Ccayac CT 03

CLAVE:
COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

CCAYAC-CT-003/2
CATÁLOGO OFICIAL DE MEDIOS DE CULTIVO HOJA: 1 DE 31
SUBSTITUYE A:
VIGENTE A PARTIR DE: FECHA DE PRÓXIMA REVISIÓN:
CCAYAC-CT-003/1
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FECHA: 2019-07-10
1. OBJETIVO.
Establecer los lineamientos generales y específicos para la preparación y evaluación del desempeño de
los medios de cultivo preparados en el Departamento de Análisis y Desarrollo de Pruebas
Microbiológicas de la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC).
TA
2. ALCANCE.
UL
Aplica a los medios de cultivo preparados y evaluados en el Departamento de Análisis y Desarrollo de
NS
Pruebas Microbiológicas de CCAYAC. CO
3. DEFINICIONES.
 Medios de mantenimiento: Su propósito es mantener cultivos puros para ser usados
DE
posteriormente en otras pruebas o para conservarlos por periodos prolongados de tiempo.

Tales medios son simples en términos de composición y no contienen componentes que
puedan favorecer un crecimiento excesivo.
O
 Medios Selectivos: Contienen ingredientes que inhiben el crecimiento de microorganismos

NT
indeseables seleccionando de esta manera el o los microorganismos deseados.

 Medios diferenciales: Contienen indicadores como colorantes que permiten diferenciar entre
ME
microorganismos como resultado de reacciones bioquímicas que se llevan a cabo durante el

crecimiento de microorganismos, que se pueden observar mediante el cambio de color del
CU
indicador (colorante).
 Medio de enriquecimiento: Es un medio líquido en el cual la muestra es inoculada con la
DO
finalidad de aumentar la cantidad de ciertos microorganismos y al mismo tiempo suprimir el

crecimiento de otros no deseados.
CONTROL DE EMISIÓN
Elaboró: Revisó: Autorizó:
Eloy Torres Infante Imelda Rocío Guzmán

Nombre: Alejandro Galindo García
Ana Karen Alquicira Jiménez Cervantes
Firma y fecha:
"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

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 Medios selectivos y diferenciales: Son medios solidos que contienen ingredientes que
permiten diferenciar microorganismos de interés de otros que no lo son, del universo de
microorganismos presentes en una muestra.
4. DESARROLLO.
TA
Se deben seguir las indicaciones de solicitud de medios, preparación, control de calidad y entrega de
UL
medios de cultivo conforme a lo indicado en los siguientes incisos
NS
A) SOLICITUD DE MEDIOS DE CULTIVO
CO
La solicitud de medios de cultivo se realiza de la siguiente forma:
A.1. El usuario elabora una solicitud de preparación de medios de cultivo en el CCAYAC-F-227

DE
“solicitud de medios de cultivo”, en original y copia. Anotar el nombre del solicitante, fecha y
hora de solicitud, laboratorio al que pertenece, el nombre y concentración del medio cuando
O
proceda, la cantidad en unidades de presentación (cajas Petri, tubos, frascos, matraces) y el

NT
volumen de cada unidad de presentación.

A.2. La fecha de recepción de las solicitudes de medios de cultivo es de lunes a viernes.
ME
A.3. Recepción de solicitudes: el personal del área de medios de cultivo recibe el vale y se revisa
que cumplan con los datos arriba mencionados y se le asigna a cada medio un número
CU
consecutivo de solicitud de preparación medio.

DO
A.3.1. Se debe llenar el formato CCAYAC-F-474 “preparación y evaluación del desempeño de

medios de cultivo” con los siguientes campos:
 Medio de cultivo: anotar el nombre del medio solicitado.
 No. de lote: el formato asigna de manera automática el lote correspondiente a la siguiente
nomenclatura: dd.mm.hh.ss, donde dd= día de preparación, mm=mes de preparación, hh=hora
de preparación, ss=segundo de preparación.
 Cantidad a preparar: el volumen solicitado más un excedente para realizar el control de calidad.
 Fecha de preparación: el día de preparación.
 Realizado por: la persona que preparó.
 Formulación: Escribir el o los ingredientes, marca, lote, y cantidad en g o mL por litro.
 Cantidad requerida para 1000 ml: la computadora realiza el cálculo de la cantidad a pesar.
 Los demás campos son llenados por el personal encargado de preparar medios de cultivo.
 El personal encargado del control de calidad llena los campos mencionados en el CCAYAC-F-
474.

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NOTA 1: Los únicos datos generados automáticamente son el número de lote y la cantidad requerida a
pesar por mL los demás datos deben ser llenados por los técnicos o analistas.
NOTA 2: Para el caso de los medios de cultivo cuya formulación es comercial solo se debe registrar el
nombre del medio, marca, lote y cantidad en g o mL por litro. En caso de que el medio se prepare por
ingredientes se debe llenar cada uno de los ingredientes utilizados.
TA
B) PREPARACIÓN
UL
La información de la composición de los medios de cultivo, soluciones y reactivos que se usan para los
NS
métodos analíticos se encuentra descrita en las fichas técnicas de preparación.
CO
Para consultar las fichas técnicas de preparación de los medio de cultivo, se debe revisar el siguiente
listado. Al hacer click en el nombre de cada medio se desplegara el archivo en formato PDF
DE
LISTADO DE FICHAS DE MEDIOS DE CULTIVO

O
NT
AGARES
CLAVE MEDIO
ME
AG-1 Agar ASTEL

AG-2 Agar Azul de Toluidina
CU
AG-3 Agar Baird Parker

DO
AG-4 Agar BCYE

AG-5 Agar de Hierro Kligler (KIA)
AG-6 Agar de hierro y lisina (LIA)
AG-7 Agar Entérico de Hektoen
AG-8 Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC)
AG-9 Agar Movilidad
AG-10 Agar Nutritivo
AG-11 Agar oxford
AG-12 Agar PALCAM
AG-13 Agar Sangre de Cordero
AG-14 Agar Soya Tripticaseina
AG-15 Agar Sulfito de Bismuto

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AGARES
CLAVE MEDIO
AG-16 Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal)
AG-17 Agar TBX
TA
AG-18 Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS)
AG-19 Agar Urea de Christensen
UL
AG-20 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
NS
AG-21 Agar-hierro-triple azúcar (TSI)
AG-22 Agar Dextrosa Sabouraud CO
AG-23 Agar para antibióticos #1
DE

O

NT

ME

CU

DO

AG-36 Agar Papa Dextrosa
AG-37 Agar Glucosa Rojo Violeta Billis (RVBAG)
AG-38 Agar MacConkey
AG-39 Agar Cetrimida
AG-40 Agar Sal Manitol
AG-41 Medio de enriquecimiento para Clostrodios
AG-42 Agar Columbia
AG-43 Agar EMB-L

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AGARES
CLAVE MEDIO
AG-44 Agar Citrato de Simmon
AG-45 Agar Neutralizante
TA
AG-46 Agar Glucosa Rojo Violeta Billis (RVBA)
AG-47 Agar Cuenta Estándar
UL
AG-48 Agar Indicador PM
NS
AG-49 Agar Swarm
AG-50 Agar Mueller-Hinton CO
AG-51 Agar Vogel Jhonson
AG-52 Agar Hígado de Ternera
DE
AG-53 Agar GVPC

AG-54 Agar Letheen modificado
O
AG-55 Agar Extracto de Malta

NT
AG-56 Agar Verde Brillante

ME
AG-57 Agar Eosina Azul de Metileno (AEMB)

AG-58 Agar SIM
CU
DO
CALDOS
CLAVE MEDIO
CL-1 Caldo Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa)
CL-2 Caldo Cerebro Corazón
CL-3 Caldo Fraser Completo
CL-4 Caldo Fraser Medio
CL-5 Caldo glutamato con minerales modificado (MMGB)
CL-6 Caldo L-lisina descarboxilasa
CL-7 Caldo Muller Kauffmann Tetrationato
CL-8 Caldo Rappaport-Vassiliadis
CL-9 Caldo Rojo de Fenol
CL-10 Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0,T1N1,T1N3 y T1N6,T1N8 y T1N10

