Qf-Gallardo M PDF

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
BÚSQUEDA DEL REGULÓN “QUORUM SENSING” DE

Acidithiobacillus ferrooxidans MEDIANTE ESTUDIOS
PROTEÓMICOS Y DETERMINACIÓN DEL EFECTO DEL FE2+ SOBRE
LAS AHLs PRODUCIDAS POR LA BACTERIA
Memoria para optar al título profesional de Bioquímica
María José Gallardo Nelson
PATROCINANTE DIRECTOR
Mercedes Zaldívar S.R. Dr. Nicolas Guiliani G.
Dpto. de Bioquímica y Biología Dpto. de Biología
Molecular. Facultad de Ciencias, Universidad de Chile.
Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas, Universidad de Chile.
Santiago, Chile
2009
Agradecimientos…
ÍNDICE DE CONTENIDOS
1 RESUMEN ............................................................................................................ x
2 ABSTRACT......................................................................................................... xii
3 INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
3.1 V. fischeri y el primer sistema de quorum sensing (QS) descrito ....................... 2
3.2 Clasificación de los sistemas de QS .................................................................. 4
3.3 QS mediado por N-acil homoserina lactona (AHL) o autoinductor del
tipo 1 (AI-1) ............................................................................................................... 4
3.3.1 Sintasas de AHL y familia de proteínas I .................................................... 5
3.3.2 Estructura, transporte y acumulación de AHLs ........................................... 5
3.3.3 Familia de proteínas R................................................................................ 7
3.4 Detección de AHLs mediante biosensores ........................................................ 8
3.5 Interferencia de los sistemas de QS .................................................................. 9
3.6 Regulón QS y estudios de proteómica............................................................. 10
3.7 QS en Acidithiobacillus ferrooxidans y propuesta de investigación .................. 12
4 HIPÓTESIS......................................................................................................... 15
4.1 Objetivos ......................................................................................................... 15
4.1.1 Objetivo General....................................................................................... 15
4.1.2 Objetivos específicos................................................................................ 15
5 MÉTODOS.......................................................................................................... 16
5.1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo .................................................... 16
ii
5.2 Monitoreo del crecimiento celular .................................................................... 16
5.3 Experimentos de identificación de acil homoserina lactonas (AHLs)................ 17
5.3.1 Extracciones orgánicas desde sobrenadantes de cultivos bacterianos..... 17
5.3.2 Separación de la extracción orgánica por Cromatografía en
Capa Fina (CCF) ................................................................................................. 17
5.3.3 Revelado con biosensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) ........................... 17
5.4 Técnicas de proteómica................................................................................... 18
5.4.1 Preparación de extractos proteicos totales de A. ferrooxidans
para SDS-PAGE.................................................................................................. 18
5.4.2 Determinación cuantitativa de las proteínas ............................................. 18
5.4.3 Electroforesis monodimensional en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturantes ................................................................................... 19
5.4.4 Electroforesis bidimensional (2D-PAGE) .................................................. 19
5.5 Cuantificación de Hierro .................................................................................. 20
5.5.1 Análisis cuantitativos ................................................................................ 20
5.5.1.1 Absorción atómica ................................................................................ 20
5.5.1.2 Método de la fenantrolina ..................................................................... 21
5.5.2 Análisis cualitativos .................................................................................. 21
5.5.2.1 Cromatografía en capa fina .................................................................. 21
5.5.2.2 Absorción Ultravioleta........................................................................... 22
5.6 Experimentos de adición de AHLs exógenas................................................... 22
6 RESULTADOS.................................................................................................... 23
6.1 Búsqueda de un regulón QS mediante estudios proteómicos.......................... 23
6.1.1 Búsqueda de condiciones óptimas de crecimiento celular y
iii
patrón de proteínas para los experimentos de proteómica.................................... 23
6.1.2 Obtención de AHLs .................................................................................. 26
6.1.2.1. Extracción de AHLs desde sobrenadantes de cultivos de
A. ferrooxidans ATCC23270............................................................................. 26
6.1.2.2 Extracción de AHLs de sobrenadantes de cultivos de E. coli
que sobreexpresan la proteína AfeI................................................................... 29
6.1.2.3 Síntesis de AHLs y aAHLs.................................................................... 29
6.1.3. Análisis proteico de células de A. ferrooxidans inducidas por
distintas fuentes de AHLs ..................................................................................... 31
6.1.3.1. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes de
A. ferrooxidans crecido en azufre) sobre células de A. ferrooxidans
crecidas en hierro.............................................................................................. 31
6.1.3.2. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes
de cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI) sobre células de
A. ferrooxidans crecidas en hierro. .................................................................... 32
6.1.3.3. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes
de cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI) sobre células de
A. ferrooxidans crecidas en tiosulfato................................................................ 35
6.1.3.4. Efecto de AHLs sintéticas sobre células de A. ferrooxidans
crecidas en tiosulfato. ....................................................................................... 38
6.1.3.5. Efecto aAHLs sintéticos sobre células de A. ferrooxidans
crecidas en tiosulfato. ....................................................................................... 40
6.2. Caracterización de un posible complejo entre Fe y AHLs............................. 44
6.2.1. Análisis cuantitativos de la fase acuosa.................................................... 47
6.2.2. Análisis cualitativos de la fase orgánica.................................................... 48
iv
7. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 51
7.1 Caracterización de un regulón QS en A. ferrooxidans ........................................ 51
7.1.1 Biomasa y análisis de autoinducción en A. ferrooxidans.............................. 52
7.1.2 Adición de AHLs exógenas .......................................................................... 53
7.1.3 Utilización de análogos de AHLs.................................................................. 54
7.2 Identificación de un complejo putativo entre el Hierro y las AHLs....................... 55
8. CONCLUSIONES ............................................................................................... 57
9. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 58
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de la vía de regulación de la bioluminiscencia mediante el sistema
de QS LuxI/R en V. fischeri………………………………………………………………3
Figura 2. AHLs producidas por diferentes bacterias Gram-negativas………………………….6
Figura 3. Estandarización de condiciones de extracción de proteínas de cultivos de
A. ferrooxidans…………………………………………………………………………….25
Figura 4. Análisis de diferentes extractos de AHLs mediante CCF acoplada a un
biosensor…………………………………………………………………………………...27
Figura 5. AHLs (A) y aAHLs (B) sintéticamente obtenidas en colaboración con el
laboratorio de química orgánica del profesor Doutheau (Lyon, Francia)……………30
Figura 6. Efecto de los extractos de AHLs obtenidas a partir de sobrenadantes de
cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI sobre células de A. ferrooxidans
crecidas en hierro…………………………………………………………………………33
Figura 7. Efecto de los extractos de AHLs obtenidas a partir de sobrenadantes de
cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI sobre la oxidación del hierro…………34
Figura 8. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes de cultivos
de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI) sobre células de A. ferrooxidans crecidas
en tiosulfato………………………………………………………………………………37
Figura 9. Análisis mediante 2D-PAGE de las proteínas extraídas de células de
A. ferrooxidans crecidas en tiosulfato………………………………………………….38
Figura 10. Análisis mediante 2D-PAGE de las proteínas extraídas de células de
A. ferrooxidans crecidas en tiosulfato………………………………………………….40
Figura 11. Efecto del antagonista aAHL 134 sobre células de A. ferrooxidans crecidas
en tiosulfato……………………………………………………………………………….42
vi
Figura 12. Efecto del antagonista aAHL 43 sobre células de A. ferrooxidans crecidas en
tiosulfato………………………………………………………………….....................43
Figura 13. Experimento preliminar del posible complejo entre hierro y AHL………………..45
Figura 14. Metodología experimental de la caracterización del complejo Fe-AHLs………..46

Figura 15. Cuantificación de hierro total por absorción atómica……………………………...42
Figura 16. Cuantificación de Fe2+ por el método de la fenantrolina………………………….48
Figura 17. Análisis del patrón de migración del precipitado del complejo AHL-hierro……...49
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. AHLs presentes en el sobrenadante de A. ferrooxidans 23270……………………...13
Tabla 2. Tabla resumen del tiempo generacional de diferentes bacterias…………………….24
Tabla 3. Análisis espectrometría de masas. El análisis se efectuó mediante cromatografía
líquida de fase reversa acoplada a un espectro de masas (CLFR-EM)...................28
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-oxo-C10-AHL N-3-oxo-decanoil-L-homoserina lactona

3-oxo-C12-AHL N-3-oxo-dodecanoil-L-homoserina lactona
3-oxo-C6-AHL N-3-oxo-hexanoil-L-homoserina lactona
3-oxo-C8-AHL N-3-oxo-octanoil-L-homoserina lactona
aAHL Análogo N-acil homoserina lactona
Acyl-PTA Proteína transportadora de acilos acilada
AHL N-acil homoserina lactona
AI Autoinductor
AI-1 Autoinductor del tipo 1
AI-2 Autoinductor del tipo 2
C14-AHL N-tetradecanoil-L-homoserina lactona
C10-AHL N-decanoil-L-homoserina lactona
C12-AHL N-dodecanoil-L-homoserina lactona
C4-AHL N-butiril-L-homoserina lactona
C6-AHL N-hexanoil-L-homoserina lactona
C8-AHL N-octanoil-L-homoserina lactona
CCF Cromatografía en capa fina
DCM Diclorometano
DMSO Dimetil sulfóxido
DTT Ditiotreitol
EPS Sustancia exopolimérica (del inglés ExoPolimeric Substance)
IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido
LB Luria-Bertani
OH-C12-AHL N-3-hydroxydodecanoil-L-homoserina lactona
OH-C10-AHL N-3-hydroxydecanoil-L-homoserina lactona
OH-C6-AHL N-3-hydroxyhexanoil-L-homoserina lactona
OH-C8-AHL N-3-hydroxyoctanoil-L-homoserina lactona
ORF Marco Abierto de Lectura
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
QS Quorum Sensing
SDS-PAGE Electroforésis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de
sodio
SDS Dodecil sulfato de sodio
NMR Resonancia magnetica nuclear
TRIS trishidroxymetilaminometano
X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosido
ix
1 RESUMEN
Acidithiobacillus ferrooxidans es una de las principales bacterias ácidofilas y
quimiolitoautotróficas involucradas en los procesos de biolixiviación. Esta bacteria Gram-
negativa es capaz de oxidar tanto el ión ferroso (Fe2+), como compuestos reducidos del
azufre con el objetivo de obtener energía para su crecimiento. La mayor parte de las
bacterias biolixiviantes crecen adheridas a superficies de sustratos sólidos (minerales). A.
ferrooxidans además es capaz de desarrollar biopelículas y exhibir modificaciones
morfológicas durante el proceso de adherencia. La formación de biopelículas está regulada
en diversas bacterias por el sistema de “Quorum Sensing” (QS). El QS es un proceso en el
cual las bacterias se comunican con otras de su misma especie para coordinar su
comportamiento y funcionar como un organismo multicelular.
El QS regula diversos fenotipos los cuales son el resultado de cambios en la expresión
de múltiples genes. Estos son cambios globales dependientes de una familia de reguladores
transcripcionales llamadas proteínas tipo R. Este conjunto de genes que se activan o se
reprimen en una condición determinada se denomina regulón. Para poder determinar qué
genes forman parte de un regulón, se deben realizar experimentos de genómica y
proteómica comparativa.
Recientemente en nuestro laboratorio se ha caracterizado un sistema QS funcional del
tipo AI-1 en la bacteria A. ferrooxidans. Sin embargo, aún no se han identificado ni los genes
ni los fenotipos que este sistema regula.
Por lo tanto, nos propusimos con esta tesis analizar los efectos sobre el patrón de
expresión proteica de A. ferrooxidans de extractos de sobrenadantes de cultivo de A.
ferrooxidans, AHLs sintéticas y sus análogos (aAHLs) mediante estudios proteómicos para
indagar el regulón QS en esta bacteria. Estos experimentos fueron realizados en un fondo
silvestre debido a que aún no se disponen de metodologías para manipular genéticamente a
x
esta bacteria. Se observó que la adición de AHLs y aAHLs inducen cambios que se traducen
en variaciones a nivel fisiológico (aumento de número de células), del medio (mayor
oxidación de hierro y acumulación de azufre) y del patrón de expresión de proteínas.
Otro punto abordado en esta tesis, fue determinar el efecto que tiene el Fe2+ sobre las
AHLs producidas por la bacteria. Aparentemente el circuito regulatorio paradigmático de
todos los sistemas de QS parece no ocurrir cuando A. ferrooxidans crece en un medio con
hierro, puesto que tanto los niveles de AHLs como de transcrito del gen afeI son bajos en
este medio de cultivo en comparación con azufre y tiosulfato. Por esta razón, nos propusimos
estudiar cuál sería la posible explicación de este fenómeno. Experimentos preliminares nos
llevaron a pensar que pudiese existir un putativo complejo entre hierro y AHLs. No es claro
aún qué tipo de estructura forman las AHLs con hierro, pero sí es claro que estas moléculas
autoinductoras son capaces de unirse al Fe2+ y alterar su patrón de migración en una
cromatografía en capa fina (cambia la polaridad).
xi
2 ABSTRACT
SEARCHING THE QUORUM SENSING REGULON IN Acidithiobacillus
ferrooxidans USING A PROTEOMIC APROACH.
Acidithiobacillus ferrooxidans is one of the main acidophilic and chemo- lithotrophic
bacteria involved in the bioleaching process. This Gram-negative bacterium is capable of
oxidizing ferrous iron and reduced sulfur compounds to obtain energy in order to grow. The
majority of bioleaching bacteria grow fixed on solid substrate surfaces (ores). A. ferrooxidans
is also able to develop biofilms and exhibits morphological modifications during the adhesion
process. Biofilm formation is regulated by the quorum sensing (QS) system in different
bacteria.
QS is a process in which bacteria communicate with other members of the same
species to coordinate their behavior and allows the group to function as a multicellular
organism. QS regulates diverse phenotypes which are the consequence of multiple gene
expression changes. This global change is dependent of the type R transcription regulator
protein family. This activated or repressed set of genes is called a regulon. In order to
determine which genes are part of this regulon, comparative genomics and proteomics
experiments must be performed. Recently in our lab, a functional AI-1 type QS system has
been characterized. However, neither genes nor phenotypes regulated by this system have
been identified. Hence the purpose of this study is to analyze the effects of supernatant
extracts, AHLs and aAHLs on A. ferrooxidans protein expression patterns with the final
purpose of identifying part of the QS regulon. These experiments were performed over a wild
type background due to the lack of genetic manipulation methodologies for this bacterium.
The addition of AHLs and aAHLs induced changes and variations at physiological levels.
Apparently canonical regulatory circuits of all QS system does not seem to work when
A. ferrooxidans grows on ferrous iron media. For this reason, we characterized a putative
xii
Fe2+-AHL complex. Nevertheless, the kind of structure AHL and iron form has not yet been
clarified, but it is clear that AHL binds to Fe2+ and alters its migration pattern.
xiii
3 INTRODUCCIÓN
El fenómeno de comunicación se ha desarrollado en diversos organismos, alcanzando
la forma más sofisticada en organismos sociales, particularmente seres humanos. Para que
una verdadera comunicación ocurra, se necesitan dos sucesos fundamentales. Primero, uno
o más individuos deben producir una señal que sea percibida por otros (receptores) y
segundo, los receptores deben alterar su comportamiento en respuesta a la señal [1].
Organismos superiores y multicelulares, en los que cada una de las células debe
cumplir con sus actividades y funcionar como un todo, exigen que las células posean un
sistema de generación, transmisión, recepción y respuesta de diversas señales que las
comuniquen e interrelacionen funcionalmente entre sí. Este mecanismo se conoce como
comunicación celular.
Hasta hace algunas décadas atrás, se creía que los organismos unicelulares
procariontes como las bacterias vivían en forma independiente respondiendo sólo a
estímulos físicos y químicos de origen ambiental. Hoy se sabe que las bacterias se
comunican con otras mediante moléculas orgánicas, que actúan de manera similar a como lo
hacen las hormonas en organismos superiores. La producción y posterior percepción de
estas moléculas permite a las bacterias comunicarse y coordinar su comportamiento, para
así funcionar como un (micro)organismo multicelular [2].
Este mecanismo de comunicación célula-célula se conoce como “quorum sensing”
(QS) y fue descrito por primera vez en la bacteria marina Vibrio fischeri [3]. Este sistema le
permite a una sola bacteria obtener información acerca de la densidad celular de su entorno
cercano, mediante la síntesis de moléculas químicas denominadas autoinductores (AI) cuya
concentración extracelular aumenta en función del incremento en la densidad celular [4].
1
3.1 V. fischeri y el primer sistema de quorum sensing (QS) descrito
Un gran número de bacterias presentan la interesante propiedad de emitir luz
(luminiscencia). La mayoría de estas bacterias bioluminiscentes son marinas y viven
estableciendo relaciones ecológicas con organismos marinos. Un ejemplo de este fenómeno
es la producción de luz azul-verde por parte de la bacteria Gram-negativa V. fischeri que
establece una relación simbionte con el calamar marino Euprymna scolopes. Cuando V.
fisheri vive libre en el mar y su densidad celular no supera las 102 cel/mL, no es luminiscente.
Sin embargo, a altas densidades celulares (1010-1011 cel/mL), ya sea en el laboratorio o
cuando coloniza un órgano específico denominado órgano de luz del calamar, es capaz de
emitir luz [3, 5].
A nivel molecular, la bioluminiscencia está regulada por 7 genes, repartidos en 2
operones denominados luxICDABE y luxR. Ambos operones poseen una región promotora
común y se transcriben divergentemente. Los genes luxA y luxB codifican para las
subunidades de la enzima luciferasa. Los genes luxC-E codifican proteínas que forman una
complejo multienzimático responsable de la síntesis del sustrato utilizado por la luciferasa.
Los productos de los genes luxI y luxR son reguladores de la bioluminiscencia. La proteína
LuxI es responsable de la síntesis de una molécula AI, identificada como N-(3-oxohexanoil)-l-
homoserina lactona (3-oxo-C6-AHL). La proteína LuxR es un activador transcripcional, que
en su forma activa (unido a 3-oxo-C6-AHL ) es capaz de unirse a la región promotora del
conjunto génico de bioluminiscencia [6].
La vía de regulación de bioluminiscencia conforma el paradigma del QS presente en
bacterias Gram-negativas. A medida que aumenta la densidad celular se acumula la
molécula 3-oxo-C8-AHL en el medio extracelular y una vez que ésta alcanza la
concentración umbral (5 a 10 nM) es capaz de reingresar a la célula y unirse al regulador
transcripcional LuxR [6]. Este activador se une a la región promotora del operón lux
aumentando su transcripción y produciendo el fenotipo de bioluminiscencia [7] (Figura 1). En
2
este sistema QS las sintasas de homoserina lactona conforman una familia de proteínas
homólogas, evolutivamente conservadas denominadas familia tipo LuxI. Las proteínas que
actúan como elementos de respuesta, ya que unen autoinductores específicos y actúan
como reguladores transcripcionales, pertenecen a otro grupo conservado denominado familia
de proteínas tipo LuxR. Las proteínas homólogas a LuxI y LuxR han sido identificadas en un
gran número de proteobacterias Gram-negativas y se denominaron familia de proteínas I y
familia de proteínas R, respectivamente [8].
Genes estructurales de la
bioluminiscencia
luxR lux I C D A B E G
LuxI
LuxR
Figura 1. Esquema de la vía de regulación de la bioluminiscencia mediante el sistema de QS LuxI/R en V.

fischeri. En la figura se esquematiza el modelo de activación de la bioluminiscencia mediante el sistema de QS
LuxI/R. La proteína LuxI sintetiza la molécula autoinductora (triángulos amarrillos) y ésta difunde a través de la
membrana celular. Una vez que alcanza su concentración umbral biológicamente activa ingresa nuevamente a
la célula y se une al regulador transcripcional LuxR. Entonces, esta proteína reguladora, bajo la forma de
dímero, se une al operón de la luciferasa y activa su transcripción.
3
3.2 Clasificación de los sistemas de QS
Una vez descrito el sistema de comunicación celular dependiente de homoserina
lactona identificado en bacterias Gram-negativas, se encontraron otros sistemas de
comunicación bacteriana, que no utilizaban el mecanismo clásico mencionado anteriormente.
Las principales diferencias de estos nuevos sistemas con el modelo LuxI/R radican en la
naturaleza del autoinductor, los mecanismos que controlan su síntesis, la respuesta celular
que gatillan y el espectro de comunicación (interespecies, intraespecies o entrereinos).
De acuerdo con el tipo de autoinductor secretado ha sido posible clasificar los distintos
tipos de QS en, a lo menos, en tres grandes grupos:
a. QS mediado por homoserina lactona (AHL) o autoinductor del tipo 1 (AI-1). Las
bacterias Gram-negativas poseen una proteína de la familia I como sintasa y una
proteína de la familia R como regulador transcripcional específico [7].
b. QS mediado por oligopéptidos. Utilizado por bacterias Gram-positivas, estos pequeños
péptidos activan vías de señalización de sistemas de dos componentes [4].
c. QS mediado por 4,5-dihidroxi 2,3-pentanediona (DPD). Es utilizado tanto por bacterias
Gram-positivas como Gram-negativas y corresponde a un sistema de comunicación
interespecie. La síntesis de este AI depende de la proteína LuxS [9]. El DPD es una
molécula altamente reactiva e inestable en solución, que forma rápidamente un
compuesto cíclico.
3.3 QS mediado por N-acil homoserina lactona (AHL) o autoinductor del tipo 1 (AI-1)
En esta sección de la tesis se describirán los distintos actores moleculares
involucrados en el mecanismo de QS de tipo I. Se enfatizará en la estructura de la molécula
de AHL, la vía de síntesis y la vía de transducción de la señal en sistemas del tipo I / R.
4
3.3.1 Sintasas de AHL y familia de proteínas I
Existen tres familias de enzimas, no homólogas entre sí, capaces de sintetizar las
moléculas autoinductoras del tipo AHLs [10].
Las N-acil homoserina lactonas (AHLs) derivan de 2 moléculas orgánicas, el S-adenosil
metionina (SAM) y la cadena acilo de la proteína transportadora de acilo (acil-PTA). Ambos
sustratos se encuentran normalmente en la célula y participan en la síntesis tanto de
aminoácidos como de ácidos grasos [11, 12].
Las proteínas de la familia I catalizan la reacción de unión entre el grupo acilo de la
acil-PTA y la metionina del SAM [7]. En esta familia de proteínas el porcentaje de identidad
de la secuencia aminoacídica es sólo del 28 al 34%. A pesar de esta baja identidad de
secuencia existen 2 regiones bastante conservadas. La primera corresponde al sitio activo
de la catálisis situado en el extremo amino-terminal y la segunda, que corresponde al sitio de
unión a acil-PTA que se encuentra en el extremo carboxilo-terminal [13].
La familia AinS/LuxM corresponde a 2 proteínas homólogas, no relacionadas
estructuralmente con la familia de proteínas I. Sin embargo, son capaces de sintetizar AHLs
mediante el mismo mecanismo y con los mismos sustratos que las proteínas homólogas a
LuxI [10]
Una tercera familia de sintasas de AHLs se describió en Pseudomona fluorecens. Esta
enzima sintetiza AHLs hidroxi-sustituidas con largos de cadena acil de 6, 12 y 14 carbonos.
La proteína HdtS no posee homología con ninguna de las 2 familias anteriores [10, 14, 15].
3.3.2 Estructura, transporte y acumulación de AHLs
Las AHLs son moléculas orgánicas de bajo peso molecular que se acumulan en el
medio de crecimiento de un cultivo bacteriano. Debido a esto, son aislados desde los
sobrenadantes de cultivos de bacterias en la fase estacionaria de crecimiento mediante una
5
extracción orgánica. La primera en ser purificada e identificada fue la 3-oxo-C6-AHL
producida por V. fischeri [5, 16].
Desde este entonces, se han identificado numerosas AHLs y algunos ejemplos que ilustran
las diferencias estructurales caracterizadas hasta la fecha se presentan en la figura 2.
Figura 2. AHLs producidas por diferentes bacterias Gram-negativas y su respectiva sintasa de AHL.
En la figura se presentan las AHLs producidas por 6 bacterias Gram-negativas, su sintasa y su estructura.
Como se observa en la figura 2, la estructura química de las AHLs se puede dividir en
dos partes. La primera consiste en un anillo invariable de homoserina lactona que es común
para todas las AHLs. La segunda es conformada por la cadena acilada que es responsable
de la diversidad estructural de las AHLs y varía tanto en el largo (4-18 átomos de carbono), la
sustitución del carbono 3 y la presencia de dobles enlaces en la cadena hidrocarbonada [7,
10, 17].
6
De acuerdo al paradigma del QS, las AHLs, debido a su naturaleza anfipática difunden
libremente a través de la membrana citoplasmática en favor del gradiente de concentración.
Como inicialmente el modelo de QS se definió para la bacteria V. fischeri que sintetiza una
AHL de cadena corta (3-oxo-C6-AHL) fue necesario corroborar e investigar qué sucedía con
las AHLs con mayor número de carbonos y por lo tanto de mayor grado de hidrofobicidad. Se
realizaron experimentos con moléculas autoinductoras marcadas radiactivamente y se
comprobó que las AHLs de cadena corta como C4-AHL y 3-oxo-C6-AHL difunden
pasivamente por la membrana de la célula igualando las concentraciones luego de un tiempo
muy breve [16]. En cambio, AHLs de cadena larga como 3-oxo-C12-AHL en P. aeruginosa,
salen a través de bombas de eflujo activo (MexAB-OprM) [18] y entran a la célula por
difusión.
3.3.3 Familia de proteínas R
Los reguladores transcripcionales de la familia R comparten dos regiones estructurales
altamente conservadas: el dominio de unión a DNA, del tipo hélice-vuelta-hélice (HVH) en el
extremo carboxilo terminal y el dominio de unión a AHL en el amino terminal [7, 10].
Las proteínas R pueden unirse a secuencias específicas de DNA denominadas cajas
tipo lux. Estas cajas corresponden a secuencias invertidas repetidas de 18 a 22 pares de
bases (pb) [11, 19].
El mecanismo a través del cual los distintos miembros de la familia R regulan la
transcripción de sus genes blanco, varía en cada sistema. En la mayoría de los sistemas de
QS la proteína R es un activador transcripcional, es decir, que en presencia de su AHL
cognada es capaz de reconocer y unirse a las cajas tipo lux y así activar la transcripción. La
unión de la molécula de AHL a la proteína R, de las bacterias A. tumefaciens, Vibrio cholerae
y P. aeruginosa permite la dimerización del regulador y la posterior interacción de este
dímero con el DNA [19-24]. Por otro lado, existen reportes de proteínas R que funcionan
7
como represores, ya que se unen a la región promotora en ausencia de AHLs y se liberan en
presencia de AHLs, como es el caso de EsaR de E. stewartii o ExpREcc de Erwinia
carotovora [25, 26].
Algunas proteínas homólogas a LuxR tienen la capacidad de reconocer moléculas de
AHLs que no son sus cognadas, lo cual permite utilizarlas como sistema de detección. Estos
sistemas de detección conforman biosensores bacterianos a homoserina lactonas y permiten
identificar AHLs producidas por otros microorganismos [27, 28].
3.4 Detección de AHLs mediante biosensores
Un biosensor es una herramienta o sistema analítico compuesto por un material
biológico (tal como una enzima, anticuerpo, célula entera, organelo o combinaciones de los
mismos) y una parte transductora que convierta la señal bioquímica en una señal
cuantificable.
Un biosensor bacteriano a AHLs debe contar con 3 elementos principales i) una
proteína tipo R, ii) una secuencia promotora blanco regulada por el homólogo LuxR y iii) un
gen reportero fusionado a esta secuencia, como lacZ o el operón lux. Por otro lado, la cepa
bacteriana donde se introduce la construcción biosensora debe carecer de la sintasa de
AHLs, así el gen reportero solamente se activará en presencia de una AHL exógena. Uno de
los biosensores frecuentemente utilizado para detectar diferentes AHLs es el biosensor
Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) [27]. Este biosensor posee la capacidad de
detectar AHLs de cadena acil de largo variable (C4-C12) y con y sin sustitución en el carbono
3. La sensibilidad varía para cada una de las AHLs que detecta. También, existen cepas
bioreporteras específicas para AHLs de cadena corta como Chromobacterium violaceum
CV026 [29] y de cadena larga como Sinorhizobium meliloti Rm11559 [30]. Es posible
determinar las diferencias estructurales en la molécula AI utilizando la técnica de
cromatografía en capa fina (CCF) acoplada a estos biosensores. Esta metodología permite
8
separar las moléculas de AHL de acuerdo a su polaridad (largo de cadena y sustitución del
carbono 3). Sin embargo, la técnica que permite identificar mejor la estructura química y
determinar cuantitativamente a la molécula AI, es la cromatografía líquida de fase reversa
acoplada a un espectrofotómetro de masas (CLFR-EM) [31, 32].
3.5 Interferencia de los sistemas de QS
Como se mencionó anteriormente, los sistemas de QS regulan procesos fisiológicos
importantes en las poblaciones bacterianas. Es por esto que en nichos donde distintos
microorganismos compiten por recursos limitados, la bacteria que posea la habilidad de
interferir con el mecanismo de comunicación celular tendrá una ventaja sobre la otra
población.
Se han descrito casos en que organismos superiores interfieren en la comunicación
bacteriana y por ende en procesos fundamentales para una población de bacterias. Un
ejemplo de interferencia entre un organismo eucarionte y una bacteria es el caso de la alga
marina Delisea pulchra que secreta moléculas de estructura similar a las AHLs de Serratia
liquefaciens. Estas moléculas fueron identificadas como furanonas halogenadas [33]. Las
furanonas actúan como antagonistas uniéndose a la proteína reguladora SwrR afectando la
expresión de una serie de proteínas y como consecuencia de esto, inhiben el fenotipo de
“swarming” que es regulado por QS [34, 35].
A partir de los ejemplos de interferencia de sistemas de QS existentes, ya sea inter-
especies como el caso entre Bacillus subtilis y E. carotovora [36] o inter-reinos como el caso
de D. pulcra y Medicago truncatula [37], se ha abierto un nuevo campo que apunta a la
síntesis química de moléculas capaces de bloquear el mecanismo de comunicación celular.
De hecho, se han sintetizado análogos estructurales de AHLs, los cuales han sido evaluados
por su actividad agonista y/o antagonista de sistemas QS del tipo AI-1 en bacterias como
Vibrio fischeri, E. carotova, Agrobacterium tumefaciens y P. aeruginosa [38-42].
9
Existen 2 familias estructurales de análogos. La primera está conformada por
moléculas en las que se ha reemplazado el anillo lactona por otro heterociclo o carbociclo.
La segunda familia la conforman compuestos en los cuales varía la cadena acilo o el grupo
homoserina, reemplazándose por ejemplo por un grupo sulfonamida o un grupo urea. Sólo
en los análogos pertenecientes a la segunda familia se ha encontrado tanto actividad
agonista como antagonista, dependiendo de las variaciones en la cadena acilo que posea la
molécula [40-44].
3.6 Regulón QS y estudios de proteómica
Como se ha descrito en la introducción de esta tesis, las bacterias son capaces de
coordinar su comportamiento en función de la densidad celular. Algunos de los mecanismos
regulados por QS en bacterias Gram-negativas son la bioluminiscencia en V. fischeri, la
virulencia en bacterias patógenas como P. aeruginosa, la transferencia de DNA en la
bacteria patógena de plantas A. tumefaciens y la formación de biopelículas en un gran
número de microorganismos [4, 7, 45]. Estos fenotipos son el resultado de los cambios en la
expresión de múltiples genes. Estos cambios globales son regulados directa o
indirectamente por proteínas tipo R, que además de regular la transcripción de otros genes
regulan su propia expresión. Este conjunto de genes que se activan o se reprimen en una
condición determinada se denomina regulón. Un regulón está definido como un conjunto de
genes regulados por una misma proteína en determinadas condiciones experimentales.
Para poder determinar qué genes forman parte de un regulón, se deben realizar
experimentos de genómica y proteómica. Para estudios de QS los experimentos se efectúan
al comparar una cepa silvestre con una cepa mutante en genes de QS. Generalmente, son
mutantes en el gen de la sintasa de AHL [46, 47]. Los primeros estudios que se hicieron en
esta área se realizaron en la bacteria P. aeruginosa comparando la cepa silvestre con una
doble mutante lasI-rhiI y determinando el efecto de suplementar con AHLs sintéticas ambos
10
cultivos. Se determinó que cerca de 200 genes son regulados por QS [48]. Luego, se
realizaron 3 estudios independientes de macroarreglos de DNA [49-51]. Se encontró
concordancia solamente en 77 genes, los que se asignaron como el regulón QS general. En
cuanto a las discrepancias en los estudios cabe destacar 2 puntos principales, primero las
diferentes condiciones experimentales en que se realizaron los experimentos y segundo que
la transcriptómica posee ciertas limitaciones, ya que sólo indica la abundancia de mRNA y no
entrega ninguna información sobre los niveles de proteínas ni de modificaciones post-
traduccionales.
Para el estudio de modificaciones post-transcripcionales se puede utilizar la
proteómica. Esta técnica permiten comparar los patrones proteicos de una bacteria en
distintas condiciones experimentales y así identificar las proteínas que se inducen o reprimen
tomando como control una de estas condiciones.
Lo habitual es que el regulón QS corresponda aproximadamente a un 5% del total de
proteínas, valor similar al que se encuentra en experimentos de microarreglos de DNA [52].
Como se vio en el caso de Serratia proteamaculans al comparar una cepa mutante con una
silvestre, al agregar AHL de forma exógena se observó un cambio en 39 proteínas tanto
inducidas como reprimidas que corresponden a un 1% del proteoma [47].
En los casos en que no existan mutantes, se realizan estudios con una cepa silvestre,
en los cuales se compara una condición control con una condición “inducida”, que consiste
en adicionar AHLs sintéticas a una cepa no mutante. Para estos experimentos se requiere
que los niveles endógenos de AHLs sean mínimos para que el efecto de la AHL exógena sea
detectado. Este experimento fue realizado en la cepa silvestre de S. meliloti y se encontró un
cambio en 100 proteínas, tanto inducidas como reprimidas con respecto a la condición
control. Estas corresponden a un 5% del proteoma total [53]. En este estudio se utilizaron
dos AHLs, la 3-oxo-C16:1-AHL y la C14-AHL que afectaron a grupos diferentes de proteínas,
lo que sugiere, según los autores, que la respuesta a AHL en esta bacteria es mediada por
11
diferentes receptores y cada regulador posee un grupo diferente de genes que corresponden
a distintos regulones.
El porcentaje de genes y proteínas que cambia su patrón de expresión nos indica que
el QS tiene efectos globales en la fisiología bacteriana. Es por esto que los estudios
proteómicos y de microarreglos son fundamentales para identificar potenciales genes
regulados por AHLs y así permitir la identificación de un regulón QS.
3.7 QS en Acidithiobacillus ferrooxidans y propuesta de investigación
En bacterias Gram-negativas se ha descrito que la formación de biopelículas es
regulada por sistema QS, principalmente del tipo 1 (AI-1) [45].
Acidithiobacillus ferrooxidans es una de las principales bacterias ácidofilas y
quimiolitoautotróficas involucradas en los procesos de biolixiviación. Esta bacteria Gram-
negativa es capaz de oxidar tanto el ión ferroso (Fe2+) como compuestos reducidos del
azufre con el objetivo de obtener energía para su crecimiento [54]. La mayor parte de las
bacterias biolixiviantes crecen adheridas a superficies de sustratos sólidos, como por
ejemplo, la pirita. A. ferrooxidans además es capaz de desarrollar biopelículas y exhibir
modificaciones morfológicas durante el proceso de adherencia [55].
A. ferrooxidans posee un sistema de QS funcional mediado por AHLs [15, 56]. El
sistema está compuesto por el gen afeI que codifica para la sintasa de AHLs, el gen afeR
codificante para el regulador transcripcional AfeR y una caja afe palindrómica río arriba de
ambos genes. La caracterización de las AHLs producidas por A. ferrooxidans fue reportada
en dos estudios. Mientras que Rivas y col. (2005) identificaron una sola AHL en el
sobrenadante de cultivo de A. ferrooxidans y no descartan la existencia de más, en nuestro
laboratorio se identificaron 9 AHLs diferentes mediante espectrometría de masas (Tabla 1)
[15, 56].
12
Tal como se ha visto que existen variaciones en el proteoma y el transcriptoma según
la fuente energética utilizada por A. ferrooxidans durante su crecimiento [57-59], nuestro
laboratorio observó el mismo fenómeno en la producción de AHLs. Estas varían en número y
concentración dependiendo si la bacteria crece en hierro, azufre o tiosulfato. Cuando A.
ferrooxidans crece en un medio que contiene hierro (Fe2+) como sustrato oxidable, el
espectro de AHLs es menor en comparación a las otras fuentes energéticas. Esto se
correlaciona con la expresión del gen afeI que es cerca de 13 veces menor en células
crecidas en hierro con respecto a su expresión en células crecidas en azufre y tiosulfato [15].
Además, al contrario de lo observado en células crecidas en compuestos reducidos de
azufre, en las células crecidas en hierro no se detecta una variación en la concentración del
AI con el incremento de la densidad celular.
13
El siguiente paso en la línea de investigación es la caracterización del sistema QS de
A. ferrooxidans y la identificación de los genes que son regulados por este mecanismo
(regulón QS). Debido a que aún no se disponen de metodologías para manipular
genéticamente a esta bacteria, es imposible contar con mutantes de los genes afeI y afeR.
Por este motivo es necesario utilizar metodologías que nos permitan observar efectos
globales y que además puedan ser realizados en un fondo silvestre. El objetivo de esta tesis
es caracterizar el efecto de la adición exógena de moléculas de AHLs sobre el patrón de
expresión de proteínas en A. ferrooxidans. Para esto se utilizarán extractos de
sobrenadantes de cultivo de A. ferrooxidans, AHLs sintéticas y aAHLs como fuentes de AI.
14
4 HIPÓTESIS
“Los extractos de sobrenadantes de cultivo de A. ferrooxidans, AHLs sintéticas y
análogos de AHLs pueden interferir en el sistema QS de Acidithiobacillus ferrooxidans
e inducir cambios en el patrón de expresión proteico”
4.1 Objetivos
4.1.1 Objetivo General
Estudiar el efecto de distintas fuentes de AHLs -extractos de sobrenadantes de cultivo
de A. ferrooxidans, AHLs sintéticas y análogos de AHLs- sobre el patrón de expresión
proteico de Acidithiobacillus ferrooxidans y caracterizar el efecto del Fe2+ sobre las AHLs
producidas por la bacteria.
4.1.2 Objetivos específicos
4.1.2.1. Objetivo específico 1. Buscar las condiciones óptimas de crecimiento celular
y definir el patrón de proteínas para los experimentos de proteómica.
4.1.2.2. Objetivo específico 2. Realizar estudios proteómicos para identificar
proteínas del regulón QS con extractos de AHL de sobrenadantes de cultivo de A.
ferrooxidans, de la cepa de E. coli que sobreexpresa la proteína AfeI, AHLs sintéticas
y análogos de AHLs.
4.1.2.3. Objetivo específico 3. Caracterizar el efecto del Fe2+ sobre las AHLs
producidas por A. ferrooxidans.
15
5 MÉTODOS
5.1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
La cepa de Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270 se cultivo aeróbicamente a
30ºC con agitación en el medio 9K. Para el crecimiento en Fe2+, este medio contenía 33,3 g/L
de FeSO4•7H2O ajustando el pH a 1,5 con ácido sulfúrico concentrado [60]. En el caso de los
cultivos en azufre elemental, el ion ferroso se reemplazó por perlas de azufre esterilizadas (50
g/L previamente, ajustando el pH del medio a 2,5 [61, 62]. Para el crecimiento en tiosulfato se
utilizó medio DSMZ 71 [3 g/L de (NH4)2SO4, 0,5 g/L de MgSO4•7H2O, 0,25 g/L de
CaCl2•2H2O, 3 g/L de KH2PO4 y 5 g/L de Na2S2O3•5H20]; se prepara el medio sin tiosulfato,
se esteriliza por autoclave a 121ºC por 20 min y se agrega el tiosulfato (solución 50% p/v)
esterilizado por filtración.
E. coli BL21(DE3) fue cultivada en medio LB [63] suplementado con 100 µg/mL de
ampicilina ya sea en caldo o placas LB-agar (1,5%). Cuando fue necesario se suplementó
con 0,4 mM IPTG.
La cepa de A. tumefaciens NTL4(pZLR4) fue crecida en medio LB o medio AB mínimo
(ABm) [KH2PO4•3 g/L, NaH2PO4 1 g/L, NH4Cl 1 g/L, MgSO4•7H2O 0,3 g/L, KCl 0,15 g/L,
CaCl2 0,01 g/L, FeSO4•7H2O 2,5 mg/L y glucosa 5 g/L] [64] con 0,5% de glucosa,
suplementado con 25 µg/mL de gentamicina según correspondiese.
5.2 Monitoreo del crecimiento celular
El crecimiento de A. ferrooxidans se siguió mediante el recuento celular en una cámara
de Petroff-Hausser y la visualización con el microscopio óptico OLYMPUS BX50. Se tomó
muestras de 1,5 µL de cada cultivo. La concentración de células se obtuvo dividiendo el
promedio de células contadas en cada celda por el volumen que contiene una celda, el cual
corresponde a 5 • 10-8 mL.
16
5.3 Experimentos de identificación de acil homoserina lactonas (AHLs)
5.3.1 Extracciones orgánicas desde sobrenadantes de cultivos bacterianos
Los cultivos de A. ferrooxidans ATCC23270 y E. coli BL21 (DE3) se centrifugaron a
10000•g por 25 min para separar las células del sobrenadante. El sobrenadante se extrajo
tres veces con medio volumen de diclorometano (CH2Cl2). Cada extracción se efectuó
durante 30 min, reservando cada vez la fase orgánica (inferior). La fase orgánica se secó con
MgSO4 anhidro y se filtró con algodón hidrofílico. El filtrado se concentró en un rotavapor a
50°C y el concentrado se llevó a sequedad con N 2. El extracto seco se resuspendió en
acetato de etilo alcanzando un factor de concentración de 4000 veces para A. ferrooxidans y
200 veces para E. coli. Luego se realizaron los análisis de cromatografía en capa fina (CCF).
5.3.2 Separación de la extracción orgánica por Cromatografía en Capa Fina (CCF)
Para separar los distintos compuestos orgánicos se utilizó la técnica de cromatografía
en capa fina utilizando una matriz C18 de fase reversa (Merck®). Las muestras
resuspendidas en acetato de etilo se cargaron sobre la placa y se esperó la absorción de
éstas para iniciar la cromatografía. Ésta se realizó utilizando metanol-Agua 60%-40% como
fase móvil [65].
5.3.3 Revelado con biosensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4)
Para el ensayo se utilizó la cepa reportera de A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). Esta cepa
no es productora de AHLs dado que carece del gen I. Presenta una fusión del gen lacZ con
traG el cual es regulado por la proteína TraR. Estas características permiten la detección de
AHLs exógenas mediante la visualización de la actividad β-galactosidasa en presencia de su
sustrato X-gal [27, 66].
La cepa reportera se inoculó desde una colonia aislada fresca y se creció en un tubo
de 5 mL de LB suplementado con gentamicina a 25 µg/mL a 30ºC durante 12 horas. Se
17
inoculó al 1% en medio fresco ABm, suplementado con glucosa. Se creció hasta fase
exponencial y se agregó en proporción 1:1 con ABm sólido fundido (1% agar). Se agregó X-
gal a 80 µg/mL y se mezcló intensamente. Se vertió la suspensión sobre la CCF
(0,3 mL/cm2) y se esperó hasta que el agar gelifique. Se incubó a 30ºC toda la noche para
revelar la presencia de AHLs. Luego se secó el agar para escanear la placa de CCF
revelada con el biosensor.
5.4 Técnicas de proteómica
5.4.1 Preparación de extractos proteicos totales de A. ferrooxidans para SDS-PAGE.
El extracto de proteínas totales se preparó a partir de células de A. ferrooxidans,
crecidas en azufre, tiosulfato o ión ferroso. Las células se centrifugaron y luego se lavaron 3
veces con agua ácida (pH 2,0 con H2SO4) y citrato de sodio. Se utilizaron dos metodologías de
extracción. La primera consistió en una extracción rápida donde las células lavadas fueron
resuspendidas en agua y amortiguador de carga 3X, hervidas durante 5 minutos y finalmente
centrifugadas por 10 min a 10.000•g para descartar el debris celular. En la segunda se
resuspendieron las células obtenidas en amortiguador de pH (Tris-HCl 30 mM pH 8,15)
suplementado con PMSF 100 µg/mL, para luego sonicarlas. La suspensión se centrifugó por
10 min a 10.000•g a 4°C y se descartó el precipitad o correspondiente al debris celular.
5.4.2 Determinación cuantitativa de las proteínas
Se realizó según el método de Bradford [67] usando el sistema comercial Coomassie
Plus Protein Assay Reagent (Pierce).
18
5.4.3 Electroforesis monodimensional en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturantes
Para analizar las muestras de proteínas totales en geles monodimensionales SDS-
PAGE, se mezclaron 2 volúmenes de la solución que contenía las proteínas más un volumen
de amortiguador de carga 3X (Tris-HCl 0,187 M pH 6,8, SDS 6%, glicerol 30%, β-
mercaptoetanol 15% y azul de bromofenol 0,06%). Las muestras se calentaron a 95°C por 5
min, se centrifugaron y se aplicaron en los pocillos de geles de poliacrilamida al 12,5%. Se
sometió a electroforesis a 200 V hasta que el frente de corrida alcanzara el borde inferior del
gel. Posteriormente, los geles se tiñeron con azul de Comassie R-250 (0,2% de azúl de
Comassie en metanol 25% y ácido acético 7,5%) o con nitrato de plata [68, 69]. Para estimar
el peso molecular de las proteínas a analizar, se utilizó el marcador de peso molecular
BenchMarkTM (Invitrogen).
5.4.4 Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)
Las células de A. ferrooxidans crecidas en azufre, tiosulfato o ion ferroso se lavaron y
se resuspendieron en amortiguador de sonicación (Tris-HCl 30 mM, pH 8,15 más PMSF 100
µg/mL). Se agregó RNAsa y DNasa a 50 µg/mL en frío por 15 min y luego las células se
sonicaron cuatro veces con intervalos de 10 min de congelación. La suspensión se centrifugó
por 10 min a 10.000•g, 4°C y se descartó el sedimen to.
Los extractos de proteínas se diluyeron en el amortiguador de rehidratación (urea
8 M, CHAPS 2%, DTT 10 mM, anfolitos Bio-Lyte 3-10 0,2%). Se agregó una alícuota de 350
µL a una tira de electroenfoque que contiene un gel de acrilamida (DryStrips IPG, pH 3-10
NL y pH 4-7 L, 180 mm, Amersham). Finalmente, se agregó aceite mineral sobre la tira para
prevenir la deshidratación y precipitación de la urea. Se realizó una hidratación pasiva
durante toda la noche. Las proteínas se enfocaron con el equipo Multiphor II de Amersham,
utilizando el siguiente programa de corrida: 500 V durante 1 min., 500 V durante 5 h, 3500 V
19
durante 5 h, 3500 V durante 9,5 h. Para preparar la tira de DryStrip IPG para la segunda
dimensión, ésta se quitó de la bandeja de electrofocalización y se equilibró durante 15 min
en 2,5 mL del primer amortiguador de equilibrio (Tris-HCl 50 mM, pH 8,8, urea 6 M, SDS 2%,
glicerol 30%, y DTT 1%). Se incubaron las tiras en un segundo amortiguador de equilibrio
similar al anterior excepto que el DTT fue sustituido por iodoacetamida 1,5%. Para la
segunda dimensión (SDS-PAGE) las tiras de ReadyStrip IPG se transfirieron a geles SDS-
PAGE (12,5%) y se cubrieron con agarosa 0,5% después de aplicar el patrón de peso
molecular (BenchMark™ Ladder, Invitrogen). Los geles se sometieron a una electroforesis
durante toda la noche a bajo voltaje (~ 50 V). Luego de la electroforesis, los geles se
removieron y se tiñeron con nitrato de plata [69].
5.5 Cuantificación de Hierro
Para los experimentos de unión de hierro a homoserina lactona, se utilizó una solución
de Fe2+ de 100 mg/L y una solución 50 mM de C10-AHL y C12-AHL. Ambas soluciones
fueron mezcladas en cantidades equimolares formando 2 fases. Se procedió a la agitación,
puesto que se espera encontrar el complejo en la interfase de la solución acuosa/orgánica.
Luego, se separaron las fases. Para analizar la fase acuosa se utilizaron técnicas
cuantitativas mientras que la fase orgánica fue analizada mediante técnicas cualitativas.
Si hay formación de complejo, la concentración de hierro en la fase acuosa disminuirá,
dado que éste pasará a la fase orgánica junto con la AHL.
5.5.1 Análisis cuantitativos
5.5.1.1 Absorción atómica
La cuantificación de hierro total (Fe2+ + Fe3+) se realizó mediante espectrofotometría de
absorción atómica (E.A.A), con llama aire/acetileno (Perkin Elmer 3110) en el laboratorio de
Operaciones Unitarias de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la
20
Universidad de Chile. La longitud de onda utilizada para detectar el hierro es de 248,3 nm.
Se realizó una curva de calibración con estándares de 1, 2, 3, 4 y 5 mg/L. (Las muestras se
ionizan con el mechero y se analizan en un espectrofotómetro. Luego, se leen las
absorbancias y las respectivas concentraciones de la muestra).
5.5.1.2 Método de la fenantrolina
La cuantificación del Fe2+ se realizó por el método de la fenantrolina. La o-fenantrolina
forma un compuesto de color rojo al complejarse con Fe2+ que se cuantifica a 510 nm en un
espectrofotómetro. Se preparó una solución stock de 100 mg/L de Fe2+ y una solución 0,25%
de o-fenantrolina. Se prepararon estándares de 0, 2, 4, 8 y 16 mg/L de Fe2+ para construir la
curva de calibración. La concentración de Fe2+ de la muestra se calculó según la siguiente
fórmula:
[Fe+2] = (A510 – intercepto) / pendiente
Para los siguientes análisis se evaporó el solvente de la fase orgánica separada
previamente de la fase acuosa y se analizó por diferentes técnicas cualitativas el precipitado
obtenido [70].
5.5.2 Análisis cualitativos
5.5.2.1 Cromatografía en capa fina
Se comparó el patrón de migración del precipitado contra un control de homoserina
lactona comercial. Se utilizaron placas de silica gel 60 cromatofolio con indicador de
fluorescencia254 y el solvente utilizado fue diclorometano:metanol (80:20). Para revelar la
placa se utilizaron dos sistemas de detección: vapores de yodo que se unen a todas las
21
moléculas y el reactivo de Dragendorff [71] que detecta solo compuestos que contienen
nitrógeno en su estructura.
5.5.2.2 Absorción Ultravioleta
La presencia de hierro en las muestras, se determinó en el laboratorio de Química
Analítica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile. También, se analizó la
cantidad de hierro presente en la homoserina lactona comercial.
5.6 Experimentos de adición de AHLs exógenas
Para estos experimentos se evaluaron distintas condiciones experimentales. Se creció
A. ferrooxidans en azufre, tiosulfato y ión ferroso y se analizaron muestras proteicas en las
distintas fases de la curva de crecimiento.
Para inducir los cultivos se utilizaron 2 metodologías experimentales: i) los cultivos al
alcanzar la fase estacionaria o exponencial se centrifugaron y se redujo el volumen del
medio a 5 mL (concentrando 20 veces) luego se adicionaron extractos de AHLs, AHLs
sintéticas o análogos de AHL (aAHL) y se crecieron por un periodo de tiempo variables; ii) se
inocularon los cultivos de A. ferrooxidans en presencia de extractos, AHLs sintéticas o aAHL
y se crecieron hasta fase exponencial o estacionaria.
En ambos experimentos, la condición inducida (AHLs exógenas) se comparó con una
condición control que sólo contenía el mismo volumen del solvente en que estaban disueltas
las moléculas “inductoras”.
22
6 RESULTADOS
6.1 Búsqueda de un regulón QS mediante estudios proteómicos
6.1.1 Búsqueda de condiciones óptimas de crecimiento celular y patrón de proteínas
para los experimentos de proteómica.
Como se mencionó en el punto 3.7 de la introducción, no disponemos de una cepa
mutante en ninguno de los genes que forman parte del sistema QS en A. ferrooxidans. Por
esto se utilizó para todos los experimentos de esta tesis la cepa silvestre de A. ferrooxidans
ATCC23270. Inicialmente, tomamos la decisión de cultivar la bacteria en un medio que
contiene hierro, ya que como se observa en la Tabla 1 la cantidad y tipos de AHLs en estos
cultivos es mínima. El siguiente paso fue monitorear el crecimiento celular de un cultivo de A.
ferrooxidans crecido en este sustrato para determinar el volumen de cultivo necesario para
obtener una extracto total de proteínas suficiente en cada punto de la curva de crecimiento.
A. ferrooxidans, a diferencia de otras bacterias, alcanza densidades celulares bajas y el
crecimiento en placas no se utiliza rutinariamente debido a la baja velocidad de crecimiento
de esta bacteria, cuyo tiempo generacional es mucho mayor que el de E. coli (Tabla 2).
Además, los sustratos energéticos utilizados para su crecimiento precipitan e interfieren en la
técnica clásica utilizada para monitorear crecimiento en otras bacterias (densidad óptica a
600 nm). Por esta razón se determinó la concentración de células (número de células/mL)
mediante conteo en una cámara de Petroff-Hausser con un microscopio óptico.
Se monitoreó el crecimiento de la bacteria A. ferrooxidans utilizando hierro como fuente
energética (Figura 3A). Se tomaron muestras del cultivo para la extracción de proteínas
totales a las 24, 48, 72 y 96 horas (Figura 3A) [el volumen de cultivo necesario para cada
punto experimental dependió de la concentración de células, es decir se decidió fijar un
número total de 4,2 • 109 células (Figura 3B)].
23
El objetivo de este experimento fue determinar la variación del patrón de proteínas de
A. ferrooxidans a lo largo de la curva de crecimiento en un medio suplementado con hierro,
ya que esta condición fue utilizada inicialmente como control en los experimentos de
proteómica. Para esto, los extractos de proteínas totales se analizaron en un gel de
poliacrilamida al 12,5%.
Como se observa en la figura 3C los patrones de proteínas extraídas entre 24 y 72
horas son bastante similares y además se observa que presenta una concentración de
proteína semejante. Esto es importante para comparar dos condiciones experimentales
diferentes, dado que la metodología de extracción rápida (ver Métodos) no permite calcular la
concentración real de proteína (método de Bradford), por lo que la concentración se
determina a partir del gel. Al normalizar el volumen obtenido en cada punto por el número
24
total de células se obtiene la misma concentración de proteína en el rango entre 24-72 horas
de cultivo.
A C
SDS-PAGE 12,5%
Curva crecimiento Acidithi obacill us PM
ferrooxi dans en hi erro
KDa
Ln concentración
8 ,4
de bacterias
8 ,3
8 ,2 50 kDa
8 ,1
8
7 ,9
7 ,8
0 12 24 36 48 60 72 84 9 6 1 08
Tie mpo (hora s)
20 kDa
B
Tiempo Volumen Número total
(horas) Cu ltivo (mL) de células 1 5 kD a
9
24 54 4,20*10
9
48 28 4,20*10
1 0 kD a
9
72 20 4,20*10
9
96 19 4,20*10 24h 48h 72h 96h
Figura 3. Estandarización de condiciones de extracción de proteínas de cultivos de

