Guía%Ejercicios%Certamen%1%

Fundamentos%de%Ingeniería%Bioquímica%
IWQ;250%
2014;1%
! 222
1. La! velocidad! de! reacción! de! una! catálisis! enzimática! simple! es! descrita! por! la! ecuación! de! Briggs9
Haldane:!
!
a) Escriba! la! ecuación.! ¿Bajo! qué! condiciones! es! válida! esta! ecuación?! (¿Qué! suposiciones! se!
hacen!para!su!obtención?)!
b) ¿Cuál! es! la! diferencia! de! esta! expresión! con! su! análoga! para! MIchaelis9Menten?! ¿Cuál! de! las!
dos!es!más!completa?!
!
! Examinando!la!Ecuación:!
!
c) Escriba!a!que!tiende!v!cuando!la!concentración!de!sustrato!es!mucho!mayor!que!Km!para!este!
sustrato.!
d) ¿Cuál!es!la!velocidad!de!reacción!cuando!la!concentración!de!sustrato!es!igual!a!Km?!
!
2. Una! reacción! catalizada! por! una! enzima! tiene! una! velocidad! de! 35! [mmol/mL9min]! cuando! la!
95
concentración! de! sustrato! es! 0,01! [M].! Si! Km! es! 2x10 ! [M],! ¿Cuál! será! la! velocidad! inicial! para! las!
93 94 94 96 96
siguientes!concentraciones!de!sustrato!en![mol/L]:!3,5x10 ;!4x10 ;!2x10 ;!2x10 ;!1,2x10 ?!
!
3. Usted!cree!que!ha!encontrado!un!nuevo!inhibidor!(I)!para!el!HIV9proteasa,!por!lo!que!lleva!a!cabo!unos!
pocos! experimentos! para! caracterizar! su! comportamiento.! Los! resultados! indican! que! al! agregar! un!
exceso!de!sustrato!sintético!a!la!proteasa!en!presencia!del!inhibidor,!la!actividad!enzimática!aumenta!
pero!solo!hasta!un!50%!de!la!vmax!observada!en!ausencia!del!inhibidor.!Si!la!afinidad!de!la!enzima!por!el!
sustrato!no!!se!ve!afectada!¿Qué!tipo!de!inhibidor!es!(I)?!Fundamente.!
!
4. Se! ha! obtenido! la! siguiente! expresión! cinética! para! la! reacción! de! hidrolisis! de! maltosa! con!
glucoamilasa:!
15!
!= !
45 + ! + 0,2! !
!
Donde!m!es!la!concentración!molar!de!maltosa!y!v!la!velocidad!inicial!de!hidrolisis!de!maltosa.!!!!!!!Si!la!
reacción!es!inhibida!por!el!sustrato!(s)!y!KI!>>>!Km,!¿de!qué!tipo!de!inhibición!se!trata?!
!
5. Una! enzima! es! inhibida! en! forma! no! competitiva.! En! ausencia! de! inhibidor! se! han! obtenido! los!
siguientes!resultados:!
!
! S!! [mM]! 0,23! 1,00! 1,73! 2,10!
! ν!! ![μmol/mL9min]! 40! 120! 161! 175!
!
Se!sabe!que!a!una!concentración!de!inhibidor!de!35![mM]!la!velocidad!máxima!es!125![μmol/mL9min].!
Determinar!vmax,!Km!y!KI!para!la!reacción!enzimática.!
!
6. Los!siguientes!resultados!de!velocidad!inicial!de!conversión!de!succinato!a!malato,!en!presencia!de!una!
determinada! concentración! de! malato! (que! se! sabe! es! la! única! molécula,! presente! en! el! reactor! que!
podría!actuar!como!inhibidor),!fueron!obtenidos!con!succinato!deshidrogenasa,!que!cataliza!la!reacción:!
!
 !
S!en![mM]!
v!en![mM/min]!
!
Por!otro!lado,!con!un!preparado!de!succinato!deshidrogenasa!se!contactó!una!solución!de!100![M]!de!
succinato,!obteniéndose!los!siguientes!resultados:!
!
Tiempo% Malato%
[min]% [mM]%
0! 0!
20! 25000!
40! 41000!
60! 50000!
80! 60000!
100! 62000!
120! 62000!
150! 62000!
!
Si! se! sabe! que! la! afinidad! de! la! enzima! por! el! sustrato! se! ve! alterada! por! la! presencia! de! Malato,! se! pide!
determinar! la! expresión! cinética! de! conversión! enzimática! de! succinato! a! malato,! evaluando! todos! sus!
parámetros!cinéticos,!¿Qué!concentración!de!malato!se!usó!en!el!set!de!experimentos!correspondientes!al!
gráfico,!si!la!afinidad!de!la!enzima!por!el!sustrato!es!igual!a!la!del!inhibidor!por!la!molécula!correspondiente!
en!la!reacción?!
!
7. Para!la!hidrólisis!enzimática!de!sucrosa!(Suc!!!2Glu)!se!utiliza!la!enzima!invertasa.!Para!llevar!a!cabo!la!
reacción,! se! dispone! de! un! preparado! enzimático! comercial! (PC),! el! cual,! según! lo! expuesto! en! el!
envase,!posee!una!actividad!específica!de!200![UI/mgPC].!Dado!que!el!preparado!ha!estado!almacenado!
en!forma!descuidada!por!largo!tiempo,!se!requiere!ratificar!el!dato!de!actividad!específica.!Para!esto!se!
preparó!una!solución!(sólo!se!diluye)!de!muestra!enzimática!(ME)!de!0,2![mgPC/mL].!Se!tomó!0,5![mL]!
de!la!muestra!previamente!preparada!y!se!mezcló!con!4![mL]!de!una!solución!de!sucrosa!de!50![g/L].!
Para! detener! la! reacción! se! agregó! 0,1! [mL]! de! un! reactivo! adecuado.! Se! tomó! muestras! y! midió! la!
absorbancia!A,!obteniéndose!los!siguientes!resultados:!
!
Tiempo% Absorbancia%a%
[min]% dilución%[1:10]%
5! 1,4628!
15! 2,5944!
!
! !
Asuma!! = 1,38 .! ,!siendo!C!la!concentración.!
! !
!
Corresponde!la!actividad!declarada!a!la!real!actual?!Especifique!claramente!cada!paso!dado!para!llegar!
a!su!resultado.!En!caso!de!no!ser!así,!determine!el!porcentaje!de!variación.!
!
8. La! hidrólisis! de! la! urea! por! ureasa! es! una! reacción! que! aún! no! se! comprende! completamente.! La!
reacción!muestra!inhibición!de!algún!tipo.!Los!siguientes!son!datos!obtenidos!experimentalmente:!
!
[S]%=%0,2%M% [S]%=%0,02%M%
1/v% [I]% 1/v% [I]%
0,22! 0,0000! 0,80! 0,0000!
0,33! 0,0012! 1,02! 0,0012!
0,51! 0,0027! 1,50! 0,0022!
0,76! 0,0044! 1,83! 0,0032!
0,88! 0,0061! 2,04! 0,0037!
1,10! 0,0080! 2,72! 0,0044!
1,15! 0,0093! 3,15! 0,0059!
! !
!
Donde!! v! :! Velocidad!inicial!en![mol/L!min]!
! ! [I]! :! Concentración!de!Inhibidor!M!
! ! [S]! :! Concentración!inicial!de!urea!M!
!
a) Determine!la!constante!de!MIchaelis9Menten!(Km)!para!esta!reacción.!
b) ¿Qué!tipo!de!inhibición!es!esta?!Fundamente.!
c) Basado!en!la!respuesta!b),!¿Cuál!es!el!valor!de!KI?.!
!
93
9. Una!enzima!de!comportamiento!Michaeliano!simple!tiene!un!Km!de!10 !M.!cuando!se!incuba!la!enzima!
96
con!una![S0]!de!5x10 !M,!el!80%!del!sustrato!reacciona!en!10!min.!
!
a) Estime!la!νmáx!de!la!reacción.!
b) Estime!la![S]!remanente!al!cabo!de!20![min]!de!comenzada!la!reacción.!
c) Proponga!un!método!para!estimar!la![E0]!con!que!se!realizó!la!reacción.!
!
!
10. Para!el!dimensionamiento!de!un!proceso!en!el!cual!se!transforma!un!sustrato!S!en!producto!P,!se!realiza!
una!experimentación!previa,!la!que!arroja!los!siguientes!resultados:!
!
Se!detectó!la!influencia!inhibidora!de!una!molécula!I!al!graficar!los!datos!vinicial![g/L/h]!v/s!S![g/L]!para!las!
reacciones!correspondientes;!con!I!(línea!continua)!y!sin!I!(cuadrados),!como!se!muestra!en!la!gráfica!
siguiente.!
!
Experimentos!adicionales!indicaron!que!la!inhibición!no!era!a9competitiva,!detectándose!solo!una!
disminución!en!la!afinidad!enzima/sustrato.!
!

!
El!proceso!consta!de!2!partes;!en!la!primera!se!transforma!el!sustrato!en!producto,!y!en!la!segunda!se!
inactiva! la! enzima! elevando! la! temperatura! del! reactor.! La! enzima! se! considera! inactiva! cuando! la!
concentración!de!enzima!activa!es!del!1%!de!la!inicial.!
!
Si!se!requiere!transformar!el!90%!del!sustrato!inicial!(100!g/L),!estime!la!temperatura!de!inactivación!de!
tal!manera!que!el!tiempo!de!inactivación!no!supere!el!50%!del!tiempo!de!transformación.!
!
Se!cuenta!con!los!siguientes!datos!para!el!proceso!de!inactivación:!
!
T°%C% kd%(1/h)%
90! 600!
60! 3,1!
!
!
!
!
!
!
!
 Ejercicios%Propuestos%
!
1. Obtenga!las!expresiones!cinéticas!para!la!velocidad!inicial!de!reacción!en!función!de!la!concentración!de!
sustrato,!considerando!los!supuestos!de!Michaelis9Menten!y!Briggs9Haldane.!Realice!este!ejercicio!para!
todos!los!casos!de!inhibición.!
!
2. Durante! un! test! de! la! cinética! de! una! reacción! catalizada! por! enzimas,! se! registraron! los! siguientes!
datos:!
!

!
!
a) Determine!la!constante!de!Michaelis9Menten!de!la!reacción!sin!inhibidor!presentada!a!30![°C]!y!a!
49,6![°C]!
b) Determine!la!velocidad!máxima!de!reacción!sin!inhibidor!a!30![°C]!y!a!una!concentración!de!enzima!
de!1,6![g/L]!
c) Determine!KI!para!la!inhibición!a!30![°C]!y!decida!qué!tipo!de!inhibidor!fue!usado!en!la!reacción.!
!
4 94
3. La!enzima!ATPasa!tiene!un!peso!molecular!de!5x10 ![Da],!un!valor!de!Km!de!10 !M!y!un!valor!para!k2!de!
10 4![moléculas!ATP/moléculas!Enzima!min]!a!37[°C].!La!reacción!catalizada!es!la!siguiente:!
94

!
!"#$%$
!"#! !"# + !! !
Que!también!puede!ser!representada!por:!
!
!! !!
! + ! !" ! + !!
!!!
Donde![S]!corresponde!a!ATP!
!
La! enzima! a! esta! temperatura! es! inestable.! La! cinética! de! desactivación! enzimática! puede! ser!
representada!por!un!sistema!de!primer!orden!como!el!siguiente:!
!
! = !! ! !!!! !
!
Donde!E0!es!la!concentración!inicial!de!enzima!y!kd!=!0,1![min]!-1
!
En!un!experimento!con!una!preparación!enzimática!parcialmente!pura,!10![μg]!de!proteína!totalmente!
 cruda!(conteniendo!la!enzima)!son!añadidos!a!1![mL]!de!mezcla!de!reacción!conteniendo!ATP!a!0,02!M,!
e!incubados!a!37![°C].!Luego!de!12!horas!de!finalizada!la!reacción!(es!decir,!a!t!!∞),!se!encontró!que!la!
concentración!de!fosfato!inorgánico!(Pi)!fue!de!0,002!M,!la!que!inicialmente!era!cero.!¿Qué!fracción!de!
preparación!cruda!de!proteína!era!la!enzima?!Ayuda:!Considere![S]>>Km!
!
4. Los!siguientes!datos!fueron!obtenidos!de!la!oxidación!enzimática!de!fenol!por!fenol!oxidasa!a!diferentes!
concentraciones!de!fenol:!
!

!
!
a) ¿Qué!tipo!de!inhibición!es!ésta?!
b) Determine!las!constantes!νmáx,!Km!y!KI!
c) Determine!la!velocidad!de!oxidación!a![S]!=!70![mg/L]!
!
5. La! decarboxilación! de! glioxalato! (S)! por! la! mitocondria! es! inhibida! por! malonato! (I).! Usando! los!
siguientes!datos!obtenidos!en!experimentos!en!un!reactor!batch,!determine!lo!siguiente:!
!

!
!
a) ¿Qué!tipo!de!inhibición!es!ésta?!
b) Determine!las!constantes!νmáx,!K'm,!y!KI.!
!
!
6. Se! diseña! un! método! para! determinar! la! actividad! de! una! enzima.! Para! esto! se! incuban! 0.6! mL! de!
muestra!con!0.6!mL!de!celobiosa,!deteniendo!la!reacción!con!0.2!mL!de!Na2CO3,!se!sabe!que!la!reacción!
es:!celobiosa! !!2!glucosa!(PM!180!g/mol).!La!muestra!se!obtiene!al!diluir!1!mL!de!caldo!en!13!mL!de!
H2O.! Para! determinar! la! velocidad! de! reacción! se! realizaron! experimentos! de! espectrometría! a! tres!
diluciones,! midiéndose! la! Absorbancia! a! distintos! tiempos.! Determine! la! actividad! específica! de! la!
enzima!(UI).!
!
t% 1:5% 1:10% 1:15% I!=!1!cm!de!celda!
!
0! 9! 9! 9! A!=!L*ε*C!
! !
5! 0,2655! 0,165! 0,1163! C![g/L]!
! !
10! 0,57! 0,3375! 0,2325! t![min]!
! !
15! 0,69! 0,48! 0,345! [UI]!=!μmoles!de!S!/!seg!
!
20! 0,78! 0,585! 0,4695!
! ! !
25! 0,825! 0,675! 0,57!
! ! !
!
!
Las!regresiones!(C![g/L]!vs!t)!para!un!ε!=!0,22!correspondientes!a!cada!dilución!son:!
!
 1: 5!!!!!!! = 0,1208! + 1,0336!!!!!! ! = 0,88088!!!!
1: 10!!!! = 0,1152! + 0,3102!!!!!! ! = 0,98188!
1: 15!!!! = 0,1040! + 0,01,52!!!!!! ! = 0,99919!
!
95 93
7. Una!enzima!fue!analizada!a!una!concentración!de!sustrato!inicial!de!10 !M,!el!valor!de!Km! es!de!2*10 !
M.!Al!cabo!de!1!min!el!2!%!del!sustrato!ha!sido!convertido!en!producto.!
!
a) ¿Qué! concentración! de! sustrato! ha! sido! convertido! en! producto! al! cabo! de! 3! min! y! cuál! es! la!
concentración!de!producto?!
b) ¿Cuál!es!la!velocidad!máxima!posible?!
c) ¿Alrededor!de!qué!concentración!de!sustrato!se!obtiene!vmax?!
d) A!esa!concentración,!¿Qué!concentración!de!sustrato!es!convertido!en!producto!al!cabo!de!3!min?!
e) Si!la!E0!aumenta!al!doble,!que!pasa!con!vmax,!explique.!
f) Si!E0!aumenta!al!doble,!qué!pasa!con!Km,!explique.!
!
8. Una!cierta!enzima!es!usada!para!la!conversión!del!sustrato!Catecol!en!L9Dopa.!El!proceso!es!llevado!a!
cabo!en!un!reactor!batch,!disponiéndose!de!los!siguientes!datos!experimentales:!
!
t%(h)% [S]%M%
0! 0,027!
1! 0,015012!
2! 0,005697!
3! 0,001404!
4! 0,000243!
!
Si!la!materia!prima!a!procesar!contiene!una![S0]!de!1M,!cuánto!tiempo!se!requiere!para!transformar!el!
50%! de! éste.! Explique! claramente! todos! los! supuestos! y/o! simplificaciones! realizadas! para! resolver! el!
problema.!
!
!
!
!
!
!
!
!
!