Laboratorio enzimas de restricción y diagnóstico del polimorfismo de

globina beta S mediante RFLP

Nombre: Jasmith Sánchez

Fundamento:
La anemia drepanocítica (anemia de células falciformes) se origina por la mutación de un solo nucleótido en el gen de globina
beta humana. Esto genera en la población un polimorfismo, definido por la presencia del alelo normal o el mutado, en cada uno
de los dos cromosomas 11 homólogos.
Pretendemos estudiar el posible diagnóstico genético de esta enfermedad a través de un polimorfismo RFLP, es decir,
mediante restricción y electroforesis.
Como material de partida disponemos de muestras de DNA (virtuales) correspondientes a una parte de ese gen, para las dos
variantes (normal, AA o WW, y drepanocítica, SS).
Por lo tanto, vamos a estudiar un locus que corresponde a una parte del gen de globina beta y que contiene el punto polimórfico.

Más información (no necesaria para la práctica):

Concretamente, las muestras comprenden el exón 1, el intrón A, el exón 2
y parte del intrón B.
Recuerda que el polimorfismo se sitúa en el exón 1.
 hemoglobina S.

aquí estudiado. También se representa como W, de wild type (tipo silvestre).

hemoglobina A; de ahí el nombre A para el alelo normal de la globina beta
A la hemoglobina normal del adulto, 2 2 , se la llama habitualmente
Aclaración de la nomenclatura:
La hemoglobina de las células falciformes (sickle cells), 2 S , se denomina
Cómo
2

comenzar:
El laboratorio virtual funciona dentro de una página web, por lo que debes comenzar abriendo el navegador de internet en tu
ordenador o tableta. Cualquier navegador moderno debería funcionar, siempre que tenga activado JavaScript (se recomienda
Firefox o Chrome).

Visita la página de Cibertorio en http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio/

Ensayo:
Parte 1: Búsqueda de una enzima de restricción adecuada para detectar el polimorfismo

Objetivo:
Encontrar una enzima de restricción que corte de forma diferente los alelos normal (W o A) y mutado (S) del gen de
globina beta.
Materiales virtuales:
Software:

• Laboratorio virtual de biología molecular “Cibertorio”, biomodel.uah.es/lab/cibertorio/

Reactivos virtuales:

2
 • Enzimas de restricción (deben comprarse en CygnusLab TM, como se explica más adelante)
• Muestras para diagnóstico genético de hemoglobina S (también comprado en CygnusLabTM), que contiene las siguientes
muestras de DNA:
• DNA del gen de globina  de una persona homocigótica normal (representada como AA o WW).
• DNA del gen de globina  de una persona homocigótica drepanocítica (representada como SS).
• Cuatro muestras de DNA de pacientes cuyo genotipo se pretende averiguar (designadas Pt1, Pt2, Pt3 y Pt4); en esta práctica no
las usaremos.
• Marcador de masa molecular de DNA Ladder2™ (de CygnusLabTM)
• Tampón universal de restricción 10x (de CygnusLabTM)
• Agua
• Puntas de pipeta amarillas, capacidad de 1 a 100 L
• Agarosa
• Tampón de electroforesis TBE (Tris/Borato/EDTA)
• Bromuro de etidio
• Colorante de carga de muestras en el gel (contiene azul de bromofenol, xileno-cianol y glicerol)

Instrumentación virtual:

• Micropipeta variable hasta 100 L

• Incubador con regulación de temperatura CygnusLab TempeMaticTM
• Cubeta de electroforesis horizontal en agarosa CygnusLab GelMaticTMPlus
• Fuente de corriente continua CygnusLab 1000ZXTM (de 10 a 1000 V)
• Transiluminador ultravioleta (acoplado a la cubeta)
• Pantalla y gafas de seguridad protectoras contra UV

Procedimiento:
Comienza pulsando en el botón “Iniciar Cibertorio”. Tras unos segundos, aparecerá un aviso requiriendo que se haga un pedido
de muestras y enzimas; acéptalo.

1) Pulsa el botón “Realizar un pedido”.

2) Selecciona las “Muestras para hemoglobina S” y las 4 enzimas que te sugiere el sistema cuando le das click al botón de
ayuda – asignar enzimas.
3) Al pie de página necesitarás proporcionar unos datos. (Coloca tu nombre y apellido y la contraseña corresponda al centro.
Centro=UdM, contraseña=96g.9d7).
4) Pulsa el botón “Enviar el pedido” y luego anota el código de calidad de tu pedido, pues lo necesitaras al momento de
contestar las preguntas. Este es un código de dos letras o números que esta justo debajo del botón “confirmer el
pedido y recibir los reactivos”. Una vez tengas el código anotado, puedes darle “Confirmar el pedido”. Espera a que
se actualice la pantalla y aparezca el laboratorio simulado (tubos, pipeta, etc.).

