejorada en xilosa como única fuente de carbono.
La mejor cepa fue S2A3K, que implicó una mutación en el sitio
activo de XI, aumentando Vmáximoen un 77% (0,094 µmol/
min*mg) con respecto a la de la proteína nativa XylA. Asimismo,
esta cepa mostró una mayor tasa de consumo específico de
xilosa (0.057 gxilosa/ gramobiomasa*h), lo que representa un
consumo ocho veces mayor que la cepa de control y un
rendimiento de etanol de 0,42 getanol/gramoxilosa. Estos autores
demostraron que las mutaciones en el sitio activo de XI podrían
contribuir en gran medida a mejorar el rendimiento de la xilosa
isomerasa mutante. Sin embargo, para la xilosa

13
912
metabolismo en la levadura que alberga la vía XI, son necesarias
modificaciones en los genes aguas arriba y aguas abajo. Por
ejemplo, genes aguas arriba comoGRE3 que contribuyen a la
acumulación de xilitol pueden truncar el metabolismo de la xilosa y
promover una acumulación significativa de xilitol. La modificación
de la expresión de los genes PPP (genes downstream) puede
contribuir a mejorar el flujo metabólico en esta rama metabólica y,
en consecuencia, mejorar los rendimientos de etanol.
En otra obra, el XI (XYLAgen) depiromicessp. y el XK (XYL3
gen) deStipitisse expresaron enS. cerevisiae, además de la
sobreexpresión de los genes implicados en la PPP para
aumentar el flujo de xilosa. La cepa H131-A3 resultante se
sometió a un proceso de evolución adaptativa a través de
diferentes regímenes para mejorar la tasa de consumo de
xilosa y su asimilación en condiciones anaeróbicas. H131-A3-AL
CSse obtuvo y tuvo un rendimiento de etanol de 0,41 getanol/
gramoxilosa, lo que representa un aumento del 50 % en
comparación con la cepa de control, y una tasa de consumo
específico de xilosa de 1,866 gxilosa/gramocelúla* h. En este
estudio, los autores mostraron la importancia del proceso de
evolución porque aumentó las copias delXILUn gen que
contribuye a mejorar el consumo de xilosa [81]. Además, una
combinación de diferentes enfoques, como la ingeniería
genética y los procesos evolutivos con diferentes regímenes de
cultivo, puede ayudar y también puede impulsar las dificultades
asociadas con el metabolismo de la xilosa mencionadas
anteriormente en las levaduras recombinantes.
Las isomerasas de xilosa de diferentes bacterias presentes
en el tracto digestivo de los mamíferos se expresaron enS.
cerevisiae. Las cepas recombinantes se sometieron a un
proceso de evolución adaptativa en xilosa bajo diferentes
condiciones de aireación. La cepa que expresa XI deBacteroides
vulgatus, sometido a evolución adaptativa, mostró la mayor
conversión de xilosa y el mayor rendimiento de etanol (0,419 g
etanol/gramoxilosa) entre todas las cepas. Además, la cepa control
que expresaOrpinomicessp. XI mostró un rendimiento de
etanol de 0,409 getanol/gramoxilosa. En las cepas evolucionadas se
observó una mejora del 20 % en la conversión de xilosa y tres
veces en términos de tasa de producción específica de etanol y
tasa de consumo de xilosa en comparación con las cepas no
evolucionadas. Este trabajo destaca la importancia de un
proceso evolutivo después de incorporar un gen heterólogo en
la levadura para aumentar las tasas de consumo de xilosa y los
rendimientos de etanol.82].
Para aumentar el rendimiento y la producción de bioetanol a
partir de lignocelulosa sacarificada, rica en xilosa, β-glucosidasa
intracelular (GH-1) y el transportador de celodextrina (CDT1) de
Neurospora crasafueron insertados enS. cerevisiae(EJ3).
Además, los genes XR, XDH y XK de
StipitisyADHEdeE. colise introdujeron en la misma cepa para
conferir la capacidad de reducción de acetato.Con este
enfoque, la cepa EJ3 co-consumió y co-fermentó celobiosa,
xilosa y ácido acético, que son todos los pasos deseados en
13
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923
una cepa para ser utilizada en un proceso consolidado de bioetanol.
La tasa de consumo de celobiosa a través de un proceso de
evolución adaptativa aumentó en un 200%. La cepa EJ4-a en
condiciones anaeróbicas produjo 30 getanol/L, consumiendo hasta
40 g/L cada uno de celobiosa y xilosa y 1,4 gácido acético/L en 120 h. En
estas condiciones, la productividad de etanol aumentó un 24% en
comparación con EJ4, que no expresó ninguna enzima para la
reducción de acetato. Los autores mostraron la relevancia de
identificar enfoques que permitan el uso de ácido acético, presente
en la lignocelulosa sacarificada y fuente equilibrada de poder
reductor, para mantener la retroalimentación entre las enzimas XR
y XDH. Esto aumentó el consumo de xilosa y luego el rendimiento y
la productividad de etanol [11].
En un trabajo reciente, Feng et al. [13] transformadoS.
cerevisiae (cepa NRRL Y-50463) con un conjunto de plásmidos
que contienen genes implicados en el metabolismo de la xilosa.
Además, NRRL Y-50463 tiene un gen optimizado,XYLA, de
piromicessp., yXYL2(XDH),XKS1(XK),XUT4, yXUT6para
transportadores de xilosa, todos los cuales son deStipitis. Los
autores querían dilucidar el papel de cada gen en el flujo
metabólico de xilosa. Descubrieron que los transportadores no
eran el paso limitante, sino los genes involucrados en la PPP,
como la transaldolasa (TAL1)y transcetolasa (TKL1), fueron
esenciales para mantener las interconversiones de azúcar. Esos
genes están regulados por xilulosa-5-fosfato y no por xilosa;
esto resalta la importancia de la xiluquinasa para la entrada a la
PPP, ya que esta enzima realiza la fosforilación de la xilulosa.
En varios estudios, algunosS. cerevisiaeSe han obtenido cepas
que expresan XI, lo que les permite fermentar xilosa. Sin embargo,
el problema asociado con estas nuevas cepas es la regulación
metabólica de los genes involucrados tanto en la regulación al alza
como a la baja. Por ejemplo, el transporte de xilosa, el consumo de
ATP (actividad XK) y la regulación de los genes PPP son más
importantes en la fermentación de xilosa que la regulación de los
genes implicados únicamente en el proceso de fermentación en sí.
No-SaccharomyceslevadurasSe han evaluado levaduras no
convencionales en base a sus características nativas en
fermentación alcohólica, tolerancia a inhibidores y capacidad para
fermentar pentosas y otros azúcares como la celobiosa que de tipo
salvajeS. cerevisiaeno puede fermentar. Entre estas levaduras,
Stipitis,C. shehatae, yK. marxianusson los más estudiados. Algunos
trabajos sobre la producción de etanol utilizandoSaccharomyceslas
levaduras se enumeran en la tabla4.
Las levaduras no convencionales pueden tener algunas ventajas
durante los procesos de fermentación, como tolerancia a altas
temperaturas y tolerancia a inhibidores, aunque a diferencia de
Saccharomyces, estas características han sido poco estudiadas, y
estos son puntos importantes que deben explorarse [93]. Las
propiedades conferidas podrían resultar en una reducción en los
costos de producción. Por ejemplo, en la hidrólisis separada y
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923 913