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CALDOS
CLAVE MEDIO
CL-11 Caldo Tioglicolato
CL-12 Caldo Soya Tripticaseina
TA
CL-13 Caldo para antibioticos #3
UL
NS
CO
CL-18 Caldo Dextrosa Sabouraud
CL-19 Caldo Mossel de enriquecimiento para enterobacterias
DE
CL-20 Caldo MacConkey

CL-21 Caldo A1
O
CL-22 Caldo Lauril Triptosa

NT
CL-23 Caldo EC
ME
CL-24 Caldo Triptona 1%

CL-25 Caldo MR-VP
CU
CL-26 Caldo Citrato de Koser

CL-27 Caldo Lactosa Billis Verde Brillante
DO
CL-28 Caldo Lauril Triptosa con MUG

CL-29 Caldo Neutralizante
CL-30 Caldo Soya Tripticaseina Sin dextrosa
CL-31 Caldo Urea
CL-32 Caldo Carne Cocida
CL-33 Caldo Glucosa Purpura de Bromocresol
CL-34 Caldo Extracto de Malta
CL-35 Caldo Ácido
CL-36 Caldo CSTEL
CL-37 Caldo Letheen modificado
CL-38 Caldo Nitrato

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CALDOS
CLAVE MEDIO
CL-39 Caldo Lactosado
TA
SOLUCIONES
UL
CLAVE MEDIO
NS
SOL-1 Solución Reguladora de Fosfatos (0.25M)
SOL-2 Solución salina fisiológica
CO
SOL-3 Agua Peptonada Alcalina
SOL-4 Agua Peptonada Amortiguada
DE
SOL-5 Solución Peptonada al 0.1%

SOL-6 Solución Peptonada al 0.1% con polisorbato 80
O
SOL-7 Solución de peptona y extracto de carne con polisorbato 80

NT
SOL-8 Solución amortiguadora al 1% pH 6.0±0.05

SOL-9 Solución amortiguadora 0.1M pH 8.0±0.1
ME
SOL-10 Solución amortiguadora 0.1M pH 4.5±0.05

CU
SOL-11 Solución amortiguadora 10% pH 6.0±0.05

SOL-12 Solución amortiguadora 0.2 M pH 10.5±0.1
DO
SOL-13 Solución amortiguadora 0.1 M pH 7.0±0.2

SOL-14 Solución Reguladora de Fosfatos (0.25M) diluida
SOL-15 Solución Neutralizante Concentrada
SOL-16 Solución Neutralizante Diluida
SOL-17 Agua Peptonada
SOL-18 Solución Reguladora de Fosfatos pH 6
SOL-19 Buffer de Extracción
SOL-20 Solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS)
SOL-21 Triton X

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REACTIVOS
CLAVE REACTIVO
REC-1 Reactivo de Kovacs
REC-2 Reactivo de β-Galactosidasa
TA
REC-3 Reactivos para la prueba de VP
REC-4 Reactivos para la reacción de Indol
UL
REC-5 Reactivos para la tinción de Gram
NS
REC-6 Reactivo Azul de Bromotimol 0.04%
CO
B.1. PESADO
Leer cuidadosamente la etiqueta o la fórmula del medio y pesar exactamente la cantidad indicada
DE
en una balanza granataria o analítica dependiendo de la cantidad a pesar, la cual debe estar
calibrada y verificada. Medidas de seguridad para pesar, usar máscara anti polvo y guantes
O
desechables de vinilo cuando así se indique en la etiqueta.

NT
B.2. HIDRATACIÓN
Colocar la mitad del volumen de agua tipo I a preparar en un contenedor de al menos el doble del
ME
volumen solicitado.
CU
Adicionar el polvo y mezclar. Dejar reposar de 10 a 15 minutos para su completa humectación. Se

puede utilizar un agitador magnético. Adicionar el resto de agua y mezclar procurando que el resto
DO
del polvo adherido a las paredes del recipiente, se resbale e integre al resto del medio.
Si es necesario, calentar ligeramente o calentar a ebullición para la completa disolución del polvo,
en una parrilla caliente con agitación o en la flama utilizando una rejilla y agitando de manera
continua, evitando que el medio se derrame o se pegue al recipiente por calentamiento excesivo; si
es necesario durante la ebullición disminuir la temperatura o la flama o someter en un baño de agua
fría para evitar que el medio se derrame. La disolución total se reconoce cuando al agitar el medio
no se adhieren partículas en las paredes y el medio es transparente.
NOTA: Todo medio es sensible al calentamiento, por ese motivo no debe calentarse más de lo
necesario.
B.3. DETERMINACIÓN DE pH
Medir el pH del medio con un potenciómetro previamente calibrado con soluciones de referencia
pH. 4, 7 y 10. La temperatura del medio y de las soluciones de referencia deben estar a

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temperatura ambiente, ya que de lo contrario las lecturas serán imprecisas (verificar la temperatura
en el termómetro integrado del equipo).
Registrar los datos en el formato de registro de pH.
Ajustar si es necesario con soluciones de hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N, para el caso
TA
de soluciones amortiguadoras o diluyentes de acuerdo a la formulación correspondiente.
UL
Para determinar el pH final de medios sólidos, macerar una alícuota con una varilla de vidrio e
introducir el electrodo para determinar el pH.
NS
B.4. ENVASADO CO
Distribuir en tubos, frascos o matraces la cantidad necesaria del medio de cultivo limitando el
volumen a las ¾ partes de la capacidad del recipiente. Etiquetar los envases con el nombre del
medio, fecha de preparación e iniciales de quién preparó. Para los medios donde el volumen es
DE
crítico, considerar la cantidad perdida de volumen durante la esterilización.

O
Utilizar frascos, matraces o tubos que eviten la evaporación y contaminación del medio con tapa de
rosca de baquelita las cuales durante la esterilización deben estar flojas; alternativamente se puede
NT
utilizar papel aluminio en las tapas. Colocar cinta indicadora de esterilización en los envases.
ME
Para medios líquidos se puede utilizar un dosificador automático. Los dosificadores manuales se
recomiendan para un menor número de tubos.
CU
Para los medios que contiene colorantes se recomienda envasarlos en frascos ámbar.
DO
B.5. ESTERILIZACIÓN
Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos o de acuerdo con los procedimientos recomendados para cada
medio o lo que indique el fabricante. El autoclave debe estar previamente evaluada con esporas de
Geobacillus stearothermophylus sometidas a un ciclo de esterilización e incubadas a 60°C ±2°C
por 48 horas mensualmente y con ciclos de esterilización validados. Para los medios líquidos que
se vayan a utilizar en el área de esterilidad se debe realizar la esterilización del agua previa a la
preparación y registrarlo en el formato de Preparación de medios líquidos de esterilidad.
No sobrecargar la autoclave ya que se reduce su eficiencia.
Registrar tiempo, temperatura, presión de los medios a esterilizar en cada ciclo de esterilización en
el formato de registro de esterilización por calor húmedo y en el registro de uso de olla de presión
para tratamientos térmicos diferentes a la esterilización.

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Los medios que contienen carbohidratos u otros ingredientes no estables al calor se deben
esterilizar por filtración de membrana de 0.45µm.
B.6. ADICIÓN DE SUPLEMENTOS
Cualquier ingrediente termolábil debe obtenerse e incorporarse en condiciones asépticas al medio
TA
de cultivo estéril, a una temperatura no mayor de 50 ºC o lo que indique el fabricante. Para medios
de cultivo sólidos el suplemento debe estar a temperatura ambiente para evitar la solidificación
UL
antes de su incorporación total al medios.
B.7. VERTIDO EN CAJA PETRI
NS
Distribuir en condiciones asépticas volúmenes de medio fundido a temperatura de 45 a 50 ºC en
cajas Petri evitando la formación de burbujas. Permitir el secado del agar en una campana de flujo
CO
laminar horizontal. Almacenar las placas con la base de la caja hacia arriba para evitar que se
acumule la humedad del agar y haya posible contaminación.
DE
B.8. CONSERVACIÓN Y USO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS

La mayoría de los medios deben conservarse en refrigeración de 2 a 8 ºC con su respectivo registro
O
de temperatura. Sin embargo siempre se deben seguir las instrucciones indicadas por el fabricante.
NT
El área asignada para el almacenamiento de medios debe ser exclusiva para tal fin, separada de
ME
muestras o cualquier posible fuente de contaminación cruzada, en lugares limpios, secos,

protegidos de la luz directa del sol y polvo perfectamente bien cerrados e identificados. Los medios
CU
que contienen fosfatos o tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente, debido a que se
pueden precipitar a temperatura baja. El tiempo y condiciones de almacenamiento depende de cada
tipo de medio de acuerdo con las instrucciones del fabricante; en general se recomienda que los
DO
caldos y agares envasados en tubos o frascos con tapa de rosca bien cerrados, no se usen
después de 4 semanas de su preparación en refrigeración y no más de 2 semanas a temperatura
ambiente. Los agares en placa para control ambiental por no más 4 semanas y para otro tipo de
agares lo que indique el fabricante, en refrigeración siempre y cuando se conserven en condiciones
que eviten su deshidratación. Los medios conservados en refrigeración deben sacarse antes de su
uso para permitir que alcancen la temperatura ambiente y evitar la presencia de agua de
condensación.
No se deben utilizar medios sólidos o líquidos que muestren signos de deshidratación o
evaporación respectivamente.
Fundir el medio sólido en olla de presión sin sobrecargar. No fundir el medio más de una vez.

