Centre de Investigacion en Almentacion Y Desarrollo, A.C. EFECTO DEL ESTRES POR FRIO ¥ BACTERIAS NUCLEADORAS DE HIELO (PSEUDOMGNAS SPP. EN TEJIDGS VEGETALES POR AGUSTIN RASCON CHU TESIS APROBADA POR LA UNIDAD CtAD-CUALHTEMOC COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER Et GRADO DE: MAESTAIA EN CIENCIAB-CTAD, A.C. EciB'D R petg 79 2020 SF nerd ROR ACRIN 7 POUURENT BIBLIOTECA CUAUHTEMOC. CHIHUAHUA. AGOSTO DE 1999.CONTENIDO Pagina LISTA DE FIGURAS see teeeeneinisieieiniaeeeerten eeese ten esenane preci dD LISTA DE CUADROS.... 7 RESUMEN GENERAL ci tiet eee eee - 8 GENERAL ABSTRACT... cece terriers we te ee ee a CAPITULO | INTRODUCCION GENERAL... a 1 CAPITULO IL. REVISION BIBLIOGRAFICA 3 Intreduecian settee : : 3 Dane por frio 3 Membrana celular y dafie por trio. we Membranas. 4 Estructura y compasicion aod Funcienes de las membranas. & El movimiento en las membranas biglogicas 6 Efecto dé laa temperaturas bajas sobre las MEMOCANAS ¥ ACHMARACION. 0 ee oe 6 Estrategias de control del davio por fit... eee ne & Dafie por cangelarmients. coves . o 3 Congelamienia dé S0luciOnes MEMES. ee ee cee cee 3 Congelamiento y sobreenfriamiento de soluciones ideales. - steer eeeCeprasion del punto de cangelamiento... .. Nucleacién, Congelacion de has célutas vegelales. Dafio par cangelamients.. Eventos durante él congeiamients de tejidoa vegetales: Factores que afectan el proceso de congelarniento en el tajida vegetal. Efectos del cangelamients extraceluiar e intracetular. Pruebas de viabilidad y eStres Por FiO... cece eee cece eerie cae eeer en Pruebas cualitalivas Pruebas cuantitatwas. CAPITULO Ill. AISLAMIENTO, SELECCION Y EVALUACION DE BACTERIAS NUCLEADGRAS DE HIELO PROVENIENTES DE HUERTOS MANZANEROS. 18 RESUMEN ABSTRACT... INTRODUCCION.. MATERIALES ¥ METODOS Muestreo.. Aislamiento de las Cepas. cece eee cette Seleccién y Mantenimisnte de Cepas Bacterianas...... 18 49 . 20 22 ee 2DEvaluacidn de la Actividad Nucleadora de Hiela en las Cepas . 23 Disefio Experimental y Andlisis Estadisticg...... - we ed RESULTADOS Y DISCUSION - Bee eee eS CONCLUSIONES no. - 2d LITERATURA CITADA... ce cee ae oe - 30 CAPITULO IV. DETERMINACION DEL EFECTC DEL TIPO DE POBLACION BAC- TERIANA EPIFITICA SOBRE LA CAPACIDAD BE SUPERENFRIAMIENTO DE Capsicum annyust L. fe eee cetera ee canes tesa ee ee RESUMEN. Ft eee : cee eee dl ABSTRACT 38 INTRODUCCION.... cone 39 MATERIALES ¥ METGDOS Pe ee ee ete ee AT Material biologico Fe ener cena tenn taerie lene rnee nee a Obtencién de plantas in vitra 4 DObtenci6n de planta en inverrigderO... eee ane Hn Obtencién de bacterias .. : Be eters : 42 Inoculacian de bagtarias y prueba de frio. a . vo 2 Disefic Experimental y Analisis Estadistico.. Ag RESULTADOS ¥ DISCUSION.. ... - Aa CONCLUSIONES... fee ce wees ved? LITERATURA CITADA, Pn i tnt tnen tite en nites dBCAPITULO V. ESTUDIO DEL DANO POR FRIO EN PLANTAS DE TOMATE DE CASCARA MEDIANTE GALORIMETRIA.. RESUMEN.... ABSTRACT. INTRODUCCION......... MATERIALES ¥ METODOS.... 000 ccc cece cee ences terse sean cinerea Muestrac. Estudio por conductividad eléctrica, Estudio Calorim@tico..... cc ec cece eee Tratamiento de lag muestras. Calorimetria tsatérmica. Calorimetria diferencial de barrido.......... Analisis estadistica RESULTADOS Y DISCUSION Conductividad eléctrica...... Calorimetria tsotérmica. Calorimatria dferencial dé barrido..... wee CONCLUSIONES. LITERATURA CITADA BIBLIOGRAFIA GENERAL. 54 od 56 58 40 60 60 81 62 62 62 63 . 64 . 64 64 6S 67 58 TFLISTA DE FIGURAS PAgina Figura 3-1. Prueba de congelacién de gota de Vali modificada por Lindow at al, (1978) y cormoborada por Baca y Moore (4987... dS Figura 3-2. Expresién de la aclividad nuclaadara de hieio en bacterias.. 34 Figura 9-3, Efecto de al preacondicionamiento a 4°C de las cepas batterianassobre su ANH a-6 °C (1) Sin preacondicionamente: Gi} can preacandicionamiantn ., be ee te ae ee aS Figura 3-4. Efecto de la concentracién bacteriana sobre ta actividad de nucleacion de hiela..... . fc eett teeters een ae oA Figura 4-7, Esquema general de ta determunacion del efenta de las. baclerias epifiticas sobre la capacidad de superaninamiento de tejide cultivade int vitro de chile {C annum 1. } . 30 Figura 4-2. Porcentaje de sobrevivencia de C. annum cultivade in vitro somelido a temperaturas por debaio de dos 0 °C, en funcién del tipa de indculo. La separacion de medias se realza por prueba de Tukey (p<0.004) de transfonmaciones al arcosenp de tos porcentajes ee STFigura 4-3. Respuesta de tejida cultivado in wire a distintas tatamientos de temperatura en funcidn del tipo de bacteria inoculada. Figura 4-4 Respuesta de discos de hoja de C. annum L en funcian da la temperatura de axposicién y el tipa de capa inoculada a rived foliar, RICO 96, CV=9 43, n=30 y error esténdar =0.0122. ips0.0001) Figura 5-1, Respuestas a EG de tejido de primera hoja verdaders da >. xocerpa L. Expuestas 4 distintos tratamientes de temperatura, Figura 5-2. Actividad metabdlica a 25 °C y 0 °C. Figura 5-3. Perdida de la actividad metabolica a 25 °C en funcian del tiempo aéumulade a0 °C Figura 64. Recuperacién de la actividad en teido de hoja de tomate en fespuesta 4 diferentes tralamientos de temperaturatiempa. descrita por la ecuaciOn %Actrec = ( 97- 181+2. 57) 10.01 0.02T} can una R? de 0.95... Figura 5-5. Recuperacién de la actividad en funcion del tiempo de exposicion a bajas ternperaiuras en tejide feliar de plantas de tornale.. Figura 5-6. Grafica de Arrhenius para emision de calor metabdélico de primera hoja verdadera de tomate de cascara determinado por CDB........ 52 BS 71 73 wl AB 76LISTA DE CUADROS Pagina Tabla 3-1. Capacidad da fluorescencia en cepas baclerianas........ 