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Microbiología  veterinaria  173  (2014)  379–384

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Microbiología  Veterinaria
página  de  inicio  de  la  revista:  www.elsevier.com/locate/vetmic

Comunicación  corta

Desarrollo  de  anticuerpos  y  detección  por  PCR  de  Ehrlichia  
spp.  en  perros  después  de  la  exposición  natural  a  las  garrapatas
Lindsay  A.  Starkey  a , Anne  W.  Barrett a ,  Ramaswamy  Chandrashekar  b ,
Brett  A.  Stillman b ,  Phyllis  Tyrrell b , Brendon  Thatcher  M b
,elissa  J.  Beall b
,
a a Susan  E.  Pequeña  a,  *
Jeff  M.  Gruntmeir ,  James  H.  Meinkoth ,
aDepartamento  de  Patobiología  Veterinaria,  Centro  de  Ciencias  de  la  Salud  Veterinaria,  Universidad  Estatal  de  Oklahoma,  250  McElroy  Hall,  Stillwater,
Aceptar  74078,  EE.  UU.
b IDEXX  Laboratories,  Inc.,  Westbrook,  ME,  EE.  UU.

INFORMACIÓN  DEL  ARTÍCULO ABSTRACTO

Historial  del  artículo:
Los  perros  expuestos  a  las  garrapatas  en  el  sur  de  los  EE.  UU.  pueden  infectarse  con  múltiples  especies  de  Ehrlichia.  
Recibido  el  31  de  marzo  de  2014
Para  definir  mejor  el  riesgo  de  infección,  las  muestras  de  sangre  recolectadas  de  10  perros  infestados  con  garrapatas  
Recibido  en  forma  revisada  el  30  de  julio  de  2014
a  través  de  un  modelo  de  infestación  natural  se  evaluaron  mediante  un  examen  de  frotis  de  sangre,  PCR,  ELISA  del  
Aceptado  el  1  de  agosto  de  2014
lado  del  paciente  (SNAP1  4Dx1  y  SNAP1  4Dx1  Plus),  IFA  y  ELISA  basado  en  péptidos  para  obtener  evidencia.  de  
infección  por  Ehrlichia  canis,  E.  chaffeensis  y/o  E.  ewingii.  Aunque  rara  vez  se  identificaron  mórulas  en  los  frotis  de  
Palabras  clave:
sangre,  todos  los  perros  (10/10)  se  infectaron  con  Ehrlichia  spp.  como  lo  demuestra  la  detección  por  PCR  anidada  
Perro
Ehrlichia  chaffeensis de  ADN  de  E.  chaffeensis  (7/10)  y  E.  ewingii  (10/10);  detección  por  PCR  en  tiempo  real  de  E.  chaffeensis  (0/10)  y  E.  
Ehrlichia  ewingii ewingii  (9/10);  seroconversión  en  dos  ELISA  diferentes  del  lado  del  paciente  (4/10  o  10/10);  seroconversión  en  IFA  a  
ehrlichiosis E.  canis  (10/10,  título  inverso  máximo  =  128–4096,  GMTMAX  =  548,7)  y  E.  chaffeensis  (10/10,  título  inverso  máximo  
garrapatas
=  1024–32  768,  GMTMAX  =  4096);  y  seroconversión  en  ELISA  específico  de  péptido  a  E.  chaffeensis  VLPT  (7/10)  y  
E.  ewingii  p28  (9/10).  La  rickettsemia  con  E.  chaffeensis  y  E.  ewingii,  determinada  por  PCR  anidada,  persistió  en  
perros  durante  un  promedio  de  3,2  o  30,5  días,  respectivamente.  No  se  detectó  Ehrlichia  canis  en  ningún  perro  por  
ningún  método,  y  ningún  perro  desarrolló  signos  de  enfermedad  clínica.  Nuestros  datos  sugieren  que  en  áreas  donde  
las  garrapatas  son  comunes,  los  perros  tienen  un  alto  riesgo  de  infección  con  Ehrlichia  spp.,  particularmente  E.  
ewingii  y  E.  chaffeensis,  y  pueden  servir  como  centinela  para  monitorear  la  presencia  de  estos  patógenos  zoonóticos.

2014  Elsevier  BV  Todos  los  derechos  reservados.

1.  Introducción perros  y  puede  inducir  poliartritis  (Little,  2010).  Otras  
Ehrlichia  spp.,  incluidas  E.  chaffeensis,  E.  muris  y  Panola  
Se  sabe  que  los  perros  son  susceptibles  a  la  infección   Mountain  Ehrlichia  (PME),  también  se  han  informado  en  
por  varias  Ehrlichia  spp.  Ehrlichia  canis,  el  agente  causal  de   perros  (Little  et  al.,  2010;  Hegarty  et  al.,  2012;  Qurollo  et  al.,  
la  ehrlichiosis  monocítica  canina,  se  considera  el  más   2013) .  Un  número  de  Ehrlichia  spp.  También  se  ha  
patógeno;  en  algunos  casos,  resultan  fatalidades.  Ehrlichia   informado  que  causa  enfermedades  en  humanos,  aunque  
ewingii  tiene  la  capacidad  de  establecer  infecciones  a  largo  plazo  ese   n considera  que  E.  chaffeensis  es  la  más  común  y  
clínicamente  grave  (Nicholson  et  al.,  2010).
Amblyomma  americanum  es  responsable  de  la  
*  Autor  correspondiente.  Teléfono:  +1  405  744  8523;  fax:  +1  405  744  5275. transmisión  de  E.  chaffeensis,  E.  ewingii  y  PME  (Anziani  et  
Dirección  de  correo  electrónico:  susan.little@okstate.edu  (SE  Pequeño).
al.,  1990;  Ewing  et  al.,  1995;  Yabsley  et  al.,  2008)  en  el
http://dx.doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.08.006  0378­1135/  2014  Elsevier  
BV  Todos  los  derechos  reservados.
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380 LA  Starkey  et  al. /  Microbiología  Veterinaria  173  (2014)  379–384