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Una vez fundido el medio debe ser utilizado dentro de las siguientes 3 horas mantenido a 45 ± 1°C.
Si se forma algún precipitado o un cambio anormal en la coloración desechar el medio.
Utilizar los medios que contienen sustancias perecederas o antibióticos inmediatamente después de
su preparación y de preferencia elaborar primero la base que puede almacenarse y el día de su uso
TA
agregar el complemento perecedero.
B.9. ALMACENAMIENTO DE MEDIOS DESHIDRATADOS
UL
En general los medios deshidratados deben estar almacenados en contenedores bien cerrados en
lugares frescos, secos, protegidos de la luz o de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si el
NS
medio ambiente es húmedo y caliente, los medios deben ser almacenados en refrigeración. La
mayoría de los medios de cultivo deshidratados, son estables por al menos 3 años siempre y
CO
cuando sean almacenados adecuadamente, por lo que la compra debe ser planeada para que el
medio se termine en un año.
DE
C) CONTROL DE MEDIOS DE CULTIVO

C.1. EVALUACIÓN FÍSICA
O
Verificar en forma visual la apariencia y color, en los caldos no debe haber turbiedad o material
NT
precipitado, existen excepciones como el caldo tetrationato cuya apariencia física particular y
diferente se especifica en la parte de fórmulas de cada medio de cultivo. Los agares deben de
ME
tener una consistencia firme y de color característico.

Verificar los volúmenes con una probeta calibrada y/o verificada. Registrar datos en la bitácora
CU
CCAYAC-B-536 “REGISTRO DE VOLUMEN FINAL DE MEDIOS DE CULTIVO”

DO
C.2. PRUEBA DE ESTERILIDAD

Incubar el 5% del lote de medio de cultivo preparado a 35 ± 1 ºC por 24 a 48 horas para
mesofílicos aerobios y a 25 ± 1 ºC por 3 a 5 días para mohos y levaduras dependiendo del tipo
de medio. Observar si los medios presentan algún signo de contaminación. Descartar el lote si
está contaminado. Registrar resultados.
C.3. DETERMINACIÓN DE pH
Determinar el pH en los medios de cultivo preparados con un potenciómetro calibrado como lo
describe este catálogo.
D) EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

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Para la evaluación del desempeño de los medios de cultivo utilizados en el área de Microbiologia
farmacéutica, revisar el Anexo 1 de este documento.
Para el resto de los medios de cultivo proceder como se indica a continuación:
TA
D.1. PREPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL INÓCULO.
UL
Para cada una de las cepas control realizar lo siguiente:
 A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticasa de 24 horas a 35 °C, transferir una
NS
colonia a 10 mL de caldo BHI incubar 18 horas a 35°C.
 Tomar un mL del cultivo anterior y realizar diluciones decimales en 9 mL de solución salina
CO
(0.85%) peptonada al 0.1% (10-1 – 10-10), hasta obtener una densidad microbiana de no más de
100 a 150 UFC/ml.
DE
 Sembrar 1ml de las diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado por vaciado en
placa con AST o tomar 0.1ml y sembrarlo por extensión en placa con AST por duplicado.
 Incubar las cajas invertidas a 35°C durante 24 horas. Contar las colonias para conocer en que
O
dilución se encuentra el inóculo deseado.

NT
 Realizar este procedimiento varias veces hasta obtener resultados repetibles. Una vez
establecida la dilución, inocular el medio de cultivo a probar incubándolo bajo las condiciones
ME
establecidas en el método.
CU
NOTA 1: Alternativamente se pueden usar métodos nefelométricos o espectrofotométricos

para el ajuste del inoculo de las cepas.
DO
NOTA 2: Para el uso de inóculos de los liofilizados, seguir las instrucciones de uso del
fabricante.
D.2. MÉTODO PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS SÓLIDOS PARA PRUEBAS

CUANTITATIVAS
 Preparar los cultivos de acuerdo, en una concentración de menos de 100 UFC del
microorganismo blanco.
 Seleccionar dos placas que estén secas del medio a probar y dos placas del medio de
referencia AST. Sembrar 1ml del inoculo y sembrar por vaciado en placa o sembrar 0.1ml del
inoculo si son sembradas por extensión en placa.
NOTA: Consultar e interpretar los anexos E y F de la norma ISO 11133 para los
microorganismos de prueba comúnmente usados y recomendados para cada tipo de medio
Coeficiente de productividad

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PR = (Ns / No)
Dónde
PR = Coeficiente de productividad
Ns = Es la cuenta total obtenida del medio de cultivo a probar
TA
No = Es la cuenta total obtenida del medio de referencia (AST) y deberá ser ≤ 100 UFC/ mL
Interpretación de resultados:
UL
Agares no selectivos: se considera aceptable si el coeficiente de productividad es de ≥ 0.7
Agares selectivos: se considera aceptable si el coeficiente de productividad es de ≥ 0.5
NS
D.3. MÉTODO PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS SÓLIDOS PARA PRUEBAS
CO
CUALITATIVAS
DE
Prueba de productividad y especificidad
 Preparar cultivos de trabajo como se describe en el inciso D.1

O
 Para la prueba de productividad y especificidad, utilizar placas de medio a probar

NT
estriando con asa de 1 µl para cada microorganismo de prueba de manera que se

obtengan colonias aisladas.
ME
 Para selectividad usar un medio de prueba y estriar cada microorganismo de prueba con
una sola línea recta en la misma placa paralelamente sin que se crucen las estrías,
CU
deben ser distinguibles para permitir la observación morfológica típica y tamaño de la

colonia. Incubar las placas bajo condiciones definidas en los métodos de prueba
DO
correspondientes.
Interpretación de resultados
El crecimiento de las placas se evalúa como sigue:
- 0 Corresponde a no crecimiento
- 1 Corresponde a crecimiento débil (aun cuando se reduzca el crecimiento o el tamaño de la
colonia)
- 2 Corresponde a buen crecimiento
La calificación del microorganismo blanco debe ser 2 y tener apariencia típica, tamaño y
morfología colonial (especificidad). Para las pruebas de selectividad dependerá del grado de
inhibición y de tipo de medio. El crecimiento para microorganismos no blanco deber ser
parcialmente inhibidos o completamente inhibidos.

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D.4. MÉTODOS PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS LÍQUIDOS. PRUEBAS

CUANTITATIVAS (DILUCIÓN HASTA EXTINCIÓN DEL INÓCULO).
Método adecuado para medios selectivos o no selectivos usados para medios líquidos para
TA
enumeración como NMP
UL
Preparar el inóculo de acuerdo a lo siguiente:
 Sembrar 1ml de las diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado por vaciado en
NS
placa o 0.1 ml por extensión en placa en AST.
 Incubar las cajas invertidas a 35°C durante 24 horas. Contar las colonias para conocer en que
CO
dilución se encuentra el inóculo deseado (≤100 UFC).
 Una vez establecida la dilución, inocular el medio de cultivo a probar incubándolo bajo las
DE
condiciones establecidas en el método de prueba y 2 o más diluciones hasta la extinción del

inóculo.
NOTA: Para el uso del inóculos de liofilizados, seguir las instrucciones de uso del fabricante si
O
este es el caso no se debe realizar la extinción del inoculo.