A. ferrooxidans. A) Curva crecimiento A. ferrooxidans ATCC23270 crecida en hierro.
Las flechas rojas indican los tiempos a los cuales se tomó muestra para la extracción de
proteínas. B) Volumen y número total de células utilizadas para la extracción de proteínas.
C) SDS-PAGE 12,5% de extractos de proteínas totales de A. ferrooxidans crecido en
hierro.
Una vez determinado el período de tiempo de crecimiento (24-72 horas) y el número
total de células necesarias para obtener un extracto de proteínas (4,2 • 109 bacterias),
desarrollamos una estrategia experimental que permita identificar un posible regulón QS en
A. ferrooxidans. Debido a que contamos con la cepa silvestre de A. ferrooxidans ATCC23270
para realizar la búsqueda de proteínas reguladas por el sistema de QS, decidimos analizar el
efecto de AHLs exógena sobre el patrón de proteínas.
25
Las moléculas de AHLs que utilizamos en esta tesis fueron obtenidas de
sobrenadantes de cultivos de bacterias productoras de AHLs, tanto de la misma cepa de A.
ferrooxidans como de una cepa de E coli que sobreexpresa la proteína AfeI y por lo tanto
sintetiza grandes cantidades de AHLs. En el capítulo siguiente, se describirá el proceso de
obtención y determinación de las concentraciones reales y relativas de las AHLs que se
utilizaron en los experimentos de inducción.
6.1.2 Obtención de AHLs
Las AHLs se sintetizan en el interior de la bacteria y luego difunden a través de la
membrana plasmática, acumulándose en el espacio extracelular. Por esta razón y debido a
su naturaleza apolar, se pueden obtener AHLs, de sobrenadantes de cultivos bacterianos
mediante una extracción orgánica.
6.1.2.1. Extracción de AHLs desde sobrenadantes de cultivos de A. ferrooxidans
ATCC23270.
La bacteria A. ferrooxidans ATCC23270 produce una gama variada de AHLs. Se
detectaron 9 moléculas diferentes mediante espectrometría de masas y 7 señales mediante
la técnica de CCF cuando la bacteria crece en perlas de azufre [15, 72].
Para obtener los extractos de AHLs, se crecieron cultivos de A. ferrooxidans en azufre
hasta la fase estacionaria de la curva de crecimiento. Una vez alcanzada la fase estacionaria
se centrifugaron los cultivos y se separaron las células de los sobrenadantes. Estos últimos
se extrajeron con solvente (ver Métodos). Para verificar sí efectivamente los extractos
contenían AHLs, éstos se analizaron mediante la técnica de CCF asociada al biosensor A.
tumefaciens NTL4 (pZLR4) que es específico para estas moléculas [27]. Esta técnica sólo
permite obtener una concentración relativa de AHLs. Al revelar con el biosensor se
observaron 5 señales en esta CCF, que corresponden a AHLs de cadena mediana y larga
(Figura 4). Para conocer la identidad de las AHLs o al menos una estructura aproximada se
26
utilizan estándares sintéticos de AHLs. En este experimento sólo se utilizaron AHLs no
sustituidas en el carbono 3. Es muy importante destacar que la sensibilidad de este
biosensor no es la misma para todas las moléculas producidas por A. ferrooxidans, ya que si
bien la cepa reportera de A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) es capaz de reconocer un amplio
rango de AHLs, presenta distintas sensibilidades para cada una de ellas, siendo más
sensible para AHLs de cadena mediana [27]. Por esto el análisis de los resultados debe ser
cuidadoso, pues una mancha azul más grande no indica necesariamente que la
concentración sea mayor que la de una mancha pequeña. Para corroborar estos resultados
se analizaron los extractos mediante espectrometría de masas (Tabla 3).
Figura 4. Análisis de diferentes extractos de AHLs mediante CCF acoplada a un biosensor.

