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Objetivos
Aprender la metodología para la determinación de la concentración de un analito a partir
de los datos obtenidos por técnicas instrumentales. Evaluar el error involucrado en dicha
determinación. Estimar el límite de detección de técnicas instrumentales. Obtener las
herramientas para la correcta confección de informes.
Conocimientos previos
Se considera que términos como exactitud, precisión, error aleatorio, error sistemático,
población, muestra, media de la población (µ), desviación estándar de la población (σ), varianza
de la población (σ2), media de la muestra ( x ), desviación estándar de la muestra (s), varianza de
la muestra (s2), distribución normal de error, ANOVA son conocidos por el alumno. Información
sobre su significado puede encontrarse en D.A. Skoog, J.J. Leary, Análisis Instrumental, 4ta.
Edición, Apéndice 1.
Límites de confianza.
La media de la población o media verdadera (µ) de una medición es una constante que es
siempre desconocida. Sin embargo, en ausencia de errores sistemáticos, pueden estimarse ciertos
límites dentro de los cuales cabe esperar que caiga la media de la población con una cierta
probabilidad. Los límites así obtenidos se llaman límites de confianza de la media muestral.
Los límites de confianza derivan de la desviación estándar de la muestra, s y dependen de
la certidumbre con que se la conozca. Si ésta desviación estándar se obtiene a partir de una buena
cantidad de réplicas, será una buena aproximación de la desviación estándar de la población, σ,
y entonces los límites de confianza serán mas estrechos que si la estimación de s se basa en sólo
dos o tres mediciones.
La Figura 1 muestra una curva de distribución normal de error en la que la abscisa
representa la desviación respecto de la media en unidades de desviación estándar de la población.
La columna de números del centro de la Figura indica el tanto por ciento del área total de la
curva incluída entre los valores indicados de -z y +z. Por ejemplo, el 80% del área de cualquier
curva gaussiana (distribución normal) está entre incluida entre -1,29σ y + 1,29σ. El 80% de las
mediciones caerán en este intervalo y en este caso se dice que el nivel de confianza es del 80% y
el intervalo de confianza para una nueva señal es ± zσ = ± 1,29σ. El límite de confianza de la
media muestral para N mediciones repetidas se calcula como:
zσ
µ= x± (1)
N
donde x es el valor promedio de la muestra y µ la media de la población.
Los límites de confianza basados en la ecuación (1) son válidos en ausencia de
errores sistemáticos, es decir, cuando las mediciones son exactas. La Tabla I da los valores de
z para distintos niveles de confianza.
En la mayoría de las situaciones experimentales, se realizan pocas réplicas y por lo tanto,
no es verificable que la distribución de probabilidad de las señales sea Normal, o pueda
aproximarse a una Normal. Por este motivo, se esta lejos de tener una estimación exacta de σ y el
valor de s calculado a partir de un conjunto pequeño de datos puede estar sujeto a una
incertumbre considerable; y el límite de confianza debe ampliarse. En este caso no se utiliza el
parámetro estadístico z de la distribución Normal sino que se utiliza el parámetro estadístico t
denominado de la distribución t de Student y la ecuación (1) se transforma en:
CALIBRACION 1
ts
µ= x± (2)
N
El valor de t depende tanto del valor de N-1, que se conoce como grados de libertad asi como del
nivel de confianza requerido. La Tabla II muestra los valores de t para varios niveles de
confianza.
La distribución de probabilidad de las señales se utiliza en la determinación del Límite de
detección, como veremos luego.
CALIBRACION 2
Calibración de Instrumentos utilizados en el Análisis Químico Instrumental.
Calibración.
Se entiende por calibración al conjunto de operaciones que establece, bajo condiciones
específicas, la relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los
correspondientes valores de concentración o masa del juego de patrones de calibrado.
Modelos de calibración.