sureste  de  EE.  UU.,  mientras  que  Ixodes  scapularis  es  el  vector  propuesto   Los  portaobjetos  disponibles  se  usaron  para  analizar  los  sueros  en  busca  
para  agentes  similares  a  E.  muris  (Pritt  et  al.,  2011;  Hegarty  et  al.,  2012).  La   de  anticuerpos  reactivos  contra  E.  chaffeensis  y  E.  canis  (Fuller  Laboratories,  
infección  por  E.  canis  se  observa  con  mayor  frecuencia  en  perros  porque  el   Fullerton,  California)  con  IgG  anti­perro  de  cabra  marcada  con  FITC  (KPL,  
vector  principal,  Rhipicephalus  sanguineus,  prefiere  alimentarse  de   Gaithersburg,  Maryland)  para  detectar  el  anticuerpo  unido.
huéspedes  caninos  (Dantas­Torres,  2010). Cada  muestra  se  examinó  a  una  dilución  de  1/128;  Se  evaluaron  diluciones  
Sin  embargo,  también  se  ha  demostrado  que  Dermacentor  variabilis  es   seriadas  dobles  de  muestras  positivas  hasta  que  ya  no  se  observó  
capaz  de  transmitir  E.  canis  (Johnson  et  al.,  1998). fluorescencia,  y  la  dilución  más  alta  a  la  que  se  observó  fluorescencia  
Los  perros  del  sureste  de  los  Estados  Unidos  tienen  la  seroprevalencia   específica  se  informó  como  el  título  máximo.
más  alta  de  Ehrlichia  spp.  (Bowman  et  al.,  2009;  Beall  et  al.,  2012).  Las  
infecciones  son  particularmente  comunes  en  áreas  donde  las  poblaciones   El  análisis  de  péptidos  específicos  de  especie  se  utilizó  para  detectar  
de  A.  americanum  son  intensas.  Todos  los  vectores  de  garrapatas   anticuerpos  específicos  para  Anaplasma  spp.  (eenz1),  A.  phago  cytophilum  
mencionados  están  presentes  en  el  sureste  de  los  EE.  UU.  y  pueden  infestar   (p44  aph),  A.  platys  (p44  apl),  Borrelia  burgdor  feri  (C6),  Ehrlichia  spp.  (p30/
a  los  perros  en  esta  región  (Centros  para  el  Control  y  la  Prevención  de   p30­1),  E.  canis  (p16),  E.  chaffeensis  (VLPT)  y  E.  ewingii  (p28)  utilizando  un  
Enfermedades,  2014).  Para  determinar  el  riesgo  de  infección  por  ehrlichial   prototipo  SNAP  de  investigación  (Qurollo  et  al.,  2014).  Los  valores  de  
en  los  perros,  expusimos  a  los  perros  al  hábitat  de  las  garrapatas  a  través   péptidos  positivos  se  cuantificaron  usando  un  densígrafo  para  determinar  la  
de  caminatas  semanales  y  los  evaluamos  mediante  técnicas  de  diagnóstico   intensidad  del  punto  SNAP  (Chandrashekar  et  al.,  2010).
clínico,  serológico  y  molecular.
También  se  emplearon  ensayos  inmunoabsorbentes  ligados  a  enzimas  del  
2.  Materiales  y  métodos lado  del  paciente  disponibles  comercialmente  (SNAP1  4Dx1  y  SNAP1  4Dx  
Plus1,  IDEXX1  Laboratories,  Westbrook,  Maine)  para  la  detección  de  
2.1.  Participantes  del  estudio  y  preselección anticuerpos  contra  Ehrlichia  spp.,  Anaplasma  spp.  y  B.  burgdorferi.  El  suero  
se  analizó  de  acuerdo  con  las  instrucciones  del  fabricante.
El  Comité  Institucional  de  Cuidado  y  Uso  de  Animales  de  la  Universidad  
Estatal  de  Oklahoma  revisó  y  aprobó  todos  los  protocolos  con  animales  
antes  del  inicio  de  este  estudio.  Perros  Beagle  de  clase  A  (n  =  10),  de  cinco   2.5.  PCR  anidada  y  secuenciación
meses  de  edad,  se  analizaron  para  detectar  evidencia  de  infección  actual  o  
previa  con  E.  canis,  E.  chaffeensis  y  E.  ewingii  mediante  ELISA  del  lado  del   El  ADN  se  extrajo  de  200  ml  de  sangre  completa  anticoagulada  con  el  
paciente,  anticuerpos  de  fluorescencia  indirecta  (IFA),  análisis  de  péptidos   kit  de  minicentrifugación  genómica  de  sangre  IllustraTM  (GE  Healthcare  UK  