Mediante cromatografía en capa fina de fase reversa (C18-TLC) revelada con el biosensor A.
tumefaciens NTL4 (pZLR4), se analizaron extractos orgánicos provenientes de sobrenadantes de
200 mL de cultivo de la cepa sobreproductora E. coli BL21 (DE3)-AfeI, 200 mL de cultivo de la cepa
E. coli BL21 (DE3) control y 500 mL de cultivo de A. ferrooxidans crecido en azufre. Además, se
cargaron varios estándares de AHLs.
27
La razón por la cual se decidió utilizar AHLs provenientes de sobrenadantes de cultivo
de A. ferrooxidans crecidas en azufre para los experimentos de proteómica, fue debido a que
estas corresponden a las AHLs que produce en forma natural la bacteria. La desventaja de
su utilización es la baja concentración obtenida en comparación con extractos provenientes
de la cepa sobreproductora de AHLs. Como se observa en los resultados de espectrometría
de masas (Tabla 3), las AHLs no sustituidas (C12-AHL y C14-AHL) se encuentran en
concentraciones muy bajas (del orden pM) en comparación a las AHLs producidas por la
bacteria E. coli sobreproductora de AHLs (nM).
28
Para la construcción de la tabla comparativa (Tabla 3) se utilizaron 5 muestras
independientes de extractos de sobrenadantes de cultivos tanto de A. ferrooxidans como de
E. coli BL21 (DE3)-AfeI, como control negativo de E. coli se utilizaron sólo 3 extractos
orgánicos.
6.1.2.2 Extracción de AHLs de sobrenadantes de cultivos de E. coli que
sobreexpresan la proteína AfeI.
Como se mencionó en el punto anterior, la dificultad que presenta utilizar los extractos
de AHLs producidas naturalmente por la bacteria A. ferrooxidans radica en la baja
concentración de AI en los extractos obtenidos. Debido a que se quiere “inducir” un fenotipo
QS mediante AHLs exógenas, se requiere que la concentración de éstas sea al menos un
orden de magnitud mayor que las AHLs endógenas. Por esta razón se decidió utilizar la cepa
de E. coli BL21 (DE3)-AfeI que sobreexpresa la enzima AfeI de A. ferrooxidans. Se realizó
una extracción orgánica a un sobrenadante de cultivo de esta cepa y luego se sometió a una
CCF acoplada al ensayo del biosensor NTL4 (pZLR4) (Figura 4). Se detectó la presencia de
4 señales capaces de inducir la actividad β-galactosidasa. La ausencia de señales en el
control E. coli BL21 (DE3) transformada con el plásmido sin el inserto afeI, nos indica que
AfeI es responsable de la síntesis de AHLs presentes en el sobrenadante de la cepa
sobreproductora, tal como lo describió Farah y col. (2005). Esta cepa será utilizada como
control en los experimentos de inducción, por lo que fue importante comprobar que no
producía ninguna AHL. La razón de concentración entre la cepa de E. coli sobreproductora y
A. ferrooxidans es de entre 30-50 veces, estos valores fueron calculados tanto por
espectrometría de masas como por CCF.
6.1.2.3 Síntesis de AHLs y aAHLs
Las AHLs pueden ser sintetizadas químicamente en el laboratorio con un grado de
pureza cercano al 99,9%. La ventaja que otorga el uso de AHLs sintéticas es que, al conocer
29
su peso molecular, es posible definir precisamente la concentración de trabajo. Las
concentraciones y las distintas AHLs utilizada en los experimentos serán detalladas más
adelante. En el marco del proyecto de colaboración ECOS/CONICYT C05 B04, el laboratorio
de química orgánica del profesor Doutheau (Lyon, Francia) sintetizó varias AHLs y además
nos facilitó varios análogos de AHLs.
También se utilizaron moléculas similares a las AHLs denominados análogos de AHL
(aAHLs). Estos fueron utilizados en una concentración mayor que las AHLs sintéticas debido
a antecedentes existentes en la literatura del uso de estos análogos [43, 73]. Se sintetizaron
18 AHLs sintéticas y 10 aAHLs, algunas de las cuales se utilizaron en esta tesis. Las que
fueron utilizadas se muestran en la Figura 8.
A B
N-acIl
Detectada en
homoserinA PM
A.
lactonA (mg/mmol)
ferrooxidans
(AHL)
C14-HSL 311 SI
C12-HSL 283 SI
C10-HSL 255 NO
OH-C16-HSL 355 SI
OH-C14-HSL 327 SI
OH-C12-HSL 299 SI
OH-C10-HSL 271 SI
O-C16-HSL 354 NO
O-C14-HSL 326 SI
O-C12-HSL 298 SI
O-C10-HSL 270 NO
O-C8-HSL 242 NO
Figura 5. AHLs (A) y aAHLs (B) obtenidas mediante síntesis química. En colaboración
con el laboratorio de química orgánica del profesor Doutheau (Lyon, Francia). A) Tabla de
AHLs, se indica si estas están presentes en sobrenadantes de A. ferrooxidans. B) Estructuras
de los análogos aAHL134 y aAHL 43 [43, 44, 73].
30
6.1.3. Análisis proteico de células de A. ferrooxidans inducidas por distintas
fuentes de AHLs
El objetivo de estos experimentos es buscar cambios en el patrón de expresión de
proteínas de A. ferrooxidans con la adición exógena de AIs (condición inducida) en
comparación con una condición control. Para esto se creció la bacteria en hierro y en
tiosulfato y se utilizaron como fuente exógena de AHLs todas las moléculas detalladas en la
sección anterior.
6.1.3.1. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes de A.
ferrooxidans crecido en azufre) sobre células de A. ferrooxidans crecidas en
hierro.
En este primer experimento, decidimos estudiar el efecto de las AHLs producidas
naturalmente por A. ferrooxidans cuando crece en azufre como fuente energética. Para esto,
un cultivo recientemente inoculado fue dividido en tres matraces con volúmenes iguales. A
un primer matraz se agregaron 150 µL del extracto de AHL resuspendido en metanol (cultivo
inducido). Los otros dos cultivos fueron utilizados como control. Al segundo matraz se agregó
150 µL de metanol (control solvente) y finalmente se contó con un tercer matraz al que no se
agregó nada (control).
El control solvente es necesario para asegurar que los cambios que pudiesen
observarse se deben exclusivamente a la adición de los extractos de AHLs y no del solvente.
Luego se volvió a incubar a 30°C con agitación y se tomaron muestras de cultivo a distintos
tiempos. El volumen de cultivo utilizado en cada punto correspondió al necesario para
completar un número total de 4,2 • 109 células, de acuerdo al resultado anterior (Pagina 25).
Estos volúmenes de cultivo se centrifugaron y luego las células se lavaron para eliminar las
sales y finalmente se extrajeron las proteínas con el protocolo de extracción rápida (ver
Métodos).
31
Se compararon las 3 condiciones de cultivo a las 36 y 48 horas de la curva de
crecimiento. No se encontraron diferencias significativas entre la condición inducida y los
controles (datos no mostrados). En base a este resultado y puesto que es imposible saber si
hay suficiente cantidad de AHLs en el extracto ocupado, optamos por utilizar los extractos de
AHLs obtenidos de sobrenadantes de cultivo de la cepa de E. coli sobreproductora.
cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI) sobre células de A.
ferrooxidans crecidas en hierro.
Con la misma metodología experimental utilizada en el ensayo anterior, pero con un
extracto al menos 50 veces más concentrado, se inoculó un cultivo de A. ferrooxidans en
medio con hierro. Después de 6 horas de crecimiento el cultivo fue dividido en 4 matraces, 2
de ellos control y 2 cultivos inducidos (Figura 6A). Los dos controles corresponden al control
solvente y el segundo a la cepa de E. coli que no sobreexpresa la sintasa de AHL,
respectivamente. Este último control es necesario, dado que ambas cepas de E. coli fueron
cultivadas en un medio LB y al realizar la extracción pueden quedar contaminantes de
naturaleza orgánica que interfieran e induzcan un cambio inespecífico. A los otros cultivos se
adicionaron los extractos de E. coli BL21 (DE3)-AfeI y un extracto de sobrenadante de A.
ferrooxidans crecido en azufre. Estos 4 cultivos se incubaron a 30°C con agitación y se
monitoreó su crecimiento (Figura 6B).
Se observó una diferencia de color en el cultivo inducido con respecto al cultivo con el
extracto de la cepa sobreproductora (más amarillo, matraz número 3) en comparación con
los otros 3 cultivos (Figura 6A). Esto podría deberse a un aumento en la velocidad de
oxidación de Fe2+ a Fe3+ debido a la oxidación del hierro.
32
A
1 2 3 4
B C u r v a c r e c im ie n t o A . f e r r o o x i d a n s 2 3 2 7 0 9 K F e
9 ,2 0
(1 ) (2 ) 9 ,1 0
L n c é lu la s /m l
9 ,0 0
(3 ) (4 )
8 ,9 0
8 ,8 0
8 ,7 0
8 ,6 0
8 ,5 0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78
T ie m p o ( h o r a s )
Figura 6. Efecto de los extractos de AHLs obtenidas a partir de sobrenadantes de cultivos

