MATERIALES Y METODOS

Para realizar los ensayos In vivo e In Vitro se seleccionaron los siguientes Sistemas a

pH 7, de acuerdo a los estudios de estabilidad física, química, pH y apariencia. Tabla 1.

Los ensayos In Vitro que se efectuaron fueron: determinación de la capacidad
antioxidante frente a DPPH y ensayo de protección de membranas.
Capacidad antioxidante frente a DPPH: Se procedió de la siguiente forma, en una
policubeta se agregaron 100 L de metanol. Se agregaron 100 L de la dilución de las
emulsiones a evaluar en los pocillos correspondientes. Como sustancia de referencia se
empleó Trolox, un agente anti-radicales estándar (Wojdyło A., 2007; Nenadis N., 2007;
Molyneux P., 2004).
Se agregaron 0,5 mL de solución de DPPH (100 μM en etanol absoluto) para iniciar la
reacción.Los blancos para cada dilución de las emulsiones se prepararon reemplazando
el DPPH por metanol. Posteriormente las policubetas se cubrieron y agitaron
cuidadosamente (para evitar derrames de líquido). Las policubetas se incubaron a
temperatura ambiente durante 20 minutos al abrigo de la luz.
Se registraron los valores de absorbancia a 514 nm en Tecan-Infinite M200, donde la
concentración de antioxidante necesaria para depurar el 50% de radicales libres de
DPPH fue obtenida por la disminución en la absorción.
El resultado final se calculó en equivalentes gramos de Trolox por kilogramo de activo
(g/kg).
Ensayo de la protección de membrana: se realiza en una suspensión de liposomas que
contienen en su interior carboxifluoresceina (CF) como un marcador de liberación.
(Zhang D., 1993). CF es un compuesto de autoextinción que muestra una fluorescencia
muy baja en la condición encapsulada, pero que genera una alta fluorescencia cuando
es diluido en un volumen grande. Y la liberación de marcador es dependiente del grado
de daño liposomal de la membrana (Weinstein J.N., 1984; Yasuda, T., 1981; Six, H.R.,
1974).
La liberación de la carboxifluoresceina de los liposomas fue inducida fotoquímicamente
por los daños causados por el oxígeno singulete a nivel de la membrana liposomal. La
protección de membranas se observó como la disminución de la concentración de
inmunorreactivo en el que hay una reducción del 50% de carboxifluoresceina, la cual fue
utilizada para calcular la cantidad de ácido gálico que muestra el mismo efecto. El
resultado final fue expresado en gramos equivalentes de ácido gálico/kilogramo de
extracto (g/kg).
Los estudios In Vivo se realizaron de acuerdo con las Buenas Prácticas Clínicas y de la
declaración de Helsinki (1964), con sus enmiendas de Tokio (1975), Venecia (1983),
Hong Kong (1989), Seúl (2008) y Manual de Recomendaciones de Procedimientos,
respetando las normas internacionales sobre cualquier estudio realizado en humanos
(G.C.P; I.C.H).
Las panelistas que intervinieron en el ensayo, fueron 20 mujeres sanas entre 20 y 60
años de edad (edad media 48,5), que se inscribieron voluntariamente para este estudio.
Los sujetos no exhibieron condiciones físicas o dermatológicos que invalidaran este
análisis.
El estudio se realizó durante 4 semanas, en las cuales los Sistemas de prueba A y B,
fueron utilizados por cada panelista. Los Sistemas se aplicaron en la mitad del rostro
el Sistema A y la otra mitad del rostro el Sistema B, aplicándolos en piel limpia (cabe
destacar que en todos los casos se empleó el mismo producto de limpieza), la aplicación
de los Sistemas se efectuó dos veces por día.
Se aconsejó a las panelistas evitar la exposición al sol y se impartieron instrucciones
para el uso de protectores solares.
La pérdida de agua transepidermal (TEWL) fue medida utilizando Tewameter® (Courage
& Khazaka, Germany).
Es un parámetro importante para evaluar la eficacia de la función barrera de la piel,
permite una detección temprana e incluso el más leve deterioro en la función barrera de
la piel.
La medición del color de la piel del sistema L*a*b*, según definido por la Commission
Internationale d’Eclairage (Comisión internacional de Iluminación), se realizó con el
colorímetro Chromameter® 400 Minolta. Permitió evaluar el estado de la pigmentación
de la piel en el momento de la prueba.
Para efectuar este ensayo, las panelistas fueron instruidas para volver luego de 2 y 4
semanas de empleado los Sistemas para evaluaciones visuales e instrumentales.
Se buscó determinar el efecto del Ácido lipoico luego de 14 y 28 días de tratamiento.
Para ellos se midieron los parámetros Lab* y además la humectación El panel estuvo
conformado por 20 voluntarias con dos zonas de aplicación (una tratamiento y otra
control) que denominaremos A y B al igual que las formulaciones elegidas.
Los datos obtenidos en los análisis In Vivo fueron tratados estadísticamente con el
software estadístico SPSS 16.0. El análisis descriptivo de los datos obtenidos en cada
determinación se presenta a continuación.