específicos  de  especie  y  reacción  en  cadena  de  polimerasa  anidada  y  en   Limited,  Buckinghamshire,  Reino  Unido)  de  acuerdo  con  las  instrucciones  
tiempo  real  como  se  describe  a  continuación  antes  de  la  inclusión  en  el   del  fabricante  de  cada  perro  en  cada  fecha  de  recolección,  y  el  ácido  nucleico  
estudio.  Además,  los  perros  fueron  examinados  para  detectar  infecciones   se  eluyó  en  un  volumen  final  de  200  ml.  Se  utilizaron  áreas  de  laboratorio  
por  Anaplasma  spp.  y  Borrelia  burgdorferi  (SNAP1  4Dx1),  así  como  Rickettsia   dedicadas  y  separadas  para  la  extracción  de  ADN,  la  amplificación  primaria,  
spp.  (IFA)  como  se  describió  previamente  (Barrett  et  al.,  2014). la  amplificación  secundaria  y  los  análisis  de  productos,  y  se  incluyeron  
controles  negativos  (agua)  en  cada  extracción  y  amplificación.  Los  
fragmentos  de  ADNr  16S  específicos  de  la  especie  se  amplificaron  mediante  
2.2.  Exposición  a  garrapatas  y  seguimiento  clínico  de  enfermedades PCR  anidada  utilizando  los  cebadores  ECC/ECB  seguidos  de  ECA/HE3  (E.  
canis),  HE1/HE3  (E.  chaffeensis)  y  EE72/HE3  (E.  ewingii)  como  se  describió  
Para  asegurar  la  exposición  a  las  garrapatas,  se  paseó  a  los  perros  una   previamente  ( Little  et  al.,  2010).
vez  por  semana  durante  siete  semanas  en  mayo  y  junio  de  2011,  en  una  
estación  de  campo  en  el  condado  de  Payne,  Oklahoma,  como  se  describió   Comenzando  el  día  51  del  estudio  (d51)  y  trabajando  tanto  hacia  el  d0  como  
anteriormente  (Barrett  et  al.,  2014) .  Se  permitió  que  las  garrapatas   el  d121,  se  analizaron  muestras  consecutivas  hasta  que  los  10  perros  dieron  
adquiridas  se  alimentaran  hasta  la  saciedad.  Después  del  último  paseo,  se   negativo  en  dos  días  de  muestreo  consecutivos  (1  semana).  Se  usó  
permitió  que  las  garrapatas  se  alimentaran  durante  una  semana  más  y  luego   electroforesis  en  gel  de  agarosa  estándar  para  confirmar  la  presencia  de  
se  retiraron  todas  las  garrapatas  de  cada  perro.  Los  perros  fueron   amplicones,  y  los  amplicones  representativos  se  purificaron  y  concentraron  
monitoreados  diariamente  durante  todo  el  período  de  exposición,  y  durante   de  acuerdo  con  las  instrucciones  del  fabricante  utilizando  un  kit  disponible  
dos  meses  después  de  la  exposición  final  a  la  garrapata,  en  busca  de  signos   comercialmente  (Wizard  PCR  Preps,  Promega  Corporation,  Madison,  WI)  y  
clínicos  de  infección,  incluyendo  temperatura  rectal,  nivel  de  actividad,  mialgia  y  secreción  
luego  oscular.
e  enviaron  para  su  secuenciación  en  Molecular  Core.  Instalación  en  
la  Universidad  Estatal  de  Oklahoma  (Stillwater,  Oklahoma).  Las  secuencias  
2.3.  Coleccion  de  muestra resultantes  se  compararon  con  las  disponibles  en  la  base  de  datos  del  
Centro  Nacional  de  Información  Biotecnológica,  incluidas  E.  chaffeensis  
Antes  de  la  exposición  a  las  garrapatas  y  dos  veces  por  semana  a  lo   (NR_074500)  y  E.  ewingii  (NR_044747).
largo  del  estudio  de  121  días,  se  recolectó  sangre  completa  y  suero  mediante  
punción  venosa  yugular  como  se  describió  anteriormente  (Barrett  et  al.,  
2014).  Se  realizaron  frotis  de  sangre  semanalmente.  El  suero  y  la  sangre  
completa  se  almacenaron  a  20  8C  hasta  que  se  realizó  la  serología  o  la  PCR. 2.6.  PCR  en  tiempo  real