La forma de calibración más sencilla es la que utiliza un solo patrón. Este modelo es útil
sólo cuando el patrón es absolutamente confiable. Además, se supone que la señal cero del
instrumento corresponde al cero de concentración de la especie que se quiere determinar. Entre el
cero y valor obtenido para el patrón se realiza una interpolación lineal, pero la extrapolación más
allá de la concentración de patrón no es recomendada. El modelo correspondiente es:
y=mx (3)
*
Se entiende por matriz, a todos los componentes de la muestra que acompañan al analito.
CALIBRACION 3
y= b + mx (4)
El término b indica la magnitud de la señal estimada del blanco, mientras que m es la pendiente
de la recta de calibrado e indica nuevamente la sensibilidad.
Estadísticamente, una calibración realizada a partir de dos puntos es muy pobre y
su construcción a partir de un número mayor de patrones es obligatoria. El procedimiento
estadístico para determinar los coeficientes b y m de la ecuación (4) se denomina regresión por
cuadrados mínimos. La regresión por cuadrados mínimos es una herramienta muy útil, sin
embargo, deben conocerse sus limitaciones. Además de la regresión por cuadrados mínimos
siempre debe hacerse una inspección gráfica de los datos obtenidos, para detectar puntos
anómalos o fallas en la linealidad. Las ecuaciones mediante las que se obtienen los coeficientes
de la ecuación (4) se detallan en la próxima sección.
Este método es ampliamente utilizado en todas las ramas de las ciencias, encontrándose
incorporado en muchas calculadoras y planillas de cálculo.
Para el modelo de la ecuación (4) los coeficientes pueden ser calculados de la siguiente
manera:
N
∑ ( xi − x )( yi − y )
i =1
m= N
(5)
2
∑ ( xi − x )
i =1
b = y − mx (6)
donde x , y son los promedio aritméticos de los valores de x (patrones de concentración) y valores
de y (señales). En la ecuación (5), el numerador es simbolizado Sxy y el denominador Sxx . La
N
expresión ∑ ( yi − y ) 2 se denota con el símbolo Syy.
i =1
La calidad de la calibración se evalúa prediciendo el valor de la señal, ŷ , para los
distintos patrones a través del modelo utilizado (ecuación. 4). Las diferencias entre la señales
observadas y las predichas se denominan residuos. A partir de estos valores se calcula:
sy =
∑(y i − yˆ i ) 2
=
S yy − m 2 S xx
(7)
N −2 N −2
CALIBRACION 4
b.- Todas las medidas son estadísticamente independientes unas de otras. Cualquier tendencia de
las señales a través del tiempo (derivas de la línea de base o contaminaciones secuenciales)
invalida el calibrado.
c.- Todas las medidas tienen igual desviación estándar, la cual no depende del valor de la señal
observada, por lo tanto las señales altas tendrán igual desviación estándar que las pequeñas. Esta
suposición es particularmente discutible si se trabaja en un amplio intervalo de concentraciones.
Si no se cumple, es necesario utilizar un método de calibración ponderado por las desviaciones
estándar de las medidas.
d.- Las medidas están normalmente distribuidas. En general, el error en una medida analítica es
una suma de errores independientes provenientes de distintas partes del instrumento. Aunque el
error de cada fuente individual no sea normalmente distribuido, la suma de esas contribuciones,
producirá una distribución normal†.
De todas las suposiciones anteriores, la más débil es la tercera, porque en general a bajas
concentraciones, la precisión de las medidas empeora. Una buena aproximación puede realizarse
restringiendo el intervalo en el cual se realiza la curva de calibración, de manera que la precisión
sea constante. Si no se desea disminuir el rango lineal, se debe hacer una regresión ponderada.
La ecuación (4) se usa para calcular la concentración de una muestra incógnita:
y −b
x= (8)
m
sy
sm = (9)
S xx
2
sy 1 1 ( yx − y)
sx = + + (11)
m L N m 2 S xx
†
Esta es una ilustración del Teorema Central del Límite.
CALIBRACION 5
la determinación disminuye, por lo que es mejor determinar muestras cuyo valor de señal se
encuentre en el centro de la curva de calibrado. Cuantas mas veces se repite el análisis de la
muestra incógnita, mayor será L y por lo tanto menor será la desviación estándar. El diseño de la
curva de calibrado también es importante, puesto que Sxx debe ser pequeño. Esto se logra
aumentando la cantidad de patrones en los extremos de la curva de calibrado.