Tabla 4Principales parámetros de fermentación en la producción de etanol y consumo de xilosa en noSaccharomyceslevaduras de diferentes sustratos a base de
xilosa

b C
Cepa Sustrato qsa Yetanol/xilosa Yxilitol/xilosa C máx.etanol d qetanol
mi
Referencia

K. marxianusYZJ088 15% xilosa NR 0.380 0.110 50.35 2.100 [61]

K. marxianusIMB4 2% xilosa NR 0.150 0.540 2.08 0.022 [84]
StipitisPET41 4% xilosa NR 0.347 NR 44.0 0.458 [85]
8% de glucosa

StipitisCBS 5773 2,2% xilosa 0.25 0.410 0.056 5.80 0.041 [86]
StipitisCBS 6054 0.22 0.410 0.051 6.50 0.046
C. shehataeATY839 Hidrolizado de paja de arroz NR 0.356 NR 16.80 0.700 [87]
K. marxianusYRL005 5% xilosa NR 0.380 NR 11.52 0.069 [88]
Stipitis 6,5% xilosa NR 0.470 NR 29,90 1.500 [89]
glucosa al 1,5%

C. shehataeCSEB7 Hidrolizado ácido de maíz NR 0.350 NR 9.98 0.200 [90]

C. shehataeCSEB7 Hidrolizado enzimático de maíz NR 0.440 NR 9.55 0.260
C. shehataeTTC79 Hidrolizado de bagazo de caña de azúcar NR 0.460 NR 12.15 0.200 [91]
StipitisNRRL Y-7124 Hidrolizado de bagazo de caña de azúcar NR 0.285 NR 17.20 0.360 [92]

aTasa de consumo específico (gxilosa/g CCW*L)

bRendimiento de etanol (getanol/gramoazúcar)

CRendimiento de xilitol (gxilitol/gramoxilosa)

dConcentración máxima de etanol (getanol/L)