RESULTADOS
El total de panelistas finalizó el período de tratamiento. Ninguno tuvo que abandonar el
estudio por reacciones adversas. La tolerancia fue excelente, pero en la autoevaluación
el producto B mostró diferentes grados de eficacia y mejor sensación de piel.
DPPH

Ácido lipoico en Sistema A = 0,035 ± 0,004 (gETrolox/kg)

Ácido lipoico en Sistema B = 0,017 ± 0,003 (gETrolox/kg)
gETrolox/kg es la unidad que se expresa en gramos equivalente de Trolox por kilogramo
de activo.
ENSAYO PROTECCIÓN DE MEMBRANAS
Los Sistemas A y B fueron diluidos 1 mg/5 mL. Estas soluciones fueron capaces de

proteger el 20% y 60% de las membranas bajo condiciones estándar, Figuras 1 y 2.

Tenemos que tener en cuenta que 200 mg/kg de Ácido gálico protegen el 80%. Por lo
tanto, los números en comparación con Ácido gálico como estándar son:
Ácido lipoico en Sistema A: 30 g de ácido gálico equivalente/kg
Ácido lipoico en Sistema B: 10 g de ácido gálico equivalente/kg
 Figura 1

Figura 2

ANÁLISIS DE PÉRDIDA DE AGUA TRANSEPIDERMAL (TEWL) EN PIEL

Del análisis descriptivo de los datos correspondientes al ánalisis de pérdida de agua
transepidermal (TEWL) se obtuvieron los siguientes resultados de la aplicación de las

dos formulaciones A y B. Tabla 2, 3 y Figura 3

Tabla 2: Análisis de Pérdida de agua transepidermal (TEWL) en piel, Zona A

Zona Media Desvío Mínimo Máximo Mediana LI LS

A (95%) (95%)
 Inicio 11,526 2,787 7,90 17,43 10,95 10,221 12,831

14 días 10,062 3,125 5,70 16,44 10,19 8,600 11,525

28 días 7,146 2,993 3,00 13,21 5,90 5,745 8,547

Tabla 3: Análisis de Pérdida de agua transepidermal (TEWL) en piel, Zona B

.
Zona LI LS
B Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)

Inicio 10,605 2,486 7,40 16,32 10,315 9,441 11,769

14 días 9,305 2,904 5,70 15,32 8,54 7,946 10,664

28 días 6,638 2,510 3,32 12,33 6,638 5,463 7,813

Figura 3: Gráfica de Box-Plot según Zona y Tiempo del Análisis de Pérdida

de agua transepidermal (TEWL)
ANALISIS DE LUMINOSIDAD (L*) EN PIEL

Presentamos los resultados del análisis descriptivo de los datos correspondientes a

Luminosidad (L*), resultantes de la aplicación de las dos formulaciones A y B. Las tablas

muestran los datos estadísticos obtenidos, Tabla 4, 5 y Figura 4.