de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI sobre células de A. ferrooxidans crecidas en hierro. A)
Se observan los 4 cultivos que provenían de un inoculo común. La fotografía fue tomada a las
48 horas de crecimiento y corresponden a control solvente (1), control negativo de E. coli (2) e
inducciones con extractos provenientes de la cepa de E. coli sobreproductora (3) y A.
ferrooxidans (4). B) Curva de crecimiento de A. ferrooxidans crecido en hierro. Se hizo un
inoculo común y se separo a las 6 horas en 4 cultivos. Las muestras para extracción de
proteínas fueron tomadas a las 48 y 68 horas como se muestra en la figura.
Para evaluar si el efecto del extracto de AHLs sobre el cambio de color (Figura 6A) es
debido a que las AHLs aumentan el metabolismo de la bacteria y con esto la velocidad de
oxidación del hierro o es sólo un efecto de oxidación química, decidimos realizar un
experimento para observar el resultado de la adición de AHLs en ausencia de bacterias
(abiótico) o presencia de bacterias (biótico). Se utilizó el medio 9K con hierro el cual fue
dividido en volúmenes iguales en 2 matraces, uno de ellos sin células y el otro fue inoculado
con A. ferrooxidans ATCC23270. Ambos cultivos fueron divididos nuevamente en 2, a uno se
33
le agregó el extracto de AHLs y el otro sólo se le agregó solvente como control. Los 4
matraces se incubaron a 30°C durante 43 horas con a gitación.
abiótico biótico biótico

abiótico
+ AHL + AHL
B
100 100
80 80
Abiotico
Abiotico
60 Abiotico + 60
%Fe+3
%Fe2+
AHLs Abiotico + AHLs

Biotico
40 40
Bioti co
Biotico + AHLs
20 20
Bioti co + AHLs
0 0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
Tiempo (horas)
Tiempo (horas)
Figura 7. Efecto de los extractos de AHLs obtenidas a partir de sobrenadantes de cultivos

de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI sobre la oxidación del hierro. A) Se observan los 4 cultivos,
2 abióticos y 2 bióticos. Un cultivo de cada par (biótico/abiótico) fue suplementado con un extracto
2+ 3+
concentrado de AHLs. B) Resultados del análisis de los niveles de oxidación del Fe y Fe a
distintos tiempos.
Como se observa en la figura 7A existe una oxidación química (cambio de color) pero
es menor que la oxidación biológica que se observa tanto para el matraz control como para
inducido. Para ver qué sucede en las primeras horas se tomaron muestras de los 4 matraces
y se determinó el porcentaje de Fe2+ y Fe3+ a distintos tiempos (18, 22, 25 y 43 horas, Figura
7B). Se observa que si bien existe una oxidación química en ausencia de células, ésta es
constante en el tiempo, a diferencia de lo qué sucede en los matraces con células en los
cuales el Fe2+ es oxidado completamente.
34
No se observaron mayores diferencias en la velocidad de oxidación del hierro en
presencia de AHLs en los experimentos con bacterias. De igual forma quisimos ver si
existían diferencias en el patrón de expresión de proteínas. Se tomaron muestras a 48 y 68
horas de crecimiento de los cultivos de la figura 6. Al igual que el experimento anterior se
normalizó por número de células totales. Se prepararon extractos de proteínas que fueron
analizados en un SDS-PAGE. No se observaron diferencias significativas entre los extractos
proteicos de las 4 condiciones (datos no mostrados). Con esto concluimos que las
diferencias fenotípicas observadas, tal como la oxidación de hierro (Figura 7B) y la pequeña
diferencia en el crecimiento de los cultivos (Figura 6B), no se ven reflejadas en el resultado
de la electroforesis de proteínas monodimensional. Por esta razón, decidimos analizar estas
mismas muestras de proteínas mediante electroforesis bidimensional. No obstante, la
concentración de proteínas no fue suficiente y nos impidió obtener un resultado que nos
permitiera visualizar algunas diferencias entre la condición control e inducida (datos no
mostrados).
Decidimos reproducir el mismo experimento con células de A. ferrooxidans crecidas en
tiosulfato en lugar de hierro debido a que pensamos que el hierro es capaz de unirse a las
moléculas de AHLs interfiriendo en el estudio.
cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI) sobre células de A.
ferrooxidans crecidas en tiosulfato.
Los resultados de los experimentos anteriores (aparición de la coloración amarilla) nos
hicieron pensar que el hierro podría interferir en el mecanismo de QS. Por este motivo, los
experimentos que siguen se realizaron con células de A. ferrooxidans crecidas en medio con
tiosulfato como fuente energética en lugar de hierro.
35
Para evitar el problema de la acumulación endógena de AHLs, debido a que en medio
tiosulfato a diferencia de medio con hierro existe un alto nivel basal de AHLs, la metodología
utilizada fue diferente [53].
Para intentar resolver este problema experimental se inoculó un cultivo de A.
ferrooxidans en tiosulfato y éste se incubó hasta una concentración celular de 2 • 108 cel/mL.
Las células obtenidas se lavaron reiteradas veces para eliminar las AHLs endógenas. Una
vez limpias, las células se resuspendieron en medio fresco, por lo que quedaron a una
concentración de 4*109 cel/mL en cada cultivo. Se dividieron en 2 cultivos (Figura 8A), uno de
los cuales fue inducido con un extracto de AHLs proveniente del sobrenadante de la cepa
sobreproductora de AHLs, mientras que el segundo lo fue con la cepa de E. coli que no
sobreexpresa la proteína AfeI. Las células concentradas se incubaron durante 3 horas a
30°C con agitación.
Las fracciones proteicas fueron analizadas mediante SDS-PAGE cargando 50 µg
totales de proteínas de ambos extractos (Figura 8B). Se observaron diferencias en algunas
bandas de proteínas que se indican con flechas negras (Figura 8B). En nuestras condiciones
experimentales, se observa que proteínas de peso molecular mayores a 50 kDa disminuyen
su expresión en la condición inducida, mientras que proteínas cuyo peso molecular es menor
a 50 kDa aumentan su expresión en comparación al control sin inducir.
36
A B PM 1 2
kDa
Cultivo A. ferrooxidans
en tiosulfato 120
2*108 cel/ml 100
Centrifugación y lavados 60
50
40
4*1010 células 4*1010 células
30
10 ml medio fresco
25
4*109 cel/ml 4*109 cel/ml 20

Extracto control + extracto AHL
E. coli BL21 (DE3) E. coli BL21 (DE3)-AfeI
(1) (2)
15
Figura 8. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes de cultivos

de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI) sobre células de A. ferrooxidans crecidas en tiosulfato.
A) Esquema de la metodología experimental utilizada. B) SDS-PAGE 12,5% teñido con azul de
coomasie, patrón proteico de A. ferrooxidans inducido con extracto de la cepa E. coli control (1),
patrón proteico de A. ferrooxidans inducido con extracto de la cepa de E. coli sobreproductora
de AHLs (2), (PM) estándar de peso molecular de proteínas Invitrogen. Las flechas indican las
bandas donde se observan diferencias entre ambas condiciones experimentales.
Las mismas muestras de proteínas fueron analizadas mediante electroforesis
bidimensional (2D-PAGE). Se observaron cambios en proteínas con peso molecular menor a
50 kDa. En este rango se detectaron 4 proteínas que aumentan su expresión en la condición
inducida con AHLs en comparación con la condición control (Figura 9C círculos). Este
resultado concuerda con lo que se observó en el gel monodimensional en que se
encontraron proteínas de peso molecular menor a 50 kDa que aumentan su nivel de
expresión (Figura 9B). Para el caso de proteínas de peso molecular mayor a 50 kDa no
pudimos sacar conclusiones ya que no se volvieron a observar las diferencias visualizadas
37
en el gel monodimensional (Figura 9B). Esto puede deberse a que no entraron al gel o que
se encuentran en menor cantidad y por ende no se alcanzan a visualizar.
A B
PM PM
kDa kDa
66
45 a 50 c
35
25
b 20 d
19
15
4.0 pI 7.0 4.0 pI 7.0
C a c b d
Figura 9. Análisis mediante 2D-PAGE de las proteínas extraídas de células de A. ferrooxidans

crecidas en tiosulfato. Las células fueron concentradas e inducidas con un extracto de AHLs
obtenidas a partir de sobrenadantes de cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI. A) 2D-PAGE
gradiente 4-7 lineal condición control B) 2D-PAGE gradiente 4-7 lineal condición inducida con
extracto AHLs. C) Las regiones de interés encerradas en cuadrados en A) y B) se muestran en
detalle (a-c y b-d).
6.1.3.4. Efecto de AHLs sintéticas sobre células de A. ferrooxidans crecidas en
tiosulfato.
Una vez que observamos cambios en el patrón proteico de las células a las que se
adicionó exógenamente altos niveles de AHLs, quisimos determinar a qué concentraciones
38
sucede esto y cuales son las AHLs involucradas. Para este objetivo utilizamos un cóctel de
AHLs sintéticas comerciales, que contiene una mezcla de AHLs de distinto largo de la
cadena acil y sustitución del carbono 3. Esta mezcla contiene AHLs sintéticas idénticas a
aquellas producidas por A. ferrooxidans y algunas que no. Entre las AHLs de la mezcla y que
no son producidas por A. ferrooxidans se encuentra oxo-C16, oxo-C10 y C10. La única AHL
que produce A. ferrooxidans y que no está presente en la mezcla, es OH-C8. Se preparó una
solución “stock” de 50 mM de cada AHL y luego se mezclaron las 9 AHLs en DMSO,
quedando a una concentración de 3,3 mM de cada una.
En el siguiente experimento se creció un cultivo de A. ferrooxidans en tiosulfato hasta
fase estacionaria. Se lavaron las células para eliminar las AHLs endógenas. Una vez limpias
las células se resuspendieron en un volumen reducido de medio, por lo que quedaron a una
concentración de 3,4*109 cel/ml. Luego se dividieron en 2 cultivos, siendo uno utilizado como
control (control solvente), mientras que al segundo se agregó la mezcla de AHLs sintéticas
quedando a una concentración final de 3,3 µM. Los cultivos se incubaron durante 12 horas a
30°C con agitación. Se prepararon extractos totales de proteínas de ambas muestras. El
patrón de proteínas visualizado mediante una electroforesis monodimensional no reveló
diferencias (datos no mostrados). Sin embargo, se analizaron las muestras mediante un 2D-
PAGE. Se cargaron 250 µg de extracto de proteínas totales sobre una tira de gradiente de
pH 3-10 no lineal.
Se realizaron comparaciones solamente en las zonas del gel donde se encontraban
bien enfocadas las proteínas y sin “background” debido a la presencia de ácidos nucleicos.
En estas condiciones sí se observó un cambio notorio para una proteína de cerca de 40 kDa
(Figura 10). Ésta aumenta su expresión en la condición inducida con la mezcla de AHLs en
comparación con la condición control (Figura 10C).
39
A B
PM PM
kDa kDa
66 66
45 45
a b
35 35
25 25
19 19
3.0 pI 10.0 3.0 pI 10.0
C a b
Figura 10. Análisis mediante 2D-PAGE de las proteínas extraídas de células de A.