miProductividad de etanol (getanol/L*h)
NR, no
reportado

proceso de fermentación (SHF), la diferencia entre las temperaturas
en los dos procesos debe reducirse para reducir los costos de
enfriamiento del reactor. Además, durante la sacarificación y
fermentación simultáneas (SSF), se requiere una temperatura alta
(45-65 °C) para acelerar la hidrólisis enzimática.94–96]. Durante la
producción industrial de etanol,S. cerevisiae crece a 30 °C, lo que
implica el uso de sistemas de refrigeración que aumentan el coste
del proceso de producción de bioetanol [97,98]. Por otro lado,
mientrasS. cerevisiaees tolerante a ciertos inhibidores de la
fermentación y es capaz de convertirlos en compuestos menos
tóxicos, noSaccharomyceslas levaduras pueden crecer en su
presencia a través de mecanismos más eficientes, logrando un
mayor nivel de desintoxicación [18,22].
Estipitis de ScheffersomycesEsta cepa es una levadura
fermentadora de xilosa natural con un metabolismo de xilosa
basado en la vía de oxidorreducción, lo que significa que no
produce etanol en condiciones anaeróbicas. Sin embargo,
dependiendo del nivel de aireación, se producirá masa celular o
etanol. Por ejemplo, el etanol se produce cuando la tasa de
transferencia de oxígeno es baja (100–550 mmol O2/L*h) [48,80,
81]. En el contexto del etanol celulósico,Stipitises una levadura
competitiva porque es capaz de fermentar glucosa, xilosa,
manosa, galactosa y celobiosa, que son azúcares ya presentes
en la lignocelulosa sacarificada [99,100].
A diferencia de otras levaduras que fermentan xilosa pero
también acumulan xilitol,Stipitistiene un XR con doble preferencia
para NADH y NADPH, lo que resulta en el metabolismo de la
xilosa donde XR usa NADH como cofactor libera NAD+. XDH usa
el último cofactor y se mantiene el equilibrio del cofactor; el
xilitol se acumula en bajas concentraciones y se logra un alto
rendimiento de etanol.
mutantes deStipitisNBRC1687 se obtuvieron mediante
tratamiento UV. PXF4, PXF36 y PXF58 fueron los tres mejores
mutantes productores de etanol. Sin embargo, la cepa mutante
PXF58 fue la mejor en general, produciendo 43 getanol/L, 1,4
veces mayor que NBRC1687, con un rendimiento de etanol de
0,347 getanol/ gramoxilosa. Además, este mutante consumió xilosa
más rápido que su cepa original. Cuando se cultivó PFX58 en
una mezcla de glucosa y xilosa, la cepa presentó inhibición por
el etanol debido a su baja tolerancia a este producto. Luego,
mediante un proceso de adaptación evolutiva, se obtuvo PET41
a partir de PXF58 luego de 20 ciclos en condiciones
microaerófilas en presencia de etanol entre 5 y 7%. La cepa
PET41 mostró inhibición reducida de la glucosa y mejor
tolerancia al etanol, ya que en un proceso de fermentación en
dos fases, 44 getanol/L, mientras que PXF58 solo produjo 40 g
etanol/l La tolerancia a concentraciones más altas de etanol es
uno de los problemas más comunes asociados conStipitisen los
procesos de producción de etanol [85].
Es importante señalar que el control del oxígeno en condiciones
microaerófilas o anaeróbicas podría afectar el rendimiento de
etanol deStipitis, lo que representa un coste energético en el
proceso de producción de bioetanol. De esta forma, Krahulec