00.0 0... ....32 Tabla 5-1. Eouaciones de regresion pelinomial de cuarle orden para datos de barrides de actividad metabdtica en funcién de la lemperatura, y puntos de inflexi6n determinados mediante andlisis de segunda derivada. AORESUMEN GENERAL Gon ja intencion de asiudiar de manera generat [os efectos del estrés por frio én téjidos vegetales, se contamplaron dos aspectas principales. El primer aspecto fue @| relacionado a las temperaturas congelantes., Dada la influencia que lepresentan fos factores externos, como la presencia en la flora epifita de bactenas formadoras de hielo, este aspecto se dividio en dos partes a su vez. Primera, se caracterizd la presencia en el media de bacterias con actividad nucieadera de hielo. Posteriormente, las cepas sé utilizaron como modelo para evaluer del dao por congelamianta en plantas da Capsicum annum L. desarolladas i wiro y en invernadero. El resultade de Io anterior fue, no solo la demostracién de la presencia de bacterias formadoras de hiela en la region, sino también la presencia en los mismos niches follaras de bacterias na formadoras de hielo. Estas ultimas con caracteristicas inleresantes para el desarrollo de esirategias de cantrol biolagico de dafo por temperatyras cangelantes en hortalizas anuales cuttivadas en regiones templadas. El segunde de ellos es el dafo por frio. La posibilidad de implementar metodologia desarrollada 9n calorimetrla, fue explorada coma una forma de estudiar la respuesta dal tejide y relacionarta con técnicas mas convencionales. En este caso, la conductividad eléctica ya qué ambos se basan en respuestas de caracter cuantitativo. E| resultado de lo anterior es un estudio més exacio, con menor fequerimiento de material vegetal y tiempo; aunque con un requerimiento de infraestructura mayor para la instrumentacién de calorimetria.GENERAL ABSTRACT In order to study the effects of low temperature stress on plant tissues, two major aspects were considered. The first aspect was related to freezing femperatures. Because of the inflvence that extemal factors represents, like the presence of iva nucleating active (ira) bacteria, this aspect was divided in hwo parts. First, the presence of ina bacteria was characterized in the region. Afterwards, the stains were used as a model to evaluale frost injury on Capsicum annwe L. grown in vitra and in a greenhouse. This resulted nat just in the demonstration of ina bacteria presence in the region, bul the presence of non-fna bacteria within the same foliar niches. These are interesting characteristics for the development of biclogecal control strategies for freezing episodes on vegetable crops grow: in temperate Zones The second was chilling injury The possibility of employing calorimetric methodologies was explored as a way of assessing tissue response to cald stress and relate it with more conventional methods. In this case, the eleciric canductiviy meihod rendered quantitalive responses, The resufts of the above was an accurate maasurement of tissue response to strass, with less sampla amount requirement and time to be accomplished, although, there is a major infrastructure requirement for calorimetry facililies.CAPITULG | INTRODUCCION GENERAL La distribucion geografica plantas y animales en el planela esta fegulada por muchos factores. Sin embargo. es le temperatura uno de los mas importantes {Burke ef al, 1976; Criddle ef af, 1994). El riasgo de dafio por temperaturas bajas se presenta en todas los cultivos; aunque el rango de temperaturas daflinas es distinto segun el origen, tipo de cultive y variedad. Por lo regular, las temperatures limitantes para los cultives de origen tropical y subtropical, son temperaturas bajas por encima del punto de congelamiento; Mientras que los cultivos originarios de zonag templadas y semitempladas resisten temperaturas de subcangeélacidn, Dado Io anterior. las temperaturas que representan estrés par fria pueden ser divididas en los efectos de las emperaturas bajas ne congelantes que originan dario por frio ¥ Ins efectos de las temperaturas inferiores a los cero grados causantes de dafio por congelamieanto (Hale y Orcutt, 1987). Aunque se conocen los efectos deletérecs de las bajas temperaturas, aun no existe un acuerdo sobre los mecanismos que los originan, ai el orden ef que acontecen (Parkin ef af, 1989). Principalmente, los factores que afectan al dafo por frio son inherentes a la célula vegetal. Fosfolipidas, proteinas y ‘steroles son los componentes de fa membrana mas importantes (Mathews y van Molde, 1996). Por ‘otra parte, €l dafio por congelamiente incluye factores diferentes de la célula. Por ejemplo, la presencia de agentes de nucleacién de hielo heteroga@feos de origen bacteriano. El papel que juegan las bacterias nucleadoras de hielo en el daie por congelamiento a las plantas ha sido estudiado ampliamente, $u control en especies lefiasas ha side insuficiente(Gross ef af, 1984; Ashworth af af, 1985). Sin embargo, ef control de las. bohlaciones epifitas de bacterias formaderas de hielo en plantas anuales ha résultada exiteso en el control de dafia por congelamiento de varias especies {Anderson at al, 1982} Asi, los abjetivos de este trabajo fueron: (a) el aislamiento de Micreorganismos con y sin actividad nuclasdora de hielo (ANH) en maleza de las hyertos manzaneros y el efecto del tiempo de incubacién, temperatura ¥ concentracién celular sabre $4 ANH; (b) determinar si la ANH manifestada en Suspensién acuosa por las bacterias se expresa de manera equivalente sobre tejido de C. annuum, y su efects significative sobre su capacidad de Supérentriamiento en condiciones de crecimiento in vitro y de invernadero. En io referente a temperaturas bajas no congelantes, (¢) determinar la temperatura y el tiempo de exposicidn causantes del dario por frio en plantas de tomate de cascara {Physalis ikgcarpa L.) complementando | métode canvencional de conductividad eléctrica con métedas calprimeticos.CAPITULO II REVISION BILBIOGRAFICA Introduccion Adn cuando los factores que determinan la distribucién geografica de plantas y animales son muchos, la temperatura es uno de los determinantes mas importantes (Burke et al, 1976; Criddle ef af, 1994). Las temperaturas bajas causan dafios a la produccién de cultivos de distintas formas. E| estres: por frio en las plantas puede ser dividido en los efectos de las temperaturas. que causan el dafo por frio y aquéllas del dafo por congelamiento. Las. primeras se refieren a temperaturas bajas por encima de cero de las regiones. tropicales y¥ subtropicales, mientras que las Ultimas, a los valores inferiores a los cero grados centigrados de las regiones templadas. Dajio por Frio El dafio por frio es un desorden fisiol6gico de las plantas y sus productos, el cual conduce a la disminucién de la calidad y perdidas en la utilizacion del producto, después de exposicién a temperaturas bajas no congelantes (Parkin ef a/., 1989). En general, las especies vegetales cultivadas: en regiones subtropicales y templadas, pueden sufrir dafios considerablesentre los 10 y los 0 °C. En estudios de la respuesta a temperaturas bajas de plantas de jitomate (Licopersicum esculentum L.. L. peruvianum L.) la inactivacion celular ocurria