Machine Translated by Google

proc. nacional Academia ciencia

EE.UU. vol. 96, págs. 7650–7657, artículo
del coloquio de julio de 1999

Este artículo fue presentado en el coloquio de la Academia Nacional de Ciencias "La neurobiología del dolor", celebrado del 11 al 13 de
diciembre de 1998 en el Centro Arnold and Mabel Beckman en Irvine, CA.

Regulación del calcio de una hiperpolarización lenta post-pico en

neuronas aferentes vagales
( adaptación de frecuencia picoyreceptor de rianodinayautacoidesinflamación alérgicaymastocitos)

RUTH CORDOBA-RODRIGUEZ*, KIMBERLY A. MOORE*, JOSEPH PY KAO† Y DANIEL WEINREICH*‡

*Departamento de Farmacología y Terapéutica Experimental y †Centro de Biotecnología Médica y Departamento de Fisiología, Universidad de Maryland,
Escuela de Medicina, Baltimore, MD 21201-1559

RESUMEN La activación de distintas clases de canales de potasio puede
afectar dramáticamente la frecuencia y el patrón de activación neuronal. En
una subpoblación de neuronas aferentes vagales (neuronas ganglionares
nodosas), el patrón de actividad de impulso está efectivamente modulado
por una corriente de K1 dependiente de Ca21 . Esta corriente produce una
hiperpolarización posterior al pico (AHPslow) que desempeña un papel
fundamental en la regulación de la excitabilidad de la membrana y es
responsable de la acomodación de la frecuencia pico en estas neuronas. La
inhibición de AHPslow por varios autacoides endógenos (p. ej., histamina,
serotonina, prostanoides y bradicinina) da como resultado un aumento en
la frecuencia de descarga de las neuronas aferentes vagales de <0.1 a >10
Hz. Después de un solo potencial de acción, el AHPslow en las neuronas
nodosas muestra un tiempo de aumento lento hasta el pico (0,3 a 0,5 s) y
una duración prolongada (3 a 15 s). La cinética lenta de AHPslow se debe,
en parte, a la descarga de Ca21 de un conjunto de liberación de Ca21 inducida
por Ca21 intracelular (CICR). El Ca21 evocado por potencial de acción en flujo
a través de canales de Ca21 de tipo L o N desencadena CICR.
Sorprendentemente, aunque los canales de tipo L generan el 60% de la
CICR inducida por el potencial de acción, solo la entrada de Ca21 a través de
los canales de Ca21 de tipo N puede desencadenar la lentitud de AHP dependiente de CICR.
Estas observaciones sugieren que existe una estrecha proximidad física
entre los receptores de rianodina del retículo endoplásmico y los canales
de Ca21 tipo N de la membrana plasmática y los canales de potasio lentos AHP .
Tal relación anatómica podría ser particularmente beneficiosa para la
modulación de la adaptación de frecuencia pico en las neuronas aferentes
vagales.
La activación y sensibilización de las fibras nerviosas aferentes primarias durante
la inflamación alérgica son orquestadas por mediadores inflamatorios liberados
de varias células, incluidos los mastocitos tisulares. Los mediadores inflamatorios
provocan cambios de excitabilidad en los nervios sensoriales a través de diversos
mecanismos, que incluyen (i) la modificación de la densidad y la eficacia de
acoplamiento de los canales iónicos controlados por ligandos; (ii) alteración en
los canales de sodio, potasio y calcio dependientes de voltaje; y (iii) la manipulación
de los mecanismos celulares que controlan la adaptación de la frecuencia pico.
Después de la activación inmunológica de los mastocitos en las vías
respiratorias in vivo o en los ganglios sensoriales in vitro, se puede detectar una
amplia gama de cambios electrofisiológicos en las terminaciones nerviosas
sensoriales periféricas del vago (1) y en los somas aferentes primarios vagales
(ubicados en la nodosis y ganglios yugulares) (2). Estos cambios van desde
despolarizaciones de membrana transitorias (minutos) que a veces alcanzan el
umbral del potencial de acción (AP) (3) hasta un desenmascaramiento sostenido
(días) de los receptores de taquiquinina NK-2 funcionales (4, 5). Una propiedad
de la membrana eléctrica que es particularmente sensible a los mediadores
inflamatorios es una post-hiperpolarización lenta posterior al pico (AHPslow; ver
Fig. 1) (3).
Este potencial posterior lento influye en la excitabilidad neuronal y determina la
frecuencia y el patrón de la descarga neuronal.
Hemos encontrado que la amplitud y la duración de AHPslow son sumamente
sensibles a los mediadores inflamatorios conocidos, como los prostanoides, las
aminas y las cininas, aplicados de forma exógena (Tabla 1) o liberados de forma
endógena (es decir, después de la activación inmunológica de los mastocitos) (3,
6) . La inhibición de AHPslow se acompaña de una pérdida de adaptación a la
frecuencia pico. Por lo tanto, la modulación de la amplitud y duración lenta de
AHP proporciona un mecanismo para la sensibilización neuronal.
Estamos interesados en identificar los canales iónicos y las vías de
transducción de segundos mensajeros que participan en el inicio y mantenimiento
de la AHPslow en las neuronas aferentes primarias vagales. En este informe,
describimos las propiedades generales de este potencial posterior lento y nuestro
progreso en su caracterización. Nuestra hipótesis de trabajo es que existe una
estrecha proximidad funcional entre tres canales separados [los canales de calcio
sensibles al voltaje de tipo N, los canales de calcio de liberación de Ca21
inducidos por Ca21 (CICR) sensibles a la rianodina (RY) y los canales de K1 (SK)
lentos AHP que subyacen al AHPslow] es esencial para el inicio de AHPslow.
RESULTADOS
Propiedades generales de AHPslow aferente vagal . El AHPslow se observa
en una amplia variedad de neuronas periféricas y centrales (para revisión, ver ref.
7). En las neuronas nodosas, AHPslow siempre está precedido por una
poshiperpolarización rápida posterior al pico (AHPfast, 10–50 ms) que ocurre al
final de la repolarización AP. En algunas neuronas, el AHPrápido es seguido por
un segundo potencial posterior que dura de 50 a 300 ms (AHPmedio). El medio
AHP es dependiente de voltaje y Ca21 y está bloqueado por tetraetilamonio 10
mM en el '50% de las neuronas, lo que sugiere que está mediado por canales K1
activados por Ca21 de gran conductancia (canales BK) (8).
En los somas aferentes vagales, el AHPslow es particularmente robusto.
Después de un solo AP, el AHPslow muestra un inicio retrasado (100 a 500 ms),
un tiempo de aumento lento hasta el pico (0,3 a 5 s) y una duración prolongada
(2 a 15 s; consulte la figura 1). La proporción de neuronas lentas AHP dentro de
los ganglios nodosos varía entre especies: '20% en el cobayo, '35% en conejo y
'85% en hurón. Sólo las neuronas nodosas clasificadas como fibras C (velocidad
de conducción, 1 mys) poseen AHPslow. Hasta la fecha, ha habido pocas
diferencias entre especies en las propiedades farmacológicas o fisiológicas
Abreviaturas: AP, potencial de acción; BK, canales K1 activados por Ca21 de gran
conductancia ; SK, canales K1 activados por Ca21 de baja conductancia ; CICR, depósitos
de liberación de Ca21 inducidos por Ca21 ; RY, rianodina; VDCC, canales de Ca21
dependientes de voltaje; L, N, R, tipo L, tipo N y VDCC tipo R; AHP, poshiperpolarización;
DBHQ, 2,5,-di(t butil)hidroquinona. ‡A quién deben dirigirse las solicitudes de reimpresión.
correo electrónico: dweinrei@umaryland.edu.