13
914
et al. [86] compararon dos cepas deStipitis, CBS 5773 y CBS
6054, en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Observaron un
rendimiento de etanol de 0,41 g.etanol/gramoxilosapara ambas
cepas y xilitol dieron 0,056 y 0,051 gxilitol/gramoxilosa
en condiciones microaeróbicas, respectivamente. La cepa CBS 5773
produjo 5,8 getanol/L, mientras que CBS6054 produjo 6,5 getanol/l
Alternativamente, en condiciones anaeróbicas, CBS 6054 y CBS 5773
mostraron rendimientos de etanol de 0,42 y 0,40 g.etanol/gramoxilosa,
acumulando 5 y 4,3 getanol/L, respectivamente. Sin embargo, se
acumuló más xilitol en ambas cepas debido al desequilibrio de
cofactores, que es típico en condiciones anaeróbicas.
cepas nativas deStipitistienen un alto potencial para la producción de
bioetanol utilizando xilosa como fuente de carbono en comparación con
las cepas recombinantes deS. cerevisiae. Además,
Stipitistiene altos rendimientos para la producción de etanol (más
del 80% del teórico) sin modificaciones genéticas. Cuando las cepas
nativas crecen en una combinación de glucosa y xilosa, el
metabolismo de la xilosa se reprime catabólicamente hasta que se
consume la glucosa.57,100].
Para obtener modificadoStipitiscepas capaces de usar xilosa en
combinación con glucosa, Santos et al. [57] utilizó el reciclaje de
células durante la fermentación de una mezcla de azúcar a 30 °C.
Tras el quinto paso de reciclado, obtuvieron un rendimiento de 0,46
g.etanol/gramoazúcar. Con esta estrategia se obtuvo más biomasa a
partir de la glucosa, y luego con la alta densidad celular se
consumió el 85% de la xilosa. Además, la temperatura era un
parámetro esencial para mejorar la producción de etanol, y luego la
temperatura se redujo en 1 °C en cada lote de 30 a 26 °C después
de cinco pasos de reciclaje adicionales (10° lote). Estas condiciones
les permitieron alcanzar un rendimiento de etanol de 0,47 g.etanol/
gramoazúcaracompañado de un aumento de 1,4 veces en las
actividades de XR y XDH al final del último lote. Los autores
demostraron la estabilidad fenotípica de
Stipitisy la posibilidad de mejorar los rendimientos de etanol
mediante el uso de enfoques que impliquen cambios solo en el
proceso, no en la cepa.
Un punto importante en la producción de etanol 2G es que la
cepa a utilizar en el proceso debe tolerar los inhibidores presentes
en los hidrolizados y así evitar su detoxificación, lo que implica una
reducción de costos. Se han realizado algunas obras con este fin.
Nakanishi et al. [92] estudió el comportamiento deStipitisNRRL
Y-7124 creciendo en hidrolizados enzimáticos de bagazo de caña de
azúcar pretratado alcalino. Los autores utilizaron una combinación
de reciclaje celular y fermentación por lotes alimentados para
minimizar la inhibición. Usando este enfoque, la cepa NRRL Y-7124,
después de cuatro ciclos, produjo 17,2 getanol/L con un rendimiento
de 0,285 getanol/gramoazúcaren un medio de cultivo que contiene 43
gglucosa/L y 15 gxilosa/l La productividad sigue siendo la misma sin
reciclaje (0,36 g/L*h). Sin embargo, el consumo de xilosa mejoró del
primer al cuarto ciclo en un 50%. Durante los pasos de reciclaje, las
tasas de consumo volumétrico de xilosa variaron
13
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923
entre 0,3 y 0,45 gxilosa/L*h, aumentando en cada etapa. Esta
investigación mostró que el reciclaje celular puede ayudar a resolver la
inhibición de la glucosa cuando tanto la xilosa como la glucosa están
presentes en el cultivo.
candida shehataeSe informa que las levaduras de esta especie son
cepas nativas fermentadoras de xilosa a través de la ruta de
oxidorreducción, así como termotolerantes, lo que representa una
alternativa aS. cerevisiae. Tanimura et al. [87] demostró queC.
shehataLa cepa ATY839 fue capaz de producir etanol a partir de
xilosa y glucosa como fuentes de carbono a temperaturas de hasta
37 °C utilizando solo un azúcar o ambos durante el cultivo en
condiciones microaeróbicas. En un proceso SSF utilizando paja de
arroz como sustrato, la cepa ATY839 mostró el mejor rendimiento
con un rendimiento de etanol de 0,356 g.etanol/ gramoxilosaa 37 °C y
en condiciones microaeróbicas (70% del rendimiento teórico) y
consumieron toda la xilosa del medio a las 72 h. A diferencia de,S.
cerevisiaeNBRC 0224,Stipitis NBRC 10,063, yC. shehataeATCC 22,984
cuando se usó como cepas comparativas no consumió más del 50%
de xilosa total después de 72 h en las mismas condiciones. Sin
embargo, ATY839 no mostró un rendimiento de etanol superior al
de las cepas comparativas cuando se cultivaron a 30 °C. Sin
embargo, vale la pena mencionar que las cepas nativas con
características termotolerantes además de su capacidad para
fermentar azúcares no convencionales son deseables en la
producción de bioetanol para reducir los costos de enfriamiento.
La mutagénesis también se ha utilizado para mejorar algunas
características en cepas deC. shehatae. Koti et al. [90] obtuvo unC.
shehataecepa mutante llamada CSEB7 por mutagénesis con
bromuro de etidio (EtBr), mejorando el rendimiento de etanol en un
22,63 % en comparación con la cepa original. Las fuentes de
carbono fueron hidrolizados ácidos o enzimáticos de paja de trigo.
Los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizó como
sustrato el hidrolizado enzimático. La productividad fue de 0,26 g.
etanol/L*h, y el rendimiento de etanol fue de 0,44 getanol/gramoazúcar
(86% del rendimiento teórico). Este valor representó una mejora del
19% en comparación con la cepa original. Mientras tanto, cuando se
usó hidrolizado ácido como sustrato, el rendimiento de etanol solo
mejoró en un 13%. En este caso, el uso de hidrolizado enzimático
puede haber dado mejores resultados debido a la ausencia de
inhibidores de fermentación.
Senatham et al. [91] usó luz ultravioleta para obtener mutantes de
C. shehatae43CS para mejorar la capacidad de fermentar xilosa y la
tolerancia a los inhibidores formados durante el pretratamiento con
ácido diluido del bagazo de caña de azúcar. Los autores obtuvieron
una cepa llamada TTC79 que produjo una concentración de etanol
2,8 veces mayor a partir de 50 gxilosa/L en comparación con la cepa
control y un rendimiento de etanol de 0,343 vs 0,155 getanol/ gramo
xilosa, respectivamente. En una mezcla de azúcares (20 gglucosa/L+60g
xilosa/L), la cepa TTC79 consumió toda la xilosa y produjo 39,85 getanol
/L a las 60 h, mientras que la cepa WT solo produjo
17,12getanol/L a las 72 h. Además, el mutante TTC79 creció en
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923
bagazo de caña de azúcar sin detoxificar, produciendo 12,15 g
etanol/L, 4,6 veces mayor que la cepa control usando el mismo
hidrolizado, con un rendimiento de etanol de 0,46 getanol/gramo
azúcar(90,61% teórico) sin acumulación de xilitol. Esta cepa
presentó tolerancia al ácido acético, furfural y HMF en
concentraciones de 5,25, 1,75 y 1,30 g/L, respectivamente. Se
observó que cuando se utilizó hidrolizado, el rendimiento de
etanol mejoró debido a la presencia de algunos aceptores de
electrones, como el ácido acético, que podría contribuir a una
mejor asimilación de la xilosa.
Kluyveromyces marxianusOtra levadura de interés esK.
marxianusdebido a su capacidad de crecer a temperaturas
relativamente altas y de consumir azúcares distintos de la glucosa,
a diferencia deS. cerevisiae. Por ejemplo,K. marxianusIMB4 produjo
etanol a partir de xilosa en condiciones anaeróbicas a 40 °C [84]. La
levadura tuvo rendimientos de 0,15 g.etanol/gramoxilosay 0,54gxilitol/
gramoxilosabajo estas condiciones. Sin embargo, los autores
demostraron que la presencia de oxígeno es fundamental en la
producción de etanol en esta levadura, que cataboliza la xilosa por
la vía de la oxidorreducción, acumulando altas cantidades de xilitol.
Como se describió anteriormente, este comportamiento en la
mayoría de los casos es causado por un desequilibrio de cofactores
como consecuencia de las condiciones anaeróbicas. Estos autores
también comentan que las condiciones de oxígeno controlado son
difíciles y costosas de mantener en un proceso de bioetanol.
En otro trabajo,K. marxianusprodujo etanol a temperaturas
elevadas a través de la ruta de isomerización. Para lograr este
objetivo, los genes que codifican XR y XDH se interrumpieron y
expresaron un gen XI optimizado por codones deOrpinomices.
Tras un proceso de adaptación sobre xilosa, se obtuvo la cepa
YRL005. Los resultados mostraron un rendimiento de etanol de
0,38 g.etanol/gramoxilosadesde 50gxilosa/L a 42 °C después de 7
días de cultivo. Los autores lograron un mayor rendimiento de
etanol a altas temperaturas en comparación con las cepas
nativas deK. marxianusexpresando la vía de oxidorreducción [
88].
Recientemente, la ingeniería de vías metabólicas se ha utilizado
como complemento de las cepas recombinantes para mejorar los
flujos en el metabolismo de la xilosa para obtener altos
rendimientos y productividades de etanol. Por ejemplo, diferentes
combinaciones de XR/XDH de diferentes organismos se expresaron
enK. marxianus NBRC 1777. La mejor cepa (llamada YZJ020) fue la
que expresó la XR deNeurospora crasay el XDH deStipitis, ambos
con preferencia NADPH, y dos copias deXIL3 deK. marxianus[61].
Además, la capacidad de fermentación de xilosa y el equilibrio
redox de las cepas recombinantes mejoraron significativamente
mediante la sobreexpresión de varios genes aguas abajo, incluidos
los genes de la PPP, el gen de la alcohol deshidrogenasa (KmADH2)
y el gen de la piruvato descarboxilasa (KmPDC1). La ingeniería
resultante
K. marxianusLa cepa YZJ088 produjo 50,35 getanol/L de
132,03gxilosa/L con una productividad de 2,10 getanol/L*h y
915
un rendimiento de etanol de 0,38 getanol/gramoxilosaa 42 °C en
condiciones microaeróbicas. Con estas modificaciones, los autores
resolvieron uno de los problemas más comunes en la fermentación de
xilosa en cepas fermentativas sin xilosa a través de XR/XDH:
desequilibrio de cofactores.
ParaK. marxianuscepas, se deben realizar más estudios ya
que tiene un alto potencial para la producción de etanol, es
termotolerante y tolerante al etanol, y tiene la capacidad de
fermentar una amplia gama de sacáridos.
Saccharomyces cerevisiae o
levaduras no convencionales?
A continuación, se resumen algunas de las características más importantes que se
deben tener en cuenta para el uso de levaduras fermentadoras de xilosa de forma
natural, así como de cepas modificadas genéticamente, para lograr una asimilación
eficiente de la xilosa para producir etanol.
Consumo de xilosa en presencia de oxígenoLa tasa de transferencia
de oxígeno es un factor que debe ser estrictamente controlado en la
fermentación de xilosa, especialmente en levaduras nativas y
recombinantes que utilizan la vía oxidativa, ya que influye tanto en el
crecimiento como en la producción de etanol. Un alto nivel de
oxigenación conduce a un crecimiento aeróbico que ralentiza la tasa de
fermentación, aumenta la acumulación de xilitol y disminuye el
rendimiento de etanol, mientras que el oxígeno disuelto limitado
favorece la producción de etanol.18,60].
Es de destacar queStipitistiene la capacidad de metabolizar la
xilosa en diferentes condiciones de aireación, ya que posee un XR
capaz de cambiar su preferencia de cofactor dependiendo de la
disponibilidad de oxígeno. Cuando la tasa de aireación está entre
0,1 y 0,5 vvm (tasa de flujo volumétrico de aire por unidad de
volumen de medio de cultivo), el XR utiliza NADH en lugar de
NADPH, lo que disminuye el flujo de carbono en el PPP oxidativo,
desviándolo hacia el PPP no oxidativo y glucólisis, lo que resulta en
la producción de etanol. Sin embargo, cuando el suministro de
oxígeno es superior a 0,5 vvm, la XR cambia su preferencia a
NADPH, aumentando el flujo metabólico a la PPP oxidativa y al TCA,
para contrarrestar la generación de NADPH utilizada por la XR, y
provocando además la producción de xilitol y glicerol. etanol [101–
103].
Por otro lado, recombinanteSaccharomycesLas cepas que
fermentan xilosa a través de la vía de isomerización lo hacen en
condiciones anaeróbicas, ya que XI transforma la xilosa en
xilulosa sin usar cofactores, y esto favorece la producción de
etanol.35,76,104]. Sin embargo, en tal recombinante
Saccharomyces, el xilitol también se acumula debido a la
presencia de otras reductasas. Además, se ha informado que la
xilosa desencadena una respuesta respiratoria que disminuye
el flujo de carbono al etanol y genera glicerol.76,104,105].
13
916
En resumen, el consumo de xilosa varía considerablemente entre las
levaduras mencionadas tanto en condiciones aeróbicas como limitadas en
oxígeno. A partir de los resultados revisados anteriormente, se concluye que
los niveles de oxigenación o la tasa de transferencia de oxígeno deben
determinarse para cada cepa de levadura de tipo salvaje o recombinante para
encontrar las mejores condiciones para la producción de bioetanol (u otros
metabolitos) a partir de xilosa como sustrato.
Co-consumo de Xilosa y GlucosaUno de los principales retos en la
producción de bioetanol a partir de jarabes obtenidos a partir de
lignocelulosa hidrolizada es la coutilización de pentosas y hexosas.
La glucosa reprime la utilización de otros azúcares, y su consumo es
secuencial; esta regulación metabólica se conoce como represión
catabólica. La represión catabólica a menudo reduce la
productividad y el rendimiento del etanol.106]. En cultivos de
levadura en mezclas de glucosa y xilosa, la glucosa suprime la
expresión de los genes PPP, mientras que los genes TCA y
respiratorios, que están involucrados en el metabolismo de la
xilosa, se expresan en niveles bajos.68,107]. Se ha demostrado que
los factores de transcripción Thi2 y Nrm1 están involucrados en la
desrepresión de los genes PPP después del agotamiento de la
glucosa, y su sobreexpresión permitió un consumo eficiente de
xilosa.108]. Sin embargo, en la levadura de fermentación de xilosaC.
shehatae, concentraciones de glucosa inferiores a 5 g/L no
reprimen el consumo de esta pentosa [109].
Se han llevado a cabo varios enfoques para suprimir la
represión catabólica, como combinar el metabolismo del azúcar
hexosa y pentosa de dos levaduras nativas diferentes en
cocultivo para mejorar la bioconversión microbiana.110]. Así,
algunas cepas industriales deS. cerevisiaehan sido diseñados
con el objetivo de lograr el consumo conjunto de glucosa y
xilosa, ya sea sobreexpresando los genes XI o XR-XDH o
suprimiendo los genes involucrados en las respuestas
reguladoras para evitar la represión de la glucosa.23,108,111].
Sin embargo, la tasa de consumo de xilosa en tales cepas fue
aún significativamente más baja que la de la glucosa porque el
flujo metabólico limitado a través de la vía de la xilosa en las
cepas silvestres y recombinantes es menor en comparación con
el catabolismo de la glucosa a través de la vía glucolítica de
Embden-Meyerhof-Parnas. Cabe mencionar que el
recombinante industrialS. cerevisiae Las cepas PE-2-X, PE-2-X-
dGRE3 y CA11-X pudieron consumir simultáneamente glucosa y
xilosa. Estas cepas se obtuvieron introduciendo la mutadaXIL1
gen que codifica una xilosa reductasa con mayor afinidad por
NADH que por NADPH yXIL2 que codifican para una xilitol
reductasa, tanto deStipitisy los genes endógenosXKS1 y TAL1
que codifica para una xiluquinasa y una transaldolasa,
respectivamente. En el caso de PE-2-X-dGRE3, también se
eliminó el gen GRE3 [18].
De acuerdo con los resultados anteriores, el consumo conjunto
de xilosa y glucosa depende de los antecedentes genéticos de las
cepas; por lo tanto, búsquedas más intensivas de nuevas cepas
capaces de asimilar simultáneamente estos azúcares
13
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923
debe llevarse a cabo para mejorar los parámetros del
bioproceso.
Transporte de xilosaUn problema adicional para el consumo
simultáneo de pentosas y hexosas es la inhibición de la captación de
pentosas por parte de la glucosa, ya que ambos azúcares ingresan a la
célula a través de los mismos transportadores y existe una inhibición
competitiva por parte de ellos.68,107]. En la mayoría de las levaduras,
las hexosas y pentosas se transportan principalmente por difusión
facilitada, que es un mecanismo contra un gradiente de concentración
independiente de la energía química. En particular, las levaduras
autóctonas fermentadoras de xilo tales comoStipitis,K. marxianus, yC.
shehataetienen dos tipos de transportadores de xilosa: simportadores
de protones y facilitadores de xilosa que tienen una mayor afinidad por
la xilosa [112]. S.estipitisyK. marxianusse han informado con
transportadores con mayor afinidad por la xilosa que por la glucosa; sin
embargo, a altas concentraciones de glucosa (50-200 mM), puede ocurrir
una inhibición competitiva que reduce el transporte de xilosa en un
30-50% [112–114].
Por otro lado,S. cerevisiaetiene una amplia gama de
transportadores de Hxt, y aunque principalmente transportan
glucosa, algunos de ellos pueden transportar xilosa al interior de la
célula (Hxt2, Hxt4, Hxt7 y Gal2) con Km entre 0,1 mM y 1,5 M pero
con menor afinidad que por la glucosa ( 10 µM a 100 mM) [2, 54].
DesdeS. cerevisiaecarece de un sistema de transporte de xilosa
específico, la sobreexpresión de transportadores de xilosa nativos y
heterólogos en cepas industriales podría aumentar la absorción de
xilosa y favorecer el proceso de bioetanol. Asimismo, la
mutagénesis podría aumentar la afinidad de los transportadores
por la xilosa, como ocurrió en la mutación N376F en Gal2, que
probablemente alteró el tamaño y la forma del bolsillo de unión,
aumentando la afinidad por la xilosa y eliminando la capacidad de
transporte de hexosas [112,115,116].
Fermentación de xilosa en presencia de compuestos inhibidores
modelo y con hidrolizados lignocelulósicosLos hidrolizados
lignocelulósicos contienen muchos compuestos tóxicos, como ácidos
débiles orgánicos, derivados de furano y compuestos fenólicos, y su
mezcla suele tener un efecto sinérgico como inhibidor de la
fermentación y del crecimiento de la levadura. La concentración de estos
compuestos varía según la biomasa utilizada, el pretratamiento y los
procesos de hidrólisis. La tolerancia de la levadura a los inhibidores,
como los compuestos fenólicos y los ácidos, depende de la cepa pero
también de la fuente de carbono fermentado. Por ejemplo, cepas
industriales robustas que muestran tolerancia a los inhibidores en
condiciones aeróbicas o en fermentación de glucosa, en fermentación
anaeróbica de xilosa, la tolerancia específica a los inhibidores es menor.
La menor energía metabólica como la generación de ATP debido al
catabolismo de xilosa a etanol es uno de los factores que afectan la
tolerancia a los compuestos tóxicos.2, 117,118]. IndustrialS. cerevisiaeSe
prefieren las cepas a las cepas de laboratorio porque son más tolerantes
a los inhibidores. Por ejemplo, la industria más estudiadaS. cerevisiae
Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923
Se sabe que las cepas tienen la capacidad metabólica de reducir el
HMF y el furfural a sus respectivos alcoholes, que son menos
tóxicos que los aldehídos de furano. Algunas de las características
de estas cepas implican su alta actividad oxidorreductasa incluso en
presencia de inhibidores (Fig.4), aunque aumenta la acumulación de
xilitol y glicerol [46,119]. Por lo tanto, algunos enfoques de
ingeniería genética y evolución adaptativa en cepas asimiladoras de
xilosa nativas o recombinantes han consistido en sobreexpresar
aldehído y alcohol deshidrogenasas u otras reductasas y genes de
respuesta al estrés para aumentar la tolerancia a los inhibidores
para evitar la desintoxicación por hidrolizado.117,120,121].
La mayoría de las levaduras no convencionales han sido aisladas
y caracterizadas como microbiota de alimentos y bebidas en mal
estado, lo que lleva a suponer que algunas de ellas han
desarrollado mecanismos específicos para sobrevivir en diversos
entornos naturales, incluida la capacidad de crecer y producir
etanol en presencia de algunos inhibidores [91,122]. Entre estas
levaduras,K. marxianusmostró la capacidad de crecer en
hidrolizados lignocelulósicos que contienen algunos inhibidores
(incluido el ácido acético). Tolerancia enK. marxianusparece
depender de la tasa de aireación y la reducción de especies
reactivas de oxígeno (ROS). En condiciones de microaireación, los
niveles de actividad de la oxidorreductasa aumentan y reducen los
inhibidores a compuestos menos tóxicos.68,123].
Sin embargo, otros noSaccharomyceslas levaduras han
mostrado un mayor grado de inhibición por la presencia de ácido
acético que furfural y HMF durante la fermentación de xilosa. Esta
inhibición depende de la concentración de ácido acético y del tipo
de hidrolizado utilizado [124,125]. Merece la pena explorar las
bases moleculares de su tolerancia a diferentes ambientes de
estrés, como altas concentraciones de etanol, altas temperaturas o
la presencia de compuestos tóxicos, entre otros.
Figura 4Mecanismos de
desintoxicación de HMF, furfural
y vainillina por levaduras nativas.
HMF, hidroximetilfurfural; PPP,
ruta de las pentosas fosfato
917
La eliminación de compuestos tóxicos del medio de fermentación
es costosa. Por lo tanto, para mejorar los procesos de fermentación,
el uso de cepas de levadura resistentes a los compuestos
inhibidores es fundamental para la producción industrial de
bioetanol a partir de lignocelulosa.
Consumo de xilosa y producción de etanol a temperaturas
elevadasLa termotolerancia es otra característica deseada en
levaduras consumidoras de xilosa y etanológenas, ya que las altas
temperaturas son adecuadas para la sacarificación enzimática y la
fermentación simultánea. Asimismo, la tasa de producción de
etanol podría aumentar, reduciendo los costos de enfriamiento y
minimizando el riesgo de contaminación [126]. Por lo tanto, es
beneficioso tener levaduras que fermenten eficientemente la xilosa
a etanol a altas temperaturas, por ejemplo, por encima de 37 °C [
127]. Nuevos aislados y algunas cepas industriales deS. cerevisiae
son capaces de crecer a altas temperaturas, pero en algunos casos,
su producción de etanol se ve comprometida a 40 °C, debido a que
el consumo de azúcar disminuye a esa temperatura [126,128,129].
Por lo tanto, un recombinanteS. cerevisiaecepa que metaboliza la
xilosa a etanol pero tenía baja termotolerancia, los genes que
codifican los factores de transcripción Hsf1 y Msn2 de
K. marxianusfueron clonados para aumentar la producción de
etanol a temperaturas superiores a 30 °C. Esta cepa logró
rendimientos de etanol entre 0,30 y 0,40 getanol/gramoxilosaa
temperaturas que oscilan entre 35 y 38 °C [130–132].
Cepas no convencionales termotolerantes comoC. shehatae
puede crecer a 35 °C y 37 °C pero con bajos rendimientos de etanol
(0,22 getanol/gramoxilosa) [87,133]. AlgunoK. marxianuslas cepas
pueden crecer entre 37 y 42 °C y producir etanol con rendimientos
que van desde 0,14 hasta 0,40 g/g, a partir de glucosa o xilosa, o
jarabes que contienen pentosas y hexosas a partir de hidrolizados
lignocelulósicos. No obstante, aún quedan algunos
13
918 Investigación en bioenergía (2022) 15: 905–923

