EXTRACCION-Y-PURIFICACION-DE-ACI...

Elipez

Biología molecular y citogenética

1º Laboratorio Clínico y Biomédico

Santa Maria dels Apòstols

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 MP03 BIOLOGÍA MOLECULAR
UD3 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
1. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN: LA 1ª ETAPA
Los AANN están confinados en el interior de la célula. Aislados del exterior mediante membranas y paredes celulares.

Las membranas limitan la célula y permiten la relación con el medio exterior. Están constituidas por una bicapa lipídica y en el
interior hay variedad de proteínas.

La pared celular proporciona rigidez y protección.

Membranas y paredes son una barrera que hay que vencer para acceder a los AANN, su análisis y manipulación mediante
técnicas de biología molecular que comporta una primera etapa de extracción y purificación.

Con la extracción se hacen accesibles los AANN a los reactivos y enzimas que se usan. Con la purificación se eliminan que
interfieren.

La obtención de AANN purificación se realiza en 3 fases:

Reservados todos los derechos.

• Pretratamiento de la muestra.
• Extracción de AANN.
• Purificación de AANN.

2. PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS

Los AANN se pueden obtener casi de cualquier muestra biológica. Se requiere un pretratamiento especifico que
permita obtener las suspensiones celulares sobre las que se harán la extracción y purificación.

Las suspensiones celulares à están formadas por células libres y agregados celulares que flotan en el seno de un
medio líquido.

1. PRETRATAMIENTO DE LA SANGRE
Es la muestra mas habitual. Se realiza la purificación de AANN a partir de los leucocitos. El grupo hemo de la hemoglobina es un
potente inhibidor de la PCR por lo que un objetivo común en los pretratamientos es la eliminación de la hemoglobina mediante
la lisis de los hematíes.

• OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA

Se parte de sangre total anticoagulada con EDTA (también se puede usar heparina y citrato sódico).

Es conveniente realizar la extracción en las 24h siguientes a la obtención de la muestra. Se puede refrigerar a 4ºC durante 5 días.
No se debe refrigerar mas de 3 días si se requieren moléculas intactas sin degradación ni fragmentación para aplicar técnicas
somo el Southern blot (técnica de hibridación en soporte solido).

• LISIS DE HEMATÍES (también válido para muestras de medula ósea)

1. Lisis de los hematíes à Consiste en romper los hematíes con una solución o tampón de lisis (basadas en fenómenos
osmóticos y detergentes suaves) en proporción 1:3 (1 de sangre por 3 de lisis).

2. Centrifugado de la muestra à se centrifuga y se obtiene un sedimento o pellet sobrenadante.

3. Eliminación del sobrenadante à con una pipeta Pasteur. Se elimina plasma sanguíneo y hemoglobina.

4. Conservación del sedimento à Donde quedan los leucocitos.

• OBTENCIÓN DE CELULAS MONONUCLEADAS DE SANGRE PERIFÉRICA

La sangre también se puede usar para detectar, aislar y estudiar AANN de retrovirus que infectan linfocitos: VIH y HTLV
(linfotrópicos humanos de células T). Se aíslan PBMC (células mononucleadas de sangre periférica): linfocitos y monocitos antes
de extraer los AANN mediante una centrifugación den gradiente de densidad y requiere de un medio de separación.

1. Se coloca en un tubo el medio de separación y encima la sangre.

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 2. Se centrifuga 20-30 min a 400-800xg:

a) La polisucrosa causa agregación de los hematíes à sedimentan.

b) Los granulocitos que tienen mayor densidad que el medio à sedimentan.
c) Las células mononucleadas tienen una densidad menor à permanecen en la interfase entre el medio y el plasma.

3. Se elimina el sobrenadante. Se aspira la capa de células mononucleadas con una pipeta Pasteur, se transfiere a un tubo limpio
y se lava con tampón o solución salina para eliminar restos de plasma y plaquetas.

4. Con las células lavadas se puede continuar con el proceso de extracción.

La sangre es un tejido formado por: Reactivos comerciales para la lisis de

hematíes:
• Un componente celular:

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Solución de lisis de eritrocitos estándar
Hematíes à sin núcleo ni mitocondrias, con (osmosis):
hemoglobina en su interior (contiene Fe) y su
función es el transporte de gases respiratorios. • Cloruro de amonio (NH4Cl): 150mM
• Bicarbonato potásico (KHCO3): 10mM
Leucocitos à De mayor tamaño que los
• EDTA: 1mM
hematíes. Intervienen en el proceso de defensa
del cuerpo. Hay tipos: neutrófilos, eosinófilos, Solución de lisis de eritrocitos con detergente:
basófilos, linfocitos y monocitos.
• Tris-HCl: 10mM, pH8
Plaquetas à Fragmentos celulares sin núcleo. • Triton X-100: 1%
• Sacarosa: 11%
• Un componente liquido à el plasma.

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Medio de separación para la extracción de PBMC à mezcla de 2 componentes:

• Ficoll à polisacárido sintético hidrofílico producido por la copolimerización de sucrosa y epiclorhidrina.

• Diatrizoato sódico.

Tiene una viscosidad baja, densidad = 1.077g/ml, osmolaridad adecuada para mantener la viabilidad celular. Marcas
comerciales: Ficoll-paque, Histopaque, Lymphoprep.

2. PRETRATAMIENTO DE CULTIVOS CELULARES

Son métodos de obtención de células mediante siembras controladas en medios adecuados. Se usan para estudios genómicos y
de expresión génica.

El pretratamiento consiste en una recolección de células antes de seguir con la extracción de los AANN.

Se dan 2 situaciones:

• Cultivos en suspensión à si las células crecen en suspensión en el medio.

a) Recolectar en un tubo
b) Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación.
c) Lavar las células con tampón o suero antes de la extracción y purificación de AANN.

• Cultivos en monocapa à si crecen en monocapa adheridas a la pared del frasco y hay 2 posibilidades:

1. Usar el propio frasco:

a) Retirar del frasco el medio de cultivo
b) Lavar la monocapa con tampón o solución salina.
c) Iniciar en el propio frasco el proceso de extracción.

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 2. Pasar la monocapa a un tubo:
a) Despegar las células de la pared del frasco: con raspado o medios enzimáticos (se incuban las células con
solución de tripsina al 0.05-0.25%).
b) Recolectar las células en un tubo.
c) Lavar las células antes de seguir con la extracción.

3. PRETRATAMIENTO DE TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS

Requiere un pretratamiento previo de homogeneización à Tratamiento mecánico o químico al que se somete un tejido para
liberar las células que lo integran.

La cantidad de tejido a procesar depende del tipo de tejido, del método de homogeneización y del procedimiento de extracción
y purificación.

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Para tejidos animales basta con 10-25mg (10-40microg ADN).

Para tejidos vegetales basta con 100mg-1g (10-40microg ADN).

Homogeneización mecánica à someter al tejido a una trituradora o abrasiva para desmenuzarlo. Puede ser automático o
manual.

• Homogeneización mecánica automatizada à con máquinas o elementos mecánicos.

1. Se corta en pequeños fragmentos y se homogeneiza con instrumentos mecánicos: trituradores, agentes abrasivos y
agitación, esferas de vidrio o cerámica.
2. Cuando ya está homogeneizado se pasa a un tubo limpio para comenzar la extracción.

El proceso de rotura mecánica del tejido puede liberar proteasas y enzimas responsables de la degradación de los
componentes celulares. à conviene realizar estos procesos en frio y de forma rápida o añadir inhibidores enzimáticos.

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• Homogeneización mecánica manual con mortero à minimiza el problema de la degradación.
1. Se colocan fragmentos de tejido en un mortero y se cubren con nitrógeno liquido que permite la congelación
rápida del tejido y evita la formación de cristales en el interior de las células. Con otros sistemas de congelación, los
cristales provocan la lisis celular y por tanto la liberación de enzimas y su degradación).
2. Se pulverizan los fragmentos congelados à se consigue polvo fino y se deja evaporar el nitrógeno líquido.
3. El polvo obtenido se transfiere a un tubo para seguir con el proceso de extracción.

• Homogeneización química à someter el tejido a la acción de proteasas y detergentes que degradan los componentes
tisulares, disgregando las células. Para muestras pequeñas y cortes de tejido en congelación obtenidos con un criostato.
1. Se añade a la muestra la mezcla de incubación con proteasas y detergentes para la digestión del tejido.
2. Incubadora 37-56ºC – 12-24h.
3. Se sigue con el proceso de extracción. Si en la mezcla de incubación se añaden enzimas y detergentes que
desestabilizan y rompen membranas celulares, se puede simultanear la homogeneización del tejido con el primer
paso del proceso de extracción.

4. PRETRATAMIENTO DE TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL E INCLUIDOS EN PARAFINA (FFPE)

Muy útil para estudios retrospectivos à la calidad de los AANN suele ser peor porque durante el proceso de fijación el ADN se
fragmenta y el ARN puede ser parcialmente degradado según el tiempo que pasa entre la obtención y la fijación de la muestra.

• DESPARAFINIZACION à tratamiento requerido para la extracción de AANN de muestras FFPE. Eliminación de la

parafina de los tejidos.
1. cortes finos (5-10micrometros) con microtomo del tejido.
2. 5-10mg a un tubo eppendorf.
3. Incubar con xilol u otro agente deparafinante, etanoles de concentración decreciente y agua destilada.
4. El tejido desparafinado y rehidratado se somete a homogeneización química como la de los tejidos frescos
simultaneándola con el primer paso de la extracción de AANN.

5. PRETRATAMIENTO DE OTRAS MUESTRAS

• CULTIVOS DE BACTERIAS Y LEVADURAS

Respuesta Coca-Cola Zero Azúcar. Demasiado bueno para explicarlo con palabras
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 Poner las bacterias y levaduras en un tampón de suspensión. Según el medio en el que se encuentre el material de partida hay 2
situaciones:
Solución tampón de
• Medio líquido:
suspensión para bacterias y
1. Se centrifuga el tubo para eliminar el medio de cultivo sobrenadante.
levaduras (solución GTE)
2. El sedimento se resuspende en el tampón de suspensión.
TRIS: 25mM, pH8
• Colonias aisladas sobre un medio solido:
1. Se recoge la colonia de la superficie de la placa con un asa de siembra estéril. EDTA: 10mM
2. Se resuspende la colonia en el tampón de suspensión. Glucosa: 50mM

• CÉLULAS DE LA MUCOSA ORAL

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Sistemas de obtención:

• Raspado con torunda o cepillo à se sumerge en una solución conservante para que las células se desprendan.
• Enjuague con una solución conservante.
• Recolección de saliva.

Se centrifuga la suspensión celular y se elimina el sobrenadante.

• ESPUTO
Solución mucolítica y
Puede usarse como material de partida para detectar o confirmarla presencia de descontaminante para esputos:
microorganismos patógenos causantes de infecciones respiratorias.
NALC: 0.375g
El pretratamiento consiste en la fluidificación con N-acetilcisteína (NALC) en una disolución

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de citrato sódico. Si el microorganismo que se quiere detectar es una micobacteria se puede Citrato trisódico H20: 14.5g
añadir también hidróxido sódico para descontaminar la muestra.
Hidróxido sódico (NaOH): 20g

Agua destilada hasta 1L.

3. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
El proceso implica 2 procesos:

• Lisis celular para liberar los AANN.

• Inactivación de nucleasas celulares (ADNasas y ARNasas) para evitar la degradación de AANN.

Ambos procesos se consiguen mediante la incubación de la suspensión celular con una solución de lisis.

En células con pared celular es necesario aplicar algunas variaciones al tratamiento para vencer la dificultad de lisis que
presentan.

El proceso de extracción à consiste en la obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en el que los AANN se
encuentran libres de las estructuras celulares en las que se mantenían aisladas.

1. LA SOLUCIÓN DE LISIS
Depende del tipo de célula que se va a lisar y puede incluir: detergentes, EDTA, proteasas y agentes caotrópicos.

• DETERGENTES à Componentes principales de la solución de lisis. SDS à el detergente + utilizado en muestras

humanas y de animales en combinación con EDTA.

Su función es desestructurar la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizar las proteínas que se insertan en ellas. à se
produce la lisis celular y liberación del contenido citoplasmático y nuclear al medio de reacción.

• EDTA à es un quelante de cationes divalente como el Ca y el Mg. El EDTA inhibe la actividad de las ADNasas al atrapar
los cationes de Mg que hay en el medio.

• PROTEASAS à se puede añadir a la solución de lisis (proteinasa K). Digieren las proteínas citoplasmáticas y de la
membrana facilitando la rotura y disolución de las membranas eliminando las nucleasas.

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 Es útil para tejidos frescos y FFPE para simultanear la digestión del tejido
La inactivación de nucleasas es muy
con la extracción de los AANN.
importante para obtener una buena cantidad
de AANN no fragmentados.
• AGENTES CAOTRÓPICOS à Solución eficaz para inactivar nucleasas.

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Desnaturalizan las macromoléculas impidiendo que realicen su actividad El ARN es rápidamente degradado por las
(Isotiocianato de guanidino). Se recomienda su uso para purificar ARN. ARNasas.

Con la lisis celular, la liberación del ADN de

2. TRATAMIENTO EN CELULAS CON PARED CELULAR estructuras que lo contienen lo pone en
contacto con ADN asas citoplasmáticas.
La pared celular dificulta la lisis celular. Para degradar la pared se usan otros
tratamientos como: tratamientos enzimáticos, tratamientos mecánicos o el CTAB
(bromuro de cetil-trimetil-amonio). Solución de lisis para células vegetales:
• TRATAMIENTO ENZIMÁTICO à Digieren los componentes de la pared. Se Bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB)
puede poner en practica antes de usar la solución de lisis con detergente o 2% (p/v).
simultáneamente incorporando la enzima a la solución de lisis.
Cloruro sodico (NaCl): 1.4M
1. Lisozima o lisostafin à bacterias Gram positivas.
EDTA: 20mM

