PRCTICA 4.

DETERMINACIN DE CREATININA EN ORINA Y DE OTROS PARMETROS EN SANGRE

INTRODUCCIN A. DETERMINACIN DE CREATININA EN ORINA.
El fosfato de creatina es un compuesto que acta como almacn de alta energa fcilmente convertible en ATP, en msculo y otros tejidos de mamferos. La creatina se sintetiza en hgado y pncreas. Desde estos rganos, a travs del aparato circulatorio, se transporta hacia diferentes tejidos, donde puede fosforilarse. El contenido de creatina y fosfocreatina alcanza los 400 mg por 100g de msculo. Ambos componentes pueden convertirse espontneamente en creatinina, que es eliminada por el rin. Cada da, y de forma constante, un 2% de la creatina muscular se convierte en creatinina. A continuacin pasa a la sangre y, posteriormente, a la orina. En condiciones normales, sus niveles plasmticos y en orina dependen de la masa muscular, por lo que su produccin vara segn el sexo y edad del individuo. Los valores normales de creatinina en plasma son 0.5-1.3 mg/ml para hombres y 0.4-1.0 mg/ml para mujeres. Las determinaciones de creatinina en orina y en plasma se utilizan para calcular el aclaramiento de creatinina (clearance), prueba utilizada para estimar el filtrado glomerular y, por tanto, para valorar la funcin renal. Se han propuesto distintas frmulas o expresiones para el clculo del aclaramiento, como la de Cockcroft-Gault o la de Jelliffe. Aunque se han descrito otros procedimientos ms especficos para determinar creatinina en plasma u orina, el mtodo ms rpido es el basado en la reaccin de Jaff, que consiste en la formacin de un complejo con coloracin amarillo-naranja por reaccin con el picrato en medio alcalino. En la presente prctica se va a proceder la determinacin de la concentracin de creatinina en una orina problema, sometiendo diversas muestra de la misma a la reaccin de Jaff. A continuacin se proceder a la medida de absorbancia en el colormetro. Finalmente, se calcular la concentracin de la creatinina en la orina problema utilizando una recta de calibrado obtenida con anterioridad. MATERIAL Y REACTIVOS Colormetro NaOH 1,4 M ClH 25 mM Micropipeta de 1000 l Tubos de ensayo y gradilla cido pcrico 14 mM

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Rotule cuatro tubos y adicione los siguientes reactivos (mililitros) en el orden establecido, siguiendo las indicaciones pertinentes. REACTIVO / n tubo HCl 25 mM Orina problema cido Pcrico 14 mM NaOH 1,4 M (AGITAR) 1 1,6 -2,6 0,8 2 0,8 0,8 2,6 0,8 3 0,4 1,2 2,6 0,8 4 -1,6 2,6 0,8

AGITE todos los tubos y espere 15 minutos. Mida la absorbancia en el colormetro a una longitud de onda de 500 nm. Utilice el tubo n 1, exento de creatinina, para ajustar el cero de absorbancia. A continuacin, y haciendo uso de la recta de calibrado siguiente, calcule la concentracin de creatinina en la orina problema. Recta de calibrado: Absorbancia 500 = 0,824 x (miligramos de creatinina)

CUESTIONES (se valorara la brevedad en las respuestas en todos los apartados)

A1. Cul es la concentracin de creatinina en la orina problema?

A2.

Encuentre una frmula para calcular el aclaramiento de creatinina en

funcin de la concentracin de creatinina en orina y en sangre y del volumen de diuresis. Cules son los valores normales del aclaramiento?

A3. Por qu se debe incluir el valor de la superficie corporal en la frmula?

A4. Cul es el valor medio de la superficie corporal humana?

A5. Encuentre una frmula para calcular la superficie corporal en funcin del peso y la altura.

A6. Encuentre la frmula de Cockcroft-Gault para el clculo del aclaramiento de creatinina. Qu ventaja posee frente a otras expresiones para el clculo del aclaramiento?

A7. Qu relacin existe entre el filtrado glomerular y el valor la concentracin de creatinina en sangre?

B. DETERMINACIN DEL VOLUMEN DE HEMATOCRITO. El hematocrito representa la proporcin de glbulos rojos a sangre entera, y se expresa en volmenes por ciento. Su medida se realiza por centrifugacin de la sangre heparinizada o tratada con algn otro inhibidor de la coagulacin, calculando el % que alcanza la masa globular. Normalmente, en el adulto oscila del 36-50 %, con un valor medio de 46 para varones y 40 para mujeres. En neonatos, los valores normales son ms altos, sobre el 56%, pero la cifra decrece progresivamente en el primer mes hasta alcanzar un mnimo prximo al 35% y ascender de nuevo lentamente. Aproximadamente, el hematocrito multiplicado por 100.000 nos indica el nmero de eritrocitos por milmetro cbico. Ello es debido a la poca contribucin que los glbulos blancos y plaquetas tienen sobre el volumen celular de la sangre. MATERIAL Y REACTIVOS Centrfuga de hematocrito Sangre entera Capilares heparinizados de 1.8 mm de dimetro mximo y longitud no superior a 75 mm. En caso de no estar heparinizados, deben ser previamente tratados con una disolucin al 3.8% de citrato sdico en agua, baando su superficie interna y secndolos. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Todas las personas que manejen sangre deben conocer las denominadas PRECAUCIONES UNIVERSALES EN EL MANEJO DE SANGRE Y FLUIDOS CORPORALES, que establecen que toda muestra de sangre o fluido corporal debe ser considerada como potencialmente infecciosa. Por ello, se deben adoptar las medidas adecuadas para evitar cualquier posible contagio. El alumno de Ciencias de la Salud est obligado a conocerlas (consltense en las normativas, manuales o sitios pertinentes) y a ponerlas en prctica de manera inexcusable. Entre ellas, es fundamental la utilizacin obligatoria de guantes y la evitacin del contacto de la sangre o fluidos con heridas, ojos y mucosas. 1. Introducir la sangre en el tubo capilar por capilaridad, sumergiendo ste, con un cierto ngulo respecto a la vertical, en una gota de sangre por uno de sus extremos. Mantener el otro extremo abierto. No llenar el capilar menos de 40 mm ni ms de 70 mm.

2. Tapar el extremo del tubo capilar con plastilina u otro tipo de cera extendida sobre una lmina. Para ello, tapone con el dedo el extremo superior del capilar y apritelo en forma vertical sobre dicha lmina, con cuidado de no romperlo. 3. Site el capilar en una hendidura del rotor de la centrifuga de hematocrito, con el extremo tapado con plastilina hacia la parte exterior. 4. Centrifugue durante 3 minutos y lea el volumen de hematocrito mediante el empleo de la plantilla excntrica correspondiente, ajustando el cero en el inicio de la sangre y el 100 en el menisco superior del plasma.

CUESTIONES
B1) Exprese el resultado obtenido para el volumen de hematocrito, e indique si se trata de un valor normal o, por el contrario, es indicativo de anemia o de poliglobulia.

B2) De qu factores depende el valor del volumen de hematocrito?

B3) Cmo calculara el volumen corpuscular medio (VCM) de los eritrocitos? Cmo clasificara las anemias en funcin del VCM? Y en funcin del contenido en hemoglobina?

B4) Explique la diferencia existente entre los trminos sangre entera, plasma y suero.

B5) Si la sangre est tratada con heparina, razone qu obtendra en el sobrenadante y en el sedimento, tras centrifugarla.

B6) Para qu se utiliza la heparina? Explique su mecanismo de accin.

B7) Qu puede significar la obtencin de un plasma de color rojizo?

C. DETERMINACIN AUTOMATIZADA DE PARMETROS CLNICOS.

DETERMINACIN DE CIDO RICO EN SANGRE. En humanos, el cido rico es el producto final del catabolismo de las purinas (adenina y guanina). La produccin diaria de cido rico procedente del catabolismo de productos endgenos es, aproximadamente, 400 mg por da; el procedente de la dieta supone unos 300 mg diarios. El cido rico es un cido dbil cuyo pKa es 5,75.

Por tanto, en el medio fisiolgico se encuentra en forma de urato. Los valores normales de referencia oscilan entre 3-7 mg/dl en hombres y 2-6 mg/dl en mujeres. La causa ms comn de hiperuricemia es la disminucin de la excrecin de urato, fundamentalmente de origen renal. Aparece hiperuricemia en enfermedades neoplsicas de la sangre (leucemias), en el alcoholismo, tras llevar a cabo ejercicio fsico intenso o en el caso de deshidratacin o tratamiento con diurticos. Se ha descrito la existencia de hipouricemia, entre otras situaciones, durante las primeras 28 semanas de gestacin, lo que explicara tal vez la mejora de la gota (sndrome que se caracteriza por hiperuricemia) durante el embarazo. La gota es un sndrome que se caracteriza por hiperuricemia, artritis aguda y, en algunos casos, depsitos tisulares de urato sdico, que se da en un grupo heterogneo de enfermedades. La crisis aguda de gota se inicia por la respuesta inflamatoria a los cristales de urato monosdico. La determinacin analtica de cido rico se lleva a cabo habitualmente utilizando dos enzimas acopladas: uricasa (urato oxidasa) y peroxidasa, segn la secuencia de reacciones expresada a continuacin: cido rico + O2 + 2H2O H2O2 + indicador reducido ---- (uricasa) alantona + H2O2 + CO2

----(peroxidasa) indicador oxidado + H2 O

En esta prctica vamos a utilizar un sistema de qumica seca, til para la medida de cido rico y otros parmetros, tales como hemoglobina, glucosa, colesterol, glucosa, creatinina, urea, triglicridos, GPT, GOT, etc. El aparato de medida consiste en un fotmetro de reflexin. El fundamento de la medida se basa en la reflexin de luz sobre una tira portarreactivos que contiene un sustrato cromgeno. Dicha tira portarreactiva dispone de una banda magntica que contiene todas las informaciones especficas del mtodo, necesarias para la ejecucin y calibracin del aparato de forma totalmente automatizada. Slo se necesitan 32 l de sangre y el tiempo de medida es de 3 minutos. MATERIAL Y REACTIVOS -Tiras portarreactivos -Instrumento medidor Reflotrn -Papel cientfico -Pipeta Reflotrn de 32 l PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL (Este apartado de la prctica lo realizar el profesor a modo de demostracin)

1. Conecte el aparato y ponga el interruptor en la posicin I (parte trasera). 2. Djelo que se caliente hasta que en la pantalla aparezca el mensaje LISTO. Si no va a ser utilizado durante algn tiempo, puede pulsar la tecla Stand-by, situada en la parte inferior derecha de la pantalla. (Al mismo tiempo que sigue este protocolo, la lectura de las hojas informativas para cada test, que se incluyen en este cuadernillo como apndice, pueden facilitarle el proceso). 3. Tome una tira portarreactivos correspondiente al parmetro que pretende determinar. Cierre inmediatamente el tubo. No toque la zona gris. 4. Retire la hoja protectora de la tira portarreactiva, evitando doblar la tira. 5. Introduzca la tira cuidadosamente en la ranura para los portarreactivos, situada debajo de la cmara de medicin. 6. Utilice la pipeta de volumen fijo para aspirar sangre (bien de la muestra proporcionada o bien por puncin en el dedo de algn voluntario -en este caso consulte con el profesor-) 7. Coloque la muestra como gota en el centro del campo de aplicacin (rojo) provisto de una malla, evitando tocar ste con la punta de la pipeta. 8. Antes de que transcurran 15 segundos, introduzca la tira horizontalmente en la ranura de la cmara de medicin. Cierre la tapa. 9. En la pantalla aparece la confirmacin de la medida que estamos realizando (UA), Asimismo aparece el tiempo necesario hasta que disponible el resultado. Tome nota de la lectura. 10. Abra la cmara de medicin y retire la tira. Observe que el color debe haberse desarrollado en toda la zona del test, presente en la tira. 11. Descarte la tira. CUESTIONES C1) Los valores normales de urato en sangre son muy cercanos al lmite de solubilidad de dicho compuesto, por lo que un ligero aumento de la cantidad de urato en sangre puede conducir a sndromes gotosos. Justifique este hecho.