a temperaturas. por debajo de los 12 °C ( Rank ef al, 1991;Breidenbach et al., 1990). Este tipo de eventos ha sido asociado con la composicion lipidica, variaciones entre especies y proteinas de membrana, sefalando que a mayor proporcién de lipidos saturades, mayor sensibilidad al frio de la planta. Lo anterior debido probablemente a efectos sobre la ‘capacidad de intercambio y pérdida de fluidez de la membrana (Parkin ef al, 1989; Salisbury y Ross, 1978; Saltveit, 1993). El dafio se manifiesta de diferentes formas, por lo general se observa necrosis, decoloracién, pérdida de turgor y oscurecimiento del tejido, desarrollo disminuido, o bien, germinacién deficiente o nula en el caso de semillas. (Hale y Orcutt, 1987) Membrana Gelular y Dafio por Frio Membranas Estructura y composicién de las membranas. La Mayor parte de la informacién actual respecto a las membranas biolégicas se resume en el modelo del mosaico fluido propuesto por Singer y Nicholson en 1972. Segun éste, la bicapa lipidica fluida contiene un numero de proteinas. Algunas de ellas, las. proteinas periféricas, estan embebidas sdlo de manera parcial en la matriz de lipides y estan expuestas sélo en una de las caras de la membrana. Otras, las proteinas integrales, se encuentran embebidas en mayor grado, pero expuestas en ambas caras. Las proteinas integrales se involucranfrecuentemente en la trasmisién, ya sea de sustancias especificas o sefales quimicas a través de las membranas. Toda la membrana es un mosaico fluido de lipidos y proteinas (Mathews y van Holde, 1996), Las membranas son partes integrales de los organelos celulares. El citoplasma esta rodeado por una unidad simple. mientras que algunos organelos, como los cloroplastos y las mitocondrias, tienen un sistema de membrana doble. Como se mencioné anteriormente, las membranas se componen de lipidos, proteinas y, en una menor proporcién, esteroles, organizados en forma de una bicapa, Las proporciones varian segiin el organelo y la planta, Por lo regular, los lipidos predominantes son los fosfolipidos. Los fosfolipidos consisten de una molécula de gliceral, a la cual se le esterifican dos cadenas de acidos grasos que pueden diferir en la longitud y el grado de insaturacién de su cadena de atomos de carbono. La tercera posicién esta ocupada por un grupo fosfato capaz de unirse a diversos glucidos, aminas y aminoacidos. Los grupos acidograsos de cada bicapa se orientan unos hacia ‘otros en el centro de la bicapa. Las cabezas de fosfato polares se orientan hacia las superficies externas de la membrana (Mathews y van Holde, 1996). Las proteinas son muy variables en su estructura y localizacién en la membrana, Pueden ascciarse solo a la superficie de la membrana: estar embebidas ya sea parcial o totalmente e incluso atravesarla. Los esteroles mas comunes én las plantas son el campesterol, sitosterol y estigmasterol (Salisbury y Ross, 1978). En general, debido a sus caracteristicas estructurales los esteroles tienen la funcién de estabilizar a los fosfolipides, limitando la fluidez y la permeabilidad de la membrana (Mathews y van Holde, 1996)Funciones de las membranas. Las funciones de las membranas en las plantas son diversas. Las membranas mantienen la organizacién dentro de la célula; al confinar a distintos sistemas enzimaticos, el metabolismo puede mantenerse en equilibria. Su naturaleza semipermeable determina qué puede entrar o salir de una célula u organelo, Las proteinas pueden servir como acarreadores en el transporte activo; ademas, algunas poseen funciones enzimaticas, participando én numerosas reacciones bioquimicas que acontecen en las mitocondrias y los tilacoides de los cloroplastos (Taiz y Zeiger. 1991). En la superficie de las membranas se encuentran también sitios de reconocimiento y receptores de sefiales quimicas reguladoras del metabolismo (Mathews y van Holde, 1996). El movimiento en las Membranas Bioldégicas Segiin él modelo anteriormente descrito, las membranas son sistemas dinamicos y estan en un estado de constante movimiento. La fluidez de la membrana depende de la estructura quimica de los lipides y proteinas que la constituyen, asi como de la manera en que éstos estén ordenados dentro de la membrana. El grado de insaturacién de los grupos acil de los fosfolipidos tiene mucho que ver con la fluidez de la membrana. Asi, entre mas elongadas e insaturadas sean las cadenas de carbonos, mayor fluidez poseerd la membrana (Hale y Orcutt, 1987). Efecto de las Temperaturas Bajas sobre las Membranas y Aclimatacién Los fosfolipidas poseen una temperatura especifica a la cual pasan de un estado fluido a uno mds sélido. A esto se le conoce como temperatura de transicién. Es esencial que las membranas de las células vivientes seanfluidas, por lo que la composicidn se regula de manera tal, que la temperatura de transicién de los lipides se mantenga por debajo de la temperatura del cuerpo (Mathews y van Holde, 1996), Dado que las membranas estan compuestas por mezclas de fosfolipidos, la mayor de las veces pasan por una separacién de fase lateral y no una simple transicién de fase. La separacion de fase ocurre cuando las moléculas de fosfolipidos son heterogéneas. Asi, a temperaturas bajas forman conglamerados mas o menos homdlogas generando *islas” de moléculas. Estas a su vez pueden aislar y reubicar proteinas en un movimiento lateral. Tales eventos son capaces de dar lugar a fracturas por las cuales se liberen los contenidos celulares (Sharom et al., 1994). Durante los cambios de estacién y la aclimatacién al frio muchas plantas presentan adaptaciones en su composicién lipidica. El alga verde Caulerpa prolifera nativa del Mar Menor presenta una elevacién en su proporcién de acidos grasos insaturados durante el invierno en relacién a su grado de insaturacién durante el verano (Terrades et al, 1996), Por otra parte, la determinacién mediante cromatografia de gases del contenido de Acidos grasos insaturados, en plantulas de 13 especies de leguminosas, después de ser sometidas a bajas temperaturas, mostré una correlacién directa en el grado de insaturacion respecto a la sensibilidad al frio (Matsuo ef a/., 1992), La resistencia vegetal al dafio por frio depende en gran medida del mantenimiento de las funciones de la membrana. Un incremento en el grado de insaturacion ren el mantenimiento de su de los acidos grasos de la membrana puede auxi funcién a bajas temperaturas (Terrados et al., 1996). A