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2. Liticasa o zimolasa à para células vegetales, levaduras y hongos.
Tris-HCl: 01.M, pH8
• TRATAMIENTO MECÁNICO à Ebullición de agua destilada o tampón, ciclos
de congelación-descongelación, sonicación...
• TRATAMIENTO CON CTAB à Es un detergente iónico que se sustituye
Las sales caotrópicas influyen en la
por el SDS para facilitar la eliminación de las paredes celulares por el alto
organización de moléculas de H20 y en su
contenido en polisacáridos y polifenólicos que contienen las paredes.
interacción con macromoléculas como
proteínas y AANN. Consiguen aumentar la
3. VERIFICACIÓN DEL RESULTADO DE LA LISIS solubilidad de sustancias apolares y
modificar las interacciones intramoleculares
Se ha de comprobar que el proceso de lisis ha sido eficiente. Si no se ha no covalentes que mantienen la estructura
conseguido hay que prolongar el protocolo hasta conseguir una muestra secundaria y terciaria de las proteínas
homogeneizada. Si se observan grumos, hay que añadir más solución de lisis y desestabilizandolas.
reincubar la muestra a 37-65ºC. La obtención de una solución homogénea es
indicadora de un buen resultado de la lisis. La serie de Hofmeister da una idea de la
intensidad del efecto caotrópico causado por
las sales.

4. CONSIDERACIONES EN LA EXTRACCIÓN DEL ADN

Para purificar ADN hay que eliminar el ARN del lisado. No suele ser necesario en muestras de sangre periféricas y medula ósea
porque la contaminación de ARN es mínima y es aconsejable en muestras como la saliva, tejidos y raspados celulares.

• Se añade al medio de reacción ARNasa A.

• Se incuba a 37ºC 15-45min.

La obtención de una solución homogénea es indicativa de un buen resultado de la lisis.

4. PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

El proceso de purificación à cosiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes del lisado. Hay diferentes
técnicas de purificación.

• Purificación con solventes orgánicos.

• Precipitación son sales (salting-out).
• Cromatografía de intercambio iónico.
• Cromatografía de adsorción.
• Purificación mediante esferas magnéticas.
• Ultrafiltración.

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 1. PURIFICACIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS
La purificación son solventes orgánicos à se basa en la distinta solubilidad de los compuestos que integran el lisado celular en
solventes orgánicos. Fases del procedimiento:
• Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos.
• Precipitación del ADN.
• Lavado del ADN.
• Resuspensión del ADN.

1. ELIMINACIÓN DE COMPUESTOS SOLUBLES EN SOLVENTES ORGÁNICOS.

Más habitual à Fenol, cloroformo y alcohol isoamílico 25:24:1

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Se mezclan los volúmenes iguales de reactivo y lisado (1 y 2) y se agita con un vórtex (3). Se centrifuga (4). Se forma la fase
orgánica: el fenol desnaturaliza y disuelve las proteínas que hay en el lisado y el cloroformo disuelve los lípidos. Se forma la fase
acuosa: el lisado. Sin proteínas ni lípidos (5).

2. PRECIPITACIÓN DEL ADN El ADN es una molécula polianiónica, tiene fuerte

carga negativa por los grupos fosfato. En un
La fase acuosa se transfiere a un tubo limpio (6) y el ADN se precipita añadiendo medio acuoso hace que las moléculas de ADN se
acetato sódico (7) e isopropanol o etanol al 100% frio (8). Centrifugación (9), el repelan entre sí y se rodeen de una capa
ADN precipita en el fondo (10) y en el sobrenadante quedan el resto de los hidratante de moléculas de agua que la
contaminantes hidrosolubles del lisado. estabilizan à es soluble en H20. Cuando se añade
alcohol al medio acuoso, se elimina la capa
3. LAVADO DEL ADN hidratante que las rodea. Los cationes de sodio
neutralizan la carga negativa de los grupos fosfato
Se elimina el sobrenadante y el pellet de ADN se lava con etanol 70-95% (11) y se del ADN à así las moléculas de ADN ya no se

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vuelve a centrifugar (12). El ADN es insoluble en etanol por lo que se queda en el repelen entre sí y se unen otras formando una
sedimento, pero el resto de sales y contaminantes si lo son, por lo que se maraña visible de hebras blanquecinas.
eliminan con el sobrenadante.

4. RESUSPENSIÓN DEL ADN Tampon TE para

El etanol interfiere en casi todas las técnicas de biología molecular. Hay que eliminarlo. Se resuspende resuspender el ADN:
el ADN con agua destilada o tampón de baja fuerza iónica a pH neutro o ligeramente alcalino como Tris HCl: 10mM, pH8
Tris- EDTA (TE) (13). La rehidratación del ADN es un proceso lento: incubación inicial a 55-65ºC
seguido de una incubación a Tª ambiente con agitación suave hasta la completa disolución del pellet o EDTA: 1mM
una incubación en nevera a 4ºC hasta el día siguiente.

2. PRECIPITACIÓN CON SALES (SALTING-OUT)

La precipitación con sales à se basa en la presencia de altas concentraciones salinas à generan medios con elevada fuerza
iónica à incrementando las interacciones hidrofóbicas entre proteínas, disminuyendo su solubilidad en el medio acuoso y
provocando su precipitación. Fases del procedimiento:

• Precipitación de las proteínas.