5) Prepara mezclas de reacción para ensayar la restricción de las dos muestras de DNA (AA y SS) con cada una de las
cuatro enzimas asignadas. Para ello, debes poner en cada tubo 10 L de uno de los tipos de DNA, 4 L de tampón
10x, 25 L de agua y 1 L de una de las enzimas de restricción. Incluye también, como control, un tubo con cada
muestra de DNA sin enzima.
Nota: de las 78 enzimas disponibles en el programa, 57 no cortan en esa región del DNA y, entre las 21 que sí cortan, sólo 3 ven
afectada su diana por la mutación y, por ello, sirven para estudiar este polimorfismo. Esto ilustra la baja probabilidad de que se
pueda detectar mediante análisis de restricción un polimorfismo causado por la mutación de un único nucleótido.

Haz una tabla en la que indiques los reactivos y los volúmenes que debes pipetear en cada tubo.

Tubos DNA DNA Tampón Agua Apa LI Bsu 36I Mae Sma I Total
AA SS 10x II
1 10 μ L 4 μL 25 μL 1 μL 40 μL
2 10 μL 4μ 25 μL 1 μL 40 μL

3
 3 10 μL 4μ 25 μL 1 μL 40 μL
4 10 μL 4μ 25 μL 1 μL 40 μL
5 (control) 10 μL 4μ 26 μL 40 μL
7 10 μL 4μ 25 μL 1 μL 40 μL
8 10 μL 4μ 25 μL 1 μL 40 μL
9 10 μL 4μ 25 μL 1 μL 40 μL
10 10 μL 4μ 25 μL 1 μL 40 μL
11 10 μ 4μ 26 μL 40 μL
(control)

6) Pon en marcha la reacción de restricción pulsando en el botón “incubar” (está en la parte central inferior, bajo el
cronómetro). Transcurrido el tiempo virtual requerido, se ha completado la reacción. Dependiendo de la configuración
del laboratorio, puede que aparezca un mensaje que te informa de lo que se ha añadido en cada tubo; verifica que coincide con lo
que pretendías.

7) En el menú principal de Cibertorio, selecciona el módulo “Laboratorio de

electroforesis”. Pulsa el botón “autocarga”, que hará que las muestras preparadas en la
digestión anterior se transfieran a los pocillos del gel virtual. En el pocillo nº 13 se carga
automáticamente una mezcla de patrones de tamaño.

8) Ajusta en la fuente de corriente el voltaje a 200 voltios y el tiempo a 2,5 horas virtuales. Conecta la corriente para
comenzar la electroforesis. Mientras progresa, puedes encender la luz UV (asegúrate de tener puestas tus gafas o careta
virtuales de protección) y apagar las luces de la habitación virtual para ver cómo va avanzando el DNA y separándose
las bandas.

9) Una vez completada la electroforesis, interpreta los resultados obtenidos: decide cuál de las enzimas es la adecuada
para investigar el polimorfismo de la globina.
Justifica la enzima elegida y dibuja un esquema de cómo han quedado las bandas (puedes capturar una imagen usando la
cámara digital incluida en la cubeta).

4
 Para este caso la única enzima adecuada para investigar el polimorfismo de la globina es Bsu 36 I, ya que vemos en
el barrido que los cortes para ambas muestras de ADN son completamente diferentes, y en el tubo 8 (donde está el
ADN SS o enfermo) los cortes son menos que los presentes en el tubo 2 (ADN AA o sano). La enzima Sma I no
corta a ninguno de los 2 ADN y las enzimas Apa LI & Mae II corta ambos ADN en partes iguales (se ve el mismo
patrón de bandas, es decir que no hay polimorfismo allí)

10) Por comparación con el avance de las bandas del patrón (“escalera de DNA”), calcula el tamaño en pares de bases
que tienen los fragmentos de restricción obtenidos del DNA de las muestras. (Este cálculo puede hacerse de forma
precisa mediante una curva de calibrado, o bien de forma aproximada por comparación visual del avance.)

Suponiendo que cada banda del marcador de peso molecular vale 10 pb

 Tubo 1. = 49 pb + 75 pb
 Tubo 2. = 22 pb + 45 pb + 50 pb + 55 pb
 Tubo 3. = 35 pb + 56 pb + 65 pb
 Tubo 4. = 90 pb
 Tubo 5 (C) = 90 pb
 Tubo 7. = 49 pb + 75 pb
 Tubo 8. = 22 pb + 55 pb + 68 pb
 Tubo 9. = 35 pb + 56 pb + 65 pb
 Tubo 10. = 90 pb
 Tubo 11 (C) = 90 pb

Preguntas para evaluar los resultados parte 1:

1. Las muestras de los tubos a los que no has añadido ninguna enzima de restricción han mostrado en el análisis
electroforético:

○
una única banda de aproximadamente 90 pb
○
una única banda de aproximadamente 250 pb
○
una única banda de aproximadamente 770 pb
○
varias bandas
Respuesta: Una única banda de aproximadamente 90 pb (suponiendo que cada banda del marcador de peso molecular vale 10 pb)

NOMBRE DE CADA ENZIMA EN Apa LI Bsu 36I Mae II Sma I

TU CASO:

2. ¿Cuáles de las enzimas ensayadas no han

cortado el DNA de ninguna de las dos
muestras? Sma I

3. ¿Cuáles de ellas han cortado sólo el DNA de una

de las dos muestras? Ninguna

4. ¿Cuáles de ellas han cortado ambas

muestras de DNA del mismo modo?
Apa LI & Mae II

5
 5. ¿Cuáles de ellas han cortado de distinta forma el
DNA de ambas muestras? Bsu 36I

6. ¿Qué enzimas son adecuadas para analizar

este polimorfismo mediante RFLP?
La única que sirve es Bsu 36I

Parte 2: Diagnóstico genético de drepanocitosis mediante

RFLP
Objetivo:
Empleando una enzima de restricción elegida previamente, que corta de forma diferente los alelos normal y mutado del
gen de globina beta, realizar el diagnóstico genético de cuatro pacientes.