PNAS está disponible en línea en www.pnas.org.

7650
Machine Translated by Google
Ponencia del coloquio: Córdoba-Rodríguez et al.
HIGO. 1. Un solo AP puede evocar tres tipos de AHP en nodose
neuronas (Arriba) Una neurona con un potencial posterior de un solo componente
con una duración de '30 ms. Este AHP se designa como AHPfast. Todas las neuronas tienen esto
postpotencial de corta duración. (Centro) Ejemplo de una neurona con dos
postpotenciales, un AHPfast seguido de un postpotencial de mayor duración
('300 ms), el medio AHP. En aproximadamente la mitad de las neuronas, el
El medio AHP es dependiente de Ca21. (Abajo) En un subconjunto del tipo de fibra C
neuronas nodosas, un desarrollo lento (cientos de ms) y de larga duración
(2–15 s) se observa el potencial posterior. Este potencial posterior lento (AHPslow)
siempre es dependiente de Ca21. Los registros intracelulares se obtuvieron en
temperatura ambiente de neuronas adultas aisladas de nudos de conejo
ganglios Los valores cerca de las líneas horizontales son membrana en reposo.
potenciales. La calibración en la parte superior también se aplica al medio. Similar
los resultados se han registrado en neuronas nodosas de cobayas y hurones.
del AHP lento. Un AHP lento análogo también ha sido recientemente
descrito en '25% de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal tipo C de
la rata (9, 10).
El AHPslow en las neuronas aferentes vagales influye celular
excitabilidad y controla la frecuencia AP sobre la fisiológica
rango de 0,1 Hz a 10 Hz (11, 12). Una propiedad interesante
del AHPslow es que su amplitud está sintonizada tanto con el número AP
y frecuencia En el rango de 1 a 100 Hz, la amplitud de
el AHPslow aumenta con el número de AP hasta que se estanca
después de '15 AP (Fig. 2); resultados similares se observaron cuando el
Se supervisó la corriente subyacente al AHPslow . Por razones
aún sin resolver, 10 Hz (intervalos entre picos de 100 mseg) evoca
consistentemente las respuestas más grandes.
Tabla 1. Mediadores inflamatorios que bloquean AHPralentización en vagal
neuronas aferentes
Mediador Tipo de receptor CE50, nM
bradicinina B2 72
Histamina H1 2,000
serotonina segundo 300
PGD2, PGE2 segundo ;20
Leucotrieno C4 segundo ;100
Bradicinina (26), histamina (27), serotonina (28), PGD2 y PGE2
(12) y el leucotrieno C4 (3) bloquean el AHPslow. nd, no determinado;
prostaglandina PG.
proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos 96 (1999) 7651
HIGO. 2. Efectos de la variación del número de puntos de acceso y la frecuencia en la
amplitud del AHP lento. Todos los puntos de datos se registraron de un solo
Neurona nodosa de conejo adulto agudamente disociada a temperatura ambiente.
El potencial de reposo y la resistencia de entrada de la membrana fueron de 255 mV y
53 MV, respectivamente. Los AP fueron evocados por la despolarización transmembrana
pulsos de corriente (2 nA, 3 ms) a las frecuencias indicadas. Resultados similares
se obtuvieron al medir IAHP usando el voltaje-clamp híbrido
técnica en neuronas nodosas de conejo, cobayo y hurón.
La corriente que genera el AHPslow (IAHP) es una corriente K1 dependiente
de Ca21 insensible al voltaje (13, 14) que no se ve afectada por una amplia
gama de antagonistas del canal K1 : 100 nM
ilamonio, Ba21 10MmMd-tubocurarina,
metro Cs1 4
, 4-aminopiridina 5 mM y, tetraetapamina
10 nM 30 mM, 10
caribdotoxina. La magnitud del AHPslow (o el IAHP) es
relacionado linealmente con la concentración de Ca21 extracelular (Fig.
3) y requiere un aumento del Ca21 libre citosólico ([Ca21]i) para
activación. Amortiguación del Ca21 intracelular con 1,2-bis(2-
ácido aminofenoxi)etano-N,N,N9,N9-tetraacético (BAPTA)
suprime el AHPslow (Fig. 4). Análisis de ruido del IAHP
sugiere una conductancia de un solo canal de '10 pS (inédito
observaciones). Estas características son consistentes con las propiedades de
un canal de K1 activado por Ca21 de pequeña conductancia (SK
canal; árbitro. 8). De los varios canales SK recientemente clonados
del cerebro de mamífero (15), el canal hSK1 tiene un perfil farmacológico y
biofísico compatible con el canal K1
actual subyacente a la AHPslow en las neuronas nodosas.
La inyección de Ca21 evoca dos temporalmente distintos hacia el exterior
Corrientes. Para probar si los canales K1 asociados con el
AHPmedium y AHPslow son activados directamente por Ca21, nosotros
Ca21 inyectado iontoforéticamente en neuronas nodosas. Independiente del
AHPslow, una gran corriente hacia el exterior con rápido
la cinética de activación y decaimiento fue provocada por la inyección de Ca21 .
Esta corriente (IK-medio) fue evocada en la celebración de potenciales
entre 22 mV y 245 mV. Estaba completamente bloqueado por 5
tetraetilamonio mM pero no afectado por los inhibidores de la
AHPslow (prostaglandinas D2 o E2 100 nM o forskolina 1 M). metro
El medio IK dependía fuertemente del voltaje y requería membrana
manteniendo potenciales más positivos que 255 mV. Asumiendo un
potencial de inversión de 280 mV, el medio IK tuvo un aumento de e-fold
en conductancia máxima para cada 8,0 6 1,0 mV (media 6 SEM; n 5
8) despolarización, calculada a partir de gráficos semilogarítmicos de
Conductancia máxima de cuerda versus potencial de retención de tensión de
sujeción. Estas propiedades son similares a las de gran conductancia
Canales BK (AHPmedio) .
En las neuronas que exhibieron AHPslow, la inyección de Ca21 provocó
una corriente de salida prolongada y de desarrollo lento (IK-slow).
Machine Translated by Google