NT
D.5. MÉTODO PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS SELECTIVOS LÍQUIDOS

ME
 Preparar los inóculos para los microorganismos blancos y no blancos de acuerdo a lo establecido
CU
en el inciso D.1
 Para microorganismos blanco el inoculo debe ser de ≤100 UFC
DO
 Para microorganismos no blanco ≥1000UFC

 Alternativamente se puede usar inóculos liofilizados y seguir las instrucciones del fabricante.
 Inocular el medio líquido a probar con los inóculos preparados e incubar de acuerdo al método
de prueba correspondiente. Posteriormente estriar ambos inóculos con un asa de 1 µl en el
medio selectivo correspondiente como XLD.
 Incubar de acuerdo a lo indicado en el método correspondiente.
 Interpretación de resultados
 La productividad del medio líquido es satisfactoria si hay crecimiento confluente en al menos una
línea del microorganismo blanco en el medio específico para el microorganismo.
 Selectividad del medio líquido es satisfactoria si no hay crecimiento en el microorganismo no
blanco o crecimiento parcial.

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D.6. MEDIOS DE PRE ENRIQUECIMIENTO

 Preparar cultivos de trabajo como se describe en el inciso D.1
 Inocular el medio de pre eriquecimiento a probar con un inóculo de ≤100 UFC
 Incubar de acuerdo a lo indicado en el método correspondiente
 Interpretación de resultados
TA
 Se reconoce un resultado satisfactorio si al agitar el tubo se observa la presencia de turbiedad
y/o gas, células agregadas, depósito de desarrollo en la base del tubo o la botella y cambio de
UL
color.
NS
E) TOXICIDAD DEL DILUYENTE (REGULADOR DE FOSFATOS)
CO
E.1. Método de prueba cuantitativo para diluyentes
El método determina la habilidad del diluyente para mantener vivos a los microorganismos sin
multiplicarse o reducirse durante un periodo de contacto antes de que sean inoculados en agar o
DE
medio líquido.
O
E.2. Procedimiento
NT
 Inocular una porción a probar (por ejemplo 9 ml) del diluyente con 1 ml del microorganismo
conteniendo 10 4 UFC/ml y mezclar. Inmediatamente tomar 0.1ml del diluyente inoculado y
ME
sembrar por extensión en placa por duplicado sobre la superficie en agar no selectivo (medio
de referencia) como AST (t0).
 Mantener el diluyente inoculado a temperatura ambiente por el tiempo especificado apropiado
CU
descrito en el método de prueba empleado, entre la preparación de la suspensión inicial y el

momento cuando el inóculo está en contacto con el medio de cultivo (normalmente 45
DO
minutos).
 Mezclar y tomar el mismo volumen (0.1ml) e inocular por duplicado las placas de medio de
referencia (t1).
 Incubar el medio de referencia a una temperatura y tiempo apropiados como 35 ° C por 24
horas.
 Lectura e interpretación de datos
 Después de la incubación contar las colonias en las placas a tiempo t 1 y t2 y realizar los
promedios de los duplicados. El número de microorganismos, t1, después de la incubación del
diluyente debe estar dentro de ±30% de la cuenta inicial (t0)
FÓRMULA:
Promedio de la cuenta al tiempo 45’t45 - Promedio de la cuenta al tiempo 0’ t0 X 100
Promedio de la cuenta al tiempo 0’

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E.3. Interpretación de resultados
Se considera aceptable si el porcentaje se encuentra entre ± 30%.

Realizar la prueba cada mes y registrar los resultados.
TA
F) ENTREGA DE MEDIOS DE CULTIVO
F.1. Los medios de cultivos ya preparados se deben recoger de preferencia al siguiente día de su
UL
preparación o el mismo día por el solicitante anotando quien entregó, la hora y fecha.
F.2. El usuario deberá firmar de recibido en el formato correspondiente, revisando que todos los
NS
datos de preparación y almacenamiento estén correctos.
F.3. Una vez que los medios preparados salen del área de preparación de medios de cultivo, es
CO
responsabilidad del solicitante la correcta conservación de los mismos (ver. conservación y uso
de los medios de cultivo preparados). No pueden ser procesadas quejas de medios de cultivo
cuyo tiempo, temperatura y forma de conservación no se apegue a las instrucciones de este
DE
catálogo o lo indicado por el fabricante.

O
NT
4.1 POLÍTICAS GENERALES.

 En la mayoría de los casos se pueden obtener medios en forma deshidratada. Las fórmulas
ME
pueden estar disponibles en varias marcas comerciales y se deben preparar de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
 Debido a que pueden existir algunas diferencias entre marcas, es necesario que el laboratorio
CU
determine la funcionalidad de los medios rutinariamente como parte de un programa de control

de calidad. Los medios deshidratados pueden usarse a menos que en el método se recomiende
DO
lo contrario, recomiende alguna marca por no estar disponible en el mercado o por haberse
evaluado diversas marcas comerciales.
 Para algunos ingredientes o reactivos que se utilizan en la preparación de medios de cultivo o
soluciones, el fabricante no dispone de una fecha de caducidad declarada en el certificado de
calidad ya que lo considera solo como requisito para productos perecederos que son utilizados
en humanos como alimentos, fármacos o en análisis clínicos.
Por tal motivo, en los casos que se tengan reactivos sin fecha de caducidad declarada por el
fabricante, se considera que la vida media de un reactivo almacenado a temperatura ambiente
es de 5 años, reactivos en refrigeración de 3 años y reactivos congelados de 1 año, todos a
partir de la fecha de entrega del producto, por lo que en caso de utilizar este tipo de reactivos
se deberá llenar el formato Etiqueta para sustancias químicas no peligrosas, indicando la fecha
de recepción y apertura del insumo, y la caducidad será conforme lo estipulado anteriormente.
 Es recomendable emplear siempre que sea posible medios de cultivo deshidratados
comerciales a menos que el método de prueba indique que se elabore a partir de ingredientes.

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 Se deben respetar estrictamente las indicaciones del fabricante y/o las estipuladas en este
documento.
 Los medios de cultivo son muy higroscópicos, por lo que hay que evitar tener los frascos
destapados por mucho tiempo. Abrir un frasco nuevo solo cuando el que este en uso se haya
terminado, anotar en el frasco la fecha de apertura.
TA
 No mezclar medio de cultivo o reactivos de frascos de diferente lote.
 No usar medios apelmazados, con cambios en la coloración o textura, aun cuando no hayan
UL
expirado.
 Los contenedores donde se preparen o se envasen los medios de cultivo deben ser de
NS
borosilicato, libres de inhibidores microbianos, enjuagados con agua tipo I, perfectamente
limpios, libres de residuos de detergente alcalino, para lo cual se debe realizar la prueba de
CO
residuos de detergente alcalino, aleatoriamente y al menos dos veces al mes; adicionando al
material seco unas gotas de indicador azul de bromotimol al 0.04% y registrarlos en el formato
DE
y/o bitácora correspondiente.

 El agua tipo I que se utilice para preparar los medios de cultivo debe cumplir con lo establecido
en el CCAYAC-P-040 Procedimiento para la recolección, uso, distribución, almacenamiento y
O
control de agua usada en la CCAYAC. Los resultados del análisis microbiológico se registrarán
NT
en la bitácora del Análisis microbiológico de agua tipo I, tipo II y red municipal.

 El laboratorio donde sean procesadas las muestras no debe rebasar de 15 colonias en 15
ME
minutos de exposición de una placa de agar soya tripticasa o agar peptona-glucosa extracto de
levadura
CU
 Condiciones del laboratorio: Llevar acabo la prueba en condiciones asépticas. Limpiar y

desinfectar el área y registrar en el CCAYAC-F-586 limpieza y sanitización de áreas de trabajo
DO
de microbiología farmacéutica/laboratorio.