pesar de los esfuerzos en el estudio del dafio por frio, no hay un acuerdo sobre su causa 0 naturaleza, o al menos sobre los eventos primarios que desencadenan el dario por temperaturas bajas. La teoria mas aceptada para explicar el dafio por frio se fundamenta en las transiciones de fase de los lipidos de membrana provocados por la temperatura (Lyons y Raison, 1970). Otra postura postula que el dafio por frio se debe al efecto directo de las bajastemperaturas sobre las enzimas o el efecto indirecto de las perturbaciones de la membrana sobre las enzimas intrinsecas ( Parkin ef al, 1989; Markhart, 1986). Estrategias de Control del Dafio por Frio El dafo por frio tanto en planta como en fruto se ha tratado de controlar de diversas maneras, tanto quimicas como fisicas. Una de ellas es la utilizacién de Acido abseisico (ABA) 0 sus andlogos sintéticos como el LAB 173711, complementado 0 no con réetardadores de crecimiento (Xin et al. 1992; Flores- Nimedez ef al, 1993; Lee ef af, 1995). Esta estrategia de control se basa principalmente en la capacidad de! ABA para mantener la estabilidad de la membrana, el cierre de estomas, estabilizacién del nivel de clorofila y el sistema radicular (Flores-Nimedez ef al, 1993). Otra es la exposicion a sustancias capaces de mantener la fluidez de la membrana. La exposicion de discos de cotiledones y segmentos de hipocotilo de pepino y discos de pericarpio de tomate a vapores de anestésicos (halotano y metoxiflurang), redujo | dafio por fric a temperaturas entre los 2 y los 6 "C (Saltveit, 1993). Otra forma de tratamiento es ¢| manejo de temperaturas. De acuerdo a Collins ef al. (1995), el tratamiento a 40 °C de hipocotilos de frijol mungo, no s6lo activa la sintesis de proteinas de bajo peso molecular especificas para el choque térmico, sino que incrementa la tolerancia al frio. Ademas, se han feportado resultados similares en tomates donde aparentemente existe una felacién entre la respuesta al choque térmico y la adquisicién de tolerancia al frio (Lurie ef al, 1991; Adnan ef a/., 1998).Dafio por Congelamiento Congelamiento de Soluciones Ideales El congelamiento en soluciones ideales presenta un comportamiento relativamente simple y nos permite comprender algunos aspectos del fendmeno en si. Ademas, adn y cuando la complejidad estructural y de composicion de las células vegetales es muy superior, el proceso de congelamiento en gran parte de los casos presenta similtudes con las soluciones ideales. Congelamiento y superenfriamiento de soluciones ideales. El congelamiento es el arreglo ordenado de las moléculas en el estado liquido a la forma cristalina s6lida del hielo. Los puntos de congelacidn y de fusién del agua se refieren ala misma temperatura, segiin si el cambio de fase va de liquido a solido o visceversa (Brown ef a/., 1997). Muchos liquides no congelan de manera invariable en su punto de congelamiento normal. Pueden mantenerse en estado liquido a temperaturas de muchos grados por debajo del punto de fusion, mientras no alcancen la organizacién molecular de la fase sdlida. Al evento anterior se le denomina superenfriamiento. Esta puede prolongarse hasta que en cierto punto, acontece el ordenamiento y el hielo se forma en un proceso exotérmica que eleva la temperatura a 0 “C, en la cual el liquido remanente continua congelandose (2umdahl ef af, 1993). Depresién del punto de congelamiento. La presencia de solutos en el agua afecta la presién de vapor, la presi6n osmdtica, aumentan el punto de ebullician y disminuye el punto de congelacion. Estas propiedades,10 denominadas coligativas, dependen de manera directa del numero de particulas de solute presentes. Los efectos anteriores se deben al incremento en el desorden de las moléculas del solvente, en este caso el agua, al mezclarse con un solute ( Chang, 1997) De acuerdo a la ley de Raoult, el punto de congelacién de una solucién disminuye respecto al solvente puro en proporcién directa a la concentracion de las particulas de soluto. Una solucién ideal no electrélita de 1M empieza a congelarse por debajo de -1.86 °C, pera no se congela completamente a esta temperatura. Dado que inicialmente sélo el solvente puro pasa a la fase sélida, la solucién remanente se vuelve mas concentrada. Por lo anterior hay una caida progresiva en el punto de congelacidn. De esta manera, las fases liquida y Sélida coexisten en un rango amplio de temperaturas antes de congelarse por completo. La depresién del punto de congelamiento (ATs) se define como el punto de congelamiento del solvente puro menos e| punto de congelamiento de la solucién. Las bases fisicoquimicas de este fenémeno consisten en que, en el punto de congelamiento de un liquid, las fases sdlida y liquida coexisten en equilibrio, por lo que su cambio de energia libre es. igual a cera. Esto es, Si AGu= Ans - ThsASis (MoMurry y Fay, 1995) donde, AG es la energia libre de Gibbs; AH, la entalpia; Ty, la temperatura (°K) correspondiente al punto de congelamiento y AS, la entropia. y AG,.= 0; entonces, Tas® AH pal ASas,uu asi, el incremento en el desorden elevard la entropia del sistema (4S). La introduccién del soluto disminuye el valor del cociente, es decir, el punto de congelamiento (T;..). Nucleacién. En general, un liquido superenfriado es inestable; la agitacién, formacién esponténea de , o la adicién de una sustancia (nucleo) capaz de catalizar la transicion de fase liquida a sdlida, provocara que solidifique rapido ( Chang, 1997). Al fenémeno anterior se le conoce como nucleacién. Existen nucleadores homogéneos y heterogéneos. La nucleacién homogénea se lleva a cabo en ausencia de cuerpos extrafios y de manera espontanea. En la nucleacién homogénea del agua pura, los nucleos se forman espontaneamente a -38.1 °C. En 1972, Rasmussen y McKenzie demostraron que gotas de agua pura de 10 mm de didmetro superenfriaban a -38.1 °C. A esta temperatura las moléculas de agua se ordenan entre si para formar el cristal. Por otra parte, en la nucleacién heterogénea participan catalizadores diferentes del agua, para llevar a cabo la transicion a la fase sdlida. En este ultimo tipo de nucleacion, la probabilidad aumenta en proporcidn directa al volumen de agua. Las fuentes de nucleos heterogéneos son diversas. Los investigadores. Schnell y Vali (1976) reportaron bacterias con un gen nucleador de hielo. Ellos encontraron que la hojarasca en descomposicién era una fuente de nucleos de hielo, Mas tarde, Maki