Procedimiento:
Debes haber realizado previamente la práctica “ensayo de enzimas de restricción”. Ahora, utilizando únicamente la enzima
adecuada para detectar este polimorfismo (seleccionada en la práctica anterior), realizarás el análisis de cuatro muestras de
pacientes a los que hay que diagnosticar si son portadores del alelo causante de la drepanocitosis.

1) Si te saliste de la práctica, sigue las instrucciones de la parte 1 para comprar muestras y enzimas en el impreso de
pedido en línea de CygnusLab, así como para usar el laboratorio virtual.

NOTA: Para hacer responder las preguntas de la parte 2 necesitas haber anotado el código que te asigna el
sistema al hacer un pedido (una clave de 2 dígitos o letras que se muestra en la pantalla bajo el botón
"confirmar el pedido y recibir los reactivos".

2) Prepara una tabla con los reactivos y cantidad de cada uno que necesitarás para cada tubo, completando
ésta:

tubo no 1 2 3 4 5 6

vol. de agua 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L

vol. de 8 L 8 L 8 L 8 L 8 L 8 L
tampón

6
 tipo de SS AA Pt1 Pt2 Pt3 Pt4
muestra

vol. de 22 22 22 22 22 22
muestra L L L L L L

volumen total 80 80 80 80 80 80
L L L L L L

Prepara los 6 tubos de ensayo con el contenido indicado en la tabla.

A continuación, transfiere la mitad del contenido de cada tubo (40 L) al tubo situado debajo de él (es decir, del
tubo 1 al 7, del 2 al 8, etc.). Así has creado duplicados de cada tubo, uno quedará como control y al otro
añadiremos enzima de restricción.
A los tubos 7 a 12 añade ahora 1 L de la enzima de restricción que seleccionaste en la práctica “ensayo de
enzimas de restricción”.

3) Pon en marcha la reacción de restricción pulsando en el botón “incubar”. Transcurrido el

tiempo virtual requerido, se habrá completado la reacción. Dependiendo de la configuración
del laboratorio, puede que aparezca un mensaje que te informa de lo que se ha añadido en cada
tubo; verifica que coincide con lo que pretendías

4) En el menú principal de Cibertorio, selecciona el módulo “Laboratorio de electroforesis”. En la cubeta, pulsa el botón
“autocarga”, que hará que las 12 muestras preparadas en la digestión anterior se transfieran a los 12 primeros pocillos
del gel virtual; en el pocillo nº 13 se carga automáticamente una mezcla de patrones de tamaño (“escalera de DNA”
Ladder2™).

5) Ajusta en la fuente el voltaje a 200 voltios y el tiempo a 2,5 horas virtuales. Conecta la corriente para comenzar la
electroforesis. Mientras progresa, puedes encender la luz UV (asegúrate de tener puestas tus gafas o careta virtuales de
protección) y apagar las luces de la habitación virtual para ver cómo va avanzando el DNA y separándose las bandas.

6) Una vez completada la electroforesis, dibuja un esquema de la posición de las bandas (puedes capturar una imagen
usando la cámara digital incluida en la cubeta) e interpreta los resultados obtenidos:

 ¿Cuál es el genotipo de los cuatro pacientes?

Paciente 1: genotipo AA
Paciente 2: genotipo SS
Paciente 3: genotipo SS

7
 Paciente 4: genotipo AS

 ¿Serán portadores o desarrollarán la enfermedad?

Paciente 1: está sano

Paciente 2: presenta anemia de células falciformes
Paciente 3: presenta anemia de células falciformes
Paciente 4: como presenta un alelo sano y un alelo enfermo, es portador, pero exhibe el comportamiento de sano

Preguntas para evaluar los resultados parte 2:

Para hacer esta evaluación necesitas haber anotado la clave que te asigna el sistema al hacer un pedido
(una clave de 2 dígitos o letras que se muestra en la pantalla "Gracias por formalizar su pedido", bajo el
botón "confirmar el pedido y recibir los reactivos")

Escribe aquí la clave asignada a tu experimento: 31

1. ¿Cuántos genotipos diferentes has encontrado en el conjunto de 6 muestras (2 patrones y 4 pacientes)?

Pt1 Pt2 Pt3 Pt4

2. Deduce el genotipo de los pacientes: AA SS SS AS

3. Pacientes que probablemente desarrollen anemia x x

drepanocítica:

4. Pacientes que no desarrollarán la enfermedad, pero x

la pueden transmitir a su descendencia: