DETERMINACIN DE PARENTESCO EN ALPACAS (Vicugna pacos) POR MEDIO DEL ANLISIS DE ADN MICROSATLITE

RESUMEN Diez microsatlites polimrficos para alpacas y llamas fueron usados para evaluar el parentesco en 47 alpacas (18 cras, 18 madres y 11 padres) de la Estacin Experimental IVITAMarangan, provincia de Canchis (Cusco, Per). El anlisis se llev a cabo utilizando dos metodologas: secuenciador automtico (ABI 377 DNA sequencers) y tcnica de tincin con nitrato de plata. Los microsatlites fueron amplificados en tres reacciones de PCR mltiple y diez reacciones de PCR simple. El nmero de alelos vari entre 4 y 20. Las frecuencias allicas y la probabilidad de exclusin (PE) fueron calculadas utilizando el software Cervus 2.0. Todos los loci, a excepcin de dos, se encontraron dentro de los rangos encontrados en la literatura. La probabilidad de exclusin acumulada para los 10 loci fue 0.9999. La probabilidad de exclusin acumulada para cada reaccin de PCR mltiple fue mayor a 0.90. Ambas metodologas obtuvieron los mismos resultados. Los resultados confirmaron la paternidad en 18 casos; sin embargo en el 22% de los casos (n=4) se identificaron padres alternativos que no correspondieron a los padres registrados. Palabras clave: alpaca, microsatlites, paternidad INTRODUCCIN Mtodos precisos para identificacin y verificacin de parentesco son de gran importancia para los criadores de animales domsticos, as como para el establecimiento de registros y libros genealgicos. Por muchos aos, los mtodos convencionales, tales como la tipificacin de grupos sanguneos y polimorfismos bioqumicos han sido las nicas herramientas utilizadas para dicho fin. Durante la pasada dcada se han desarrollado tcnicas basadas en ADN y puestas en prctica mediante la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Entre estas tcnicas se encuentra el anlisis de ADN microsatlite.
En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Tcnica de reaccin en cadena

de la Polimerasa o PCR que es una tcnica para la sntesis "in Vitro" de secuencias especficas de DNA con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de Biologa Molcular ni en los procedimientos de diagnstico basados en el estudio de DNA. La tcnica se basa en la replicacin del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5-> 3 usando un molde de

cadena sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta regin doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3 del fragmento de DNA que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la reaccin en Cadena de la Polimerasa se basa en la repeticin de un ciclo formado por tres etapas: 1 Desnaturalizacin del ADN doble cadena 2 Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 especfica de cada una de las hebras 3 Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa Los microsatlites, comnmente conocidos como repeticiones cortas en serie (STRs), son secuencias cortas (no mayores de 6 pares de bases de largo) repetidas en serie (Hancock, 1991) que pueden ser amplificados por la tcnica de PCR y los distintos alelos observados por medio de electroforesis en gel y posterior teido con nitrato de plata o por marcado con sustancias fluorescentes. Tincin con plata. Es adecuado para la deteccin de DNA 2C y 1C y es ms sensible que el EtBr. Es una buena alternativa para la autorradiografa y suprime los peligros, carezas y restricciones asociadas con los radioistopos. Teido con EtBr La tincin con EtBr y la ilumincin con hv es el mtodo ms simple de visualizar los geles nativos. Teir los geles en una solucin de 1 g/ml de EtBr (en tampn de electroforesis 1x) durante 5-10 minutos. (ms tiempo puede hacer las bandas ms difusas). El EtBr se intercala en los surcos de la doble hlice, por eso no tie ADN de una cadena. Es peligroso. En pases como EE.UU, Canad, Reino Unido y Australia, el ingreso de camlidos a libros de registro se basa en el anlisis de ADN (microsatlites) para identificacin individual y de parentesco. En el Per, a diferencia de estos pases, se cuenta con un libro de registro que acredita la descendencia de los animales inscritos, por medio de tcnicas que tienen un grado de certeza muy inferior a las obtenidas por pruebas genticas aceptadas en pases con mayor desarrollo tecnolgico. Por lo tanto, se vuelve necesario contar con una prueba de anlisis de ADN de alta confiabilidad, de costo moderado y que pueda ser aplicado en forma masiva con la tecnologa disponible en el pas. MATERIALES Y MTODOS Se colect sangre de 47 alpacas (Vicugna pacos) previamente identificadas (11 padres, 18 madres y 18 cras) en los registros de la Estacin Experimental del IVITA-Marangan,

para la prueba de determinacin de parentesco. El Centro Experimental se encuentra en el distrito de Marangan, provincia de Canchis, departamento de Cusco, y los anlisis se realizaron en las instalaciones de la Unidad de Virologa y Gentica Molecular de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, y en la Unidad de Biodiversidad y Procesos Ecolgicos de la Universidad de Cardiff, Gales, Reino Unido. El ADN genmico fue extrado de la sangre utilizando el ULTRACLEAN DNA BloodSpin Kit (Mo Bio Inc) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La calidad (tamao del fragmento) y la cantidad (concentracin) del ADN fue determinada comparando ULTRACLEAN DNA BloodSpin Kit Dirigir al aislamiento de ADN de clulas sanguneas con minicolumns de giro; til en PCR, la clonacin y el ordenacin en serie. diluciones seriadas de un marcador de peso molecular (DNA Hind III, AMRESCO a una concentracin de 50 ng/l en un gel de agarosa al 0.8%. HindIII es una enzima de restriccin producida por el microorganismo Haemophilus influenzae que posee una diana de restriccin en el ADN de cadena doble dependiente de una secuencia metilada, palindrmica y asimtrica, sobre la cual su actividad cataltica hidrolasa genera extremos cohesivos. Los diez loci microsatlite (LCA19, LCA22, LCA5, LCA23, YWLL08, YWLL29, YWLL36, YWLL40, YWLL43, YWLL46) designados para llama (Lama glama) y alpaca, descritos por Lang et al. (1996) y Penedo et al. (1998) fueron amplificados por medio de la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en un termociclador modelo 9700 GeneAmp (Perkin Elmer) mediante dos mtodos. El primero consisti en tres reacciones de PCR mltiple (amplificacin de ms de un locus por reaccin de PCR) y su anlisis mediante un sistema automatizado (ABI 377 DNA sequencers); y el segundo consisti en diez reacciones de PCR de locus simple (amplificacin de un solo locus por reaccin de PCR) y su anlisis mediante un sistema no automatizado de tincin con nitrato de plata (Bassam et al., 1991). ABI 377 DNA sequencers Descripcin de las funciones y capacidad del SEQUENCER de ADN de ABI 377:: 900 bases con la exactitud 98.5 % 24 - 96 prueba el caudal de proceso y transferencia

 Corra ordenando en serie las reacciones sobre la base de qumica de terminador tintura - etiquetar La versatilidad permite que a este sistema respalde el ordenacin en serie y fragmente aplicaciones de anlisis Lee hasta y ms all de 900 bases por las lecturas largas muestra generar Electrophoresis optimizan la velocidad, la solucin, y readlength.

La asignacin de paternidad fue dada por exclusin, observando incompatibilidades entre los tamaos de alelos del padre, de la madre y de las cras, para lo cual se estable ci el poder de la prueba de parentesco por medio de la probabilidad de exclusin individual y acumulada descritas por Jamieson y Taylor (1997). Para el anlisis de la probabilidad de exclusin individual y acumulada, la heterocigocidad observada y el contenido de informacin polimrfica (PIC) se utiliz el software Cervus 2.0 Parentage Analysis . software Cervus 2.0 Parentage Analysis . asignacin de padres a sus vstagos que usan sealadores genticos. Cervus use que la probabilidad, un mtodo estadstico bien arraigado para anlisis de origen, asignen el origen. Cervus lanzan dos realce de tecla a este proceso: 1) las proporciones de Likelihood son calculadas permitiendo la posibilidad de que los genotypes de padres y vstagos puede ser mecanografiado mal. 2) Cervus determinan el nivel de la confianza en los parentages que asigna va la simulacin. Cervus representan una herramienta fcil de usar y prctica para cientficos que buscan establecer padre - vstagos que las relaciones emparejan cuando algunos genotypes estn incompletos, incorrectos o faltantes. RESULTADOS Y DISCUSIN La determinacin de parentesco o paternidad por medio del anlisis de microsatlites est difundido en muchas de las especies domsticas y es utilizada con frecuencia en animales silvestres. Los elevados ndices de confiabilidad permiten el uso de microsatlites en estudios de paternidad en caninos con 92% de certeza (Morera et al., 1999; Pdr et al., 2001), bvidos domsticos y silvestres con porcentajes cercanos al 100% (Kankan y Fado, 1999; Mommens et al., 1998), equinos con niveles cercanos al 100% (Binns et al., 2000) y en primates no humanos con 99% de certeza (Constable et al., 2001;

Vigilant et al., 2001). Similares aplicaciones se observan en camlidos, donde Sasse et al. (2000) y Sam et al. (2001) demostraron la factibilidad de realizar pruebas de paternidad en camellos (Camelus dromedarius) y Skidmore et al. (1999) en paternidad de hbridos de camello y guanaco. La disponibilidad de informacin sobre ADN microsatlite en camlidos sudamericanos permiti disear el presente estudio, en el cual se eligieron diez microsatlites especficos y altamente polimrficos para camlidos sudamericanos. En el estudio se encontr que los diez microsatlites analizados amplificaron y presentaron polimorfismo en alpacas, con un nmero de alelos que vari entre cuatro para el locus LCA22, YWLL46 y 20 para el locus YWLL08, con un promedio de 9.1 alelos por locus; resultados similares a los publicados por Lang et al. (1996) y Penedo et al. (1998) aunque con ligeras variaciones en el YWLL08 y el YWLL36, posiblemente debido al distinto origen de los animales. La probabilidad de exclusin hallada para cada loci microsatlite vari entre 0.174 para el YWLL46 y 0.844 para el YWLL08, mostrando diferencias considerables en los microsatlites YWLL29, YWLL40, YWLL46, YWLL08 y YWLL36 (diferencia mayor o menor al 0.1) con respecto a lo publicado por Lang et al. (1996) y Penedo et al. (1998). La probabilidad de exclusin acumulada para los 10 microsatlites fue 0.9999. Las tres reacciones PCR mltiple obtuvieron una elevada probabilidad de exclusin combinada (>0.90). Adems, se identificaron cuatro microsatlites altamente informativos basados en su alta probabilidad de exclusin individual (YWLL08, YWLL36, LCA23 y YWLL29). La probabilidad de exclusin individual y acumulada para los diez loci microsatlite as como para las tres PCRs mltiples se muestran en el Cuadro 1. Los anlisis de exclusin de paternidad determinaron cuatro errores (22%) en la asignacin de paternidad de los 18 casos evaluados en base a los registros de la Estacin Experimental IVITA-Marangan. Se encontr, adems, un caso en el cual no se pudo determinar el erdadero padre debido a su ausencia en las muestras colectadas, lo cual demuestra la importancia del uso de pruebas moleculares en la determinacin de parentesco. Una limitante para el anlisis de microsatlites en el pas, es la dificultad de uso de equipos de anlisis automatizados en forma rutinaria, los que se encuentran limitados a pocas instituciones de investigacin debido a su elevado costo. En el estudio se utilizaron dos metodologas: un anlisis automatizado (secuenciador automtico) y un anlisis convencional (tincin con nitrato de plata) obtenindose los mismos resultados, lo cual hace posible utilizar un sistema de anlisis convencional en estudios de determinacin de paternidad (Figs. 1 y 2). Se debe precisar que la tcnica de tincin con nitrato de plata tiene como limitante que analiza un solo microsatlite por reaccin de PCR, alargando el tiempo del anlisis; sin embargo, se obser v la factibilidad del uso de PCR mltiple (ms de un microsatlite) en geles teidos con nitrato

de plata, para microsatlites con grandes diferencias de tamao de sus alelos, permitiendo disminuir el tiempo y los costos de la prueba. ste es el primer estudio a nivel molecular diseado en el pas para pruebas de parentesco en camlidos sudamericanos, siendo posible su aplicacin en llamas y camlidos silvestres con los marcadores microsatlites utilizados.

Figura 1. Lectura de los loci LCA23, LCA22 y YWLL36 de alpacas utilizando el software GeneScan 2.1y Genotyper 2.5 (ABI PRISM) (a) Lectura del locus LCA23 marcado con el colorante TET (verde). Los nmeros 28, 31 y 32 corresponden a las muestras 1383 (Padre), 1408 (Madre) y 1435 (Cra). Ntese que la cra (homocigoto para el alelo 148) comparte un alelo con el padre (148) y otro con la madre (148). (b) Lectura del locus LCA22 marcado con colorante FAM (azul). (c) Lectura del locus YWLL36 marcado con el colorante HEX (amarillo). A la derecha se observa el rango de intensidad de fluorescencia. Determinacin de parentesco en alpacas (Vicugna pacos) por medio del anlisis de ADN microsatlite Cuadro 1. Heterocigocidad observada (H(o)), contenido de informacin polimrfica (PIC) y probabilidad de exclusin individual (PE) y acumulada (PEa) de microsatlites utilizados para determinar parentesco y paternidad en alpacas PCR Mltip M1 Microsatlites LCA 19 YWLL 29 YWLL 40 YWLL 46 LCA 23 LCA 22 YWLL 36 YWLL 43 LCA 5 YWLL 08 H(o) 0.702 0.787 0.660 0.383 PIC 0.709 0.786 0.604 0.307 PE 0.548 0.634 0.408 0.174 Pea 0.9191

M2

0.638 0.779 0.621 0.9286 0.511 0.477 0.294 0.894 0.852 0.733 0.304 0.639 0.452 0.9637 0.809 0.744 0.575 0.915 0.918 0.844

M3

M1 + M2 + M3 10 Microsatlites 0.9998

Figura 2. Lectura del locus YWLL 08 de alpacas para la determinacin de parentesco utilizando la tcnica de tincin con nitrato de plata (Uso de PCR simple).Lectura del locus YWLL 08 para la obtencin de patrones allicos. MPM = Marcador de Peso Molecular (Eco1471/PvuI) L1 = Blanco, L2 = Patrn alelos 134 y 166, L3 = Alegado Padre 2, L4 = Blanco, L5 = Cra, L6= Madre, L7 = Verdadero Padre y L8 = Patrn alelo 138.

CONCLUSIONES ? Se demostr la factibilidad del uso de ADN microsatlite (diez microsatlites) para la determinacin de parentesco con una elevada probabilidad de exclusin (0.9999). ? Con el uso de slo tres microsatlites (YWLL43, LCA5 y YWLL08) en una reaccin de PCR mltiple es posible determinar parentesco con una probabilidad de exclusin aceptable

(0.9637). ? Es posible extrapolar los resultados obtenidos mediante el uso de un equipo de secuenciamiento automtico (ABI 377 DNA sequencers Applied Biosystems) con la metodologa de tincin de plata, con la diferencia del uso de un solo locus por reaccin de PCR.