• Precipitación del ADN.
• Lavado y resuspensión del ADN.

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 1. PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS

Se añade al lisado un volumen igual de una solución salina concentrada (actúa como Solución precipitante de proteínas (I)
solución precipitante de proteínas) (1). Se agita con un vórtex 20-30s. NaCl 6M
Solución precipitante de proteínas (II)
Se centrifuga la mezcla à las proteínas sedimentan en el fondo (leucocitos) (pellet) (2) Acetato de amonio 10M
y en el sobrenadante quedan los AANN, sales y componentes hidrosolubles del lisado.

2. PRECIPITACIÓN DEL ADN

Se transfiere el lisado a un tubo limpio (3). Se añade un volumen igual de isopropanol (solución precipitante de proteínas) (4) y
se mezcla por inversión suave del tubo varias veces quedando las proteínas abajo (5) El sobrenadante se pasa a otro tubo (6)
descartando las proteínas que han quedado abajo. El ADN precipita en forma de maraña de hebras blanquecinas que
sedimentan mediante centrifugación (7).

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3. LAVADO Y RESUSPENSIÓN DEL ADN

Se elimina el sobrenadante y se lava con etanol 70-95% (8). Se elimina el sobrenadante (10) y se deja secar (11) y se resuspende
en agua destilada o tampón TE (12).

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3. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
La cromatografía de intercambio iónico à se basa en la unión electrostática reversible de iones en En la cromatografía de
solución de grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria. intercambio iónico, la unión
(es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades fase estacionaria-grupo
de carga de las moléculas.) funcional es covalente y el
tipo de ion unido al grupo
Los grupos funcionales tienen carga neta negativa à se llaman intercambiadores aniónicos à se funcional depende de la
unen reversiblemente a iones negativos (aniones) que se encuentran en la solución. concentración salina y del pH
del medio.
Los grupos funcionales que tienen carga neta positiva à se llaman intercambiadores catiónicos à
se unen a los iones positivos (cationes) presentes en la solución.

Para la purificación de AANN se usan matrices de sílice o celulosa (fase estacionaria) empaquetadas en columnas de propileno. A
la matriz se le une covalentemente un intercambiador aniónico ya que los AANN son polianiones con carga negativa. Los grupos
funcionales más usados son: MAE (metilaminoetanol) y DEAE (dietilaminoetil).

Procedimiento: 3 pasos:

1. la columna de cromatografía se carga con una dilución de lisado (1) en un tampón de baja salinidad y pH neutro. Así los
AANN tienen una carga muy negativa y se unen a los grupos funcionales del intercambiador, que tienen carga positiva.
Las proteínas, los polisacáridos y contaminantes del lisado con carga positiva no se unen al intercambiador y eluyen de
la columna (2).
2. La columna se lava con tampones de concentración salina creciente (3) à se van eliminando contaminantes con débil
carga negativa (4).
3. El ADN se eluye de la columna con un tampón de máxima salinidad y alto pH (5).

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 4. Los AANN se precipitan del eluido (6) con isopropanol o etano para eliminar las sales del tampón de elución, se lavan
con etanol y se resuspenden en agua destilada o tampón TE.

Este método permite purificar de manera individualizada distintos tipos de AANN en función de la carga neta negativa de cada
tipo de molécula.

Jugando con la concentración salina de los tampones se puede conseguir que eluyan el ARNm y los ARN ribosómicos de alto

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peso molecular, mientras permanece unido en la columna el ADN.

4. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
La cromatografía de adsorción à se basa en la capacidad de adsorción de los AANN al vidrio y a la sílice en presencia de sales
caotrópicas. El vidrio está formado por silicatos (SiO44-). En contacto con el agua, la superficie del vidrio se recubre de una capa
hidratante. En solución acuosa los AANN también se recubren de una capa hidratante. Las capas hidratantes de ambas impiden
la interacción entre ellas.

Cuando se añade una sal caotrópica (lana de vidrio o silice en perlas), esta atrae las moléculas de agua y retira la capa
hidratante de ambas estructuras, creando un entorno hidrofóbico que permite la interacción entre la sílice y los AANN.

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Procedimiento: Para la purificación se utiliza membranas de lana de vidrio o perlas de sílice empaquetadas en columnas de
polipropileno que se ajustan a tubos ependorf.

1. La columna se carga con el lisado diluido en un tampón que contiene un agente caotrópico (1) y se centrifuga (2). Los
AANN quedan unidos a la membrana de la columna (adsorción) (3) y el medio liquido con las proteínas y componentes
celulares contaminantes se recogen en un tubo colector y se elimina (3).

2. Los AANN se lavan con etanol 70% para eliminar el resto de los contaminantes. Se centrifuga y se elimina el contenido
del tubo colector (4). Para evitar que queden restos de albohol, la columna vacía se somete a una nueva centrifugación
y el tubo colector se desecha con los restos de etanol.