Tabla 4: Análisis de Luminosidad en piel, Zona A

Zona LI LS
A Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)

Inicio 53,617 2,539 49,99 59,14 53,51 52,428 54,805

14 días 55,118 2,650 50 60,56 55,44 53,878 56,359

28 días 55,894 2,657 51,09 61,44 55,535 56,650 57,138

Tabla5: Análisis de Luminosidad en piel, Zona B

Zona LI LS
B Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)

Inicio 53,876 2,772 48,77 59,75 54,53 52,579 55,173

14 días 56,411 3,168 50,55 62,89 56,435 54,929 57,893

28 días 58,094 2,992 52,78 65,77 57,55 56,694 59,494

 Figura 4: Gráfica de Box-Plot según Zona y Tiempo del Análisis de
Luminosidad en piel
ANÁLISIS DEL PARÁMETRO (a*), BALANCE ENTRE ROJO Y VERDE EN PIEL

Presentamos los resultados del análisis descriptivo de los datos correspondientes al

parámetro a*, balance entre rojo y verde, resultantes de la aplicación de las dos
formulaciones A y B. Los cálculos estadísticos y la gráfica correspondientes se

observan en Tabla 6,7 y Figura 5..

Tabla 6: Análisis del parámetro a*, balance entre rojo y verde en piel,
Zona A

Zona LI LS
A Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)

Inicio 12,627 2,279 9,18 19,50 12,445 11,560 13,693

14 días 12,037 2,995 8,22 20,19 11,045 10,636 13,439

28 días 13,462 11,242 7,4 58,91 10,235 8,201 18,724

Tabla 7: Análisis del parámetro a*, balance entre rojo y verde en piel,
Zona B

Zona LI LS
B Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)
 Inicio 13,516 2,618 9,95 21,61 12,975 12,291 14,742

14 días 12,041 2,597 8,77 18,10 11,225 10,826 13,257

28 días 10,713 2,693 6,12 17,45 9,71 9,453 11,974

Igura 5: Gráfica de Box-Plot según Zona y Tiempo del Análisis del

parámetro a*, balance rojo y verde en piel

ANÁLISIS DEL PARÁMETRO (b*), BALANCE AMARILLO Y AZUL EN

PIEL

Presentamos los resultados del análisis descriptivo de los datos correspondientes al

parámetro b*, balance entre amarillo y azul, resultantes de la aplicación de las dos
formulaciones A y B. Los cálculos estadísticos y la gráfica correspondientes se

observan en Tabla 8, 9, Figura 6.

Tabla 8: Análisis del parámetro b*, balance amarillo y azul en piel, Zona A

Zona LI LS
A Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)

Inicio 16,762 3,819 9 22,52 17,885 14,975 18,55

 14 días 15,885 3,542 7,66 20,22 16,815 14,228 17,543

28 días 14,322 3,438 7,11 20,99 14,765 12,713 15,931

Tabla 9: Análisis del parámetro b*, balance amarillo y azul en piel, Zona B

Zona LI LS
B Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)

Inicio 16,707 3,672 9,76 23,06 17,93 14,989 18,426

14 días 15,997 3,484 8,54 20,93 17,075 14,366 17,628

28 días 14,148 4,144 5,66 19,43 15,11 12,208 16,088

Figura 6: Gráfica de Box-Plot según Zona y Tiempo del Análisis del

parámetro b*, balance amarillo y azul en piel

ANÁLISIS DEL PARÁMETRO ITA (FUNCIÓN DE LOS PARÁMETROS L*

y b*)
Presentamos los resultados del análisis descriptivo de los datos correspondientes al
parámetro ITA, resultantes de la aplicación de las dos formulaciones A y B. Los cálculos

estadísticos y la gráfica correspondientes se observan en Tabla 10, 11, Figura 7.