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5. DOCUMENTOS DE REFERENCIA.
Documentos Clave
5.1 Instructivo para el manejo de las autoclaves CCAYAC-I-001
5.2 Instructivo de uso de baños para control de temperatura CCAYAC-I-003
TA
5.3 Instructivo para operación de incubadoras CCAYAC-I-011
UL
5.4 Instructivo de uso y verificación de los potenciómetros CCAYAC-I-017
5.5 Instructivo para lavado y uso de refrigerador y congelador CCAYAC-I-018
NS
5.6 Instructivo de operación de máquina pipeteadora CCAYAC-I-047
5.7 Instructivo para el uso de contadores de colonias
CO CCAYAC-I-062
5.8 Instructivo de operación para manejo y uso de las balanzas granatarias CCAYAC-I-026
5.9 Criterios para la verificación metrológica de las balanzas CCAYAC-CR-13
DE
6. BIBLIOGRAFÍA.
O
NT
Documentos
ME
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11133 Microbiology of food, animal feed and water--- Preparation,
6.1
production, storage and performance testing of culture media.
CU
Bacteriological Analytical Manual US Food and Drug Administration Center for Food Safety Applied
6.2
Nutrition.
DO
6.3 Buenas prácticas de la OMS para laboratorios de Microbiología Farmacéutica

6.4 Buenas prácticas de la OMS para laboratorios de Control de Calidad de productos Farmacéuticos
6.5 FEUM 12ª edición, Suplemento 2020, MGA 0571, pp. 66-76. México 2020.
6.6 FEUM 12ª edición, Vol. I, MGA 0381, pp. 397-403. México 2018
6.7 FEUM 12ª edición, Vol. I, MGA 100, pp. 282-295. México 2018

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ANEXO 1. PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS UTILIZADOS EN LA PRUEBA DE

ESTERILIDAD, LÍMITES MICROBIANOS Y VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS.
La prueba de promoción de crecimiento se realiza con el fin de garantizar la funcionalidad de los medios
de cultivo y consiste en demostrar la capacidad del medio para permitir el crecimiento de una cantidad
TA
determinada de microorganismos control. Esto se consigue inoculando muestras representativas de
cada lote del medio de cultivo listo para su uso con una cantidad determinada de microorganismos para
UL
poner de manifiesto que estos pueden recuperarse bajo las condiciones de prueba. Adicionalmente en
el caso de los medios de cultivo utilizados para el análisis microbiológico de productos farmacéuticos no
NS
estériles se evalúa el desempeño respecto a las propiedades inhibidoras e indicadoras de los medios
selectivos. CO
1. Preparación de los inóculos
DE
1.1. Inóculos comerciales estandarizados

O
Reconstituir el liofilizado de acuerdo a lo indicado en el instructivo del fabricante para obtener

NT
de 10 a 100 UFC de cada microorganismo de prueba cuando vaya a realizarse la prueba de

promoción de crecimiento y más de 100 UFC cuando sean usadas para evidenciar la inhibición
ME
del crecimiento, esto según lo indicado en las tablas 1 a la 4.

CU
1.2. Estandarización de inóculos en el laboratorio (en los casos en que no se dispone de

inóculos comerciales estandarizados).
DO
1.2.1. Preparación del inoculo de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC
6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella
typhimurium ATCC 14028, Kocuria rhizophila ATCC 9341, Staphylococcus epidermidis
ATCC12228.
 A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticaseína de 24 horas (h) a 35°C,
transferir una asada a 10 mL de caldo BHI, e incubar de 18h a 24h a 35°C, en
condiciones de aerobiosis.
 Tomar un mL del cultivo anterior y realizar diluciones decimales en 9 mL de solución
salina (0.85%) peptonada al 0.1% (de 10-1 a 10-10), hasta obtener una densidad
microbiana de no más de 100 UFC/mL.
 Sembrar por vaciado en placa, por duplicado en agar soya tripticaseína las diluciones
apropiadas para obtener el inóculo deseado, (un inoculo de no más de 100 UFC / mL

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cuando las cepas son empleadas para evidenciar la promoción de crecimiento en los
medios de cultivo, cuando sean usadas para evidenciar la inhibición de crecimiento en
los medios de cultivo deben ajustarse a más de 100 UFC/mL) De acuerdo a tablas 1 y
2.
 Colocar las placas invertidas e incubar en condiciones de aerobiosis a 35°C por 24
TA
horas.
UL
1.2.2. Preparación del inoculo de Clostridium sporogenes ATCC 11437 y ATCC 19404
NS
 A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticaseína de 24h a 35°C, en
condiciones de anaerobiosis. Transferir una asada a 10 mL de caldo BHI, e incubar de
CO
18h a 24h a 35°C.
DE
 Sembrar por vaciado en placa, por duplicado en agar soya tripticaseína las diluciones
O
apropiadas para obtener el inoculo deseado, (un inóculo de no más de 100 UFC/mL
NT
cuando las cepas son empleadas para evidenciar la promoción de crecimiento en los
medios de cultivo).
ME
 Colocar las placas invertidas e incubar en condiciones de anaerobiosis a 35°C por 24

horas.
CU
1.2.3. Preparación del inoculo de Candida albicans ATCC 10231

DO
 A partir de los cultivos desarrollados en Agar Dextrosa Sabouraud de 48 horas a 20-

25°C, transferir una asada a 10 mL de caldo BHI, e incubar 48 h a 20-25°C, en
condiciones de aerobiosis.
 Sembrar por vaciado en placa, por duplicado en Agar Dextrosa Sabouraud las
diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado, (un inóculo de no más de 100
UFC / mL cuando la cepa es empleada para evidenciar la promoción de crecimiento en
los medios de cultivo).
 Colocar las placas invertidas e incubar en condiciones de aerobiosis a 20-25°C por 48
horas.

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1.2.4. Preparación del inoculo de Aspergillus brasiliensis ATCC16404
 A partir de los cultivos desarrollados en Agar Dextrosa Sabouraud de 48 horas a 20-25°C,

recuperar las esporas con solución salina (0.85%) peptonada al 0.1% y adicionada con
polisorbato 80 al 0.05%
TA
 Tomar un mL de la suspensión anterior y realizar diluciones decimales en 9 mL de solución
salina (0.85%) peptonada al 0.1% (de 10-1 a 10-5), hasta obtener una densidad microbiana
UL
de no más de 100 UFC/mL.
 Sembrar por vaciado en placa, por duplicado, en Agar Dextrosa Sabouraud las diluciones
NS
apropiadas para obtener el inóculo deseado, (un inoculo de no más de 100 UFC / mL
cuando la cepa es empleada para evidenciar la promoción de crecimiento en los medios de
CO
cultivo).
 Colocar las placas invertidas e incubar en condiciones de aerobiosis a 20-25°C por 48
DE
horas.
2. Inoculación de los medios para la prueba de esterilidad

O
NT
2.1. Inocular muestras representativas de cada lote nuevo de medio de cultivo con 1mL de la
dilución que contenga no más de 100 UFC (o el volumen indicado por el fabricante) de cada
ME
uno de los microorganismos indicados en la Tabla 1. Paralelamente inocular de la misma

forma dos frascos de medio de cultivo del lote anterior aprobado y dos placas de un agar no
CU
selectivo, como AST, esto con la finalidad de verificar que realmente se inocularon menos de
100 UFC. Los medios que deben inocularse se indican a continuación:
DO
 Frascos de medio fluido de tioglicolato.

 Frascos de caldo soya tripticaseína.
 Frascos de fluido A.
2.2. Para cada uno de los microorganismos de prueba, usar porciones independientes del medio de
cultivo.
2.3. Incubar los frascos en las condiciones establecidas en la tabla 1 según corresponda a cada
microorganismo, considerando incluir un frasco sin inocular como control negativo el cual se
debe incubar por 14 días.
2.4. Revisar si los frascos inoculados presentan turbidez como evidencia del crecimiento
microbiano y registrar.