3. Se añade sobre la membrana agua destilada o tampón TE (5) à la membrana y los AANN recuperan la capa hidratante
y se separan (desorción). Incubación 3-5min para favorecer la resuspensión del AANN y se centrifuga, se desecha la
columna y queda en el eppendorf los AANN purificados.

5. PURIFICACIÓN MEDIANTE ESFERAS MAGNÉTICAS

La purificación mediante esferas magnéticas à se basa en la unión de AANN a microesferas magnéticas que pueden ser
retenidas mediante un imán. Las microesferas suelen estar constituidas de magnetita. La unión de los AANN se puede realizar
por adsorción o por afinidad.

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 • ADSORCIÓN DE AANN A ESFERAS MAGNÉTICAS

Las microesferas se recubren de sílice.

1. Las esferas se añaden al lisado con un agente caotrópico (1) à los AANN se unen a la superficie de las esferas

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(adsorción) (2).
2. El tubo que contiene la mezcla se coloca en un soporte con imán (separador magnético) (3).
3. El resto de componentes con las proteínas y contaminantes se elimina del tubo por pipeteo o decantación (3).
4. Lavar los AANN con etanol al 70% y se agita. Se vuelve a agitar y la solución de lavado con el resto de contaminantes se
elimina por pipeteo o decantación.
5. Se resuspenden los AANN con agua o tampón TE y se incuba 10min (4) à los AANN se separan de las esferas
(desorción). La desorción se puede favorecer incubando con agitación a Tª elevada (55ºC).
6. Se coloca el tubo en el separador magnético para que las esferas sin AANN se agrupen a la pared del tubo y los AANN
en solución se pipetean y se transfieren a un tubo limpio (4).

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• SEPARACIÓN MAGNÉTICA POR AFINIDAD

Las esferas se recubren con polímeros sintéticos o naturales con alta afinidad por AANN. Esferas recubiertas con
oligonucleótidos poli T se usan para purificar ARNm eucariota que contiene una cola de poliA:

1. Las mimcroesferas-oligoT se añaden al lisado con un tampón especifico que facilita la hibridación del oligoT con la cola
de poliA de los ARNm.
2. El tubo se pone en el separador magnético à permite eliminar todos los componentes del lisado y mantener el ARNm
unido a las esferas.
3. Se lavan las esferas con etanol y se eluye el ARNm à se mezclan las esferas con agua destilada o tampón Te y se eleva
la temperatura para que se produzca la separación del ARNm del oligoT por desnaturalización térmica.
4. Se retiran las esferas con el separador magnético y el ARNm en solución se transfiere a un tubo limpio.

Una variación de esta técnica es recubrir las esferas con estrptavidina à en este caso el
La estreptividina es una proteína aislada
lisado se incuba previamente con oligonucleótidos poliT marcados con biotina en
de Stroptomyces con 4 sitios de unión
condiciones de hibridación. para la biotina. LA unión estreptovidina-
biotina es una de las interacciones no
covalentes más fuertes que se conocen.
6. ULTRAFILTRACIÓN
La ultrafiltración à es la retención por tamaño de moléculas de AANN mediante membranas con un tamaño de poro
determinado. Se suele utilizar este método para purificar productos de PCR con tamaño superior a 150pb. Procedimiento:

1. La muestra se centrifuga à sobre el filtro quedan los productos amplificados de PCR y al tubo colector pasan los
contaminantes.
2. El filtro se lava con etanol.
3. Se resuspenden los productos de PCR añadiendo agua destilada o tampón TE, se incuba unos minutos a Tª ambiente y
se transfiere a un tubo limpio mediante pipeteo.

7. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS
Los plásmidos son muy útiles en la tecnología de ADN recombinante à se usan como
Los plásmidos son moléculas circulares
vectores para clonar secuencias génicas de interés. El problema es la purificación à hay de ADN extracromosómico bacteriano
que separarlos del ADN cromosómico bacteriano y del ARN bacteriano. Para la purificación de pequeño tamaño que portan genes
de plásmidos hay 2 técnicas: de resistencia a antibiótico y factores de
virulencia.
• Centrifugación en gradiente de densidad.
• Lisis alcalina.

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 1. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD

Una vez purificado todo el ADN (cromosómico + plasmídico) se sometía a una centrifugación en gradiente de densidad
autogenerado de cloruro de cesio. El ADN plasmídico tiene una densidad mucho menor que el ADN cromosómico à se
separaban en bandas diferenciadas pero la técnica era muy laboriosa y casi no se utiliza.
Soluciones usadas para la purificación
2. LISIS ALCALINA
de plásmidos:
Es el método + usado en la purificación de plásmidos. Fases: • Solución de lisis alcalina:
SDS (dodecil-sulfato-sódico): 1%
• Lisis alcalina NaOH (hidróxido sódico): 0,2N
• Neutralización rápida • Solución de neutralización:
• Purificación del ADN plasmídico KCH3CO2 (Acetato potásico): 3M, pH 4.8

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
1. Lisis alcalina à Se añade SDS e hidróxido de sodio à se produce la lisis de las bacterias por el SDS y la desnaturalización del
ADN cromosómico y plasmídico por el pH alcalino.

2. Neutralización rápida à se añade a la mezcla una solución de acetato potásico a pH ácido (pH 4.8) que produce 2 efectos:

• La brusca neutralización del pH provoca uniones del ADN cromosómico que precipita y el ADN plasmídico renaturaliza
recuperando su estructura.
• La alta concentración salina provoca la precipitación de las proteínas junto con la sal. Mediante centrifugación se
sedimentan los componentes insolubles, quedando en el sobrenadante el ADN plasmídico.

8. CONSIDERACIONES ESPECIALES PARA LA PURIFICACIÓN DE ARN

Las ARNasas son enzimas muy resistentes. La esterilización por calor no las elimina, con las temperaturas altas se inactivan, pero

Reservados todos los derechos.

recobran su actividad y su conformación nativa cuando baja la temperatura. El EDTA tampoco las inactiva. La purificación de
ARN se debe hacer en condiciones especiales:

• Trabajar con guantes en cabina de flujo laminar.

• Limpieza de superficies con soluciones comerciales inactivadoras de ARNasas.
• El material debe estar certificado como libre de ARNasas.
• La solución de lisis debe contener un agente caotrópico que inactive las ARNasas (isotiocianato de guanidino).
• Todos los reactivos empleados en el proceso y el agua destilada deben estar libres de ARNasas.

Método estándar para la obtención de agua libre de ARNasas en laboratorios:

Se trata el agua destilada con dietilpirocarbonato (DEPC) al 0.1%. El tratamiento debe ser de mínimo 2h a 37ºC en agitación o toda la
noche a Tª ambiente.

El agua tratada tiene que autoclavarse a 120ºC 20min para inactivar y eliminar el DEPC que a esa Tª se degrada en cO2 y etanol. La
presencia de pequeñas trazas de DEPC en el agua puede inhibir reacciones enzimáticas utilizadas en biología molecular.

5. AUTOMATIZACIÓN DEL PROCESO DE EXTRACCIÓN/PURIFICACIÓN

Hay automatización de la gran mayoría de procedimientos independientemente del volumen de las muestras (de individuales
hasta 96 simultáneas) y del tipo de muestras.

1. VENTAJAS DE LA AUTOMATIZACIÓN
• Garantiza la obtención de AANN altamente purificados.
• Minimiza la contaminación por proteínas.
• Evita la contaminación cruzada entre muestras.
• Aporta rapidez y permite obtener AANN purificados en menos de 1h.

2. TIPOS DE INSTRUMENTOS AUTOMÁTICOS

• Basados en el uso de partículas magnéticas à utilizan cartuchos cerrados de reactivos con un compartimento para
cada paso de la técnica con el correspondiente reactivo específico.
• Basados en cromatografías de adsorción à las columnas de silica-gel se cargan mediante pipeteo automático y el paso
de los reactivos por la columna se fuerza con sistemas de vacío o centrifugación.
• Instrumentos modulares à robots modulares que se adaptan a distintas tecnologías.

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 6. CALIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS PURIFICADOS
La calidad de los AANN viene determinada por 3 parámetros:
• Integridad.
• Pureza.
• Concentración.
Una buena calidad es clave para conseguir una adecuada funcionalidad de estos en las diferentes técnicas de biología molecular.

1. INTEGRIDAD DE LOS AANN

La integridad à es el parámetro que determina si un AN conserva su tamaño original. La mejor manera de valorar la
integridad es la electroforesis en gel de agarosa al 0.7-1.2% (p/v). dependiendo del tipo de AANN que se haya purificado,

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
el resultado esperado en la electroforesis varía:

• ADN genómico à si mantiene su integridad se observará una banda única de ADN perfectamente definida en la
parte superior del gel. Si se fragmenta o se degrada aparece una estela fluorescente (smear) a lo largo de la calle
de electroforesis, cuya extensión e intensidad dependerán del grado de degradación de la muestra. Este patrón
no es aplicable a muestras purificadas a partir de tejido FFPE porque la fijación e inclusión en parafina provoca la
fragmentación del ADN.
• ADN plasmídico à Lo ideal es obtener una única banda de electroforesis, pero a veces aparece una banda débil
correspondiente al plásmido con una estructura relajada y una tercera banda correspondiente a dímeros.
• ARN à es normal que aparezca un smear por el ARNm.

2. PUREZA DE LOS AANN

Reservados todos los derechos.

Pureza à es el parámetro que determina la ausencia de posibles contaminantes. Para que los AANN mantengan su
funcionalidad requiere un determinado grado de pureza, reduciendo al mínimo los contaminantes. La medida del grado de
pureza se basa en las propiedades de su máxima absorbancia a una longitud de onda de 260nm.