Para  validar  externamente  los  resultados  de  PCR  anidados,  Ehrlichia  
2.4.  Serología spp.  La  PCR  se  realizó  en  una  instalación  separada  utilizando  un  enfoque  
diferente.  La  plantilla  de  ADN  se  extrajo  de  200  ml  de  sangre  entera  canina  
Los  anticuerpos  contra  Ehrlichia  spp.  fueron  detectados  usando  pruebas   utilizando  el  kit  de  preparación  de  plantillas  de  PCR  de  alta  pureza  
IFA  como  se  describió  previamente  (Ristic  et  al.,  1972).  Comercialmente (RocheApplied  Science,  Indianápolis,  Indiana)
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LA  Starkey  et  al. /  Microbiología  Veterinaria  173  (2014)  379–384 381

según  las  instrucciones  del  fabricante.  Se  obtuvo  un  volumen  final  de  200   A.  americanum,  sin  embargo,  también  se  observaron  cantidades  bajas  de  
ml  de  ADN  eluido  para  cada  muestra.  Todas  las  muestras  de  ADN  se   D.  variabilis  y  A.  maculatum.  Nunca  se  observaron  signos  clínicos  de  
almacenaron  a  20  8C  hasta  la  prueba. enfermedad  en  ningún  perro  (Barrett  et  al.,  2014).
Se  utilizaron  ensayos  de  sonda  de  hibridación  de  PCR  en  tiempo  real   Los  10  perros  desarrollaron  títulos  de  anticuerpos  en  IFA  tanto  para  E.  
que  detectan  el  gen  de  la  disulfuro  oxidorreductasa  de  E.  ewingii  (DQ902688)   canis  como  para  E.  chaffeensis  (Tabla  1).  Los  títulos  inversos  máximos  
y  E.  chaffeensis  (AF403711)  para  analizar  el  ADN  de  la  muestra.  Los   oscilaron  entre  128  y  4096  para  E.  canis  y  entre  1024  y  32  768  para  E.  
ensayos  de  PCR  en  tiempo  real  se  realizaron  con  el  instrumento  LightCycler   chaffeensis.  La  media  geométrica  de  los  títulos  inversos  máximos  
480  (Roche  Applied  Science,  Indianápolis,  Indiana).  La  PCR  se  llevó  a  cabo   (GMTMAX)  para  E.  canis  y  E.  chaffeensis  fueron  548,7  y  4096,  
en  un  volumen  de  reacción  total  de  20  ml  que  contenía  LightCycler  480   respectivamente  (Fig.  1).
Genotyping  Master  mix  (Roche  Applied  Science),  cebadores  y  sondas   El  análisis  de  péptidos  específicos  de  la  especie  utilizando  ensayos  
específicos  de  especie  y  5  ml  de  ADN  molde  (Ndip  et  al.,  2007).  Los   basados  en  pocillos  de  microtitulación  reveló  anticuerpos  contra  E.  
parámetros  de  ciclado  para  la  PCR  en  tiempo  real  consistieron  en  un  ciclo   chaffeensis  (VLPT)  en  7/10  perros  y  E.  ewingii  (p28)  en  9/10  perros.
de  desnaturalización  de  95  8C  durante  10  min,  seguido  de  un  perfil  de   Los  valores  positivos  de  péptido  oscilaron  entre  0,03  y  0,45  para  E.  
amplificación  de  55  ciclos  (95  8C  durante  20  s,  60  8C  durante  30  s  con  una   chaffeensis  y  entre  0,04  y  0,85  para  E.  ewingii  (Fig.  1).  Anticuerpos  contra  
sola  adquisición  de  datos,  72  8C  durante  20  s) ,  un  perfil  de  curva  de  fusión   E.  canis  (p16),  B.  burgdorferi  (C6)  o  Anaplasma  spp.  (eenz1,  p44  aph,  p44  
(95  8C  por  1  min,  45  8C  por  1  min  y  80  8C  continuo  con  una  rampa  de  0.14   apl)  no  se  detectaron  (Tabla  1).  En  d121,  4/10  perros  tenían  anticuerpos  
8C  por  segundo  y  4  adquisiciones  de  datos  por  8C)  y  un  ciclo  de  enfriamiento   reactivos  a  Ehrlichia  spp.  (p30/30­1)  usando  el  ELISA  del  lado  del  paciente  
de  40  8C  por  30  s.  En  cada  ejecución,  se  analizaron  como  controles   SNAP1  4Dx1,  y  7/10  tenían  anticuerpos  reactivos  a  Ehrlichia  spp.  (p30/30­1  
positivos  105  y  102  copias  de  plásmidos  recombinantes  que  contenían  un   y  p28)  utilizando  SNAP1  4Dx1  Plus  (IDEXX  Laboratories  Inc.,  Westbrook,  
inserto  de  la  diana  específica  de  la  especie.  Se  probó  agua  de  grado  PCR   Maine).  Los  tres  perros  que  dieron  negativo  en  d121  en  SNAP1  4Dx1  Plus  
(Roche  Applied  Science,  Indianápolis,  Indiana)  como  control  negativo.  Se   dieron  positivo  en  d61  o  d93;  en  total,  10/10  perros  desarrollaron  anticuerpos  
determinó  que  la  sensibilidad  analítica  era  de  10  copias  del  gen  usando  los   reactivos  a  Ehrlichia  spp.  en  SNAP1  4Dx1  Plus  durante  el  estudio.
plásmidos  específicos  del  ensayo.

En  la  PCR  anidada,  7/10  perros  dieron  positivo  en  al  menos  una  fecha  
de  estudio  para  la  presencia  de  E.  chaffeensis  (Tabla  2a),  10/10  para  E.  
2.7.  Conteos  sanguíneos  completos  y  frotis  de  sangre. ewingii  (Tabla  2b)  y  0/10  para  E.  canis  (datos  no  mostrada).  Secuencias  de  
amplicones  representativos  alineados  con  un  100  %  de  identidad  con  los  
Se  envió  sangre  entera  para  hemograma  completo  al  servicio  de   de  E.  chaffeensis  (NR_074500)  o  E.  ewingii  (NR_044747).  La  rickettsemia  
laboratorio  de  patología  clínica,  Universidad  Estatal  de  Oklahoma,  de  cada   con  E.  chaffeensis  y  E.  ewingii  se  detectó  de  forma  intermitente  en  la  sangre  
perro  en  los  días  16,  44,  58,  72  y  86.  Se  secaron  frotis  de  sangre  finos  al   mediante  PCR  anidada  durante  un  promedio  de  3,2  y  30,5  días  en  total,  
aire,  se  fijaron  en  metanol  y  se  tiñeron  con  el  ensayo  de  Wright.  Giemsa,  y   respectivamente.  La  PCR  en  tiempo  real  detectó  ADN  de  E.  chaffeensis  en  
luego  fue  examinado  microscópicamente  en  busca  de  mórulas  dentro  de   0/10  y  ADN  de  E.  ewingii  en  9/10  perros  a  lo  largo  del  estudio  (Tablas  2a  y  
los  leucocitos  por  un  patólogo  clínico  internado  (JHM). 2b).

Como  se  informó  anteriormente  (Barrett  et  al.,  2014),  no  se  observaron  
3.  Resultados cambios  significativos  en  ningún  CBC.  Se  encontró  una  sola  mórula  en  un  
neutrófilo  de  un  perro  el  día  61  y  en  dos  neutrófilos  de  un  segundo  perro  el  
Todos  los  perros  utilizados  en  este  estudio  fueron  seronegativos  para   día  72.
anticuerpos  reactivos  a  Anaplasma  spp.,  Borrelia  burgdorferi  y  Ehrlichia  
spp.  en  todos  los  métodos  utilizados,  así  como  PCR  negativa  para  Ehrlichia   4.  Discusión
spp.,  antes  de  la  exposición  natural  a  las  garrapatas.  Como  se  informó  
anteriormente,  los  perros  se  infestaron  con  garrapatas  en  cada  fecha  de   El  diagnóstico  de  infecciones  transmitidas  por  garrapatas  es  cada  vez  
exposición  para  una  infestación  total  de  57  a  108  garrapatas  por  perro   más  común  en  los  Estados  Unidos,  tanto  en  animales  como  en  personas  
(Barrett  et  al.,  2014).  La  mayoría  de  las  garrapatas  presentes  eran (Nicholson  et  al.,  2010).  Nuestros  datos  revelan  que  el  riesgo  de

Tabla  1  
Anticuerpos  detectados  contra  Ehrlichia  canis,  E.  chaffeensis,  E.  ewingii,  Ehrlichia  spp.,  Anaplasma  platys,  A.  phagocytophilum  y  Borrelia  burgdorferi  en  10  perros  naturalmente  
infestados  con  garrapatas.

Organismo 18  vectores  de  garrapatas analito Meses  después  de  la  infestación  inicial  de  garrapatasa

0 1 2 3 4

E.  canis   R.  sanguineus   IFA 0/10   1/10   8/10   8/10   8/10  

E.  chaffeensis   A.  americanum   IFA 0/10   5/10   9/10   9/10   8/10  
Ehrlichia  spp. Varios p30/p30­1   0/10   0/10   6/10   6/10   7/10  
E.  canis   R.  sanguineus   p16 0/10   0/10   0/10   0/10   0/10  
E.  chaffeensis   A.  americanum   VLPT   0/10   1/10   5/10   6/10   2/10  
E.  ewingii   A.  americanum   p28 0/10   0/10   6/10   8/10   8/10  
B.  burgdorferi   I.  scapularis   C6   0/10   0/10   0/10   0/10   0/10  
Anaplasma  spp. Varios  I.   eenz1   0/10   0/10   0/10   0/10   0/10  
A.  phagocytophilum   scapularis  R.   p44  aph   0/10   0/10   0/10   0/10   0/10  
A.  platys sanguineus p44  apl 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
a
El  suero  se  analizó  mediante  IFA  los  días  de  estudio  30,  61,  93  y  121  y  mediante  ELISA  utilizando  péptidos  específicos  los  días  de  estudio  33,  65,  89  y  117.
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382 LA  Starkey  et  al. /  Microbiología  Veterinaria  173  (2014)  379–384

Fig.  1.  Títulos  medios  geométricos  de  Ehrlichia  chaffeensis  y  Ehrlichia  canis  en  IFA  (líneas  con  errores  estándar)  y  valores  peptídicos  medios  aritméticos  de  Ehrlichia  ewingii/
p28  y  E.  chaffeensis/VLPT  (barras  con  errores  estándar)  en  perros  naturalmente  infestados  con  garrapatas.  No  se  detectaron  anticuerpos  contra  E.  canis/p16  en  ningún  perro.

la  infección  es  alta  incluso  con  un  período  de  tiempo  relativamente   Después  de  la  exposición  natural  a  las  garrapatas  en  el  presente  
limitado  de  exposición  a  las  garrapatas.  Según  lo  evidenciado  por   estudio,  se  respalda  a  los  perros  como  el  huésped  reservorio  propuesto  
PCR  y  datos  serológicos,  todos  los  perros  en  este  estudio  se  infectaron   para  E.  ewingii  (Yabsley  et  al.,  2011),  aunque  se  necesitan  más  
con  Ehrlichia  sp(p).,  aunque  la  infección  con  E.  ewingii  fue  más  común   estudios  para  confirmar  esa  interpretación.
que  la  infección  con  E.  chaffeensis.  Algunos  perros  siguieron  siendo   Los  resultados  de  los  diversos  ensayos  de  diagnóstico  utilizados  
positivos  en  la  PCR  de  forma  intermitente  durante  todo  el  estudio,  con   en  estos  perros  coincidieron  en  gran  medida  entre  sí,  aunque  se  
4/10  perros  todavía  positivos  en  la  PCR  para  E.  ewingii  el  día  121,   detectaron  anticuerpos  no  específicos  en  IFA  antes  de  los  ensayos  
más  de  dos  meses  después  de  la  exposición  final  a  las  garrapatas,  lo   basados  en  péptidos  específicos  (Fig.  1),  y  los  ensayos  basados  en  
que  indica  que  se  había  establecido  una  infección  persistente.  Trabajos   péptidos  pueden  detectar  anticuerpos  contra  Ehrlichia  spp.  que  aún  
anteriores  han  demostrado  que  los  perros  pueden  infectarse   no  han  sido  descritos  (Little,  2010).  Además,  se  observaron  resultados  
persistentemente  con  E.  ewingii  después  de  la  inoculación  intravenosa   de  PCR  discordantes  ocasionales  que  podrían  deberse  a  los  diferentes  
(Yabsley  et  al.,  2011).  El  hallazgo  de  rickettsemia  persistente  por  E.  ewingii objetivos  utilizados,  la  sensibilidad  relativa  de  los

Tabla  2a  
Detección  por  PCR  anidada  (y  en  tiempo  real)  de  Ehrlichia  chaffeensis  en  10  perros  infestados  de  forma  natural  por  garrapatas.

Día  de  estudio número  de  perro

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

13  
16   () () () () () () () () () ()
19  
23 +
26
30   +
33   () () () () () () +  () () () +  ()
37   +
40   + + +
44   +
47 + + +
51 () +  () () () () () +  () () () ()
55   +
59  
61   +
65   () () () () () () () +  () () ()
67   + +
72
75
totala 0 dieciséis 0 1 1 0 8 3 1 2
a
Número  total  de  días  consecutivos,  inclusive,  en  los  que  se  detectó  E.  chaffeensis  por  PCR.
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LA  Starkey  et  al. /  Microbiología  Veterinaria  173  (2014)  379–384 383

Tabla  2b  
Detección  por  PCR  anidada  (y  en  tiempo  real)  de  Ehrlichia  ewingii  en  10  perros  infestados  de  forma  natural  por  garrapatas.