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2.5. Criterios de aceptación

 Se debe observar crecimiento microbiano claramente visible, en todos los medios
inoculados en no más de tres días en el caso de bacterias y no más de cinco días en
el caso de hongos a las temperaturas indicadas.
 El control en agar no selectivo debe tener menos de 100 UFC.
TA
 El nivel de turbidez del medio del lote nuevo y el lote previamente aprobado debe ser
equivalente al comparar visualmente.
UL
 El control negativo no presenta crecimiento.
NS
2.6. Si no se cumplen los criterios de aceptación anteriormente descritos, la prueba es
insatisfactoria y el lote de medio se desecha y no se emplea en la prueba de Esterilidad.
CO
Tabla 1 Microorganismos de prueba para promoción de crecimiento para los medios de la prueba de Esterilidad
DE
Tiempo
Medios Temperatura de
Microorganismos de prueba Condiciones máximo de
de cultivo Incubación
incubación
O
ATCC6538 CIP4.83
Tioglicolato (Medio “A”)
Staphylococcus aureus Aerobiosis 30°C – 35°C 3 días

NT
NCTC10788 NCTMB9518
Medio Liquido de
ATCC9027 CIP 82.118

ME
Pseudomonas aeruginosa * Aerobiosis 30°C – 35°C 3 días

NCIMB 8626
CU
ATCC 6633 ATCC11437

Clostridium sporogenes ** Anaerobiosis 30°C – 35°C 3 días
NCTC532 CIP793
DO
ATCC 6633
Caldo Soya-tripticaseina
Bacillus subtilis CIP52.62 Aerobios 30°C – 35°C 3 días

NCIMB 8054
(Medio “B”)
ATCC10231 5 días
Candida albicans Aerobios 30°C – 35°C
IP 48.72 NCPF3179
ATCC16404
5 días
Aspergillus brasiliensis IP1431.83 Aerobios 20°C – 25°
IMI149007
ATCC6538
Solución al 0.1 por
ciento de peptona
CIP4.83
(FLUIDO “A”)
Staphylococcus aureus Aerobiosis 30°C – 35°C 3 días

NCTC10788
NCTMB9518
ATCC9027
Pseudomonas aeruginosa* CIP 82.118 Aerobiosis 30°C – 35°C 3 días
NCIMB 8626

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Tiempo
Medios Temperatura de
Microorganismos de prueba Condiciones máximo de
de cultivo Incubación
incubación
ATCC 6633
Bacillus subtilis CIP52.62 Aerobios 30°C – 35°C 3 días
NCIMB 8054
TA
ATCC10231
5 días
Candida albicans IP 48.72 Aerobios 30°C – 35°C
NCPF3179
UL
ATCC 6633
ATCC11437
NS
Clostridium sporogenes ** Anaerobiosis 30°C – 35°C 3 días
NCTC532
CIP793
* Kocuria rhizophila ( Micrococcus luteus ) ATCC 9341 Microorganismo alternativo: de Pseudomonas aeruginosa
CO
**: Bacteróides vulgatus ATCC 8482 Microorganismo alternativo: de Clostridium sporogenes
ATCC American Type Culture Collection CIP Collection de l´Institut Pasteur IMI Commonwealth Mycological Institute
NCPF National Collection of Pathogenic Fungi NCIMB The National Collection of Industrial and Marine Bactéria Limited
DE
3. Inoculación de medios de cultivo para recuento microbiano de la prueba de límites

O
microbianos.
NT
3.1. A partir de un inóculo estandarizado que contenga menos de 100 UFC, probar cada lote de
medio preparado ya sea sólido o líquido forma independiente para cada microorganismo.
ME
3.2. Por cada microorganismo de prueba de acuerdo a lo indicado en la tabla 2 inocular dos placas
o tubos del lote nuevo a probar y de un lote previamente aprobado de AST (referencia), bajo
CU
las mismas condiciones ambientales y técnicas. Incluir un control negativo del lote nuevo para
dar validez a la prueba.
DO
3.3. Incubar a la temperatura indicada en la tabla 2 durante un periodo no mayor al tiempo mínimo
establecido en la prueba.
3.4. Criterios de aceptación
3.4.1. Medios sólidos.

 Debe haber crecimiento microbiano en el lote nuevo y el previamente aprobado.
 El recuento microbiano en cada placa no debe exceder las 100 UFC.
 El promedio de las cuentas del nuevo lote puede variar en un factor de 2 respecto del lote
previamente aprobado. Para conocer el factor de 2 (intervalo), dividir y multiplicar por 2 el
promedio calculado para un inóculo previamente estandarizado en un medio de cultivo
analizado y aprobado previamente (medio de referencia).

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FECHA: 2019-07-10
Ejemplo:
Cuenta promedio del medio a evaluar (lote nuevo): 47 UFC
Cuenta promedio (Lote previamente aprobado de referencia): 44 UFC
TA
Cálculo del factor 2: 44 UFC ÷2 = 22
44 UFC x 2 = 88
UL
El lote nuevo de preparación debe presentar una cuenta promedio entre 22 y 88 UFC, por lo que la
cuenta promedio del medio a evaluar (47 UFC) puede considerarse aceptable.
NS
El control negativo no presenta crecimiento.
3.4.2. Medios líquidos.

CO
 Se debe observar crecimiento microbiano claramente visible, en todos los medios inoculados en
no más de tres días en el caso de bacterias y no más de cinco días en el caso de hongos a las
DE
temperaturas indicadas.
 El control en agar no selectivo debe tener menos de 100 UFC.
O
 El nivel de turbidez del medio del lote nuevo y el lote previamente aprobado debe ser
NT
equivalente al comparar visualmente.

ME
4. Inoculación de medios de cultivo usados para determinación de microorganismos

CU
específicos de la prueba de límites microbianos.

DO
Inocular los medios sólidos o líquidos con el tipo de microrganismo apropiado según la prueba que
vaya a realizarse, de acuerdo a lo descrito en la tabla 3. Las pruebas que se realizan a estos
medios son las siguientes:
4.1. Promoción de crecimiento a medios sólidos o líquidos.

 Se inoculan con no más de 100 UFC del microorganismo de referencia. En el caso de
medios sólidos usar el método de extensión en superficies.
 Por cada microorganismo de prueba de acuerdo a lo indicado en la tabla 3 inocular dos
placas o tubos del lote nuevo a probar y de un lote previamente aprobado de AST
(referencia), bajo las mismas condiciones ambientales y técnicas. Incluir un control negativo
del lote nuevo para dar validez a la prueba.
 Incubar a la temperatura indicada en la prueba (ver tabla 3) durante un tiempo no mayor al
mínimo establecido también en la prueba.
 Revisar los medios inoculados en busca de crecimiento microbiano y registrar.

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Criterios de aceptación:
 Los mismos que los enlistados en el numeral 3.4 del presente anexo.
4.2. Determinación de las propiedades selectivas en medios sólidos o líquidos.
TA
 Se inoculan con mínimo 100 UFC. En el caso de medios sólidos usar el método de
extensión en superficies.
UL
 Se inoculan dos tubos o placas del lote nuevo a probar y paralelamente se inocula de la
misma forma dos placas un agar no selectivo, como AST, esto con la finalidad de verificar
NS
el tamaño del inoculo utilizado, ya que el medio podría inhibir el crecimiento de los
microrganismos que deberían crecer en él.
CO
 Incubar a la temperatura especificada en la tabla 3 durante un tiempo no menor al tiempo
máximo indicado en la prueba. Incluir un control negativo del lote nuevo a probar que debe
DE
ser tratado en las mismas condiciones de incubación.

 Revisar los medios inoculados en busca de inhibición del crecimiento microbiano en los
medios selectivos y registrar.
O
NT
Criterios de aceptación
 El crecimiento microbiano debe ser inhibido en el medio selectivo.
ME
 El recuento microbiano debe ser mayor a 100 UFC en el agar no selectivo de referencia.
CU
4.3. Determinación de las propiedades diferenciales en medios sólidos o líquidos.

 Se inoculan con no más de 100 UFC del microorganismo de referencia. En el caso de
DO
medios sólidos usar el método de extensión en superficies.

placas o tubos del lote nuevo a probar, un lote previamente aprobado del mismo medio
diferencial y un lote previamente aprobado de AST (referencia), todos bajo las mismas
condiciones ambientales y técnicas. Incluir un control negativo del lote nuevo para dar
validez a la prueba.
 Incubar a la temperatura especificada durante un periodo de tiempo que se encuentre en el
intervalo indicado en la prueba (ver tabla 3).
 Las colonias deber tener apariencia similar en el lote nuevo y en el lote previamente
aprobado, en el caso de que no se disponga de un lote previamente aprobado, se debe
tomar como referencia las características diferenciales típicas descritas en la tabla 3.
 Además se deberán cumplir los criterios enlistados en el numeral 3.4 del presente anexo.

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5. Inoculación de medios de cultivo usados para la valoración microbiológica de antibióticos.

 A partir de un inóculo estandarizado que contenga menos de 100 UFC, probar cada lote de
medio preparado de forma independiente para cada microorganismo.
placas del lote nuevo a probar y de un lote previamente aprobado de AST (referencia), bajo
TA
las mismas condiciones técnicas y ambientales.
 Incubar a la temperatura indicada en la tabla 4 incluyendo un control negativo del lote
UL
nuevo para dar validez a la prueba.
NS
 Debe haber crecimiento microbiano en el lote nuevo y el previamente aprobado.
CO
 El recuento microbiano en cada placa no debe exceder las 100 UFC.
 El promedio de las cuentas del nuevo lote puede variar en un factor de 2 respecto del lote
DE
previamente aprobado.
O
Tabla 2. Promoción de Crecimiento para los medios de recuento microbiano de Límites Microbianos
NT
Tamaño
Microorganismo de Condiciones
ME
Medio de Resultado esperado

prueba de incubación
inóculo
S. aureus ≤100 UFC
CU
30-35°C
P. aeruginosa ≤100 UFC Crecimiento de 50 a 200% del promedio
Agar Soya ≤ 3 días
B. subtillis ≤100 UFC de UFC obtenidas en el medio de
DO
Tripticaseina
C. albicans ≤100 UFC 20-25°C referencia.
A. brasiliensis ≤100 UFC ≤ 5 días
S. aureus ≤100 UFC
30-35°C
P. aeruginosa ≤100 UFC
Caldo Soya 24-48 h
B. subtillis ≤100 UFC Crecimiento visible (turbidez)
Tripticaseina
C. albicans ≤100 UFC 20-25°C
A. brasiliensis ≤100 UFC ≤ 5 días
20-25°C
C. albicans ≤100 UFC Crecimiento de 50 a 200% del promedio
Agar dextrosa ≤ 5 días
de UFC obtenidas en el medio de
Sabouraud 20-25°C,
A. brasiliensis ≤100 UFC referencia.
≤ 5 días

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Tabla 3. Evaluación de los medios para determinación de patógenos específicos de Límites Microbianos
Temperatura
Cepas de Tamaño de Propiedad a
Medio y tiempo de Resultado esperado
prueba Inoculo evaluar
incubación
Caldo Mossel de E. coli Promoción de
≤100 UFC Crecimiento visible (turbidez)
enriquecimiento P. aeruginosa crecimiento 30-35°C,
TA
para 24 - 48 horas
S aureus ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento
enterobacterias
UL
Crecimiento de 50 a 200% del promedio de UFC
Promoción de obtenidas en el medio de referencia.
Agar glucosa rojo E. coli 30-35°C,
≤100 UFC crecimiento + E. coli: colonias rojo-púrpura rodeadas de un halo
NS
violeta bilis P. aeruginosa 18 - 24 horas
diferencial de precipitación rojizo.
P. aeruginosa: colonias incoloras.
Promoción de
E. coli ≤100 UFC
CO
crecimiento 42 - 44°C, Crecimiento visible (turbiedad)
Caldo MacConkey
24 - 48 horas
S. aureus ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento
DE
Promoción de Crecimiento de 50 a 200% del promedio de UFC

30-35°C,
Agar MacConkey E. coli ≤100 UFC crecimiento + obtenidas en el medio de referencia.
18 - 72 horas
diferencial E. coli: colonias rosadas- rojizas.
O
Caldo Rappaport Salmonella Promoción de

≤100 UFC Crecimiento visible (turbidez)
Vassiliadis de typhimurium crecimiento
NT
30-35°C,
enriquecimiento
S. aureus ≥100 UFC Selectividad 18-24 horas Ausencia de crecimiento
para Salmonella
ME
Salmonella Promoción de Crecimiento de 50 a 200% del promedio de UFC

Typhimurium crecimiento obtenidas en el medio de referencia.
Agar Xilosa, lisina, ≤100 UFC 30-35°C, E. coli: colonias de amarillas a rojo amarillentas.
Propiedad
CU
desoxicolato E. coli 18-48 horas Salmonella Typhimurium: colonias rojas con

diferencial
centros de color negro.
S. aureus ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento
DO

P. aeruginosa ≤100 UFC 30-35°C,
Agar Cetrimida crecimiento obtenidas en el medio de referencia.
18 - 72 horas
E. coli ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento.
S. aureus ≤100 UFC crecimiento + 30-35°C, obtenidas en el medio de referencia.
Agar sal manitol
diferencial 18 - 72 horas Colonias amarillas de tamaño mediano.
E. coli ≥100 UFC Selectividad Ausencia de crecimiento
Medio de 30-35°C,
Promoción de
enriquecimiento C. sporogenes ≤100 UFC 48 horas. Crecimiento visible (turbiedad)
crecimiento
para clostridios Anaerobiosis.
30-35°C,
Agar Columbia C. sporogenes ≤100 UFC 48 - 72 horas
crecimiento obtenidas en el medio de referencia.
Anaerobiosis.
Caldo Dextrosa Promoción de 30 - 35°C,
C. albicans ≤100 UFC Crecimiento visible (turbiedad)
Sabouraud crecimiento 3 - 5 días
Agar Dextrosa Promoción de 30-35°C Crecimiento de 50 a 200% del promedio de UFC
C. albicans ≤100 UFC
Sabouraud crecimiento 24 - 48 horas obtenidas en el medio de referencia.

CLAVE:
CCAYAC-CT-003/2
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-CT-003/1
2021-06-30 2027-06-30
FECHA: 2019-07-10
Tabla 4. Promoción de crecimiento para los medios utilizados en la Valoración microbiológica de antibióticos.
Temp.
Tiempo
TA
Medio incubación Microrganismos de prueba
incubación
(°C)
UL
Agar para Kocuria rhizophila ATCC 9341
32-35 24 horas
NS
antibióticos #1 Staphylococcus aureus ATCC 6538
Agar para CO Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

32-35 24 horas
antibióticos #2 Staphylococcus aureus ATCC 6538
Agar para
32-35 5 días Bacillus subtilis ATCC 6633
DE
antibióticos #8
Agar para
32-35 24 horas Bordetella bronchiseptica ATCC 4617
antibióticos #10
O
Agar para Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

NT
32-35 24 horas
antibióticos #11 Kocuria rhizophila ATCC 9341
Agar para
ME
29-31 48 horas Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763

antibióticos #19
Agar para
32-35 5 días Bacillus subtilis ATCC 6633
CU
antibióticos #32
Agar para
36-37.5 48 horas Mycobacterium smegmatis ATCC 607
antibióticos #35
DO
Agar para
36-37.5 48 horas Mycobacterium smegmatis ATCC 607
antibióticos #36

CLAVE:
CCAYAC-CT-003/2
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-CT-003/1
2021-06-30 2027-06-30
FECHA: 2019-07-10
ANEXO 2. ELABORACIÓN DE FICHAS TÉCNICAS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO,

SOLUCIONES Y REACTIVOS.
A. La información de la composición de los medios de cultivo, soluciones y reactivos que se usan

para los métodos analíticos se encuentra descrita en las fichas técnicas de preparación.
TA
B. En cada ficha de preparación, se incluye el nombre medio de cultivo, solución y/o reactivo, al
cual se le asigna una clave de la siguiente forma: AG= Medios de cultivo agar, CL= Medios de
UL
cultivo caldo, Sol = Soluciones, REC= Reactivos, seguido de un numero consecutivo conforme
se vayan anexando medios de cultivo a la lista. Además se incluye la composición, preparación,
NS
apariencia del medio preparado y observaciones.
Ejemplo: CO
AG-1 Agar ASTEL
CL-1 Caldo Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa)
SOL-1 Solución Reguladora de Fosfatos 0.25 M
DE
REC-1 Reactivo de Kovacs

O
C. Para incluir, modificar o eliminar nueva ficha técnica de preparación en el listado del registro
NT
electrónico se debe enviar una solicitud por correo electrónico a la Coordinación de medios de
cultivo, con copia al encargado del Departamento de Análisis y Desarrollo de Pruebas
ME
Microbiológicas (DMB) preferentemente con la siguiente información:

 Nombre del medio, solución y/o reactivo
CU
 Composición, indicando ingredientes, cantidad y unidades.