¿Cómo expresamos la incertidumbre del resultado de una muestra incógnita? Esto se hace
en base a un intervalo de confianza para el promedio de concentraciones obtenidos mediante L
análisis repetidos de la muestra. Puesto que en general el número de muestras utilizado en la
calibración es pequeño se debe utilizar el parámetro t para generar un intervalo de confianza.
Este intervalo se calcula mediante la ecuación (12). Los resultados para una muestra incógnita se
expresan como:
y −b
xx = x ± tα , N −2 ⋅ s x (12)
m
donde t depende del número de muestras realizadas en la calibración y del intervalo de confianza
deseado (ver Tabla II). No debemos olvidar el correcto redondeo de las cifras decimales, que
deberá hacerse cuando se hayan finalizado los cálculos.
S xy
r=
S xx ⋅ S yy
El coeficiente de correlación vale 1 o –1 en el caso de que las variables estén perfectamente
correlacionadas, pero no debe mal interpretarse puesto que un coeficiente de correlación de 1, no
necesariamente significa que la linealidad sea buena, sino que el numerador y el denominador de
la expresión anterior se cancelan mutuamente. Es común obtener buenos coeficientes de
correlación con rectas de regresión que no responden a un modelo lineal. El coeficiente de
correlación sólo es otro indicio adicional que debe sumarse al análisis de los residuos.
El tercer método es el análisis de la varianza de la regresión. El análisis de la varianza (ANOVA)
puede utilizarse para detectar una falla de ajuste en la regresión. Muchas planillas de cálculo
realizan este cálculo automáticamente. Para realizar este análisis de forma completa, se necesitan
datos replicados para cada patrón.
Test F de Linealidad
Este Test se basa en descomponer la varianza existente entre las señales experimentales y los
valores predichos en dos aportes. Uno de ellos es el error experimental. Para tener una
estimación del error experimental en la medición de las señales, debemos medir “i” replicados de
cada patrón, por lo que para cada punto x habrá varios valores de señal (yi). Para estimar la
CALIBRACION 6
varianza debida al error puramente experimental, calculamos la media de los cuadrados debida a
esta contribución (MSPE, Mean Squares Pure Error):
k ni
∑∑(y ij − yi ) 2
MS PE =
i j
n−k
Donde n es el número total de mediciones, k es el número total de patrones, i son las repeticiones
de cada patrón y los yij son las señales de todos los experimentos.
Para estimar el posible error debido a una falla de ajuste debida a la elección de un modelo
incorrecto, calculamos la media de los cuadrados debida a la “falta de ajuste” (MSLOF, Mean
Squares Lack of Fit):
∑n i ⋅ ( y i − yˆ i ) 2
MS LOF = i
k −2
Esto mide la diferencia media entre la media de las réplicas de cada patrón y su correspondiente
valor estimado por la regresión. Cabe esperar que si el modelo lineal es correcto, las varianzas
MSLOF y MSPE serán comparables. Si MSLOF es mayor que MSPE el ajuste no es correcto y hay
que utilizar otro modelo o reducir el ámbito de concentraciones en el cuál se hace el calibrado.
Para comparar MSLOF y MSPE hacemos un test F de varianzas calculando:
MS LOF
Fcal =
MS PE
Si Fcal < Fk-2,n-k,α (obtenido de tablas) se acepta que existe buen ajuste al modelo lineal.
Los cálculos de ANOVA pueden ser un poco engorrosos y se recomienda el uso de planillas de
cálculo que facilitan mucho la tarea.
( y i − yˆ i )
Residuo estándar:
sy
Un residuo estándar cercano o mayor que 1.5 indica que este residuo es anormalmente alto,
puesto que está a una distancia igual a 1.5 veces su desviación estándar. Este punto debe ser
examinado mas cuidadosamente para determinar la causa del residuo alto. Esto puede deberse a
una falla en la medición de la señal o a un problema de ajuste de la recta al modelo lineal. En
todo caso, puede intentarse repetir la regresión quitando este punto del juego de datos, para ver
de que manera cambia el valor de pendiente y ordenada al origen.
Protocolos de calibración
Para la determinación de la concentración pueden ser utilizados distintos modos de
calibración dependiendo del analito y de la técnica instrumental usada. El caso descripto
anteriormente se denomina calibración externa porque las muestras y los patrones se
determinan en forma separada.
CALIBRACION 7
Otros modos también son utilizados: calibración interna, método del agregado patrón
y técnicas de dilución isotópica.
Calibración interna:
Si antes de la determinación se le agrega a la muestra una cantidad fija de una sustancia
con características químicas similares a las de la especie a determinar, esta sustancia es llamada
estándar interno y el método se denomina de calibración interna o método del estándar
interno. El agregado sirve para calibrar un paso crítico que de otra manera introduce una gran
incerteza, por ejemplo el volumen de muestra inyectado en una corrida de Cromatografia
Gaseosa. La señal producida por este estándar interno es producida en las mismas condiciones
que la de los analitos, porque se encuentran juntos en la muestra. Para averiguar la concentración
de los analitos, se aplica alguno de los modelos lineales vistos anteriormente utilizando como
señal del patron, la señal producida por el estándar interno. La concentración del estándar interno
puede variarse para comprobar la linealidad y construir una curva de calibrado, o puede usarse un
modelo de un único patrón. Hay que tener en cuenta que si el estándar interno no tiene la misma
sensibilidad en el detector que los analitos, hay que corregir las señales de estos con un factor de
respuesta. Estos factores de respuesta se calculan a priori mediante estándares de los compuestos
a determinar (ver Willett, J. E., Gas Chromatography, Analytical Chemistry by Open Learning,
Wiley, 1987).
La forma más sofisticada del método del estándar interno es el método de dilución
isotópica. Aquí se opta por agregar a la muestra una sustancia que es químicamente igual a la
sustancia a determinar pero aún así discernible de la original. Este método utiliza la misma
sustancia como patrón pero con al menos un átomo de su estructura reemplazado por un isótopo.
Por ejemplo, 12C es reemplazado por 13C en un compuesto orgánico. Para este método debe
utilizarse un técnica selectiva a isótopos, generalmente espectrometría de masa.
Agregado patrón
En el método del agregado patrón se le agrega a la muestra, concentraciones crecientes del
analito de interés. La señal obtenida se deberá a la cantidad de analito originalmente presente en
la muestra sumados a la cantidad agregada. El propósito de este método es generalmente corregir
efectos de interferencias multiplicativas‡ debidas a la matriz de la muestra. Una vez obtenidas, la
señales instrumentales se grafican versus las cantidades de analito añadidas. La recta de
regresión se calcula de manera usual. Para conocer la concentración de la muestra incógnita se
extrapola la recta al punto sobre el eje x donde y=0. La intersección negativa sobre el eje x
corresponde a la cantidad de analito en la muestra problema. Este valor viene dado por b/m. En
este caso los resultados se expresan como:
2
b sy 1 y
x = ± tα , N − 2 ⋅ + 2 (13)
m m N m S xx
En esta expresión no aparece L como en la expresión (11), puesto que no se hacen réplicas de
cada muestra, sino que se hace un agregado patrón por cada una de ellas. Esto demanda mucho
tiempo y esfuerzo. No debemos olvidar que para obtener el valor de concentración en la muestra
original, debemos corregir al valor de x y a su incertidumbre, por las diluciones hechas.
‡
Las interferencias multiplicativas son aquellas que producen un cambio relativo en la concentración. Por ejemplo,
la presencia de aluminio en exceso en la muestra disminuye la señal de un electrodo de ion selectivo a fluoruro en un
50 %.