problemas para el uso de cepas no convencionales en ambientes para lograr una mayor producción de etanol. También se debe
industriales, ya que algunas de ellas presentan mayor acumulación considerar el uso de dos o más cepas en un proceso de cultivo conjunto
de xilitol en lugar de etanol, su baja viabilidad a temperaturas para fermentar pentosas y hexosas en etanol.
superiores a 40 °C, y la escasa información sobre su genética y
metabolismo [134–137]. La termotolerancia de
K. marxianusy su capacidad para crecer en altas
concentraciones de un amplio espectro de azúcares la hace de
Conclusión
gran interés para la producción de bioetanol, y se deben
Se han utilizado recursos genómicos de una variedad de
realizar más estudios para aprovechar esta levadura [138–140].
microorganismos, así como sistemas biológicos combinados
con mutagénesis, para diseñar levaduras con capacidades de
fermentación de pentosa. Así, varias cepas industriales y de
laboratorio deS. cerevisiaecon capacidad metabólica para
Perspectivas
asimilar xilosa por expresión heteróloga de vías de xilosa, pero
aún falta mejorar su eficiencia para ser utilizados en la
Como se detalló anteriormente, durante la última década, un gran
producción de etanol a nivel industrial. Por otro lado, no-
aumento en los estudios relacionados con la manipulación
SaccharomycesLas cepas son una alternativa potencial en los
genética, la ingeniería metabólica, el análisis de flujo metabólico y la
procesos de producción de bioetanol, ya que tienen la
evolución adaptativa deS. cerevisiaey no-Saccharomyceslevaduras
capacidad nativa de consumir una amplia gama de azúcares,
se ha desarrollado para reducir los costes de producción y mejorar
incluidas las pentosas y hexosas más abundantes presentes en
la producción de bioetanol con hidrolizados de lignocelulosa.
los hidrolizados lignocelulósicos. Sin embargo, estas cepas
Además, las cepas diseñadas con una alta capacidad para
deben tener varias características deseables, como diversidad
transportar y cofermentar diferentes azúcares son deseables para
genética, alta producción de etanol, termotolerancia, tolerancia
lograr altos títulos de etanol, rendimientos y productividad. Sin
a altas concentraciones de etanol y tolerancia a inhibidores,
embargo, aún quedan muchos problemas, como la regulación a la
entre otras. Esto lleva a la conclusión de que la elección de
baja de los genes asociados con el metabolismo de la xilosa (XR,
cualquiera de losS. cerevisiaeo no-SaccharomycesLas cepas
XDH y XI) y PPP, así como la acumulación de xilitol en cepas
para llevar a cabo el proceso de bioetanol dependerán de los
asimiladoras de xilosa nativas y recombinantes.
parámetros finales deseados y de los recursos disponibles.
Las levaduras no convencionales han sido poco exploradas y,
por lo tanto, se sabe muy poco sobre su arquitectura genética y vías
metabólicas. Cepas nativas de no-Saccharomyceslas levaduras
Contribución del autorConceptualización: Alfayuset Ochoa-Chacón y
tienen algunas ventajas al ser capaces de fermentar un amplio Teresa Ponce-Noyola. Investigación bibliográfica: Alfayuset Ochoa-
espectro de azúcares. Se ha propuesto que algunas de las Chacón. Proyecto original: Alfayuset Ochoa-Chacón. Redacción: Alfayuset
limitaciones metabólicas de estas cepas relacionadas con el Ochoa-Chacón; Teresa Ponce-Noyola; Alfredo Martínez; y Héctor Mario
Poggi Varaldo. Revisión y edición: Lourdes Villa Tanaca; Ana C. Ramos
aumento del consumo de sustrato y la producción de etanol
Valdivia; Alfredo Martínez; Héctor Mario Poggi Varaldo; y Teresa Ponce-
podrían resolverse mediante la combinación de ingeniería Noyola.
metabólica, procesos evolutivos adaptativos y mutagénesis
aleatoria. La investigación debe centrarse en aumentar la reserva FondosEste trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia
de NADH o mejorar el uso de la relación NADH/NADPH de las y Tecnología de México (CONACyT) (Beca CB-236895). A. Ochoa-
Chacón recibió una beca de doctorado de CONACyT (784763).
enzimas asociadas con la vía de oxidorreducción de xilosa.
Asimismo, los XI heterólogos podrían expresarse en levadura, como
Declaraciones
StipitisyC. shehatae, que han mostrado un buen transporte de
xilosa, una adecuada regulación génica aguas abajo y una baja
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener conflictos de intereses.
acumulación de xilitol. Además, se deben realizar más estudios,
incluida la ingeniería de proteínas, para identificar nuevos
transportadores de pentosas en no-Saccharomyces levaduras,
como los transportadores de pentosas que no son inhibidos por la Referencias
glucosa y permiten una mejor asimilación de la xilosa. La
termotolerancia y la tolerancia a inhibidores son condiciones 1. Sarkar N, Ghosh SK, Bannerjee S, Aikat K (2012) Producción de bioetanol
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Nota del editorSpringer Nature se mantiene neutral con respecto a los
reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
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