 Preparación
DO
 Apariencia del medio preparado

 Observaciones, en caso de tenerlas.
D. Una vez que se recibe la solicitud, el Coordinador de Medios de cultivo elabora la ficha técnica
de preparación asignando la clave correspondiente según se trate como lo indica el numeral B
de este anexo, y la guarda en la carpeta compartida de fichas técnicas de preparación. En caso
de solicitar una eliminación se debe quitar el hipervínculo de la ficha, sin embargo no se debe
eliminar del registro electrónico, conservando así el número consecutivo de la lista.
E. Posterior se debe incluir en el listado indicando clave y nombre del medio, solución y/o reactivo
e incluir el hipervínculo del archivo.
F. Se debe realizar la actualización del Catálogo, como lo indica el Procedimiento para la creación
o actualización, difusión, emisión y control de documentos del Sistema de Gestión de la
Calidad.

CLAVE:
CCAYAC-CT-003/2
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-CT-003/1
2021-06-30 2027-06-30
FECHA: 2019-07-10
8. HISTÓRICO DE CONTROL DE CAMBIOS.
CCAYAC-CT-003
Persona que
Página del
Revisión y fecha del elabora los Cambios Relevantes de versión vigente con respecto a la
documento
documento anterior cambios en la anterior
TA
vigente
versión vigente
Todo el Se actualiza conforme a los lineamientos del CCAYAC-P-001
UL
documento y CCAYAC-IT-017 vigentes.
Se elimina la solicitud programada de medios de cultivo y el
NS
1
CCAYAC-F-490
5 Ahora dice Geobacillus stearothermophylus
CO
Se incluyen las actividades descritas en el CCAYAC-M-311
Método de prueba para la funcionalidad de los medios de
Eloy Torres Infante 12-17
Rev: 7 cultivo para uso en el análisis microbiológico de productos
Alicia Soto
DE
2015-12-11 farmacéuticos.
Reséndiz
Se eliminan de este catálogo los siguientes medios:
Caldo antígeno flagelar, Medio de esporulación Duncan-
O
Strong modificado para Clostridium perfringens, Medio de

Todo el
fermentación Spray para Clostridium perfringens, Agar
NT
documento
inducción de fase, Agar Lactobacilli AOAC, Caldo Lactobacilli
AOAC, Agar Lactobacilli MRS, MEDIO 24 LEB completo,
ME
agar Mac Clung Toabe y Medio MP.

Todo el
Se actualizó el logotipo institucional
documento
CU
Eloy Torres Infante Se adiciona la tabla de preparación del medio Caldo Lauril
94
Rev: 0 Alicia Soto Triptosa, de acuerdo al volumen de muestra a utilizar.
DO
2018-11-15 Reséndiz Se adiciona la formulación y preparación de los medios Agar

Urea base (de Christensen), Caldo MacConkey, Agar
177 - 183
Columbia, Agar Swarm, Agar BCYE, Agar BCYE modificado
y Agar GVPC.
Se incluye el término “Departamento” de Análisis y Pruebas
Microbiológicas conforme al Manual de Organización
especifico de la CCAYAC
Eloy Torres Infante Se re estructura el documento completo para indicar la
preparación de los medios de cultivo mediante las fichas
Todo el
Ana Karen técnicas de preparación las cuales se pueden consultar en el
Rev: 1 documento
listado de medios de cultivo, con ello se eliminan los anexos
2019-07-10 Alquicira Jiménez de preparación de medios contenidas en la versión anterior.
Se incluye la forma de solicitar los medios de cultivo y/o
reactivos, su preparación, control de calidad y la entrega a
los usuarios.
Se re estructuran las políticas generales precisando la
16-17
caducidad de medios y/o reactivos que no cuenten con una

CLAVE:
CCAYAC-CT-003/2
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-CT-003/1
2021-06-30 2027-06-30
FECHA: 2019-07-10
CCAYAC-CT-003
Persona que
Página del
Revisión y fecha del elabora los Cambios Relevantes de versión vigente con respecto a la
documento
documento anterior cambios en la anterior
vigente
versión vigente
fecha declarada por el fabricante
TA
Se modifica la bibliografía para actualizar las referencias de
18 la FEUM, y se incluyen las BPL de la OMS
UL
Se incluye el Anexo 1 con la información de la promoción de
NS
crecimiento de los medios de cultivo para análisis de
productos farmacéuticos donde se describe como realizar la
19-28 prueba en los medios utilizados en las metodologías de
CO
esterilidad, limites microbianos y potencia de antibióticos, así
también ésta sustituye a lo descrito en el CCAYAC-M-286, ya
que se trata de la misma información.
DE
Se incluye el Anexo 2 para indicar la forma en la que se

29 elaboran y/o modifican las fichas técnicas de preparación de
medios de cultivo, soluciones y reactivos.
O
NT
ME
CU
DO

Ccayac CT 03

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CLAVE:

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

posteriormente en otras pruebas o para conservarlos por periodos prolongados de tiempo.

 Medios Selectivos: Contienen ingredientes que inhiben el crecimiento de microorganismos

indeseables seleccionando de esta manera el o los microorganismos deseados.

microorganismos como resultado de reacciones bioquímicas que se llevan a cabo durante el

finalidad de aumentar la cantidad de ciertos microorganismos y al mismo tiempo suprimir el

Eloy Torres Infante Imelda Rocío Guzmán

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

A.1. El usuario elabora una solicitud de preparación de medios de cultivo en el CCAYAC-F-227

proceda, la cantidad en unidades de presentación (cajas Petri, tubos, frascos, matraces) y el

volumen de cada unidad de presentación.

consecutivo de solicitud de preparación medio.

A.3.1. Se debe llenar el formato CCAYAC-F-474 “preparación y evaluación del desempeño de

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

LISTADO DE FICHAS DE MEDIOS DE CULTIVO

AG-1 Agar ASTEL

AG-3 Agar Baird Parker

AG-4 Agar BCYE

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

AG-25 Agar para antibióticos #4

AG-27 Agar para antibióticos #8

AG-28 Agar para antibióticos #9

AG-29 Agar para antibióticos #10

AG-31 Agar para antibióticos #19

AG-33 Agar para antibióticos #35

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

AG-53 Agar GVPC

AG-55 Agar Extracto de Malta

AG-56 Agar Verde Brillante

AG-57 Agar Eosina Azul de Metileno (AEMB)

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

CL-20 Caldo MacConkey

CL-22 Caldo Lauril Triptosa

CL-24 Caldo Triptona 1%

CL-26 Caldo Citrato de Koser

CL-28 Caldo Lauril Triptosa con MUG

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

SOL-5 Solución Peptonada al 0.1%

SOL-7 Solución de peptona y extracto de carne con polisorbato 80

SOL-8 Solución amortiguadora al 1% pH 6.0±0.05

SOL-10 Solución amortiguadora 0.1M pH 4.5±0.05

SOL-11 Solución amortiguadora 10% pH 6.0±0.05

SOL-13 Solución amortiguadora 0.1 M pH 7.0±0.2

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

desechables de vinilo cuando así se indique en la etiqueta.

Adicionar el polvo y mezclar. Dejar reposar de 10 a 15 minutos para su completa humectación. Se

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

crítico, considerar la cantidad perdida de volumen durante la esterilización.

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

B.8. CONSERVACIÓN Y USO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS

muestras o cualquier posible fuente de contaminación cruzada, en lugares limpios, secos,

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

C) CONTROL DE MEDIOS DE CULTIVO

tener una consistencia firme y de color característico.

CCAYAC-B-536 “REGISTRO DE VOLUMEN FINAL DE MEDIOS DE CULTIVO”

C.2. PRUEBA DE ESTERILIDAD

D) EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

Para el resto de los medios de cultivo proceder como se indica a continuación:

dilución se encuentra el inóculo deseado.

NOTA 1: Alternativamente se pueden usar métodos nefelométricos o espectrofotométricos

D.2. MÉTODO PARA EVALUAR EL DESEMPEÑO DE MEDIOS SÓLIDOS PARA PRUEBAS