CALIBRACION 8
Límite de Detección
En Análisis Instrumental, debemos aprender a elegir la técnica correcta para cumplir con
nuestro análisis. Para ello, debemos comparar muchas “figuras de mérito” de cada método. Las
figuras de mérito forman una base común sobre las que se pueden comparar los métodos
analíticos. Ya hemos visto algunas figuras de mérito, como ser la sensibilidad, la exactitud y la
precisión. Otra figura de mérito importantísima es el Límite de Detección. El cálculo del límite
de detección responde la pregunta: ¿Cuál es la menor concentración que podemos detectar con
este método de análisis? Para responder a esta pregunta, debemos analizar cuál es la menor señal
detectable
La probabilidad que la más pequeña señal analítica discernible, yL , puede ser medida y
no corresponde a una fluctuación aleatoria de la medida del blanco, yB , depende de a cuantas
unidades de desviación estándar del blanco (sB ) está yL de y B (promedio de las medidas del
blanco). Si la diferencia entre y B e yL es 3sB la probabilidad que la medida de yL sea una
fluctuación del blanco es menor que el 0,13% (si el número de medidas del blanco es superior a
25).
Para determinar la concentración límite, xL ,, IUPAC define que :
y L = y B + ksB (14)
donde k es un valor que se elige de acuerdo al nivel de confianza que se desee, generalmente 3.
La concentración límite es una función de yL y por lo tanto:
( y − yB )
xL = L (15)
m
Sustituyendo la ecuación (14) en la (15) se obtiene que:
ks
xL = B (16)
m
Por lo tanto el límite de detección puede encontrarse dividiendo ksB por la pendiente
obtenida por regresión de la curva de calibración. Sin embargo, la concentración límite así
obtenida será un reflejo del verdadero límite de detección sólo si la pendiente, m, y la ordenada al
origen, b, están bien calculadas.
El método IUPAC utiliza como fuente de variabilidad de las señales, la desviación
estándar del blanco. Un método alternativo, aunque menos usado, utiliza la desviación estándar
de los residuales del calibrado sx (ecuación 11) como estimador de la desviación estándar del
blanco. Esto es útil si no se ha repetido el blanco y sB no puede calcularse.
El método definido por la ecuación (16) es válido solo si la principal fuente de error está
en el blanco. Por lo tanto, en la mayoría de los casos este método dará límites de detección mas
bajos que si se tiene e cuenta todo el error del calibrado.
Un detallado artículo sobre límite de detección puede leerse en Analytical Chemistry; 55
(1983) 712A. (este artículo puede obtenerse en la biblioteca Central Leloir).
Bibliografía
D.A. Skoog, J.J. Leary, Analisis Instrumental, Ápendice 1, McGraw-Hill, 4ta. Edición, 1994.
J.C. Miller, J.N. Miller, Estadística para Química Analítica, Addison-Wesley, 1993.
M.A. Sharaf, D.L. Illman, B.R. Kowalski, Chemometrics, Wiley, 1986
R. Kellner, J.M. Mermet, M. Otto, H.M. Widmer, Analytical Chemistry, Capítulo 12, Wiley-
VCH, 1998.
G.L. Long, J.D.Winefordner; Analytical Chemistry; 55 (1983) 712A.
CALIBRACION 9
PROBLEMAS
1.- Un método oficial para el análisis de hidrocarburos clorados en muestras de aire tiene una
desviación estándar de 0,030 ppm.
a.- Calcular el intervalo de confianza del 95% para la media de cuatro medidas obtenidas con
este método.
b.- Cuantas medidas deberán hacerse si se pretende que el intervalo de confianza del 95% valga
±0,017.
2.-La exactitud de un método analítico se suele evaluar analizando uno o varios materiales
estándar de referencia cuya composición se conoce. Siempre, la medida experimental del análisis
x diferirá del valor verdadero µ obtenido con el estándar. Reordenando la ec. (2) se puede
determinar si la diferencia x − µ es debida a un error sistemático.
ts
Si | x − µ| > existe un error sistemático.
N
ts
Si | x − µ| ≤ no queda demostrada la presencia de un error sistemático.