Día  de  estudio número  de  perro

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

30
33   () () () () () () () () () ()
37   +
40   +
44   +
47   + + +
51 () +  (+)   +  (+)   () () () +  ()  + +  (+)   +  (+)   +  ()  +
55 + + + + +
59   + + + + + + + +
61   + + + + + + + +
65   +  (+) +  () () () () +  (+) +  (+) +  (+) +  (+) +  (+)
67   + + + + + +
72   + + + + + +
75 + + + + +
79 (+) () () +  (+) () +  (+) () +  () (+) ()
82 + + +
86 + + +
89   () () () +  (+) () +  (+) () +  (+) () (+)
93   + +
96   + +
100   + + +
103   +  (+) +(+) () () () +  () +  (+) (+) () +  (+)
107 + + + + +
110 + + + +
114   + + + +
117   () +  (+) () () () +  () +  (+) (+) () +  (+)
121 + + + +
totala 23 34 14 17 1 62 31 53 21 49
a
Número  total  de  días  consecutivos,  inclusive,  en  los  que  se  detectó  E.  ewingii  mediante  PCR  anidada.

diferentes  ensayos,  menor  cantidad  de  diana  presente  o  pérdida  de   la  gravedad  no  siempre  está  clara  (Kordick  et  al.,  1999;  Little  et  al.,  
ácido  nucleico  detectable  durante  el  almacenamiento  de  las  muestras   2010).
(Allison  y  Little,  2013).  Cuando  se  consideran  en  conjunto,  los  datos   Los  resultados  del  presente  estudio  muestran  que  los  perros  son  
del  presente  estudio  respaldan  el  uso  de  múltiples  modalidades  de   un  indicador  sensible  de  la  presencia  de  infecciones  por  Ehrlichia  en  
diagnóstico  para  identificar  la  infección,  particularmente  al  comienzo   garrapatas;  los  diez  perros  expuestos  naturalmente  a  las  garrapatas  
de  la  infección,  cuando  es  más  probable  que  se  desarrolle  la   se  infectaron  con  al  menos  una  especie  de  Ehrlichia  en  una  sola  
enfermedad  (Little,  2010).  Sin  embargo,  identificar  la  modalidad  de   temporada  de  transmisión  (Tabla  1).  Los  estudios  de  seroprevalencia  
prueba  más  confiable  para  detectar  una  infección  temprana  requiere   canina  han  demostrado  que  los  anticuerpos  contra  Ehrlichia  spp.  
una  mayor  exploración. son  más  comunes  en  perros  del  sureste  de  los  Estados  Unidos,  con  
Aunque  se  demostró  que  todos  los  perros  estaban  infectados   algunas  áreas  identificadas  donde  más  del  10%  de  los  perros  dan  
con  una  o  más  Ehrlichia  spp.,  ninguno  de  los  perros  mostró  signos   positivo  (Murphy  et  al.,  1998;  Bowman  et  al.,  2009).
clínicos  de  enfermedad,  ni  hubo  anomalías  en  los  análisis  de  sangre   En  áreas  hiperendémicas  de  Arkansas  y  Missouri,  la  prevalencia  
indicativas  de  infección  con  una  Ehrlichia  spp. puede  ser  aún  mayor;  hasta  el  36,9  %  de  los  perros  tenían  
Esta  observación  refleja  lo  que  comúnmente  ven  los  veterinarios  en   anticuerpos  contra  E.  chaffeensis  y  el  21,4  %  contra  E.  ewingii  (Beall  
ejercicio:  anticuerpos  contra  una  o  más  Ehrlichia  spp.  se  detectan   et  al.,  2012).  Nuestros  datos  sugieren  que  los  estudios  a  gran  escala  
comúnmente  en  perros  en  los  que  la  enfermedad  clínica  está  ausente   que  utilizan  serología  canina  pueden  proporcionar  información  
o  es  inaparente  (Little  et  al.,  2010). valiosa  sobre  el  riesgo  de  ehrlichiosis  humana,  similar  al  éxito  
En  comparación  con  E.  canis,  se  cree  que  la  infección  por  E.   observado  con  este  enfoque  para  comprender  el  riesgo  de  otros  
chaffeensis  es  menos  patógena  en  los  perros  (Little,  2010),  y  la   agentes  de  enfermedades  transmitidas  por  garrapatas,  como  Borrelia  
enfermedad  por  E.  ewingii  varía,  y  solo  una  parte  de  los  perros   burgdorferi  (Duncan  et  al. ,  2005).
infectados  desarrollan  la  enfermedad  clínica  (Anziani  et  al.,  1990). ).  
Curiosamente,  los  perros  del  presente  estudio  también  estaban  
infectados  con  Rickettsia  spp.,  aunque  de  patogenicidad  desconocida   Conflicto  de  intereses
(Barrett  et  al.,  2014).  A  pesar  de  esta  coinfección,  la  enfermedad  
no  era  evidente.  Trabajos  anteriores  han  demostrado  que  la   En  los  últimos  cinco  años,  SL  y  JM  han  recibido  honorarios  y/o  
coinfección  con  E.  canis  y  A.  platys  produce  una  enfermedad  clínica   apoyo  para  la  investigación  de  IDEXX  Laboratories,  Inc.,  una  
más  grave  en  perros  que  cualquiera  de  los  dos  agentes  por  separado   empresa  que  fabrica  algunos  de  los  ensayos  utilizados  en  esta  
(Gaunt  et  al.,  2010).  Se  ha  informado  de  coinfección  con  múltiples   investigación.  El  apoyo  salarial  para  LS  se  proporciona  a  través  de  
agentes  de  enfermedades  transmitidas  por  garrapatas  en  perros   fondos  de  Bayer  Animal  Health,  un  fabricante  de  productos  para  el  
infectados  naturalmente,  aunque  la  influencia  de  la  coinfección  en  la  enfermedad
control  de  garrapatas  para  mascotas.  Además,  RC,  BS,  PT,  BT  y  MB  son
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384 LA  Starkey  et  al. /  Microbiología  Veterinaria  173  (2014)  379–384

