XXIV Jornada de Formación

Interhospitalaria del Laboratorio Clínico

ADN mitocondrial

Lucía Frechilla Flórez

QIR 4º
27 de Febrero 2013
Índice
 Mitocondria
 Características Generales ADNmt
 Diferencias entre ADNmt y ADN nuclear
 Estructura y Organización del ADNmt
 Replicación, Transcripción y Traducción
 Peculiaridades del ADNmt
 Poliplasmia
 Heteroplastia
 Efecto Umbral
 Segregación Mitótica
 Herencia del ADNmt humano
 Tasa de Mutación ADNmt
 Polimorfismos del ADNmt
 Haplotipos Mitocondriales
 Haplotipaje del ADNmt humano por Enzimas de Restricción
 Mitocondria
Membrana externa
Membrana interna:
Replegada en crestas
Proteínas que participan en
la oxidación de la cadena
respiratoria, síntesis de ATP

Matriz mitocondrial: proteínas

para la replicación y transcripción
Espacio intermembrana:
del ADNmt, ribosomas y enzimas
contiene enzimas que utilizan el
que participan en procesos
ATP procedente de la matriz para
metabólicos como el ciclo de
fosforilar otros nucleótidos
Krebs y ß-Oxidación.
Características Generales ADNmt

Sistema genético propio

Maquinaria: Síntesis ADN, ARN y las proteínas que codifica
Cada mitocondria contiene 2-10 copias de ADN, y a su vez cada célula puede
contener cientos de mitocondrias: el nº de copias de este genoma en una
célula oscilará entre 1000-10000 dependiendo de cada órgano y tejido
Diferencias ADNmt vs. ADN nuclear
Genoma nuclear Genoma mitocondrial

Tamaño aprox. 3000MB 16.6KB

Nº moléculas distintas 23 en mujeres 1
24 en hombres
Nº copias por célula 2 >1000
diploide
Tipo de molécula Lineal Circular
Proteínas Asociadas Histonas y proteínas no Libre de proteínas
histonas
Nº genes 22000 37
Densidad genética -4/40kb 1/0.45kb (alta)
ADN repetitivo -20% Casi no existe
ADN codificante -2% 90%
Recombinación >1 por cromosoma y meiosis No
Tasa de mutación Baja Alta
Herencia Mendeliana, excepto Monoparental materna
cromosoma Y
Estructura y Organización del ADNmt
 Molécula
 Circular
 Cerrada
 Doble cadena
 Humanos: tamaño 16569 pb
 Levaduras: 80000 pb
 Plantas: 100-2000 kb

 2 cadenas complementarias: %C ≠ %G → ≠ PM
 H: rica en purinas
 L: rica en pirimidinas

rCRS: Numeración Genoma Mitocondrial (1-16569)

Nature Genetics, Andrews el al. 1999
Estructura y Organización del ADNmt
 Genes ADNmt sin intrones: Información
compactada
 ATPasa 6 y ATPasa 8 solapados
 37 Genes
 22 codifican para ARNt
 2 para ARNr (12S y 16S)
 13 para ARNm: 13 polipéptidos implicados en la cadena
de fosforilación oxidativa (OXPHOS)
 7de las 41 sub. de NADH deshidrogenasa para el complejo
I
 Citocromo b del Complejo III
 3 de las 13 sub. de citocromo c oxidasa (COX) del complejo
IV
 2 ATPasas (ATPasa 6 y ATPasa 8 ) del complejo V
Estructura y Organización del ADNmt
 10% restante de la molécula de ADN no
codificante: 1.2 kb → Región Control
 Promotores de Transcripción (H y L)
 Origen de Replicación (H)
 Secuencias de Regulación
 Lugares de Unión de factores de transcripción, secuencias
conservadas con el inicio de replicación de cadena H y secuencias
asociadas a la finalización del bucle de desplazamiento o D-loop

 Región Control muy hipervariable (posición

16024-16569 y 1-576)
 Región Hipervariable I (HVI)
 Región Hipervariable II (HVII)
Estructura y Organización del ADNmt
El código genético está alterado respecto al universal,
ya que 4 de los 64 codones presentan un significado
diferente al que poseen para la síntesis citoplasmática

Codón Código Código

Universal Mitocondrial

UGA STOP Trp

AUA Ile Met

AGA Arg STOP

AGG
Replicación 2000 Holt
~genoma nuclear

1982 Clayton: ADNmt se replica de

forma asimétrica para generar
copias idénticas de si mismo.

