NMX-F-736/2-COFOCALEC-2012
NORMA MEXICANA
NMX-F-736/2-COFOCALEC-2012
SISTEMA PRODUCTO LECHE -
ALIMENTOS - LACTEOS -
IDENTIFICACION DE PROTEINAS EN
LECHE - PARTE 2; DETERMINACION
DE PROTEINAS DE ORIGEN VEGETAL
MEDIANTE ELECTROFORESIS
CAPILAR EN GEL - METODO DE
PRUEBA
Organismo Nacional de Normalizaci6n del Sistema Producto Leche
PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C. PROLOGO
EI Consejo para el Fomento de la Calidad de la Leche y sus Derivados, A.C.
(COFOCALEC) es un organismo privado sin fines de lucro, fundado el 4 de
noviembre de 1997, con el propésito de impulsar la calidad de los productos
lacleos a través de la normalizacién, la evaluacién de la conformidad y el
fomento, Obtuvo de la Direccién General de Normas de la Secretaria de
Economia el Certificado de Registro Numero 0007, como Organismo
Nacional de Normalizacién, con fundamento en lo establecido por los
articulos 39, fraccién IV, 65, 66 de la Ley Federal sobre Metrologia y
Normalizacién, 68, 69 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrologia y
Normalizacin, y 23, fraccién IV del Reglamento Interior de la Secretaria de
Economia, como se indica en el Oficio ntimero DGN.312.01,2002.331, de
fecha 11 de junio de 2002, para elaborar, actualizar, expedir y cancelar
normas mexicanas en el area de “productos, equips, procesos, servicios y
métodos de prueba de Leche y sus Derivados, excepto alimentos para
animales”.
Esta Norma Mexicana ha sido elaborada por el Subcomité Técnico de
Normalizacion de Métodos de Prueba y aprobada por el Comite Técnico
Nacional de Normalizacion del COFOCALEC ~ Sistema Producto Leche.
Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacion el 19
de junio de 2012,
Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche
PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C.
OOG000 48 NORMA MEXICANA —_NMX-F-736/2-COFOCALEC-2012__ SISTEMA
PRODUCTO LECHE - ALIMENTOS - LACTEOS - IDENTIFICACION DE
PROTEINAS EN LECHE - PARTE 2: DETERMINACION DE PROTEINAS
DE ORIGEN VEGETAL MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR EN GEL.
- METODO DE PRUEBA.
PREFACIO
En la elaboracién de la presente Norma Mexicana, participaron las siguientes
empresas e instituciones
CENTRO NACIONAL DE METROLOGIA (CENAM)
= CONSEJO PARA EL FOMENTO DE LA CALIDAD DE LA LECHE Y
SUS DERIVADOS, A.C. (COFOCALEC)
GANADEROS PRODUCTORES DE LECHE PURA, S.A. DE C.V.
- INOLAB, S.A. DE C.V.
- INSTITUTO NACIONAL DE CIENCIAS MEDICAS Y NUTRICION
SALVADOR ZUBIRAN
PROCURADURIA FEDERAL DEL CONSUMIDOR (PROFECO)
Laboratorio Nacional de Proteccién al Consumidor de la PROFECO.
- LICONSA, S.A. DE CV.
- UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO (UNAM.
Facultad de Quimica
Departamento de Alimentos y Biotecnologia
Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche
PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 0 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC. INDICE DEL CONTENIDO
NUMERO DE CAPITULO
10.
"1
12.
13.
14,
15.
16.
17.