venado  cola  por  Amblyomma  americanum  (Acari:  Ixodidae).  J.Med.
empleados  de  IDEXX  Laboratories,  Inc.  Los  otros  autores  no  tienen   Entomol.  32,  368–374.
conflictos  de  intereses  que  informar. Gaunt,  S.,  Beall,  M.,  Stillman,  B.,  Lorentzen,  L.,  Diniz,  P.,  Chandrashekar,  R.,  
Breitschwerdt,  E.,  2010.  Infección  experimental  y  coinfección  de  perros  con  
Anaplasma  platys  y  Ehrlichia  canis:  hallazgos  hematológicos,  serológicos  y  
Agradecimientos moleculares.  parásito.  Vectores  3,  33.
Hegarty,  BC,  Maggi,  RG,  Koskinen,  P.,  Beall,  MJ,  Eberts,  M.,  Chandra  shekar,  R.,  
Breitschwerdt,  EB,  2012.  Infección  por  Ehrlichia  muris  en  un  perro  de  Minnesota.  J.  
Bayer  Animal  Health  proporcionó  los  fondos  para  respaldar  la  
Vet.  Interno.  Medicina.  26,  1217–1220.
recolección  de  las  muestras  utilizadas  en  esta  investigación.  Dr. Johnson,  EM,  Ewing,  SA,  Barker,  RW,  Fox,  JC,  Crow,  DW,  Kocan,  KM,  1998.  Transmisión  
Starkey  es  Residente  de  Bayer  en  Parasitología  Veterinaria  en  el   experimental  de  Ehrlichia  canis  (Rickettsiales:  Ehrllichieae)  por  Dermacentor  
variabilis  (Acari:  Ixodidae).  Veterinario.  Pará  sitol.  74,  277–288.
Centro  Nacional  de  Parasitología  Veterinaria  de  la  Universidad  
Estatal  de  Oklahoma,  que  proporciona  su  salario.  Muchas  gracias   Kordick,  SK,  Breitschwerdt,  EB,  Hegarty,  BC,  Southwick,  KL,  Colitz,  CM,  Hancock,  SI,  
al  personal  técnico  de  IDEXX  Laboratories,  Inc.  por  su  asistencia   Bradley,  JM,  Rumbough,  R.,  McPherson,  JT,  MacCormack,  JN,  1999.  Coinfección  
con  las  pruebas  serológicas  y  moleculares,  y  a  los  recursos  de   con  patología  múltiple  transmitida  por  garrapatas  gens  en  un  criadero  de  Walker  
Hound  en  Carolina  del  Norte.  J.  Clin.  Microbiol.  37,  2631–2638.
animales  de  laboratorio  de  la  Universidad  Estatal  de  Oklahoma  por  
el  apoyo  y  cuidado  de  los  animales  involucrados  en  este  estudio. Little,  SE,  2010.  Ehrlichiosis  y  anaplasmosis  en  perros  y  gatos.  Veterinario.  clin.
am  del  norte  Pequeño  Animado  Practica  40,  1121–1140.
Referencias Little,  SE,  O'Connor,  TP,  Hempstead,  J.,  Saucier,  J.,  Reichard,  MV,  Mein  koth,  K.,  
Meinkoth,  JH,  Andrews,  B.,  Ullom,  S.,  Ewing,  SA,  Chandra  shekar ,  R.,  2010.  
Allison,  RW,  Little,  SE,  2013.  Diagnóstico  de  enfermedades  rickettsiales  en  perros  y Infección  por  Ehrlichia  ewingii  y  tasas  de  exposición  en  perros  del  centro­sur  de  los  
gatos  Veterinario.  clin.  Patol.  42,  127–144. Estados  Unidos.  Veterinario.  Parasitol.  172,  355–360.
Anziani,  DS,  Ewing,  SA,  Barker,  RW,  1990.  Transmisión  experimental  de  una  forma   Murphy,  GL,  Ewing,  SA,  Whitworth,  LC,  Fox,  JC,  Kocan,  AA,  1998.  Estudio  molecular  y  
granulocítica  de  la  tribu  Ehrlichieae  por  Dermacentor  variabilis  y  Amblyomma   serológico  de  Ehrlichia  canis,  E.  chaffeensis  y  E.  ewingii  en  perros  y  garrapatas  de  
americanum  a  perros.  Soy.  J.  Vet.  Res.  51,  929–931. Oklahoma.  Veterinario.  Parasitol.  79,  325–339.
Ndip,  LM,  Ndip,  RN,  Ndive,  VE,  Awuh,  JA,  Walker,  DH,  McBride,  JW,  2007.  Especies  de  
Barrett,  A.,  Little,  SE,  Shaw,  E.,  2014.  Infección  por  Rickettsia  amblyommii  y  R.   Ehrlichia  en  garrapatas  Rhipicephalus  sanguineus  en  Camerún.
montanensis  en  perros  después  de  la  exposición  natural  a  las  garrapatas. Enfermedades  zoonóticas  transmitidas  por  vectores.  7,  221–227.
Enfermedades  zoonóticas  transmitidas  por  vectores.  14,  20–25. Nicholson,  WL,  Allen,  KE,  McQuiston,  JH,  Breitschwerdt,  EB,  Little,  SE,  2010.  El  creciente  
Beall,  MJ,  Alleman,  AR,  Breitschwerdt,  EB,  Cohn,  LA,  Couto,  CG,  Dryden,  MW,  Guptill,   reconocimiento  de  patógenos  rickettsiales  en  perros  y  personas.  Tendencias  