Modelo Clásico Modelo Holt

 Unidireccional y  Bidireccional y asimétrica

asimétrica
 Asincrónico
 Modelo Clásico
Replicación
Comienzo
Replicación
2 orígenes
en OH
replicación
Modelo Clásico
Replicación

2 orígenes de replicación
Horquilla de Replicación
ARN cebador sintetizado
por la ADNpolimerasa γ
(actividad transcriptasa
reversa)
Topoisomerasa
 ADN polimerasa γ

•Enzima multifuncional
•Síntesis ADN
•Reparación ADN escisión de •Unidad accesoria
bases 3’ → 5’ • No actividad
enzimática conocida
•Síntesis ARN (ADN molde)
• Reconocimiento del
cebador

•Subunidad catalítica
• Sintetiza ADN
Modelo Unidireccional y simétrico: Holt

Geles bidimensionales de agarosa: intermediarios de replicación

Contradice el modelo clásico de replicación

Replicación similar al la del genoma nuclear:

unidireccional
cadena de replicacion rápida y otra lenta

Ambos modelos de replicación coexisten

Clásico en células en cultivo en condiciones basales
Holt en células en cultivo que se están recuperando
de una depleción o de otro tipo de estrés
Transcripción del ADNmt
 37 genes codificados de ADNmt
 Cadena H: 2 ARNr, 14 ARNt, 12 genes codificantes de polipéptidos
 Cadena L: 8 ARNt, ARNm
 Promotores
 H1(gen Phe) y H2 (antes del gen 12s rRNA)
 L (región control, posición 407)
 mtTFA se une a secuencias específicas alrededor de los lugares de inicio
de transcripción

 Policistrónica: se produce la misma cantidad de ARN de todos los genes

codificados
 Problema: mTERF facilita la síntesis de un transcrito policistrónico de
16kb y otro de 3kb
 Bloquea el avance de RNApolimerasa y el transcrito 3Kb
 ARNt genera señales específicas que son reconocidas por endonucleasas
que cortarán en los extremos 5’ y 3’ del ARNt
Traducción ADNmt
 Matriz mitocondrial
 Ribosomas mitocondriales
 Coeficiente de sedimentación 55S
 Dos subunidades: 28S y 39S

 ARNr: 5S, 12S, 16S

Diferencias entre traducción de proteínas citoplasmáticas y

mitocondriales.
 ARNm mt no estructura CAP en 5’ y casi no secuencia
5’UTR
 Sistema de reconocimiento de codones inusual: lectura
del código genético con 22 tRNAs (32 balanceo de Crick).
Basado en reconocimiento de las 2 primeras bases del
codón
Peculiaridades del ADNmt
Poliplasmia
Célula
Núcleo 5-10 copias
ADNmt

ADN
nuclear

Mitocondria

Cada célula contiene 1000-10000

moléculas de ADNmt
Heteroplasmia
Célula Mitocondria con ADN mutado

Mitocondria con ADN normal

Distintos grados de heteroplasmia

 En tejidos sanos, todas las copias de
ADNmt son idénticas: HOMOPLASMIA
Sin
heteroplasmia
Célula progenitora con
HETEROPLASMIA

40%
heteroplasmia

Mutaciones patogénicas del ADNmt

afectan a alguna pero no a todas
60%
las
copias del ADNmt de una célula, tejido,
heteroplasmia
o individuo, resultando una mezcla de
Mitocondria con ADNmt mutado
genomas mitocondriales mutados y no
Mitocondria con ADNmt normal
mutados: HETEROPLASMIA
80%
heteroplasmia
Efecto Umbral
 La expresión fenotípica de una mutación patogénica del
ADNmt no sigue las reglas de herencia mendeliana,
dependiendo en gran medida, de las proporciones de
ADNmt normal y mutado que existen en un tejido en
particular

 Efecto umbral representa la proporción mínima de ADNmt

mutado necesaria para que se produzca la disfunción de un
órgano o tejido.
 Varía de unos tejidos a otros.
 Depende del requerimiento energético del tejido, en un
momento dado y en una situación de estrés.
Segregación Mitótica

NO EXPRESIÓN
FENOTÍPICA

Segregación mitótica

EXPRESIÓN
FENOTÍPICA
Herencia del ADNmt humano
El ADNmt se hereda como un patrón no mendeliano.

Fertilización: ADNmt que contiene el zigoto es aportado por el

óvulo

Cantidad de ADNmt mutado puede variar ampliamente debido a

un proceso de restricción y amplificación: CUELLO DE BOTELLA
MITOCONDRIAL

Giles el al. en 1980 analizando polimorfismos de secuencia

mediante RFLPs, observaron que la progenie presentaba siempre
la variante materna.

Estudios posteriores confirmaron que las mitocondrias del

esperma son selectivamente destruidas en el oocito y que el
ADNmt paterno es marcado mediante ubiquitinación durante la
espermatogénesis para su destrucción posterior en el oocito.
Tasa de Mutación ADNmt
Depende de la velocidad a la que surgen y se fijan las
mutaciones en los linajes.

Escala temporal en la evolución molecular

Velocidad de sustitución nucleotídica: 5-10 veces mayor en

genes mitocondriales que nucleares: reducida fidelidad de los
sistemas de replicación en el ADNmt.
Tasa de Mutación ADNmt

90% 02
ENERGIA

Daño oxidativo Gran cantidad de

ADNmt: ROS con efecto
no histonas mutagénico
protectoras
ADN polimerasa mt
escasa actividad
correctora
Tasa de Mutación ADNmt
Tasa de evolución
Frecuencia aparición de nuevas mutaciones
Tasa de fijación: probabilidad de que las
mutaciones se fijen a la población

Estimación:
Estudio de Pedigríes
Estudio de Filogenia

Nivel de estabilidad de la molécula de ADNmt

Regiones control “hot spots” cuya tasa de mutación
es 4 ó 5 veces mayor que la media

Sobreestimación

Valores
promedio
Polimorfismos de ADN mitocondrial

 Existencia en una población de múltiples

alelos de un gen, es decir, una variación
en la secuencia de un lugar determinado
del ADN entre los individuos de una
población.
 Un locus es polimórfico cuando el alelo
más común para este locus tiene una
frecuencia inferior al 99%
Polimorfismos de ADN mitocondrial
 Polimorfismos de longitud: inserciones
o deleciones de uno o más nucleótidos
 Polimorfismo de secuencia: cambio de
uno o más nucleótidos en una secuencia
de ADN
 Cambio de un solo nucleótido, dos bases
alternativas y cada una de ellas aparece en la
población en una frecuencia superior al 1%:
SNP Single Nucleotide Polymorphism
Haplotipos mitocondriales
ADNmt altamente Elevada tasa de
polimórfico mutación

Estudio y clasificación Haplogrupos mitocondriales

Origen
Dispersión
Evolución
Haplotipos mitocondriales
Haplogrupo es un conjunto de haplotipos,
polimorfismos genéticos, con los que es posible
identificar una población determinada.
Se identifican mediante la presencia de SNPs,
sustituciones en una sola posición del genoma, que
ocurren en un momento determinado y se han llegado a
fijar para todo un grupo.

Haplogrupos Frecuencia Haplogrupos Frecuencia

H 50 U4 1

I 2 U5 7

J 11 U6 1
Frecuencia de población caucásica
K 7 V 4

T 8 W 1

U3 1 X 2
Haplotipaje ADNmt por Enzimas de
Restricción
4 Polimorfismos
Haplotipaje: Amplificación de
T4216C fragmento de ADNmt mediante PCR y
posteriormente una digestión con la
C7028T
enzima de restricción adecuada
G12308A
G13708A
Haplotipaje ADNmt por Enzimas
de Restricción
Cebador Secuencia 5 →3 Tamaño Tª Hibridación Enzima

L4216 CTACTTCTAACCT 313bp 58 NlaIII

CCCTGTT

H4216 CTTACTTTAGGAT
GGGGTGT

L7028 TCGCCACACTCCA 261bp 60 AluI

CGGAAG

H7028 TGGCGTAGGTTTG
GTCTAGG

L12308 CTCAACCCCGACA 235bp 60 HinfI

TCATTACC

H12308 ATTACTTTTATTTG
GAGTTGCACCAAG
ATT

L13708 TCTTCTCACCCTA 248bp 63 MvaI

ACAGGTC

H13708 GTTGGTTAGGTAG
TTGAGGT

Cebadores de amplificación y enzimas de restricción

Haplotipaje ADNmt por Enzimas de
Restricción
Fragmentos se analizan por Electroforesis en
gel de poliacrilamida en solución con TBE

POLIMORFISMO
HAPLOTIPO

C7028 T4216C A12308G G13708A

H - - - +
T + + - +
J + + - -
UK + - + +
Y + - - +

+: Diana de restricción presente

-: Diana de restricción ausente
Haplotipaje ADNmt por Enzimas de
Restricción
Haplotipaje ADNmt por Enzimas de
Restricción
Estudio de
migraciones humanas
Establecer la probable
ruta de población de las
distintas regiones del
planeta