C2) Conoce algn tipo de ser vivo en el que el producto final del metabolismo de las purinas sea la alantona? Por qu en el ser humano es el urato y no la alantona?

C3) Cul es la enzima responsable de la ltima etapa en la va de formacin del cido rico?

C4) El alopurinol suele ser utilizado para el tratamiento de la gota. Por qu se utiliza? Cul es su modo de actuacin?

D. DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SANGRE. La determinacin de la glucemia es una prueba frecuentemente utilizada en Bioqumica Clnica. La concentracin normal de glucosa en sangre para un individuo en ayunas oscila entre 80 y 120 mg/100ml. Despus de una comida que contenga carbohidratos, esta cifra se incrementa para volver en unas dos horas a los niveles basales. Si el ayuno es prolongado el nivel de glucosa desciende, pero nunca por debajo de 50-60 mg/100 ml; la razn fundamental es que el sistema nervioso requiere un aporte continuo de glucosa. Aunque el nmero de mtodos utilizados para la determinacin de glucosa es muy abundante, la mayora son mera ancdota histrica. En cualquier caso, si los agrupamos segn el tipo de reaccin qumica que se lleva a cabo, podemos distinguir tres grandes grupos:

1. Mtodos basados en el poder reductor de la glucosa sobre un agente oxidante, generalmente una sal de cobre o hierro. Han sido utilizados los mtodos clsicos de Folin-Wu, Hagedorn y Jensen entre otros, hoy da en desuso. 2. Mtodos de determinacin de furfural. Ms especficos que los de reduccin, se basan en el comportamiento de las hexosas y pentosas en medio muy cido, donde forman furfural. A partir de glucosa se obtiene hidroxi-metil furfural, que puede detectarse colorimtricamente utilizando diversos mtodos. El ms utilizado es el de la o-toluidina. 3. Mtodos enzimticos. Son los ms utilizados en la actualidad. Entre ellos destacan: a) Mtodo de la glucosa-oxidasa y peroxidasa acopladas. Se mide colorimtricamente la formacin de un aceptor de oxgeno cromognico como el ABTS. b) Mtodo de de la glucosa deshidrogenasa , en el que se sigue a la colorimtricamente la formacin de NADH. c) Mtodo la hexoquinasa . Utiliza esta enzima acoplada deshidrogenasa de la glucosa -6-P, con la formacin concomitante de NADH y su medida colorimtrica a 340 nm. La determinacin de glucosa en esta prctica se lleva a cabo por el mtodo enzimtico de la glucosa oxidasa y peroxidasa acopladas. Glucosa + O2 ----- (Glucosa oxidasa) -----(peroxidasa) -D-gluconolactona + H2O2 indicador oxidado + H2O

H2O2 + indicador reducido CUESTIONES

D1) Qu problema puede conllevar el uso de los mtodos basados en la medida del poder reductor de la glucosa?

D2) Y los basados en la formacin de furfural?

D3) Cul es la ventaja fundamental de los mtodos enzimticos para medir la concentracin de glucosa en sangre?

D4) En qu consiste las prueba de tolerancia oral a la glucosa?

COMENTARIO GENERAL
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