Introduccién
Objetivo y campo de aplicacion
Fundamento
Referencias
Definiciones
Simbolos y abreviaturas
Reactivos y materiales
Equipos
Preparacién de la muestra
Procedimiento
Analisis cualitativo
‘Andlisis cuantitativo
Caloulos y expresién de resultados
Criterios de aceptacién
Presentacién del informe
Medidas de seguridad
Bibliografia
Concordancia con Normas Intemacionales
o
53
q
Apéndice Informativo A- Ejemplo de electroferogramas
Apéndice Informativo B- Verificacién del poder de resolucién de la
disolucién de separacién del capilar
Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche
PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 0 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A. 0. INTRODUCCION
La electroforesis en gel o electroforesis convencional (SDS-PAGE, sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), es indudablemente una
de las técnicas mas comunes empleadas en bioquimica para evidenciar
pureza y multiplicidad de los componentes proteinicos. Es el método de
separacién de biomoléculas con carga formal, a través de un tamiz
molecular, al ser sometidas a un determinado campo eléctrico. En términos
generales, la electroforesis capilar en gel (ECG) puede considerarse la
Version instrumental de SDS-PAGE pero con ventajas significativas: la
automatizacién del proceso de separacién y el superior nivel de andlisis,
similar a los métodos cromatograficos convencionales (HPLC y CG).
La separacién electroforetica se basa en que la mayoria de las proteinas
forman complejos con la especie monomeérica del dodecil sulfato de sodio
(SDS), aparentemente con la misma constante de asociacion en una retacién
de 1.4 g de SDS/g de proteina. La carga intrinseca de la macromolécula
queda enmasearada y la carga neta por unidad de masa es practicamente
constante, de esta forma la resolucion de una mezcla de proteinas depende
de la masa molecular de sus cadenas polipeptidicas y la migracién anédica
es independiente de su punto isoeléctrico.
Recientes investigaciones han demostrado con éxito el poder de resolucion
de la disolucién de separacién del capilar para el analisis de mezclas
complejas. Estudios de intercomparacion demuestran la robustez de la
metodologia yen el caso particular de la autenticidad de la leche, esta
reportado la deteccién de hasta 1% de proteina de origen vegetal en leche
en polvo,
4. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
Esta Norma Mexicana establece el procedimiento para detectar proteinas de
origen vegetal, de forma cualitativa, en leche en polvo y leche fluida mediante
electroforesis capilar en gel.
Esta Norma Mexicana es complemento de la Norma Mexicana NMX-F-736/1-
COFOCALEC Sistema Producto Leche — Alimento ~ Lacteo ~ Identificacion
de proteinas en leche - Parte 1: Determinacién de la composicién de las
proteinas propias de la leche por electroforesis capilar de zona ~ Método de
prueba, vigente y debe ufilizarse cuando se sospeche la presencia de
proteinas de origen vegetal en leche, por lo que esta descrito como un
método de analisis cualitativo pero no de rutina.
El procedimiento no es aplicable para la deteccién de proteinas hidrolizadas
de origen vegetal en leche.
Organismo Nacional de Normalizacion del Sistema Producto Leche
PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL O TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC. 2. FUNDAMENTO
Para evidenciar la posible presencia de proteina de origen vegetal en leche,
las proteinas propias de la leche se solubilizan y eliminan selectivamente,
empleando una disolucién de extraccion. El precipitado se redisuelve
utiiizando una disolucién amortiguadora de pH, en condiciones alcalinas,
reductoras y en presencia de SDS, para su andlisis por electroforesis capilar
en gel
3. REFERENCIAS
Para la correcta aplicacién de la presente Norma Mexicana se deben
consultar las siguientes Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas
vigentes 0 las que las sustituyan:
NOM-008-SCFI-2002 Sistema General de Unidades de Medida,
publicada en el Diario Oficial de la
Federacion el 27 de noviembre de 2002.
NOM-155-SCFI-2003 Leche, férmula lactea y producto lacteo
‘combinado = Denominaciones,
especificaciones fisicoquimicas, informacion
comercial y métodos de prueba, publicada
en el Diario Oficial de la Federacion el 12
de septiembre de 2003.
NMX-F-718-COFOCALEC-2006 Sistema Producto Leche — Alimentos —
Lacteos ~ Guia para el muestreo de leche y
productos lacteos, declarator
publicada en el Diario Oficial
Federacién el 09 de noviembre de 2006.