N
Determine si en los siguientes ejemplos hay alguna evidencia de error sistemático. En todos los
casos utilice un nivel de confianza del 95%.
a.- Se analiza un material de referencia cuyo valor de concentración de Hg se halla
certificado y vale 0.389%. El mismo material se analiza mediante Espectrometría de
Absorción Atómica por Generación de Vapor frío de Mercurio obteniéndose los
siguientes valores : 0,389; 0,374; 0,371. ¿Cuál es la mínima diferencia de porcentajes de
mercurio que podemos detectar con este experimento? ¿Cómo disminuye el sesgo
detectable?
b.- El tanto por ciento de níquel en una muestra particular de un acero de referencia es de
un 1,12%. Un nuevo método espectrométrico para la determinación de níquel produjo los
siguientes resultados (en %): 1,10; 1,08; 1,09; 1,12; 1,09.
c.- Se estudió la exactitud de un método volumétrico para la determinación de calcio en
minerales calcáreos analizando una piedra caliza estándar que contenía 30,15 % de CaO.
El resultado de la media de cuatro análisis fue de 30,26% de CaO, con una desviación
estándar de 0,085%.
• Indican estos datos la presencia de un error sistemático?
A partir de un elevado número de análisis, se estableció la desviación estándar de la
población. O sea s → σ = 0,094% de CaO.
• Indicarían estos datos la presencia de un error sistemático?
• Cambian las conclusiones si el estándar tiene una incertidumbre igual a 0.014%
de CaO con una probabilidad de error del 5%?
CALIBRACION 10
a.- Calcule la pendiente y la ordenada al origen de la recta de regresión para los datos mostrados.
b.- Calcule la desviación estándar residual y los límites de confianza (al 95%) para la pendiente y
la ordenada al origen.
c.- Determine las concentraciones, las desviaciones estándar y sus límite de confianza (95%) para
soluciones con intensidades de fluorescencia de 2,9; 13,5 y 23 unidades (L=1). Analice cual
presenta el mejor límite de confianza en valores absolutos. Analice donde es conveniente que
caiga el valor de la señal de la muestra dentro de la curva de calibración.
d.- Si se considera como el promedio de cuatro medidas el valor de intensidad de fluorescencia
de 13,5, cuáles serán los valores de la desviación estándar de la concentración calculada y el
límite de confianza?. Y si fuera el promedio de ocho? Analice cual es la mejora obtenida al
aumentar el número de medidas.
e- ¿El análisis del gráfico de residuos indica una buena linealidad?
4-En la tabla siguiente se muestran los resultados para la curva de calibrado de la determinación
de Mn usando un Espectrómetro de Absorción Atómica por Llama. Las alturas de las señales se
midieron con un registrador electrónico.
Concentración 0 1 2 3 4 5
(ppm)
Señal (altura en 0.00 0.98 2.10 3.16 3.68 4.15
unidades 0.90 2.20 3.22 3.72 4.27
arbitrarias)
Repita los cálculos de los puntos a y b del ejercicio anterior. Compare el ancho de los intervalos
de confianza.
Analice gráficamente los residuos de la regresión. ¿Hay alguna tendencia?
Analice si existen fallas del ajuste mediante un Test F.
Si detecta una falla de ajuste ¿Cómo la solucionaría?.
Concentración 20 40 60 80 100
de Tl (ng/ml)
Absorbancia 0.038 0.089 0.136 0.186 0.232
(área del pico
A.s)
Calcule los intervalos de confianza (95%) para la pendiente y la ordenada al origen. Calcule la
sensibilidad con su incerteza. Decida mediante un test de hipótesis si la corrección hecha con el
blanco está bien realizada.
CALIBRACION 11
Determine la concentración de Ag en la muestra, y obtenga los límites de confianza al 95% para
esa concentración.
7.- Utilizando los datos del problema 3. Determine el límite de detección según:
a.- Ecuación (16), considerando que la desviación estándar relativa del blanco es del 5%.
b.- Ecuación (16), considerando que la desviación estándar relativa del blanco es igual a la
desviación estándar residual (sy).
CALIBRACION 12
TABLA I.- Valores de z para distintos niveles de confianza
CALIBRACION 13