ef al. (1974) aislaron distintas cepas bacterianas con actividad nucleadora de hielo (ANH) a partir de la misma fuente, entre ellas Pseudomonas syringae. Las suspensiones de estos microorganismos mostraron gran actividad nucleadora de hielo a temperaturas relativamente altas, Posteriormente, dos especies de bacterias epifitas, P. syringae y Erwinia herbicola, con alta ANH ( activas a -2 y -5 °C), fueron aisladas, Sobre este mismo esquema, se encontré que diversas especies de plantas, recolectadasde distintas areas geograficas, a lo largo de las estaciones del afio, son portadoras de una cantidad sustancial de bacterias con actividad nucleadora de hielo. Ademas de lo anterior, el dafio por congelamiento en hojas de maiz cultivado en el campo a -5 °C, fue directamente proporcional a las poblaciones de bacterias con actividad nucleadora de hielo presentes (Lindow et al, 1978; Lindow ef al.,1982). Sin embargo, los ndcleos de hielo en las plantas pueden formarse sin necesidad de inoculacién del exterior, Se ha probado que existen factores en las plantas capaces de catalizar la formacién de hielo. En drboles frutales caducifolios e! dafio por congelamienta puede acontecer debido a la presencia de factores intrinsecos a la planta que limitan su capacidad de superenfriamiento, independientemente de la presencia de bacterias con ANH (Gross et al.,1984; Ashworth et al., 1985; Proebsting ef al, 1988). En este sentido, varias especies de Lobelia y Dendrosenecio, secretan sustancias con actividad nucleadora de hielo, formadas principalmente por fracciones de polisacaridas neutros con proporciones grandes de acido urénico y galacturénico ( Embuscado ef al., 1996) Congelacién de las Células Vegetales El agua de las plantas puede permanecer en un estado de Superenfriamiento si no hay una nucleacién de hielo externa o si la temperatura no baja hasta la temperatura de nucleacién homogénea. La escarcha 0 hielo del suelo pueden nuclear plantas por sitios de entrada como los estomas, lenticelas y heridas. Las plantas completas superenfrian normalmente sdlo unos cuantos grados, pero partes de algunas plantas pueden superenfriar13 hasta el limite de -47 °C, por la presencia de sclutos que deprimen el punto de congelamiento (Burke et ai., 1976). Dafo por congelamienta. El dafio por congelamiento se presenta en plantas que se desarrollan en lugares que alcanzan temperaturas por debajo de los 0 °C y enfrentan el peligro de la congelacién. Los mecanismos del dafio por congelamiento son el resultado de los danos mecanicos y deshidratacién impuestos a las estructuras celulares macromoleculares por los cristales de hielo. El follaje luce flacido y empapado, las membranas pierden su permeabilidad parcial y su compartimentacién intracelular (Burke ef a/., 1976; Taiz y Zeiger, 1991) Eventos durante el congelamiento de tejidos vegetales. Durante la formacién de hielo en las plantas superiores se pueden apreciar varias fases. Inicialmente, la temperatura desciende por debajo del punto de congelamiento del citosol y la vacuola permanece sin cambio de fase liquida a solida, es decir superentriada. Al continuar el descenso de la temperatura se forma hielo en las paredes celulares. Este evento pravoca una liberacién de energia calorifica debida al calor latente de fusién del agua (AH,.). En esta etapa, la temperatura se eleva rapidamente hasta el punto de cangelamiento normal (una atmdsfera de presi6n) y permanece ahi hasta que toda el agua remanente en el plasmalema pasa a la fase s6lida. A partir de este punto la temperatura continua descendiendo, los cristales empiezan a expanderse al interior del protoplasto, provocanda la destruccién de las estructuras y muerte de la celula (Salisbury y Ross, 1978; Taiz y Zeiger, 1991). Factores que afectan el proceso de congelamiento en el tejido vegetal. Existen diversos factores relacionados al congelamiento vegetal, Primeramente, la4 organizacion y estructura del tipo de tejido y especie vegetal del que se trate. Segundo, la cantidad de agua disponible en los espacios intercelulares es menor ala que se encuentra en el interior de la célula. Sin embargo, la mayor concentracién de salutos en la célula le confiere una disminucién del punto de congelamiento mayor. Tercero, aunque una membrana intacta es una barrera efectiva a la propagacion de hielo, en estado liquido e| agua puede moverse libremente a través de la membrana en cualquier direccian. Ademas, en muchos tejidos él espacio extracelular no esta ocupado sélo por liquido, sino por aire saturado de vapor de agua { Salisbury y Ross, 1978; Taiz y Zeiger, 1981; Mohr y Schapfer, 1995). Por ultimo, el dafio par congelamiento de tejidos vegetales se ve afectado por el tamafio de la muestra (Anderson ef al, 1985; Ashworth et al. 1985). Efectos del Congelamiento extracelular @ intracelular. La congelacién puede dafiar al tejido de maneras distintas segun su localizacion en el tejido. Bajo condiciones naturales, el hielo se forma primera entre las paredes celulares, estructuras transportadoras de agua o sobre las superficies externas. Esta formacién de cristales de hielo no es letal y él tejido puede conservar su viabilidad si se eleva su temperatura. Regularmente el hielo se va acomodanda en el apoplasto al prolongarse el tiempo de exposicién. Cuando la presencia del hielo se limita al apoplasto se denomina congelamiento extracelular, El hielo se mantencra en el exterior de la célula siempre y cuanda la velocidad de enfriamiento sé mantenga baja y la membrana intacta. Muchas plantas basan su tolerancia al congelamiento en su capacidad de acomodar el hielo en el apoplasio (Mohr y Schapfer, 1995). Sin embargo, Ia presencia de hielo en el exterior de la célula genera un patencial hidrico que favorece la deshidratacién El agua del protoplasto puede emigrar hacia el hielo extracelular provecando un incremento en la concentracién de solutos; a tal grado que algunos pueden13 alcanzar niveles toxicos. Por ejemplo, la acumulacién de compuestos semi polares como la leucina y la valina, pueden alterar las interacciones de los lipidos y desestabilizar a la membrana (Hale y Orcutt, 1987). El congelamiento intracelular puede originarse si los cristales de hielo de origen extracelular se extienden hacia el interior del protoplasto, o se generan cristales intracelulares por enfriamiento rapido. Cualquiera de los eventos anteriores tendra repercusiones letales. Se destruyen la integridad de