Tabla 10: Análisis del parámetro ITA en piel, Zona A

Zona LI LS
A Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)

Inicio 12,12 6,817 -0,05 25,77 11,855 8,93 15,31

14 días 17,542 8,136 0,00 33,64 17,5 13,735 21,350

28 días 20,832 8,654 5,66 37,78 16,64 16,782 24,883

Tabla 11: Análisis del parámetro ITA en piel, Zona B

Zona LI LS
B Media Desvío Mínimo Máximo Mediana
(95%) (95%)

Inicio 12,227 8,338 -5,41 27,65 13,64 8,325 16,13

14 días 21,298 8,761 2,63 35,61 20,78 17,198 25,398

28 días 30,231 11,047 14,49 64,32 30,775 25,061 35,401

 Figura 7: Gráfica de Box-Plot según Zona y Tiempo del Análisis del
parámetro ITA en piel
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se analizaron, para cada una de las variables en estudio, los supuestos de normalidad
(Test de Shapiro Wilk) y homogeneidad de varianzas (Prueba de Levene).
En el caso de que se cumplieran los supuestos se analizaron las diferencias entre
tiempos y entre zonas mediante un Análisis de la Varianza de dos Factores para
medidas repetidas.
Si no se cumplía el supuesto de Normalidad se recurrió a la transformación logarítmica
de la variable en estudio, y, si aún así no se cumplían los supuestos, se estudiaron las
diferencias entre los tiempos y entre las zonas aplicando un Análisis no paramétrico
(Test de Friedman) para detectar las diferencias posibles entre los diferentes grupos.
PÉRDIDA DE AGUA TRANSEPIDERMAL (TEWL)
Se comprobó que existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de
los 3 tiempos (p << 0,05). Mientras que no se encontraron diferencias significativas entre
las zonas A y B.
Al realizar las comparaciones a posteriori para los diferentes tiempos con el Test de
Dunnet, se comprobó que la pérdida de agua transepidermal (TEWL), difiere de manera
significativa entre los valores iniciales y los valores correspondientes a los 14 y 28 días
de aplicación de las formulaciones. Pudiendo concluir que la disminución en la pérdida
de agua transepidermal en ambas zonas está indicado por una disminución del TEWL,
con lo cual se observa un incremento de la humectación en la piel, luego de realizado los
tratamientos con ambas formulaciones.
LUMINOSIDAD (L*) EN PIEL
Se comprobó que existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias
de los 3 tiempos (p << 0,05). También se hallaron diferencias significativas entre
las zonas A y B (p = 0,016).
Al realizar las comparaciones a posteriori para los diferentes tiempos con el Test de
Dunnet, se comprobó que la Luminosidad difiere de manera significativa entre los
valores iniciales y los valores correspondientes a los 14 y 28 días de aplicación de las
formulaciones A y B. Entre ambas zonas podemos concluir que hay un incremento del
parámetro L* (Luminosidad) en la zona B con respecto a la zona A.
PARÁMETRO (a*), BALANCE ENTRE ROJO Y VERDE EN PIEL
Se comprobó que existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de
los 3 tiempos (p << 0,05). Mientras que no se encontraron diferencias significativas entre
las zonas A y B.
Mientras que para la zona B, se pudo observar que el parámetro a*, no sólo, difiere de
manera significativa entre los valores iniciales y los valores correspondientes a los 14 y
28 días sino que también difiere de manera significativa entre los valores
correspondientes a los 14 días y a los 28 días. Podemos concluir que la disminución del
parámetro a* en ambas zonas está indicado por una disminución del balance de color de
la piel entre el rojo y el verde, luego del tratamiento realizado con ambas formulaciones.
PARÁMETRO (b*), BALANCE ENTRE AMARILLO Y AZUL EN PIEL
Se comprobó que existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de
los 3 tiempos (p << 0,05). Mientras que no se encontraron diferencias significativas entre
las zonas A y B.
Al realizar las comparaciones a posteriori para los diferentes tiempos se comprobó que
el parámetro b*, difiere de manera significativa entre los valores iniciales y los valores
correspondientes a los 14 y 28 días en cada zonas.
PARÁMETRO ITA (Función de L* y b*) EN PIEL
Se comprobó que existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de
los 3 tiempos y entre las zonas A y B (p << 0,05).
Al realizar las comparaciones a posteriori para los diferentes tiempos se
comprobó que el parámetro ITA difiere de manera significativa entre los valores iniciales
y los valores correspondientes a los 14 y 28 días, como así también difiere de manera
significativa entre los valores correspondientes a los 14 días y a los 28 días.
Entre las zonas A y B, se encontraron diferencias estadísticamente significativas a los 14
días y también a los 28 días.
Es de gran importancia evaluar cuánto representa el incremento del parámetro ITA entre
la zona B y zona A a los 28 días de tratamiento, para lo cual vamos a calcular la Tasa de
Variación Relativa (TVR) entre ambas zonas. Lo vamos a realizar siguiendo la siguiente
ecuación:

ITA Zona B - ITA Zona A

TVR = * 100
ITA Zona A
TVR = 84,97

CONCLUSIONES

Ambas muestras Sistema A y Sistema B presentan pequeña pero consistente supresión

de la DPPH. El Sistema A fue más eficaz.  En términos de protección de la membrana, la
eficiencia es alta para ambas muestras. El Sistema A es tres veces más eficaz que el
Sistema B.
Durante los últimos años, hubo un interés creciente por el empleo de Ácido lipoico en
formulaciones cosméticas. Se informaron de algunos estudios relacionados a sus
propiedades antioxidantes, actuando como un antioxidante y modulador de las
reacciones inflamatorias. Las formulaciones que se utilizaron contienen Ácido lipoico y
Vitaminas, probablemente mejoran este tipo de acciones. El Palmitato de ascorbilo
mejora las propiedades relacionadas con el color de piel y la acción barrera de la piel.   
En el presente trabajo, hemos demostrado que la asociación entre Palmitato de
ascorbilo y Ácido lipoico puede constituir un modelo In Vivo útil para mejora el color de
piel y acción barrera de la piel, en pieles sensibles.
Después de 28 días de la evaluación clínica e instrumental In Vivo realizado en 20 de las
voluntarias que utilizan los productos dos veces por día, podemos arribar a estas
conclusiones claves
Para el Sistema A:
Aspectos visuales
  Mejora el porcentaje de suavidad en la piel
 Reducción del porcentaje de manchas
 Aumento del porcentaje de luminosidad
Para el Sistema B:

Aspectos visuales
 Mejora el porcentaje de suavidad en la piel
 Reducción del 85 % de manchas con respecto al sistema A
 Aumento del porcentaje de luminosidad

En el presente estudio, pudimos concluir que existen diferencias entre las dos
formulaciones, si bien ambas mejoran las características clínicas relacionadas al poder
antioxidante In Vivo y a los efectos In Vitro, los mejores resultados se obtuvieron en la
formulación del Sistema B.
Hemos demostrado que la asociación entre el Ácido lipoico con el Palmitato de ascorbilo
(formulación B) puede constituir un modelo In Vivo útil para mejorar el color de piel y
barrera de la piel en pieles sensibles. Hemos demostrado que después de un
tratamiento entre 14 y 28 días con esta formulación disminuyó el valor TEWL, mejoró la
luminosidad y disminuyó el eritema cutáneo. Los valores de ITA denotaron un
blanqueamiento de la piel con esta formulación.
Debemos destacar que el sistema B es el que contiene Ácido lipoico, Vitamina A, E y
Palmitato de ascorbilo como antioxidante, demuestra que la asociación de este último
con el resto de los activos mejora las propiedades relacionadas con el color de piel y la
acción barrera de la piel.