• COCIENTE A260/A280 à es el cociente que se utiliza para valorar la pureza. Los principales contaminantes tienen un
max de absorbancia a 280nm. La relación entre ambas absorbancias da una idea del grado de contaminación de la
muestra. Las medidas se suelen realizar en muestras diluidas en agua destilada o tampón TE.

• VALORES DEL COCIENTE A260/A280 EN EL ADN Y POSIBLES CORRECCIONES:

a) Se considera que tiene un grado de pureza cuando el cociente
La contaminación por proteínas se
A260/A280 tiene un valor entre 1,7 – 2.
puede solucionar con un tratamiento de
b) Valores de 1,6 e inferiores indican contaminación excesiva.
proteinasa K. Si la contaminación es por
c) Valores superiores a 2 indican una concentración elevada de ARN ya que fenoles hay que repetir el proceso de
la absorbancia del ARN a 260nm es mayor que la del ADN. à La purificación con cloroformo/alcohol
contaminación de ARN se puede eliminar mediante tratamiento con isoamílico y posterior precipitación del
ARNasas. ADN con isopropanol o etanol.

• COCIENTE A260/A230 à es un parámetro adicional para valorar la calidad del AN, aunque no tan específico. A
230nm se detecta la máxima absorbancia de contaminantes menores:
a) Puro à entre 1,5 – 2,2
b) Presencia de contaminantes à inferior a 1,5 à precipitar y lavar de nuevo con etanol, dejar secar y
resuspender con agua.

• ABSORBANCIA A 320nm à mide la turbidez de la solución (presencia de partículas en suspensión).

3. CONCENTRACIÓN DE LOS AANN

La concentración à es la cantidad de AANN por unidad de volumen de solución final. Los métodos más usados son:

• ABSORBANCIA A 260nm à según la ley de Lambert-Beer, la absorbancia de una disolución es directamente

proporcional a la concentración del soluto en la disolución y al paso óptico de la cubeta en la que se realiza la medición.
Aplicando esta ley a los AANN se obtienen estas equivalencias:

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 a) 1 ud de absorbancia = 50ng/microL de ADNds
b) 1 ud de absorbancia = 33ng/microL de ADNss
c) 1 ud de absorbancia = 40ng/microL de ARN

Como para el cálculo de los cocientes de pureza, la medida de la absorbancia se realiza sobre una dilución de la muestra
purificada. Se puede utilizar la misma dilución para calcular la concentración y los cocientes.

La medida de absorbancia obtenida debe estar incluida en el intervalo de medida lineal del espectrofotómetro. Si la lectura esta
por encima del rango lineal, hay que hacer una dilución mayor de la muestra.

La concentración de una solución de un AN se puede calcular:

Concentración de AN en ng/microL o microL/ml = (A260-A320) X factor de dilución X factor de conversión.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
La cantidad total de AN purificado en ng es igual a la concentración de la solución en ng/microL por el volumen de resuspensión
en microL.

• MODO DE FLUORESCENCIA à se utiliza para medir la concentración de ADNds y se basa en el empleo de colorantes
específicos que emiten fluorescencia cuando se combinan con el ADN (PicoGreen, SYBR Green, Bisbenzimidazol).
La técnica requiere la elaboración de una curva de calibración con cantidades de ADN conocidas. Tanto los patrones
como las muestras se hacen reaccionar con el colorante, se excita a la longitud de onda adecuada y se mide la
fluorescencia emitida.

• CONVERSIÓN DE UNIDADES à en los protocolos de biología molecular, las unidades se dan en microg y en picomoles.
Para convertir las unidades: Peso molecular medio de 1Pb = 660 y el Peso molecular de un nucleótido es = 330.

Reservados todos los derechos.

4. FUNCIONALIDAD DE LOS AANN PURIFICADOS
Unos buenos resultados de calidad en los AANN purificados son indicadores de una buena funcionalidad.

Se puede comprobar la funcionalidad sin tener que determinar parámetros de calidad, a partir de la realización de una PCR o
una RT-PCR.

7. ALMACENAMIENTO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS PURIFICADOS

La trazabilidad requiere un sistema de identificación adecuada para cada muestra. Hay varias opciones:

• Rotulación directa de los tubos. Se deben ser tintas indelebles, resistentes a solventes orgánicos y a bajas
temperaturas.
• Uso de etiquetas con codificación alfanumérica. Las etiquetas deben aguantar temperaturas de -80ºC.
• Uso de etiquetas con código de barras (1D) o de puntos (2D) resistentes a bajas temperaturas.
• Uso de tubos con codificación 2D grabada en el propio tubo. Estos sistemas permiten la identificación directa en las
cajas o racks de 96 tubos con escáneres de lectura y software especifico de descodificación.
• Las cajas o racks para guardar los tubos también deben estar identificadas con código de barras o puntos, mediante
etiquetas o grabados.

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