LC,  Iazbik,  C.,  Kania,  SA,  Lathan,  P.,  Little,  SE,  Roy,  A. ,  Sayler,  KA,  Stillman,  BA,   Parasitol.  26,  205–212.
Welles,  EG,  Wolfson,  W.,  Yabsley,  MJ,  2012.  Seroprevalencia  de  Ehrlichia  canis,   Pritt,  BS,  Sloan,  LM,  Johnson,  DK,  Munderloh,  UG,  Paskewitz,  SM,  McElroy,  KM,  
Ehrlichia  chaf  feensis  y  Ehrlichia  ewingii  en  perros  en  América  del  Norte.  parásito.   McFadden,  JD,  Binnicker,  MJ,  Neitzel,  DF,  Liu,  G.,  Nicholson,  WL,  Nelson,  CM,  
Vectores  5,  29. Franson ,  JJ,  Martin,  SA,  Cunningham,  SA,  Steward,  CR,  Bogumill,  K.,  Bjorgaard,  
ME,  Davis,  JP,  McQuiston,  JH,  Warshauer,  DM,  Wilhelm,  MP,  Patel,  R.,  Trivedi,  VA,  
Bowman,  D.,  Little,  SE,  Lorentzen,  L.,  Shields,  J.,  Sullivan,  MP,  Carlin,  EP,  2009.   Eremeeva ,  ME,  2011.  Aparición  de  una  nueva  especie  patógena  de  Ehrlichia,  
Prevalencia  y  distribución  geográfica  de  Dirofilaria  immitis,  Borrelia  burgdorferi,   Wisconsin  y  Minnesota,  2009.  N.  Engl.  J.Med.  365,  422–429.
Ehrlichia  canis  y  Anaplasma  phagocytophilum  en  perros  en  el  Estados  Unidos:  
resultados  de  una  encuesta  serológica  nacional  basada  en  clínicas .  Veterinario.   Qurollo,  BA,  Davenport,  AC,  Sherbert,  BM,  Grindem,  CB,  Birkenheuer,  AJ,  Breitschwerdt,  
Parasitol.  160,  138–148. EB,  2013.  Infección  con  Panola  Mountain  Ehr  lichia  sp.  en  un  perro  con  linfocitos  
Centros  para  el  Control  y  la  Prevención  de  Enfermedades,  2014.  http://www.cdc.gov/ atípicos  y  expansión  de  células  T  clonales.  J.  Vet.  Interno.  Medicina.  27,  1251–
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Chandrashekar,  R.,  Mainville,  CA,  Beall,  MJ,  O'Connor,  T.,  Eberts,  MD,  Alleman,  AR,   Qurollo,  BA,  Chandrashekar,  R.,  Hegarty,  BC,  Beall,  MJ,  Stillman,  B.,  Liu,  J.,  Thatcher,  
Gaunt,  SD,  Breitschwerdt,  EB,  2010.  Rendimiento  de  un  ELISA  en  clínica  disponible   B.,  Pultorak,  B.,  Comyn,  A.,  Bretischwerdt,  EB,  2014.  Una  descripción  análisis  de  las  
comercialmente  para  la  detección  de  anticuerpos  contra  Anaplasma  phagocytophilum,   manifestaciones  clínicas  en  perros  con  co­infecciones  y  co­exposiciones  a  patógenos  
Ehrlichia  canis  y  Borrelia  burg  dorferi  y  antígeno  de  Dirofilaria  immitis  en  perros.   transmitidos  por  garrapatas.  J.  Vet.  Interno.  Medicina.  28,  976–1134.
Soy.  J.  Vet.  Res.  71,  1443–1450.
Ristic,  M.,  Huxsoll,  DL,  Weisiger,  RM,  Hildebrandt,  PK,  Nyindo,  MBA,  1972.  Diagnóstico  
Dantas­Torres,  F.,  2010.  Biología  y  ecología  de  la  garrapata  marrón  del  perro, serológico  de  pancitopenia  canina  tropical  por  inmunofluorescencia  indirecta.  
Rhipicephalus  sanguineus.  parásito.  Vectores  3,  26. Infectar.  inmune  6,  226–231.
Duncan,  AW,  Correa,  MT,  Levine,  JF,  Breitschwerdt,  EB,  2005.  El  perro  como  centinela   Yabsley,  MJ,  Adams,  DS,  O'Connor,  TP,  Chandrashekar,  R.,  Little,  SE,  2011.  Infecciones  
de  la  infección  humana:  prevalencia  de  anticuerpos  C6  contra  Borrelia  burgdorferi   primarias  y  secundarias  experimentales  de  perros  domésticos  con  Ehrlichia  ewingii.  
en  perros  de  los  estados  del  sudeste  y  del  Atlántico  medio.  Enfermedades  zoonóticas   Veterinario.  Microbiol.  150,  315–321.
transmitidas  por  vectores .  5,  101–109. Yabsley,  MJ,  Loftis,  AD,  Little,  SE,  2008.  Infección  natural  y  experimental  del  venado  cola  
Ewing,  SA,  Dawson,  JE,  Kocan,  AA,  Barker,  RW,  Warner,  CK,  Panciera,  RJ,  Fox,  JC,   blanca  (Odocoileus  virginianus)  de  los  Estados  Unidos  con  una  Ehrlichia  sp.  
Kocan,  KM,  Blouin,  EF,  1995.  Transmisión  experimental  de  Ehrlichia  chaffeensis   estrechamente  relacionado  con  Ehrlichia  ruminantium.  j
(Rickettsiales:  Ehrlichieae)  entre  blanco Salvaje  Dis.  44,  381–387.