ferrooxidans crecidas en tiosulfato. Las células fueron concentradas e inducidas con una
mezcla de AHLs sintéticas. A) 2D-PAGE gradiente pH 3-10 no lineal condición control. B) 2D-
PAGE gradiente pH 3-10 no lineal condición inducida con mezcla de AHLs sintéticas. C) Las
regiones de interés encerradas en cuadrados en A) y B) se muestran en detalle (a-b).
6.1.3.5. Efecto aAHLs sintéticos sobre células de A. ferrooxidans crecidas en
tiosulfato.
Para finalizar los experimentos de proteómica en el marco de esta memoria de título y
como se mencionó en la introducción de este capítulo, se probó también el efecto de
análogos de AHL (aAHLs). En la medida que una de estas moléculas fuese capaz de unirse
al regulador AfeR podría simular un fenotipo tanto tipo mutante nula (efecto antagonista),
como tipo sobreproductor (efecto agonista).
Las moléculas de aAHLs que utilizamos habían sido probadas con el biosensor de V.
fisheri [43, 44, 73]. Para determinar la actividad biológica que presentaban estas moléculas
en el sistema luxIR se evaluó la influencia de éstas en la inducción de la bioluminiscencia.
Los resultados obtenidos con estos estudios permitieron clasificar los aAHLs como agonistas
40
o antagonistas, según si disminuían o aumentaban la bioluminiscencia inducida por la AHL
cognada, respectivamente.
Desde el punto de vista metodológico no fue necesario concentrar las células ya que
queríamos analizar con el fin de evaluar si los análogos compiten positiva o negativamente
con las AHLs endógenas de A. ferrooxidans, decidimos probar una molécula de cada tipo (un
agonista, aAHL 43 y un antagonista, aAHL 134) para el sistema LuxIR. Como antagonista
elegimos al aAHL 134 porque pertenece a la familia de análogos derivados de sulfonamidas
(Figura 5B, Página 30) y que, al igual que la mayoría de las AHLs producidas por A.
ferrooxidans, posee una cadena acilo larga. En el marco de esta tesis de pregrado sólo
utilizamos éstos 2 aAHLs. Se realizaron estudios preliminares de proteómica y también
funcionales con otros análogos, determinando su efecto en el biosensor de S. meliloti [30]
que reconoce AHLs de cadena larga, pero no serán incluidos en esta tesis.
Se evaluó el efecto del aAHL 134 en un cultivo de A. ferrooxidans crecido en tiosulfato.
Se utilizó la molécula a una concentración de 40 µM. Los cultivos se crecieron durante 63
horas monitoreando la concentración celular y el pH del medio. Luego, se centrifugaron los
cultivos y los sobrenadantes obtenidos fueron sometidos a una extracción orgánica con
DCM. No se observaron diferencias en el crecimiento celular ni en el pH del medio (Figura
11A) y tampoco en el patrón de expresión proteico (datos no mostrados). Sin embargo, los
resultados de los sobrenadantes de ambos cultivos presentaron diferencias (Figura 11B).
Se observó un patrón de señales distinto entre ambas condiciones, en la CCF, (Figura
11B). El extracto control tiene una sola señal la cual corresponde a la señal más abundante
de los extractos de sobrenadantes de cultivos de A. ferrooxidans (Figura 4, página 27). Sin
embargo en el sobrenadante de células crecidas en presencia del aAHL 134 desaparece
esta señal abundante y aparecen 5 señales distintas. Si bien es imposible concluir a qué
corresponden las manchas del sobrenadante del cultivo inducido con aAHL 134, podemos
41
inferir que este antagonista podría ser responsable de la desaparición de la señal abundante
que se encuentra en los sobrenadantes de cultivo de A. ferrooxidans.
A B
Curva crecimiento y pH A. ferrooxidans
en tiosulfato
20,00 6
19,50
5
19,00
Ln número células/ml
4 C8
18,50
pH
18,00 3
17,50
Concentración celular Control 2
17,00 Concentración celular Aahl 134
1 C10
pH Control
16,50
pH Aahl 134
16,00 0
C12
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Tiempo (horas) Estándares control aAHL 134
tiosulfato. A) Curva crecimiento y pH de A. ferrooxidans crecido en tiosulfato. B) Análisis de los
sobrenadantes de 50 mL de cultivo de A. ferrooxidans crecidas en tiosulfato mediante
cromatografía en capa fina revelado con el biosensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). En la figura
se compara el sobrenadante del cultivo control con el sobrenadante de las células que crecieron
en presencia del aAHL 134.
Como agonista putativo, utilizamos el aAHL 43 (Figura 4, página 27). Se inoculó un
cultivo de A. ferrooxidans en tiosulfato. Se dividió en 2 matraces, uno fue utilizado como
control (control solvente) y al otro se le agregó el aAHL 43, quedando éste a una
concentración final en el matraz de 40 µM. A lo largo de la curva de crecimiento se monitoreó
la concentración celular y el pH.
42
A Curva crecimiento y pH A. ferrooxidans C
en tiosulfato PM Control aAHL 43
19 5,00
(kDa)
18,5 4,50
18 4,00 116
17,5 3,50
Ln número células/ml
17 3,00
66
Concentración
pH
16,5 2,50
celular control
16 2,00
Concentración
15,5 celular aAHL 43 1,50
pH Control 45
15 1,00
14,5 pH aAHL 43 0,50
14 0,00
35
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (horas)
B
Cultivo Cultivo 25
Control aAHL 43
Masa de azufre 31,7 mg 1,6 mg
Masa de células 41,8 mg 102,3 mg 18
tiosulfato. A) Curva crecimiento y pH de A. ferrooxidans crecido en tiosulfato. B) Tabla
comparativa de la masa celular total y de azufre precipitado en el experimento. C) Análisis de los
extractos de proteínas de cultivos de A. ferrooxidans crecidas en tiosulfato mediante SDS-PAGE
12,5%, extracto de proteínas del cultivo control (control), extracto de proteínas de las células que
crecieron en presencia del aAHL 43 (aAHL 43), estándar de peso molecular de proteínas
fermentas (PM). Las flechas indican las bandas donde se observan diferencias entre ambas
condiciones experimentales.
Al igual que en el experimento anterior no se observaron diferencias ni en la curva de
crecimiento ni en el pH, pero sí en la masa total de células al final del experimento y también
en la cantidad de azufre precipitado (que se forma en el proceso de oxidación del tiosulfato).
El cultivo crecido en presencia del aAHL 43 acumula cerca de 20 veces menos azufre que el
cultivo control y además tiene una masa celular final de dos veces el control (Figura 12B).
Los extractos proteicos se visualizaron en un gel monodimensional, como se muestra
en la figura 12C. Los cambios observados se señalan con flechas negras y corresponden a
43
proteínas cuyo peso molecular es menor a 50 kDa. En general, se observa un aumento en la
expresión de proteínas en los cultivos en presencia del aAHL 43.
Para finalizar esta tesis ahondaremos en el punto mencionado anteriormente, el efecto
del hierro sobre las AHLs para tratar de entender el por qué las grandes diferencias
encontradas en el espectro de AHLs en los diferentes sustratos energéticos y los cambios de
color observados en los experimentos realizados con A. ferrooxidans crecido en hierro.
6.2. Caracterización de un posible complejo entre Fe y AHLs
El análisis de sobrenadantes de cultivos de A. ferrooxidans crecidos en hierro ha
revelado que este microorganismo produce un espectro menor de AHLs [15]. Efectivamente,
mientras es posible identificar 9 tipos de AHLs a partir de sobrenadantes de 500 mL de
cultivos en azufre o tiosulfato, en hierro (a partir del mismo volumen) sólo se detectan 2 tipos
de AHLs. Por otro lado, el gen afeI se encuentra reprimido cuando la bacteria crece en hierro
en comparación a cuando crece en compuestos reducidos del azufre [15]. Aparentemente el
circuito regulatorio paradigmático de todos los sistemas de QS, en el que el aumento en la
densidad celular aumenta la concentración del AI y también de la sintasa de AHLs, parece
no ser valido cuando A. ferrooxidans crece en un medio con hierro.
Además, se realizó una observación visual, de lo que sucedía al agregar AHLs al
medio 9K hierro en ausencia de bacterias. Se observó el cambio de color en el medio en
presencia del extracto de AHLs (Figura 6A-7A, Páginas 33-34). El cambio en el color de la
solución puede deberse a 2 motivos no excluyentes entre sí. El primer motivo por una
oxidación del Fe2+ del medio a Fe3+ y el segundo a la formación de un complejo coloreado
[Fe2+-AHL].
Estos antecedentes y la estructura química de las moléculas de AHLs sugieren que las
AHLs podrían formar un complejo con el hierro, considerando que en el medio de cultivo la
44
concentración de hierro es de 6 g/L. La formación de este complejo podría explicar la
titulación de las AHLs producidas por la expresión basal del gen afeI y por ende de la
inhibición del circuito regulatorio en medios de cultivo con hierro.
En base a estos elementos, nos propusimos entonces explorar la existencia de tal
complejo [Fe2+-AHL]. Para esto se utilizó una solución de medio 9K con hierro que se dividió
en 2 volúmenes, a uno se le agregó un extracto concentrado de AHLs y el otro se utilizó
como control sin AHLs. Nuevamente, al agregar AHLs, se obtuvo una solución coloreada
(Figura 13). Para descartar que el cambio de color se debiera a una oxidación química del
hierro, ambos sobrenadantes se cultivos se extrajeron con DCM.
MEDIO MEDIO 9KFe

9KFe + AHLs
(1) (2)
a)
F.A F.O F.A F.O

b) b)
1 1 2 2
Figura 13. Experimento preliminar de caracterización del posible complejo entre hierro y
AHL. Se tomaron 10 mL de cada solución (a) y se realizó una extracción orgánica con DCM (b).
Para cada extracción se obtuvo una fase acuosa (F.A) y una fase orgánica (F.O).
45
La obtención de una fase orgánica coloreada a partir de la solución 2 sugiere la
presencia de un complejo [Fe2+-AHL]. Esta coloración no está presente en la fase orgánica
de la solución 1 (Figura 13). Este primer resultado experimental apoyó fuertemente nuestra
hipótesis, de que el hierro podría formar un complejo con las moléculas de AHLs.
Para caracterizar este complejo, nos propusimos diseñar un experimento que nos
permitiera analizar la dinámica de una solución de hierro en presencia de AHLs (Figura 14).
Se trabajó con una solución de Fe2+ cuya concentración fue determinada exactamente
mediante absorción atómica (2 y 5 mg/L) y a la cual se adicionó cantidades definidas de
distintas AHLs. Una vez formado el complejo y con el fin de analizar la presencia del hierro
tanto en la fase acuosa como en la fase orgánica, se realizó una extracción con DCM (ver
Métodos).
Extracción
Solución de Fe+2 orgánica con
Fase Fase
DCM
+ acuosa orgánica
Solución de AHL
Análisis cuantitativos: Análisis cualitativos:

Determinación de hierro Caracterización del
(Fe+2 y Fe+3) mediante complejo mediante CCF y
absorción atómica y estudios analíticos que
espectrofotometría. permiten identificar hierro.
2+
Figura 14. Metodología experimental de la caracterización del complejo [Fe -AHLs].
46
6.2.1. Análisis cuantitativos de la fase acuosa
Para determinar la concentración de hierro en la fase acuosa utilizamos dos técnicas
complementarias. En primer lugar determinamos el hierro total mediante absorción atómica
(Fe2+ + Fe3+) y en segundo lugar, determinamos la concentración de Fe2+ mediante el uso de
una técnica colorimétrica que permite seguir por espectrometría la formación de un complejo
Fe+2/fenantrolina. Nuestros resultados revelaron que la concentración de hierro en la fase
acuosa disminuye en presencia de AHLs en relación al control sin AHLs (Figuras 15 y 16).
EXPERIMENT O FORMACION COMPLEJO [Fe+ 2-AHL]

Concentraci ón hierro total (ppm)
1.8
1.6 1.6
1.4 1. 3
1.2
1.0
1.0
0.8
0.6
0.4 0.3
0.2
0.0
solucion patrón solucion patrón + solucion patrón + solucion patrón +