7652 Documento del coloquio: Córdoba-Rodríguez et al. proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos 96 (1999)

HIGO. 4. Efectos de BAPTA sobre la lentitud de AHP y sobre la excitabilidad

de una neurona nodal de conejo disociada de forma aguda. (A) BAPTA/
acetometiléster (10 M) aplicado en bañocambiar
bloquea
el potencial
metro el AHPslow
de membrana
en 5 min sin
en
reposo o la resistencia de entrada de la membrana. Los AP fueron evocados
por pulsos de corriente despolarizante transmembrana (4 nA, 1,5 ms, 10 Hz)
HIGO. 3. Efectos de la variación de [Ca21]o en la amplitud del AHPslow
y están truncados. (B) Respuestas registradas a una velocidad de barrido
registrado en neuronas nodosas aisladas. (A) Rastros de muestra de
más rápida para ilustrar la cinética de AHPfast y AHPmedium, que preceden
AHPslow evocados por un tren de cuatro AP en presencia de diferentes
a AHPslow. El AHPfast no se ve afectado por M BAPTA/acetometiléster
[Ca21]o. Los AP son evocados por pulsos de corriente despolarizante
se ilustra(comparar
en c, donde
metro a con
la neurona
b). La dependencia
se superfunde
decon
Ca21CdCl2
por 10
100del
Mmedio
duranteAHP
30
transmembrana (2 nA, 3 ms, 10 Hz) y se truncan. [Ca21]o se varió de 2,0 a
s, lo que bloquea la mayor parte del medio AHP. El componente residual del
0,0 mM en decrementos de 0,5 mM. El AHPslow se bloquea completamente
AHP registrado en CdCl2 es rectificadores
el AHPfast,retardados.
metro que está mediado
(C) por canales K1
cuando [Ca21]o se reduce a cero nominalmente. Al volver a 2,0 mM [Ca21]o,
el AHPslow recupera su amplitud original. (B) Relación entre [Ca21]o y
amplitud AHPslow registrada en varias neuronas. Los valores son medias 6
SEM del número de observaciones indicadas cerca de cada punto de datos. La depresión de la AHPslow aumenta notablemente la excitabilidad neuronal.
La frecuencia de disparo AP promedio inducida por un protocolo de rampa
Los datos se normalizan a la respuesta máxima registrada en una neurona
actual (1 nA, 2 s) aumentó de 1 a 5,5 Hz cuando se bloqueó AHPslow .
determinada. El análisis de regresión lineal produce la línea continua (r 5
Se observó una pérdida similar de adaptación a la frecuencia de picos con
0.993).
bradiquinina, prostaglandina D2, histamina y otros autacoides inflamatorios
La Fig. 5 muestra una superposición de las respuestas de corriente de salida provocadas por la (ver Tabla 2). La barra de escala representa 3 mV, 2 s en A; 15 mV, 0,25 s
inyección de Ca21 en una neurona de tipo C nodosa única a potenciales de mantenimiento de
en B; y 15 mV, 0,5 s en C. La línea discontinua representa el potencial de
membrana en reposo (260 mV). La resistencia de entrada de la membrana
220 mV y 250 mV. Las diferencias cinéticas entre IK-medio e IK-lento después de la inyección de
en reposo fue de 70 MV. Los datos son de la ref. 19 con permiso de la
Ca21 son dramáticas. En contraste con la activación rápida de IK-medium, el inicio de IK-slow se
Sociedad Americana de Fisiología.
retrasa y el decaimiento de IK-medium es casi completo antes de que se alcance la amplitud
máxima de IK-slow . Estas dos corrientes externas reflejan las diferencias temporales y indicador fura-2. La magnitud del DCat depende tanto del [Ca21]o como del número de AP. En
farmacológicas entre AHPmedium y AHPslow. IK-slow, como AHPslow, fue bloqueado por el rango de uno a ocho AP, existe una relación aproximadamente lineal entre la magnitud del
prostaglandina D2 100 nM . Los datos que se muestran en la Tabla 2 resumen las diferencias DCat y el número de AP (Fig. 6). En presencia de fármacos que bloquean CICR pero que no
cuantitativas entre estas dos corrientes de salida inducidas por Ca21. afectan significativamente la entrada de Ca21 inducida por AP [(RY, 10 M), 2,5,-di(t butil)
hidroquinona (DBHQ, 10 M) o thapsigargin (TG, 100 nM)], encontramos que se requerían al
menos ocho AP para evocar un DCat detectable (Fig. 6). En presencia demetro
RY,relación
DBHQ DCat-AP
y TG, la
muestra pendientes de 0,5, 1,1 y 0,8 nM por AP, respectivamente. Cuando
metropendiente de sepor
9,6 nM compara
AP en con
las la
neuronas de control, el flujo de entrada de Ca21 producido por una sola dosis de AP se amplifica
Es posible que el inicio tardío de IK-lento en comparación con IK-medio se deba a distancias de 5 a 10 veces por CICR (16). Las neuronas nodosas demuestran un umbral de estímulo
de difusión de Ca21 desiguales desde el sitio de inyección a los dos tipos de canales K1 . Esta relativamente bajo para provocar CICR. Por ejemplo, se puede observar una respuesta CICR
causa parece improbable porque la orientación del empalamiento fue aleatoria, y las membranas robusta después de un solo estímulo AP en las neuronas nodosas, mientras que se requieren
plasmáticas de las neuronas nudosas disociadas parecen desprovistas de procesos que muchas decenas de AP en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal (17). La mayor respuesta
proporcionarían regiones semiaisladas donde podría generarse IK-lento . Una posibilidad CICR en las neuronas nodosas no se debe a una mayor entrada de Ca21 a través de los canales
alternativa es que se requieran pasos intermedios adicionales, como la síntesis o liberación de de Ca21 dependientes de voltaje (VDCC); un solo AP produce un flujo de entrada de Ca21
un segundo mensajero, para activar IK-slow. El gran Q10 (.3.0; ref. 14) admite la última alternativa. comparable en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal y nodosa (39 frente a 49 pC,
Un candidato es la movilización de Ca21 almacenado intracelularmente. respectivamente; refs. 16 y 18).

Ca21 liberado por el grupo CICR es esencial para la generación de AHPslow. Los AP
individuales producen aumentos transitorios en [Ca21]i (DCat) según lo medido por el fluorescente
Más bien, el grupo CICR más sensible en las neuronas nodosas
Machine Translated by Google

Ponencia del coloquio: Córdoba-Rodríguez et al. proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos 96 (1999) 7653

HIGO. 5. Comparación de dos corrientes K1 salientes evocadas por inyección intracelular de

Ca21 . Las grabaciones se realizaron en un solo agudo
neurona nodosa de conejo adulto aislado. Una corriente de salida lenta (IK-slow)
fue activado por una inyección iontoforética de Ca21 de 5-nA, 1-s en una explotación
potencial de 250 mV. Una segunda corriente de salida (IK-medio) fue
activado a 220 mV (5 nA, 0,5 s). El medio IK se activa y decae
completamente antes de que IK-slow alcance la amplitud máxima. IK-medio fue
bloqueado por tetraetilamonio 10 mM; IK-lento fue bloqueado por 100 nM
prostaglandina D2. La pipeta iontoforética se llenó con un 0,2 M
solución de CaCl2 . Las corrientes de abrazadera de voltaje se registraron con un segundo
pipeta intracelular. El modo de inyección de corriente discontinua (conmutada) de un amplificador
Axoclamp II se utilizó para aplicaciones de abrazadera de tensión y de corriente. El valor de
calibración mayor es para
IK-medio. Los datos de población se muestran en la Tabla 2.

puede reflejar una mayor proximidad entre los canales de entrada de Ca21
de la membrana plasmática y el retículo endoplásmico RY
receptores o un receptor RY más sensible.
Mediante el uso de estímulos fisiológicos (AP) en conjunto con
manipulaciones farmacológicas de CICR, hemos demostrado que CICR es HIGO. 6. (Superior) Efecto de RY en transitorios de Ca21 inducidos por AP .
esencial para el desarrollo de la Las huellas son transitorios de Ca21 provocados por un número variable de puntos de acceso, como
AHP lento. En el rango de 1 a 16 AP, las magnitudes de los se indica debajo de cada trazo. En las neuronas de control, distintos transitorios de Ca21
AHPslow inducido por AP y DCat (un monitor de CICR en estos puede ser obtenido por muy pocos APs. Por el contrario, en presencia de 10 RY, un inhibidor metro
METRO

neuronas) estaban altamente correlacionados (r 5 0.985). Simultáneo
registros de DCat y AHPslow antes y durante el baño
aplicación de inhibidores de CICR (RY, TG, DBHQ o 10 M
de CICR, se requieren al menos ocho AP para generar un
cambio perceptible en [Ca21]i. Supresión del transitorio Ca21 por RY
se debe a su efecto sobre CICR y no al resultado de efectos inespecíficos
metro

ácido ciclopiazónico) reveló que ambas respuestas estaban bloqueadas
en forma paralela (Fig. 7; ver también Tabla 1 en la ref. 19). Estas
Los datos indican que un pool CICR es esencial para la generación
del AHP lento. También proporcionan una explicación potencial para
la cinética lenta del AHPslow, es decir , la movilización de Ca21
del CICR.
Efectos del cambio de [Ca21]o en AHPslow, DCat y Ca21
afluencia. Si el AHPslow depende del Ca21 liberado del
grupo CICR desencadenado por el influjo de Ca21 inducido por AP , sería
seguir que los cambios en [Ca21]o deben producir correspondiente
efectos tanto en AHPslow como en DCat. Los datos mostrados en
La Fig. 3A ilustra los efectos de la reducción progresiva de [Ca21]o
de 2,0 mM a nominalmente cero en la amplitud de la
AHPslow registrado en una sola neurona nudosa. Como [Ca21]o era
disminuyó, la amplitud del AHPslow se redujo proporcionalmente. Cuando
los resultados de esta y cinco neuronas adicionales
(Fig. 3B), la relación entre [Ca21]o y el
amplitud del AHPslow fue lineal (r 5 0.993; n 5 6, combinado
datos de tres abrazaderas de corriente y tres abrazaderas de tensión híbridas
experimentos).
en los canales de Ca21 ; la cinética y la amplitud de ICa provocada por los AP son
completamente no afectado por RY. (Inferior) Efecto de RY en la relación
entre la amplitud de los transitorios de Ca21 y el número de puntos de acceso. mi y
F son amplitudes medias de transitorios de Ca21 provocados por números variables
de potenciales de acción para control (n 5 10) y para nodosis tratada con RY
neuronas (n 5 3), respectivamente. Regresión lineal de datos de control
(potenciales de acción n.º 4) y las células tratadas con RY arrojaron pendientes de 9,6 6
0,01 y 0,5 6 0,23 nM por AP, respectivamente. Comparación de las pendientes
ilustra que CICR es capaz de amplificar el "gatillo" Ca21
resultante de la entrada de Ca21 inducida por AP en 20 veces. Se modifican los datos
de ref. 16 con permiso de Journal of Physiology (Londres).
A continuación, examinamos la relación entre [Ca21]o y el
magnitud de la DCat inducida por AP. La Fig. 8A ilustra DCats
provocado por un número variable de AP registrados desde un solo
neurona en solución de Locke que contiene Ca21 2,2 o 1,1 mM. los
resultados poblacionales que relacionan la amplitud normalizada de la
Se muestra DCats registrados en cuatro neuronas a la cantidad de AP
en la figura 8B. En [Ca21]o 1,1 mM, los primeros AP no provocaron
un DCat medible. Para la neurona que se muestra en la Fig. 8A, al menos
ocho AP fueron necesarios para evocar un DCat detectable. En tres
neuronas adicionales, el número mínimo de AP necesarios para

Tabla 2. Comparación de IK-lento e IK-medio

Cima Tenencia Decadencia

conductancia, potencial, tiempo hasta el pico, tiempo constante, Duración,

Actual nS norte mV norte milisegundo norte milisegundo norte s norte

IK-lento 27,9 6 6,5 53,2 14 255,4 6 2,7 6 14 6,570 6 1085 958 12 6,735 6 789 818 5 23 6 3,4 6 2,5 6 0,16 14

IK-medio 6 16,5 220 6 3,7 6 6 56 6 6 97 6

IK-lento e IK-medio son corrientes de salida provocadas por la inyección iontoforética de Ca21 en neuronas nodosas agudamente aisladas de
El conejo. La conductancia máxima es la mayor conductancia provocada, independientemente del potencial de membrana. la tenencia
potencial es el potencial al que se midió la conductancia máxima. La constante de tiempo de decaimiento se midió ajustando un
línea, a simple vista, a la transformada logarítmica de la caída de la corriente. La duración se calculó desde el inicio de la inyección de Ca21
al momento en que la corriente había decaído al 20% de su valor máximo. Los datos se resumen como la media 6 SEM.
Machine Translated by Google
7654 Ponencia del coloquio: Córdoba-Rodríguez et al.
HIGO. 7. Efecto de DBHQ, un inhibidor funcional de CICR, sobre el transitorio
de Ca21 inducido por AP y sobre el AHP lento registrado simultáneamente en
una neurona nodosa de conejo aislada de forma aguda. Las trazas superiores
representan transitorios de Ca21 superpuestos evocados por un tren de cuatro
AP (10 Hz) registrados en la solución de Locke de control y 7 minutos después
de cambiar a la solución de Locke que
trazas
metro contiene
muestra 10 M DBHQ.
AHPslow. El par inferior
El tratamiento DBHQde
bloqueó completamente tanto el transitorio Ca21 como el AHP lento. El [ Ca21 ]i
en reposo era 91 nM. Los datos de fluorescencia se adquirieron a 10 Hz. El
potencial de membrana en reposo fue de 267 mV. Las amplitudes AP están
truncadas. Los datos son de ref. 19 con permiso de la Sociedad Americana de
Fisiología.
obtener un DCat detectable osciló entre 4 y 32. La relación DCat-AP
registrada en [Ca21]o 1,1 mM, como en la solución de Locke que
contenía [Ca21]o normal, siguió una relación hiperbólica (5 6,75 y 0,31;X2
r 5 0,988 y 0,999 para Ca21 2,2 y 1,1 mM , respectivamente (Fig. 8B y
véase también la Fig. 1 en la referencia 16). Dada la naturaleza
hiperbólica de la relación DCat-AP , deducir los efectos de [Ca21]o
alterado sobre la magnitud de DCat depende claramente de en qué
parte de esta relación se realice la comparación.
En un extremo, hay un cambio de '2 veces cuando se comparan las
fases de meseta de las curvas en [Ca21]o normal y medio normal.
También es posible calcular las pendientes iniciales límite para la fase
ascendente de las curvas (líneas discontinuas en la Fig. 8B). Las
pendientes limitantes, que representan el potencial total de liberación
de Ca21 del conjunto de CICR antes de que ocurra realmente cualquier
liberación, fueron 15 6 3,8 y 2 6 0,7 nM por AP en [Ca21]o 2,2 y 1,1
mM, respectivamente. Por lo tanto, reducir [Ca21]o por un factor de 2
da como resultado una reducción de DCat por un factor de 7 6 2.8
cuando se comparan las fases ascendentes de las dos curvas. La
reducción de 7 veces del DCat asociada con la reducción a la mitad de
[Ca21]o es mucho mayor que la reducción de 2 veces en la amplitud
AHPslow (Fig. 3), lo que sugiere que algo, pero no todo, el Ca21
liberado del CICR pool es necesario para la generación de AHPslow.
El efecto desproporcionado de [Ca21]o reducido en DCat versus
AHPslow podría surgir de una reducción no lineal de la entrada de
Ca21 por AP y/o de una liberación disminuida de Ca21 del grupo CICR
por unidad de entrada de Ca21 . Para estudiar estas posibilidades,
examinamos el efecto de la reducción de [Ca21]o en la entrada de
Ca21 inducida por AP . La cantidad de Ca21 que ingresa a una neurona
con cada AP en estado normal y en [Ca21]o reducido se determinó
mediante el uso de un AP pregrabado como comando de fijación de
voltaje de celda completa en condiciones experimentales en las que el
principal portador de carga entrante es Ca21 (para más detalles, ver Fig. 2 en la ref. 16).
Cuando [Ca21]o se redujo decrecientemente desde 2 mM hasta
nominalmente cero, la magnitud del ICa disminuyó proporcionalmente.
El movimiento de carga causado por la entrada de Ca21 , normalizado
a la capacitancia de la membrana celular (pCypF), se representó frente
a la variación de [Ca21]o para 12 neuronas. En el rango de 0-2,0 mM
[Ca21]o, la entrada de Ca21 varió linealmente con [Ca21]o (r 5 0,974).
Estos resultados indican que los cambios en la entrada de Ca21 solo
proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos 96 (1999)
HIGO. 8. Efecto de la variación de [Ca21]o sobre la amplitud de los transitorios
de Ca21 inducidos por AP . (A) Rastros representativos de transitorios de Ca21
evocados por números variables de AP en normal (2,2 mM) y reducido (1,1 mM)
[Ca21]o. Los AP se provocaron mediante pulsos de corriente despolarizante
transmembrana (2 nA, 1,5 ms, 10 Hz). El número de AP se indica debajo de
cada traza. (B) La amplitud normalizada (media de 6 SEM) de los transitorios de
Ca21 registrados en cuatro neuronas se representa frente a un número variable
de puntos de acceso. Los datos se normalizan a la respuesta máxima registrada
en una neurona dada. E representa transitorios de Ca21 registrados en [Ca21]o
2,2 mM ; F representa transitorios de Ca21 registrados en las mismas neuronas
en [Ca21]o 1,1 mM. Las curvas continuas son hipérbolas rectangulares ajustadas
(52 6,75
a los datos X respectivamente).
y 0,31, r 5 0,988
Las
y 0,999
líneas para
discontinuas
2,2 y 1,1representan
mM [Ca21]o,las
pendientes iniciales limitantes (15 6 3,8 y 2 6 0,7 nM por AP para 2,2 y 1,1 mM
[Ca21]o, respectivamente).
no puede explicar la reducción desproporcionada en el DCat en relación
con el AHPslow que se observa cuando se reduce [Ca21]o .
El efecto desproporcionado de [Ca21]o reducido en la relación DCat-
AHPslow podría surgir de una disminución en la cantidad de Ca21
liberada del grupo CICR. La cafeína, un agonista conocido de CICR,
se usa tradicionalmente para evaluar el contenido liberable del grupo
de CICR. En 8 de las 13 neuronas estudiadas, la reducción a la mitad
de [Ca21]o redujo la DCat inducida por cafeína en un 20-79 % (100 %
frente a 47 6 7,2 % en [Ca21]o 2,2 y 1,1 mM, respectivamente; P 5
0,0002). En otras palabras, la disminución de [Ca21]o por un factor de
2 provocó una reducción de 1,25 a 5 veces en la respuesta a la cafeína.
Al volver a la solución de Locke normal, la respuesta a la cafeína se
restauró a valores cercanos al control. En las cinco neuronas restantes,
la DCat inducida por cafeína no se vio afectada por la reducción de
[Ca21]o (100 % frente a 112 6 8,4 % en [Ca21]o 2,2 y 1,1 mM,
respectivamente; P 5 0,690). No hubo una diferencia significativa en
los niveles de reposo de [Ca21]i entre estos dos grupos de neuronas
(93 6 29,5 nM frente a 111 6 29,7 nM; P 5 0,530).
Desafortunadamente, la amplia variabilidad en los efectos de [Ca21]o
reducido en las respuestas de cafeína impide una interpretación
significativa del efecto de [Ca21]o en el contenido liberable de la
reserva de CICR.
La entrada de Ca21 a través de los canales de calcio tipo N
provoca selectivamente AHPslow. Se han descrito seis tipos de
VDCC en las neuronas: L, N, P, Q, R y T (20). Las neuronas nodosas
expresan varios tipos de VDCC. Mediante el uso de un panel de
reactivos farmacológicos que son selectivos para diferentes tipos de
VDCC, probamos la contribución de cada uno a la corriente total de
Ca21 inducida por AP . Nuestros resultados, resumidos en la Tabla 3, revelan qu
Machine Translated by Google

Ponencia del coloquio: Córdoba-Rodríguez et al. proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos 96 (1999) 7655

Tabla 3. Efectos de los bloqueadores de los canales de Ca21 sobre la acción Tabla 4. Acciones de bloqueadores de canales de Ca21 específicos sobre la acción

corrientes de entrada de Ca21 inducidas por potencial transitorio de Ca21 inducido por potencial y el AHPslow

Concentración Reducción, %

Tipo de canal Bloqueador de canales M Reducción n Canal Ca21

metro
AHPlento
T amilorida 500 060 18 escribe bloqueador de canales transitorio norte
amplitud norte

L nifedipina 10 44 6 5,6 0 9 L 57 6 7,7 39 21 060 5

nifedipina
PyQ v -AGAIVA 0,2 60060 2 norte v -CTX GVIA 6 6,2 y 100 4 100 6 0 0 6
q v -CTX MVIIC 0,25 40 6 4,0 6 60 6 0 100 5
T, R Níquel
norte v -CTX GVIA 1 15 Todos Cadmio 2 60 6

El efecto bloqueador de amilorida, nifedipina, -agatoxina (AGA) v

Se utilizaron las siguientes concentraciones de antagonistas: nifedipino
v
IVA, -conotoxina (CTX) MVIIC y -conotoxina (CTX) GVIA v es v
(10 M), -conotoxina
metro GVIA (0,5 M o 1 M), níquel (502500 M),
metro metro metro

expresado como porcentaje de reducción en la amplitud máxima del total y cadmio (100 M). nd, no determinado.
metro

corriente de calcio 6 SEM. n corresponde al número de celdas para cada

condición.
de la corriente de entrada de Ca21 inducida por AP es compartida por L y N
canales tipo Ca21 (fig. 9). Canal de Ca21 tipo P, Q y T
antagonistas fueron ineficaces, lo que sugiere que el resto
La corriente de Ca21 está asociada con la entrada de Ca21 a través del tipo R
canales Nifedipino (10 M), un bloqueador del canal Ca21 tipo L ,
metro
no produjo ningún efecto medible en el AHPfast, el
AHPmedio, o AHPlento. Por el contrario, -conotoxina-GVIA
(0.5 metro M), un bloqueador selectivo de canales de Ca21 tipo N , siempre
eliminó el AHP lento, y en el '50% de las neuronas abolió el AHP medio (alrededor de
la mitad del AHP medio son Ca21-
sensible, véase más arriba), mientras que el AHPfast no se ve afectado
(Fig. 9 y Tabla 4.). Estos resultados indican que SK y BK
Los canales tipo K1 están ambos regulados por la entrada de Ca21 a través de N
canales de tipo. Los canales BK están controlados por la entrada de Ca21 directamente
(8), mientras que los canales SK se ven afectados por la entrada de Ca21 indirectamente
(es decir, el Ca21 que ingresa a través de un VDCC de tipo N desencadena que los
v receptores RY liberen Ca21 de las reservas de CICR). tal secuencia
implica un acoplamiento funcional entre canales de Ca21 tipo N

HIGO. 9. Efectos de los antagonistas de VDCC sobre corrientes de calcio inducidas por AP, transitorios de Ca21 inducidos por AHPslow y AP . (A) Corrientes de calcio hacia el interior
registrado en neuronas nodosas aisladas evocadas por una forma de onda AP pregrabada de un potencial de retención de 260 mV. De izquierda a derecha, control hacia adentro
corriente en presencia de [Ca21]o 2 mM y en presencia de nifedipina 10 M. Después de restablecer las condiciones de control, la neurona fue expuesta
metro

hasta 1 M dev cadmio

metro
-conotoxina-GVIA.
METRO Losenefectos
se registraron de 500 la corriente de control para esta celda era similar a la
otra neurona; metro

primer rastro. (B) AHPslow evocado por un tren de cuatro AP (10 Hz) registrado en otra neurona nodosa. De izquierda a derecha, AHPslow evocado en control
condiciones, en presencia de 100 M CdCl2, después del lavado, en presencia de 500 nM -conotoxina-GVIA, y después delv lavado. (C) inducida por AP
metro

Transitorios de Ca21 registrados en dos neuronas nodosas. De izquierda a derecha, transitorios de Ca21 evocados por un tren de ocho puntos de acceso en solución normal de Locke,
metro
v
y en solución de Locke que contiene 10 M de nifedipina. En otra neurona, la 1-conotoxina-GVIA redujo el transitorio de Ca21 en un 50% (ver Tabla
metro
METRO

4). Los puntos de acceso fueron provocados por pulsos de corriente despolarizante de 2,5 ms y 10 Hz.
Machine Translated by Google
7656 Ponencia del coloquio: Córdoba-Rodríguez et al.
y canales RY en el retículo endoplásmico. Probamos esto
propuesta mediante el examen de los efectos de los antagonistas de VDCC en
la magnitud de DCat inducida por AP.
Afluencia de Ca21 a través de los canales de Ca21 tipo L y N
desencadena CICR. La magnitud del DCat es un factor sensible
indicador de liberación de Ca21 del pool CICR. Para determinar
la influencia relativa de la entrada de Ca21 a través del tipo L y N
canales en el lanzamiento del grupo CICR, aplicamos selectivo
antagonistas de VDCC y monitorearon la amplitud de DCat.
Nifedipina (10 M) M) ymetro
v -conotoxina-GVIA (0.5–1.0 metro
disminuyó la amplitud de la DCat en un 57% y un 39%,
respectivamente (Fig. 9 y Tabla 4). Estos resultados revelan que el Ca21
entrar a través de canales de Ca21 tipo L o N proporciona
"activar" Ca21 para estimular CICR. Dado que la cantidad de
La entrada de Ca21 a través de los canales de Ca21 tipo L y N es comparable
(44 % y 40 %, respectivamente, de la entrada total de Ca21 inducida por AP ;
ver Tabla 3), debe haber una disposición espacial notable
entre los canales de Ca21 tipo N de la membrana plasmática, los receptores
RY del retículo endoplásmico y los canales SK de la membrana plasmática.
Nuestra hipótesis de trabajo sobre la regulación de la
AHP lento por Ca21 se ilustra esquemáticamente en la Fig. 10.
DISCUSIÓN
Ya sea que se registre en ganglios sensoriales vagales intactos o en
somas aferentes vagales aislados (neuronas nodosas), AP individuales
puede provocar un AHP lento que exhibe un inicio tardío (50-300 ms),
un tiempo lento para alcanzar la amplitud máxima (0,3–0,5 s) y un
larga duración (2–15 s) (14, 21). Inhibición de la AHPlenta por
numerosos mediadores inflamatorios (p. ej., bradicinina, prostanoides, histamina,
serotonina, leucotrieno C4; véase la Tabla 1)
produce un aumento de la excitabilidad neuronal y una pérdida de
Adaptación de frecuencia pico. Por lo tanto, la modulación de la AHPslow
por estos mediadores proporciona un mecanismo para la periferia
sensibilización de los nociceptores que puede ser la base de la hiperalgesia
inducida por inflamación alérgica.
Una cuestión mecánica no resuelta pero importante gira en torno al inicio
tardío y la duración prolongada de la
AHP lento. Muchos de nuestros estudios de AHPslow nodosa se realizaron con
neuronas adultas agudamente disociadas, que son
estructuras esencialmente esféricas que carecen de dendritas y axonales
procesos. Por lo tanto, el inicio tardío de la AHPslow no puede ser
debido a la lenta difusión de Ca21 desde los sitios distales de entrada a somal
canales SK. El coeficiente de alta temperatura (Q10 . 3.0) para
la fase ascendente y la constante de tiempo de caída de la nodosa
AHPslow (14) también argumenta en contra de la difusión simple de Ca21 como
explicación de la cinética lenta del AHPslow. El tiempo
HIGO. 10. Diagrama esquemático de la relación entre los canales de Ca21 de la
membrana plasmática, los canales de potasio BK y SK y los receptores RY del retículo
endoplásmico en las neuronas aferentes vagales primarias. Único
Los AP evocan la entrada de Ca21 a través de los VDCC de tipo L y N. Afluencia de Ca21
a través de cualquiera de estos canales puede desencadenar la liberación de Ca21 desde el
retículo endoplásmico a través de los receptores RY. Mientras que los canales BK son
activado directamente por Ca21 que ingresa a la neurona a través de N tipo VDCC, SK
los canales se activan indirectamente. Los canales SK requieren Ca21 de
Los depósitos de CICR se liberan después de la entrada de Ca21 a través de canales de tipo N.
proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos 96 (1999)
el curso del AHPslow podría surgir de un canal inusual
cinética de los canales SK. Esto también parece poco probable si SK
Los canales en las neuronas nodosas tienen una cinética de activación similar a
los clonados de cerebro de rata (22). Canales SK recombinantes
del cerebro de rata tienen constantes de tiempo de activación que son órdenes
de magnitud más corta que el tiempo de subida del AHPslow. Está
más probable que el curso temporal de AHPslow sea una consecuencia de
DCat debido a CICR.
Si el AHPslow depende directamente del Ca21 liberado de
el grupo CICR, el AHPslow y el aumento inducido por AP en [Ca21]i
debe mostrar una cinética similar. Las comparaciones cinéticas cuantitativas
entre estas dos variables están sujetas a cierta incertidumbre, porque el curso
temporal de la DCat refleja
cambios en [Ca21 ]I, mientras que la cinética del AHPslow es
determinado por eventos en la membrana plasmática. Sin embargo,
determinamos el tiempo hasta el pico y el tiempo de decaimiento del 10 al 90% para
tanto el AHPslow como el DCat provocados por uno a ocho AP
(19). El tiempo hasta el pico para AHPslow fue significativamente más lento
que el DCat por casi un factor de dos (1,0 s frente a 1,9 s); la
DCat también decayó más rápidamente que AHPslow (3 s frente a 7 s).
Se han informado discrepancias temporales análogas entre DCat y AHPslow
en motoneuronas vagales (23). Tal
las diferencias temporales sugieren que el Ca21 liberado de CICR
pools no actúa solo para activar los canales AHPslow K1 . Clonado
Los canales SK contienen muchos sitios potenciales de fosforilación
(15); Por lo tanto, la fosforilación y la desfosforilación dependientes de Ca21
pueden ser procesos adicionales en la ruta de transducción de señales de AHP
lento provocado por AP.
Ahora existen datos inequívocos que muestran que Ca21 puede directamente
activar los canales SK en las neuronas del hipocampo (24) y en
Ovocitos de Xenopus (22). En las neuronas nodosas, es menos claro
si el Ca21 solo es suficiente para activar y mantener el
AHP lento después de un AP. En las neuronas del hipocampo, fotólisis flash
de un quelante de Ca21 "enjaulado" trunca inmediatamente
AHPslow, lo que sugiere que se requiere un Ca21 intracelular elevado para
mantener el AHPslow (25). Estos resultados no,
sin embargo, distinguir entre la activación continua de Ca21 de SK
canal y la implicación de otros factores dependientes de Ca21
manteniendo la longevidad del AHPslow. También es posible que
Los factores dependientes de Ca21 actúan sinérgicamente con Ca21 para controlar
Canales SK (23). La morfología casi esférica y las grandes
El tamaño de las neuronas nodosas adultas agudamente aisladas proporciona
una preparación favorable para determinar la naturaleza de los segundos
mensajeros necesarios para activar y mantener la lentitud de AHP.
En conclusión, un subconjunto de neuronas aferentes primarias vagales
Poseen un pico de desarrollo lento y duradero después de la hiperpolarización,
el AHPslow, que puede afectar profundamente el
frecuencia de descarga de estas neuronas aferentes viscerales. Aunque la
entrada de Ca21 evocada por AP a través de Ca21 de tipo L y N
canales activa CICR, sólo el flujo de Ca21 a través de canales de tipo N activa
el AHP lento dependiente de CICR. Este tipo de
especificidad sugiere que el acoplamiento espacial entre N tipo Ca21
canales y canales SK pueden ser críticos para la generación de
el AHP lento en las neuronas nodosas. El acoplamiento exacto del mecanismo
DCat a la corriente AHPslow queda por determinar.
Agradecemos a nuestros compañeros de trabajo que participaron en muchos de los
experimentos descritos en este manuscrito: Dres. Akiva Cohen, Samir Jafri y
Bill Wonderlin y el Sr. Glen Taylor. Los autores también agradecen a la Dra. Liz
Katz y al Sr. Eric Lancaster por sus sugerencias constructivas sobre un
borrador anterior de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por Nacional
Institutos de Becas de Salud GM-46956 a JPYK, NS-22069 a DW
y Capacitación Beca NS-07375 a KAM
1. Undem, BJ & Riccio, MM (1997) en Asthma, eds. Barnes, PJ,
Grunstein, MM, Leff, A. y Woolcock, AJ (Lippincott,
Filadelfia), págs. 1009–1026.
2. Weinreich, D. (1995) Pulm. Farmacol. 8, 173–179.
3. Undem, BJ, Hubbard, W. y Weinreich, D. (1993) J. Auton.
Nerv. sist. 44, 35–44.
Machine Translated by Google
Ponencia del coloquio: Córdoba-Rodríguez et al.
4. Weinreich, D., Moore, KA y Taylor, GE (1997) J. Neurosci.
17, 7683–7693.
5. Moore, KA, Taylor, GE y Weinreich, D. (1999) J. Physiol.
(Londres) 514.1, 111–124.
6. Greene, R., Fowler, JC, MacGlashlan, D., Jr. y Weinreich, D.
(1988) J. Appl. Fisiol. 64, 2249–2253.
7. Sah, P. (1996) Tendencias Neurosci. 19, 150–154.
8. Blatz, AL y Magleby, KL (1987) Trends Neurosci. 10, 463–467.
9. Gold, MS, Shuster, MJ y Levine, JD (1996) Neurosci. Letón. 205, 161–
164.
10. Villie`re, V. & McLachlan, EM (1996) J. Physiol. (Londres) 76, 1924–
1941.
11. Coleridge, JCG y Coleridge, HM (1984) Rev. Physiol.
Bioquímica Farmacol. 99, 1–110.
12. Weinreich, D. y Wonderlin, WF (1987) J. Physiol. (Londres)
394, 415–427.
13. Higashi, H., Morita, K. y North, RA (1984) J. Physiol.
(Londres) 355, 479–492.
14. Fowler, JC, Greene, R. y Weinreich, D. (1985) J. Physiol.
(Londres) 365, 59–75.
15. Ko¨hler, M., Hirschberg, B., Bond, CT, Kinzie, JM, Marrion, NV y
Adelman, JP (1996) Nature (Londres) 273, 1709–1714.
16. Cohen, AS, Moore, KA, Bangalore, R., Jafri, MS, Wein Reich, D. y
Kao, JPY (1997) J. Physiol. (Londres) 499, 315–328.
proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos 96 (1999) 7657
17. Shmigol, A., Verkhratsky, A. e Isenberg, G. (1995) J. Physiol.
(Londres) 489, 627–636.
18. Scroggs, RS y Fox, AP (1992) J. Neurosci. 12, 1789–1801.
19. Moore, KA, Cohen, AS, Kao, JPY y Weinreich, D. (1998)
J. Neurofisiol. 79, 688–694.
20. Dunlap, K., Luebke, JI y Turner, TJ (1995) Trends Neurosci.
18, 89–98.
21. Leal-Cardosa, H., Koschorke, GM, Taylor, G. & Weinreich, D.
(1993) J. Auton. Nerv. sist. 45, 29–39.
22. Hirschberg, B., Maylie, J., Adelman, JP y Marrion, NV
(1998) J. Gen. Physiol. 111, 565–581.
23. Lasser-Ross, B., Ross, WN y Yarom, Y. (1997) J. Neurophysiol. 78,
825–834.
24. Marrion, NV y Tavalin, SJ (1998) Nature (Londres) 395,
900–905.
25. Lancaster, B. y Zucker, RS (1994) J. Physiol. (Londres) 475,
229–239.
26. Weinreich, D., Koschorke, GM, Undem, BJ y Taylor, GE
(1995) J. Physiol. (Londres) 483.3, 735–746.
27. Jafri, MS, Moore, KA, Taylor, GE y Weinreich, D. (1997)
J. Physiol. (Londres) 503.3, 533–546.
28. Christian, EP, Taylor, GE y Weinreich, D. (1989) J. Appl.
Fisiol. 67, 584–591.