la membrana, estructuras intracelulares. pérdida de la organizacién celular y consecuentemente la pérdida de la viabilidad (Burke et al, 1976; Taiz y Zeiger, 1991). Pruebas de Viabilidad y el Estrés por Frio Tanto en el dafio por frio come en el dafio por cangelamiento la membrana juega un papel fundamental. La determinacién de la temperatura critica a la cual ocurre el dafio no puede ser precisa, debido a la dificultad de aplicar métodos bioquimicas y biofisicos convencionales a las células congeladas. Breidenbach ef al. (1990) resaltan que aparentemente no existe una temperatura critica por debajo de la cual ocurre el dafio, sino una funcién compleja de la temperatura con el tiempo de exposicidn. De modo convencional, el estudio de les efectos de las bajas temperaturas, consiste en realizar pruebas de viabilidad después de realizar la exposicin al frio. Stergios ef al. (1973), resaltan el hecho de que si una prueba. de viabilidad ha funcionado efectivamente en una planta bajo condiciones especificas, esto no garantiza que funcione igual para otra planta e incluso la misma planta bajo condiciones diferentes. Por su parte Palta ef a/. (1978), menciona que, si la viabilidad es la capacidad del tejido para vivir, crecer y16 desarrollarse, un ensayo de viabilidad deberia ser capaz de medir estas tres propiedades. Sin embargo, a nivel practico la mayor parte de las pruebas miden sdlo una de estas propiedades y én ocasiones sélo un componente de ellas. Ademas, las pruebas de viabilidad carecen de una estandarizacién adecuada. Pruebas cualitativas. El crecimiento parece ser el criteria maximo de viabilidad. No obstante, és una prueba que consume mucho tiempo y difificil de cuantificar (Palta et af.,1978). Por otra parte, el oscurecimiento del tejida consiste en la visualizacion del encafecimiento debido a la actividad enzimatica desordenada en el mesoplasma por pérdida de compartimentacién en la muestra vegetal (Stergios ef al. 1973; Palta et al, 1978) Pruebas cuantitativas. Al ocurrir el dafo a la célula se liberan cantidades considerables de solutes. Dexter ef al. (1932), propusieron que la medicion de la conductividad eléctrica de la solucidn guardaria una relacién directa con las células muertas. Sin embargo, tal supuesto es muy débil dado que en ocasiones hay células dafiadas que liberan solutos al exterior, pero pueden recuperarse y restablecer sus funciones vitales de manera normal, tal es el caso de las células de cebolla (Palta ef al. 1977). Por otra parte, el calor metabdlico tetal de muestras vegetales puede determinarse mediante calorimetria. El reciente disefio del equipo de microcalorimetros permite medir el calor metabélico vegetal con una sensibilidad de + 1pW. Dado que la mayor parte de este tipo de tejidos producen de 6-12 WW / mg peso seco, la produccién de calor metabolico puede medirse utilizando una pequena cantidad de muestra (Anekonda et al., 1994). En la calorimetria isotérmica las mediciones se realizan a temperatura constante por lo que este tipo de calorimetria es la mas importante paraanalizar las propiedades fisicas y quimicas de los procesos celulares. La pérdida de la actividad metabdlica puede analizarse manteniendo la temperatura a un valor seleccionado y registrando lecturas en funcion del tiempo (Criddle ef al, 1991). La pérdida de actividad metabdlica de las plantas a temperaturas bajas y altas, puede examinarse isotérmicamente aumentando la temperatura a un valor seleccionada y observando la velocidad de decremento en actividad (Breidenbach et al., 1990; Pungor, 1995). Mientras que, la calorimetria diferencial de barrido (CDB) mide la produccién de calor metabdlico (qmet) en funcién de un cambio constante de temperatura a una velocidad predeterminada. Los datos obtenidos se analizan mediante la ecuacion de Arrhenius para obtener el valor de la energia de activacién (Ea). Esta variable representa la dependencia de la velocidad de la reaccidn respecto a la temperatura. Debido a la complejidad de las reacciones metabdlicas integradas en los sistemas bicldgicos, el valor calculado a partir de la ecuacion de Arrhenius es una Ea aparente.CAPITULO II AISLAMIENTO, SELECCION Y EVALUACION DE BACTERIAS NUCLEADORAS DE HIELO PROVENIENTES DE HUERTOS MANZANEROS RESUMEN Cepas bacterianas fueron aisladas en agar dextrosa papa y medio B de King, a partir de muestras foliares de la maleza mormal de la cobertera de huertos manzaneros ene! Valle de Cuauhtemoc Chihuahua. Fueron separadas por su morfologia y por la capacidad de fluorescer bajo luz del espectro ultravioleta cercano al cultivarlas en el medio B de King Las cepas se separaron por su capacidad de formar hielo a -5 *C en suspensiones de 10° ufciml. Dicha actividad se evalué en funcién a la edad del cultiva, al preacondicionamienta al frio y a la concentracion de la suspensién. Se detectaron bacterias con y sin actividad nucleadora de hielo (ANH) en hojas de maleza aparentemente sanas y capaces de flourescer en medio B de King. La cepa UCO03 es capaz de formar hielo a temperaturas relativamente altas (-5 *C); mientras que la cepa UCO01 es una cepa natural que no presenta ANH. Es posible que la maleza conteniendo microorganismos potencialmente patogenas con ANH posiliva, comprometan la produccion de los huertos. Sin embargo, la UC001 puede ser un fuerte candidato para control biolégico en base a competencia; puesto que se desarrolla bajo las mismas condiciones que los microorganismos con ANH positivos y fitopatogenicidad potencial. 18ISOLATION, SELECTION AND EVALUATION OF INA BACTERIA FROM APPLE COMMERCIAL ORCHARDS ABSTRACT Bacterial strains were isolated on potatoe dextrose agar and King's B medium, from foliar samples of weeds fram commercial apple orchards in the valley of Cuauhtémoe, Chihuahua. They were screened by colony morphology and fluorescence ability under U.V. light, while growing on King’s B medium plates. Also, the strains were screened by their ice nucleating capabilty at -5 °C in suspensions of 10° ufc/ml. Such capability was evaluated as 2 function of culture age, cold preconditioning and cell concentration. Ice nucleating ( Ice+) and non-ice nucleating ( Ice-) strains with flourescent capacity were isolated on symphtomless leaf samples. The UCOO3 strain is Ice+ at relatively high temperatures (-5 °C}; while UCOO1 strain is an Ice- natural strain. There is 4 chance that weeds harboring Ice+ strains, could compromise the commercial orchards production, Nonetheless, the UCOO1 could represent a strong candidate for biological control under campetitive basis; since it thrives under the same conditions of potentially phytopathogenic Ice+ strains. 19INTRODUCCION En las regiones templadas y semitempladas, los cultivos enfrentan el peligro de las temperaturas inferiores a las 0 °C. Algunas plantas evitan el dafio por congelamiento mediante el superentriamiento del agua que hay en sus tejidos (Burke ef af., 1976; Hummel ef af, 1997). La resistencia de muchas especies consi en mantener, a largo plazo, el agua simplastica en la condicién termadindmicamente inestable de un fluido sobreenfriada (Mohr, 1995). El fenomena del superentriamiento se debe a que los cambios de estado no siempre ocurren én el punto normal (temperatura a 1 atm de presion) Debido a que el agua no alcanza el grado de organizacian molecular del solido, ésta permanece en estado liquido por debajo de los 0 °C. Asi puede mantenerse hasta que en cierto punto, acontece el ordenamiento de las moléculas y el hielo se forma en un proceso exotérmico que eleva la temperatura a 0 °C, en la cual el resto del agua liquida continua congelandose (Zumdahl et al., 1993). Erwinia herbicola (Lindow et al, 1982), Fusarium avenaceum y Fusanium acuminatum ( Pouleur ef al, 1992; Richard ef al, 1996). En el caso de los microorganismos fitopatogencs con actividad nucleadora de hielo (ANH), una de las estratagias para controlarios ha sido la introduccién de microorganismos modificados genéticamente para desplazarlos por competencia como P syringae TLP2del1 y P. fluorescens A506, a las cuales sé les elimind el gen responsable de la ANH ( Wilsan y Lindow, 1994), La formacién de hielo en las hojas de las plantas puede ser acelerada por la presencia de bacterias que nhabitan de manera natural su superficie. Asi, los objetivos principales de este trabajo son: (1) el aislamiento de microorganismos con y sin actividad nucleadora de hielc (ANH) en maleza de los huertos manzaneros y (2) el efecto del tiempo de incubaci6n, temperatura y concentraci6n celular sobre su ANH.MATERIALES Y METODOS. Muestreo Para el aislamiento de las cepas bacterianas a evaluar sé utilizaron muestras de hojas de pastos @ hierbas silvestres comunes en los huertas manzaneros del Valle de Cuauhtémoc Chihuahua. Las hojas muestreadas fueron colocadas en balsas de plastico y mantenidas 4 4°C para ser transportadas al laboratorio. Las muestras se procesaron dentro de las primeras 24 horas de haberlas obtenido. Aislamiento de las Cepas El material vegetal fresco fue colocado en 10 mi de agua destilada estéril y se dejé reposar por 30 min. Posteriormente la muestra en suspension fue agitada de 15 a 30 segundos y se procedié a su siembra mediante dilucién en serie, Alicuotas de 0.1 ml se colocaron en placas con medio agar dextrosa papa y fueron incubadas a 24°C por 48 horas. De las colonias obtenidas fueron selecionadas aquéllas con las caracteristicas reportadas para Pseudomonas en agar dextrosa papa: calonias circulares, suaves, cremosas, borde liso, convexas con aspecto de domo en la parte superior, de color blanco a crema y Gram (-) ( Baca y Moore, 1987).Seleccién y Mantenimiento de Cepas Bacterianas Las cepas seleccionadas acuerdo a Baca y Moore, (1987) fueron sembradas en placas con medio B de King, versién comercial agar Pseudomonas F (Difco). Las colonias en medio B de King fueron purificadas dos siembras, mediante siembras repetidas én este mismo medio, hasta qui consecutivas la morfologia de las colonias se mantuvo homoegénea, Las cepas aisladas én este medio fueron seleccionadas en base a su capacidad para fluorescer en el ultravioleta cercano (350nm) como sefiala Shaad ( 1988), Una vez seleccionadas, las cepas se guardaron como cultives de trabajo en medio B de King. Para almacenamiento a largo plazo se elaboré un cepario de las bacterias colocandolas én una suspensién de gliceral estéril y agua destilada desionizada 30 / 70% (viv) en alicuotas de iml. Los ceparios se mantuvieron 2 4°C y a partir de ellos se realizaran resiembras en medio B de King antes de cada evaluacion. Ademas de las cepas aisladas en el valle de Cuauhtémoc, Chih. se incluyeron en el ceparia cepas de Pseudomonas conocidas como fuertes nucleadoras de hielo (controles positivas). Estas cepas sé obtuvieron de la Universidad Estatal de Oregon (OSU), E.U.A. y fueron: PssB15, PAH, Pss29A, PD y Pss8B. Evaluacién de la Actividad Nucleadara de Hielo en las Cepas Con la finalidad de realizar una seleccién preeliminar de bacterias nucleadoras de aquéllas no nucleadoras se aplicd la prueba de congelacién de2 gota de Vali modificada por Lindow et al., (1978). En esta prueba se utiliza una suspensi6n de bacterias con una poblacién de 10° ufefml en agua desionizada estéril. Sobre un recipiente de aluminio con una delgada capa de cera se colocaron equidistantes, 10 gotas de 40yl de suspensién bacteriana de la misma cepa. El recipiente se calocé sobre etilenglicol 40%, mantenido a SC en un bajo circulante Neslab, RTE-140. La prueba se considera positiva si una de 10 gotas de la suspension bacteriana se congela dentro de los primeros minutos (Baca et al., 1987)( Figura 3-1). Los resultados se reportan como porcentaje de ANH. Para fines de normalizacién estadistica de las datas, los porcentajes se transformaron al valor de arcoseno y se reportaron como arcoseno del porcentaje de actividad nucleadora de hielo. La misma prueba de gota congelada se aplicé a los cultivos puras para evaluar a) Efecto de la edad del cultivo. Se determind la ANH en los cultivos puras a los 1,2 y dias de siembra b) Efecto del preacondicionamiento con frio. Los cultivos en crecimiento en medio B de King se incubaron a 4°G por 12 horas antes de la prueba para determinar ANH. Efecto de la concentracién bacteriana, La suspensién bacteriana con una poblacién de 10° ufc/ml en agua desionizada, se diluyo 1:10 para cuantificar el efecto de la concentracion de bacterias en la expresion de ANH Disefioa Experimental y Analisis Estadistico Para analizar los datos obtenidos se utilizé un ANDEVA con un disefio completamente al azar con 6 repeticiones para las cepas evaluadas. Ladiferencia de medias se detecté por la prueba de Tukey (p<0.05). Los andlisis se realizaron mediante el programa estadistico SAS versién 6,08 (SAS Institute Inc., 1992)RESULTADOS ¥ DISCUSION En base a caracteristicas morfologicas para Pseudomonas en agar dextrosa papa se seleccionaron 30 colonias circulares, suaves, cremosas, de borde liso, convexas con aspecto de domo en la parte superior, dé color blanco crema ( Baca y Moore, 1987; Schaad, 1988), Sin embargo, de 30 capas sdlo cuatro presentaron tincién Gram (-). Para evitar confusion de cepas, Las cuatro seleccionadas se identificaron arbitrariamente como UCOO1, UCOO2, UCOO y UCO004. Dichas cepas y los contrales positives obtenides de la Universidad Estatal de Oregon (OSU, por sus siglas en inglés) fueron sametidas a luz UV (350nm} en medic B de King para detectar fluorescencia é identificarlas como posibles Pseudomonas (Shaad, 4988), los resultados se reportan én la Tabla 3-1. En ella se presentan los datos para fluorescencia en el espectro de luz ultravioleta cercano (350 nm). Las primeras cinco razas en orden descendente son variaciones todas de Pseudomonas syringae L. identificadas con las claves originales del laboratorio de OSU sefialadas con un sélo asterisco, Estas cepas presentan fluorescencia ( signo positive) de un colar azul ténus. Las siguientes claves que aparecen de la sexta a la novena posicién, son cepas aisladas de maleza de la coberteras de huertos comerciales de manzano locales. Solo las identificadas como UCOO1 y UCOO3 presentan fluorescencia, aunque a diferencia de las anteriores, su fluerescencia es de un matiz amarillo verdoso. La ANH se evalué de tres maneras. La primera fue determinando la ANH después de incubar a 25 °C durante los primeros tres dias de cultivo. La siguiente fue incubando 4 25 °C para desarrollo y una noche a 4 °C, antes de la prueba, durante cuatro dias. La Ultima se realiza evaluando dos concentraciones, 10° ufc/ml y su dilucién 1:10, para cada cepa.2 En la Figura 3-2, se muestran los resultados para la primera prueba expresados coma arcoseno de los porcentajes de congelacian, La expresién de la ANH entre las diferentes bacterias presenté cuatro patrones diferentes. Las cepas PssB-15, PAH y Pss8B, disminuyen su actividad al avanzar la edad del cultivo. Por otra parte, las cepas PD y UCOO3, expresaron una ANH alta al inicio, un descenso al segundo dia, para volver a elevarse al tercer dia. La cepa de P. syringae 29 A presento una expresién mas estable con un ligero incremento an el segundo dia respecto al primero y al tercero de la prueba. Finalmente, la pseudomona local fluorescente UCO01, no expresé actividad en ninguno de les dias de prueba Con la finalidad de realizar la prueba con preacondicianamiento a -4 °C, seleccionaron en base a los resultados anteriores cuatro cepas representande cada uno de los patrones observados. La P. syringae 293A para el comportamiento exponencial positivo; PD para el parabdlico de concavidad positiva; PAH para el exponencial negative y UCOO1 que de manera constante no presento ANH (ver la Figura 3-3, i). La Figura 3-3 (ii), muestra los resultados obtenidos con el preacondicionamiento. Las diferencias entre los patrones de comportamiento de la expresion anteriormente observados, desaparecieron Todas las cepas expresaron una ANH maxima de manera constante durante los tres primeros dias de cultivo, para disminuir solo hasta el cuarto dia. La temperatura previa a la prueba de frio afecta el tipo de niicleo expresado por las bacterias. Lo anterior concuerda con la aparicién y desaparicion de los tres distintos tipos de nucleos bacterianos, por efecto de la temperatura de incubacién segun Ruggles et al. (1992) La formacién de los cristales de hielo en las suspensiones bacterianas es aleatoria, de naturaleza probabilistica. Al disminuir la concentracion de las distintas cepas, se observa una disminucidn en todas las bacterias formadorasde hielo, Gomo puede apreciarse en la Figura 3-4 la concentracién mayor ( 10° ufe/ml) tiene una capacidad superior de catalizar la formacién de hielo, aunque para 29A y PD las diferencias no fueron estadisticamente significativas, si lo fueron para el resto de las capas bacterianas con ANH, sometidas a estudio. El comportamiento anterior concuerda con el reportade por Lindow et al., ( 1978) y por Anderson ef al, 1985} quienes resaltan la relacién directa entre la concantracién de bacterias con ANH y él dafio por temperaturas congelantes. El hecho de que UCO01, una pseudemona fluorescente local, na presentara ANH en ninguna de las pruebas y se éncontrara en la mayor parte de los muestreos, puede ser de interés agronémica. Primero, porque sé le puede encontrar en los mismos nichos que otras bacterias locales con ANH (UCO03) y segunda porque, aparentemente, no es especifica 4 un tipo de planta u hoja. Estudios posteriores podrian profundizar en el petencial de este microorganismo dentro de un manejo integrado de heladas para plantas anuales; con la ventaja adicional de ser nativo de la microflora normal, disminuye - si no és que elimina- los riesgos de introducir microorganismos extrafios sobre la dinamica natural establecida.CONCLUSIONES: Existen bacterias con actividad nucleadora de hielo en la region camo la cepa UCOO3. La actividad nucleadora de hielo in vitro de estas bacterias no sélo depende del genotipo; sino del tiempo de cultivo, las temperaturas de incubacién y la cantidad de microorganismos en las suspensiones, lo cual coincide con Io reportade por Por otra parte, existen también bacterias fluorescentes regionales como la UCOO1, sin ANH. Estas son capaces de desarrollarse bajo las mismas condiciones que las bacterias can ANH fuertemente positiva. Debido a las caracterislicas anteriores, UCOO1 presenta el potencial suficiente para convertirse en candidate a agente de control bioldgico. Ademas, cuenta con la gran ventaja de ser un microerganismo nativa, por lo que su introducci6n no presenta los riesgos de intraducir microorganismos ajenos al ecosistema, cuya repercusién pueda escapar nuestros métodos: El estudio de las poblaciones de microorganismos propios de una region es importante para conocer cuales son los verdaderos riesgos y beneficios que éstas representan para los cultivos que en ella se desarrollan. Estudios mas profundos sobre la dindmica de las poblaciones de baclerias en funcién dé su ANH pueden aportar nuevas herramientas para el manejo de las cultivos,LITERATURA CITADA Anderson, J.A, and Buchanan, D.W.1982. Frost injury of tender annual plants increased by Pseudomonas syringae. J. Amer. Soc. Hort. Sei. 107(1) 123-125. Baca S$, y Moore, L.'W. 1987. 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