C10-AHL C12-AHL extracto AHL
Figura 15. Cuantificación de hierro total por absorción atómica. La solución patrón de hierro
corresponde a 1,6 mg/L. Las concentraciones de C10-AHL y C12-AHL utilizadas son 10 veces
mayor que la de hierro (0,3 mM).
Se observa en ambas figuras que la concentración de hierro disminuye en presencia
de AHLs. Tanto para el hierro total como para el Fe2+ las mayores disminuciones se
observan con la C12-AHL (Figuras 15 y 16). De acuerdo a estos resultados podemos
47
concluir que el hierro presente en el medio 9K en forma de Fe+2 puede titular las AHLs que
produce A. ferrooxidans impidiendo probablemente la unión al regulador AfeR y con esto la
activación del sistema de QS.
EXPERIMENTO FORMACION COMPLEJO [Fe+2-AHL]
5,0
4,4
Concentración Fe+2 (ppm)
4,5
4,0
3,5
2,9
3,0
2,5
1,9
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
solucion patrón 1 solucion patrón 1 + solucion patrón 2 solucion patrón 2 +
oxo-C6-AHL C12-AHL
+2
Figura 16. Cuantificación de Fe por el método de la fenantrolina. La solución patrón 1 de
hierro corresponde a 5 mg/L. La solución patrón 2 de hierro corresponde a 1,9 mg/L. Las AHLs se
encuentran 10 veces más concentradas que la solución de hierro.
6.2.2. Análisis cualitativos de la fase orgánica
El hierro como ión no es soluble en solventes orgánicos por lo que la única posibilidad
de encontrar hierro en la fase orgánica es que esté formando parte de un complejo.
Con el objetivo de determinar si la pérdida de hierro de la fase acuosa correspondía a
una transferencia hacia la fase orgánica se realizaron dos tipos de análisis. El primer análisis
se realizó en el laboratorio de Química Analítica de la Facultad de Ciencias de la Universidad
48
de Chile y consistió en mediciones de absorción UV. Los resultados de estos análisis
revelaron que la fase orgánica contenía hierro.
Un segundo análisis consistió en la comparación de patrones de migración del putativo
complejo [Fe2+/C10-AHL] y de C10-AHL mediante cromatografía en capa fina (CCF). Como
era de esperar, el complejo [Fe2+-AHL] que es menos polar que la AHL sola, tuvo un Rf
mayor (Figura 17).
Por otro lado, el resultado obtenido con la reacción de Dragendorff (Figura 17),
específica para grupos aminas y amidas, apoya fuertemente la hipótesis de la formación de
un complejo.
A B
Rf
(1) 0,64
(2) 0,88
(1) (2)
Figura 17. Análisis del patrón de migración del precipitado del complejo AHL-hierro. A) CCF
2+
revelada con reactivo de Dragendorff C10-AHL (1), fase orgánica (C1-AHL+Fe ) (2), los círculos
muestran el lugar de migración de las moléculas. B) Tabla comparativa entre la AHL sintética y el
putativo complejo. Se calcularon los Rf y se indica el reactivo con que es revelado cada una de las
moléculas.
49
Efectivamente, al formar parte de un complejo, la C10-AHL se revela en menor
proporción con el reactivo (Figura 17A), lo que indica que el grupo amida de cada molécula
de AHL no se encuentra disponible, o dicho de otra manera se encuentra complejado por el
par de electrones libres del nitrógeno, escondiendo así el enlace amida (principio del reactivo
de Dragendorff).
En conjunto, estos resultados apoyan la idea de la formación de un complejo [Fe+2-
AHL]. Por esta razón, es lógico pensar, que al crecer A. ferrooxidans en un medio
suplementado con hierro se estarían titulando las AHLs producidas inicialmente por la
bacteria y también las AHLs agregadas de manera exógena.
50
7. DISCUSIÓN
La minería se constituye como la primera fuente de ingresos del país, siendo éste
actualmente el primer productor mundial de cobre. El desarrollo de nuevas tecnologías que
permitan el avance de esta actividad contribuirá a mantener el lugar que ha ganado nuestro
país en el área. La biolixiviación aparece como una alternativa de bajo costo y no
contaminante para realizar tareas de extracción de minerales de baja ley. La biolixiviación de
metales involucra, en su mayoría, bacterias quimiolitoautotróficas, mesófilas, acidófilas y
arqueas, dentro de las cuales Acidithiobacillus ferrooxidans es la bacteria mas estudiada.
El mecanismo por el cual se realiza la biolixiviación actualmente no se conoce del todo,
pero se postula que las bacterias adheridas al mineral en forma de biopelícula son las
encargadas de realizar este proceso [54, 55]. La mayor parte de las bacterias biolixiviantes
crecen adheridas a superficies de sustratos sólidos (minerales) [55]. A. ferrooxidans a demás
es capaz de desarrollar biopelículas y exhibir modificaciones morfológicas durante el proceso
de adherencia. La formación de biopelículas está regulada en diversas bacterias por el
sistema de Quorum Sensing (QS) [45]. Si A. ferrooxidans es capaz de formar biopelículas y
sí la formación de biopelículas estaría regulada por el sistema QS, es de vital importancia
caracterizar y estudiar el sistema QS en esta bacteria. Además de determinar que otros
mecanismos regula este sistema en este microorganismo.
7.1 Caracterización de un regulón QS en A. ferrooxidans
Hasta la fecha no se ha descrito fenotipos directamente relacionados con el
mecanismo de QS en A. ferrooxidans [74]. Solo se sabe que A. ferrooxidans posee un
sistema QS del tipo 1 funcional [15]. Por lo que es necesario determinar que genes son
expresados diferencialmente en respuesta al mecanismo de comunicación celular. En este
51
trabajo abordamos el problema con la proteómica, es decir, determinar que proteínas se
expresan diferencialmente en presencia de AHLs.
7.1.1 Biomasa y análisis de autoinducción en A. ferrooxidans
Se hace complicado el estudio de un regulón QS, en un fondo genético silvestre,
debido a la presencia de altos niveles endógenos de AHLs. El estudio realizado en un fondo
silvestre en la bacteria S. meliloti [53] fue realizado induciendo las células con sus
autoinductores cognados (oxo-C16:1-AHL y C14-AHL). Las células se lavaron en reiteradas
ocasiones antes de la adición del autoinductor y se inoculó a una densidad celular baja, para
evitar la acumulación de AHLs endógenas. Luego se crecieron en presencia de AHL durante
2 horas obteniendo un rendimiento de 100 mg de peso seco de células por litro de cultivo.
Este rendimiento permite obtener extractos proteicos suficientes para análisis. Ahora si
pensamos en la bacteria A. ferrooxidans que tiene un tiempo de duplicación aproximado de
12 horas y que alcanza una concentración de 2-5 • 108 células/mL como máximo, no
podríamos obtener una cantidad de células suficientes para los experimentos de proteómica.
Es por esto que abordamos la problemática con 2 metodologías diferentes. La primera
metodología es crecer la bacteria en presencia de las AHLs y obtener extractos celulares una
vez que se haya alcanzado la fase exponencial o estacionaria de crecimiento. Con este
procedimiento tenemos el problema de la acumulación de las AHL producidas por la propia
bacteria. La segunda es realizar experimentos a tiempos cortos de incubación, para esto las
células deben llegar a una densidad celular alta y luego realizar una serie de lavados para
eliminar las AHLs endógenas presentes en el sobrenadante del cultivo, luego las células se
concentran y se inducen. El problema de esta metodología es que al concentrar las células,
afectamos el estado fisiológico de éstas y algunos de los cambios observados pueden
deberse al estrés metodológico provocado.
52
7.1.2 Adición de AHLs exógenas
Los primeros experimentos fueron realizados con extractos de la propia bacteria. La
ventaja de utilizar estos extractos es que poseen la composición y las proporciones relativas
naturales de AHLs de la bacteria y la desventaja es la baja concentración de los extractos
obtenidos. Luego se decidió probar con extractos de la cepa de E. coli que sobreexpresa la
proteína sintasa de AHLs que permite obtener extractos mas concentrados y con un patrón,
a nivel de la composición, de AHLs similar al de A. ferroxidans. La diferencia de
concentración se observa en las CCF (Figura 4, Página 27) ya que, el factor de
concentración es de cerca de 50 veces entre el extracto de E. coli y el de A. ferrooxidans, es
decir para ver una señal de similar intensidad debo agregar un extracto al menos 50 veces
mas concentrado de A. ferrooxidans.
Para los experimentos con AHLs sintéticas se utilizaron concentraciones del orden µM
que son cerca de 6 ordenes de magnitud mayor que las que se determinaron en cultivos de
A. ferrooxidans mediante cromatografía líquida de fase reversa acoplada a un espectro de
masas (LC–MS–MS)), que son del orden de pM. La idea de ocupar un exceso de moléculas
autoinductoras es asegurarse que un porcentaje de éstas efectivamente ingrese al interior de
la célula, ya que son todas AHLs de cadena larga que ingresan a la célula probablemente a
través de transportadores de membrana [18], por lo tanto saturando el sistema nos
aseguramos de que ingresen a la célula. Como se describió en los resultados, la mezcla de
AHLs utilizada contiene moléculas producidas por la bacteria y otras que no y también
carece de algunas que se encuentran normalmente en los sobrenadantes. Este hecho hace
complicado el análisis de los resultados encontrados, ya que pudiese existir un efecto de
competencia entre las moléculas autoinductoras y no se puede descartar que la falta de una
de ellas sea relevante en el mecanismo de autoinducción.
53
7.1.3 Utilización de análogos de AHLs
Finalmente, se decidió utilizar moléculas de estructura similar a las AHLs, buscando
interferir con el mecanismo de QS. Como se explicó en la introducción existen moléculas
sintetizadas químicamente o por otros microorganismos capaces de unirse al regulador
transcripcional y bloquearlo [39, 41]. Estas moléculas son análogos de AHLs que presentan
diferencias en la cadena acilo conservando el anillo lactona. La mayoría de las moléculas
que disponemos en el laboratorio han sido probadas en la bacteria V. fischeri [41] teniendo
un efecto antagonista excepto aAHL 43, que tiene un efecto agonista. Es interesante contar
con estos 2 tipos de efectos ya que se requiere un efecto antagónico para bloquear el
circuito de autoinducción y asemejarse a una mutante y por otro lado una molécula agonista,
en el caso de que el QS tenga un efecto en la formación de biopelículas y la proteína AfeR
sea un regulador positivo, sería de gran utilidad en los procesos de biolixiviación en que
participa este microorganismo.
En ninguno de los experimentos realizados se observó diferencia en las curvas de
crecimiento, esto puede deberse a errores en el recuento o a la baja sensibilidad del método
ya que en el experimento de la figura 12 se obtuvo el doble de células en el cultivo que se
creció con aAHL 43 en comparación con el cultivo control. Esto también se correlaciona con
la cantidad de azufre precipitado que se mencionó en los resultados, indicando que hay
diferencias fisiológicas que no son detectadas con las curvas de crecimiento rutinarias.
A modo de resumen podemos concluir que para realizar la búsqueda de proteínas del
regulón QS debemos crecer A. ferrooxidans en tiosulfato como fuente energética, ya que no
sabemos que es lo que sucede con las AHLs en un medio con altas concentraciones de
hierro (6 g/L). También sabemos que la concentración de AHLs es fundamental para
observar cambios ya que al estar trabajando con una cepa silvestre tenemos la presencia de
AHLs endógenas. Sólo se observaron cambios cuando ocupamos los extractos provenientes
de sobrenadantes de cultivos de la cepa de E. coli sobreproductora de AHLs y cuando
54
ocupamos AHLs sintéticas en concentraciones µMs. Para estos experimentos tuvimos que
trabajar a altas densidades celulares (células concentradas) lo que puede provocar un estrés
a las células por lo cual se hacen fundamentales los controles respectivos. El uso de
moléculas análogas nos otorga muchas ventajas. Una de ellas es que podemos utilizarlas
aún en presencia de AHLs endógenas ya que precisamente queremos ver el efecto de estas
moléculas en una cepa silvestre y por esta misma razón tampoco es necesario concentrar
las células para los experimentos. No pudimos identificar ninguna proteína en particular en
esta tesis pero si observamos diferencias en el patrón de expresión, en el número de células,
acumulación de azufre y patrón de AHLs en el sobrenadante de cultivos de A. ferrooxidans.
Se espera más adelante repetir estos ensayos y mediante espectrometría de masas
identificar proteínas que se repriman o aumente su expresión en una condición inducida.
7.2 Identificación de un complejo putativo entre el Hierro y las AHLs.
Otro punto abordado en esta tesis fue la identificación de un posible rol de las
moléculas de AHLs como quelantes de hierro. Se ha visto que otras moléculas involucradas
en mecanismos de comunicación celular como las señales de quinolonas de Pseudomona
(PQS), son capaces de formar un complejo con Fe3+ [75]. Esto permite dar una explicación al
por qué en cultivos crecidos a una alta concentración de hierro (6 g/L) no se detectan niveles
similares de AHLs a las presentes en cultivos crecidos en compuestos reducidos del azufre.
Efectivamente las AHLs de acuerdo a su estructura química son capaces de unirse al
metal, cambiando así sus propiedades fisicoquímicas. Las concentraciones fisiológicas de
AHLs son menores en comparación a la concentración de hierro presente en los medios de
crecimiento de A. ferrooxidans. Esta concentración de hierro es también bastante alta en
relación con otras bacterias que crecen con niveles trazas de hierro en sus medios de cultivo.
Teóricamente los complejos de hierro son octaédricos por lo que se propone un complejo
55
con una estequiometría de 3 moléculas de AHL por una de Fe2+. La hipótesis de la formación
de un complejo fue comprobada mediante estudios cuantitativos y cualitativos in vitro.
También, se hicieron experimentos de NMR para identificar la estructura de este complejo,
no fueron mostrados en esta tesis ya que todavía están en proceso, pero los primeros
resultados indican que efectivamente la molécula altera su estructura original, de acuerdo al
corrimiento de señales.
Si estamos en lo correcto y así lo muestran los resultados obtenidos en esta tesis, la
señal autoinductora no estaría disponible para unirse a la proteína reguladora bloqueando el
circuito de autoinducción y tomando ahora un nuevo rol en la fisiología bacteriana. Por lo
tanto fisiológicamente hablando podríamos decir que el sistema de QS no sería funcional
cuando A. ferrooxidans utiliza hierro como fuente energética.
56
8. CONCLUSIONES
• Se identificaron condiciones óptimas de crecimiento (número de células y volumen de
cultivo) necesarias para obtener extractos de proteínas para los análisis de proteómica en A.
ferrooxidans
• La adición exógena de extractos de AHLs provenientes de cultivos que no fueron
capaces de inducir cambios fisiológicos detectables en células de A. ferrooxidans crecidas en
hierro.
• La adición exógena de extractos de AHLs provenientes de cultivos de la cepa de E.
coli que sobreexpresa la proteína AfeI, aparentemente afecta la fisiología de los cultivos de
A. ferrooxidans crecidas en hierro. No se descarta que el cambio se deba a la formación de
un complejo entre hierro y AHL in vivo.
• La adición exógena de extractos de AHLs provenientes de cultivos de la cepa de E.
coli que sobreexpresa la proteína AfeI en células de A. ferrooxidans crecidas en tiosulfato,
afecta el patrón de expresión de proteínas de la bacteria.
• La adición exógena de AHLs sintéticas a células de A. ferrooxidans creciendo en
tiosulfato, afecta el patrón de expresión de proteínas de la bacteria.
• El uso de los análogos aAHL43 y aAHL134 en el crecimiento de células de A.
ferrooxidans creciendo en tiosulfato, afecta el patrón de expresión de proteínas y de
producción de AHLs de la bacteria.
• El hierro es capaz de complejar a las moléculas de AHLs, por lo que queda
descartado el hierro como medio de cultivo para los análisis de proteómica.
57
9. BIBLIOGRAFÍA
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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

BÚSQUEDA DEL REGULÓN “QUORUM SENSING” DE

Memoria para optar al título profesional de Bioquímica

María José Gallardo Nelson

Mercedes Zaldívar S.R. Dr. Nicolas Guiliani G.

Dpto. de Bioquímica y Biología Dpto. de Biología

Molecular. Facultad de Ciencias, Universidad de Chile.

Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas, Universidad de Chile.

3.1 V. fischeri y el primer sistema de quorum sensing (QS) descrito ....................... 2

3.2 Clasificación de los sistemas de QS .................................................................. 4

3.3 QS mediado por N-acil homoserina lactona (AHL) o autoinductor del

tipo 1 (AI-1) ............................................................................................................... 4

3.3.1 Sintasas de AHL y familia de proteínas I .................................................... 5

3.3.2 Estructura, transporte y acumulación de AHLs ........................................... 5

3.3.3 Familia de proteínas R................................................................................ 7

3.4 Detección de AHLs mediante biosensores ........................................................ 8

3.5 Interferencia de los sistemas de QS .................................................................. 9

3.6 Regulón QS y estudios de proteómica............................................................. 10

3.7 QS en Acidithiobacillus ferrooxidans y propuesta de investigación .................. 12

4.1 Objetivos ......................................................................................................... 15

4.1.1 Objetivo General....................................................................................... 15

4.1.2 Objetivos específicos................................................................................ 15

5.1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo .................................................... 16

5.3 Experimentos de identificación de acil homoserina lactonas (AHLs)................ 17

5.3.1 Extracciones orgánicas desde sobrenadantes de cultivos bacterianos..... 17

5.3.2 Separación de la extracción orgánica por Cromatografía en

Capa Fina (CCF) ................................................................................................. 17

5.3.3 Revelado con biosensor A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) ........................... 17

5.4 Técnicas de proteómica................................................................................... 18

5.4.1 Preparación de extractos proteicos totales de A. ferrooxidans

5.4.2 Determinación cuantitativa de las proteínas ............................................. 18

5.4.3 Electroforesis monodimensional en geles de poliacrilamida en

condiciones desnaturantes ................................................................................... 19

5.4.4 Electroforesis bidimensional (2D-PAGE) .................................................. 19

5.5 Cuantificación de Hierro .................................................................................. 20

5.5.1 Análisis cuantitativos ................................................................................ 20

5.5.1.1 Absorción atómica ................................................................................ 20

5.5.1.2 Método de la fenantrolina ..................................................................... 21

5.5.2 Análisis cualitativos .................................................................................. 21

5.5.2.1 Cromatografía en capa fina .................................................................. 21

5.5.2.2 Absorción Ultravioleta........................................................................... 22

5.6 Experimentos de adición de AHLs exógenas................................................... 22

6.1 Búsqueda de un regulón QS mediante estudios proteómicos.......................... 23

6.1.1 Búsqueda de condiciones óptimas de crecimiento celular y

6.1.2 Obtención de AHLs .................................................................................. 26

6.1.2.1. Extracción de AHLs desde sobrenadantes de cultivos de

6.1.2.2 Extracción de AHLs de sobrenadantes de cultivos de E. coli

que sobreexpresan la proteína AfeI................................................................... 29

6.1.2.3 Síntesis de AHLs y aAHLs.................................................................... 29

6.1.3. Análisis proteico de células de A. ferrooxidans inducidas por

distintas fuentes de AHLs ..................................................................................... 31

6.1.3.1. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes de

A. ferrooxidans crecido en azufre) sobre células de A. ferrooxidans

6.1.3.2. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes

de cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI) sobre células de

A. ferrooxidans crecidas en hierro. .................................................................... 32

6.1.3.3. Efecto de extractos de AHLs (obtenidas a partir de sobrenadantes

de cultivos de la cepa E. coli BL21 (DE3)-AfeI) sobre células de

A. ferrooxidans crecidas en tiosulfato................................................................ 35

6.1.3.4. Efecto de AHLs sintéticas sobre células de A. ferrooxidans