4, DEFINICIONES
Para fines de la presente Norma Mexicana aplican las definiciones
contenidas en la Norma Mexicana PROY-NMX-F-736/1-COFOCALEC-2012
Sistema Producto Leche — Alimentos — Lacteos — Identificacion de proteinas
en leche — Parte 1: Determinacion de la composicin de las proteinas propias
de la leche por electroforesis capilar de zona — Método de prueba
5. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS.
Cuando en la presente Norma Mexicana se haga referencia a los siguientes
simbolos y abreviaturas se entiende por:
UL microlitro
kPa _kilopascal
kDa kilodalton
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PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC. Asimismo, se deben considerar los simbolos y abreviaturas contenidos en la
Norma Mexicana PROY-NMX-F-736/1-COFOCALEC-2012 Sistema Producto
Leche — Alimentos — Lacteos ~ Identificacién de proteinas en leche ~ Parte 1
Determinacién de la composicién de las proteinas propias de la leche por
electroforesis capilar de zona — Método de prueba.
6. REACTIVOS Y MATERIALES
64 Reactivos
Todos los reactivos que se enlistan a continuacién deben de ser grado
analitico de la mas alta pureza posible. Se indica el numero CAS
correspondiente.
6.1.1 Tetraborato de sodio decahidratado (Borax) [1303-96-4]
Na2B4O7-10H20.
61.2 Sal _disédica_dihidratada del Acido _etielendiamino-tetraacético
(EDTA) [6381-92-6] CoH 4NaNa2Oo-2H,0.
6.1.3 Tris(hidroximetil)-amino metano (Tris Base) [77-86-1] C4Hy;NOs,
6.1.4 2-Mercaptoetanol (8-Mercaptoetanol) (60-24-2] CoHsOS.
6.1.5 Dodecil sulfato de sodio (SDS) [151-21-3] CyzHasO.SNa.
6.1.6 Acido Clorhidrico [7647-01-0] HCl.
6.1.7 Hidréxido de sodio [1310-73-2] NaOH.
6.1.8 Mezcla de estandares que contenga un minimo de seis proteinas
diferentes, con una masa molecular entre 10 kDa y 250 kDa, por
ejemplo:
a-Lactoalbimina bovina [9051-29-0] MW ~14.2 kDa;
Inhibidor de tripsina [9035-81-8] MW ~20.1 kDa;
Anhidrasa carbénica bovina [9001-03-0] MW ~29 kDa;
Ovoalbumina [9006-59-1] MVV ~45 kDa;
Albiimina sérica bovina [9048-46-8] MW ~66 kDa;
Fosforilasa b de conejo [9012-69-5] MW ~97.4 kDa;
B-galactosidasa [9031-1 1-2] MW ~116 kDa;
Miosina de conejo [N/A] MW ~205 kDa.
NOTA-SDS-MW Analysis Kit Size Standard de Beckman Coulter Inc., es un ejemplo de
‘mezcla comercial patentada con 7 diferentes proteinas (16 mgimL). Vase Apéndice
Informative B.
6.1.9 Agua grado HPLC 0 de pureza equivalente H,O.
6.1.10 Disoluciones amortiguadoras de referencia pH 7,00 y 10,00.
Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche
PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC. 6.1.11
62
6.2.4
6.2.2
6.2.3
6.24
6.25
6.26
6.27
6.28
6.29
6.2.10
6.2.11
6.2.12
6.2.43
6.2.14
6.2.15
6.2.16
6.2.17
63
63.1
Material de referencia. Leche entera fresca liofilizada
Materiales
Pipetas automaticas verificadas, capacidad de 20 uL, 200 ul y
1000 pL.
Puntas para pipetas automaticas.
Pipetas Pasteur.
Pipeta graduada de 1 ml.
Jeringas desechables de 1 mL de capacidad
Unidades de filtracion de PVDF, 13 mm; 0,45 ym.
Vasos de precipitado de 10, 30y 100 ml.
Matraces volumétricos verificados Tipo "A’ de 10, 25 y 100 mL.
Espatula de acero inoxidable,
Microespatula de acero inoxidable.
Agitadores magnéticos.
Frascos de vidrio de 100 mL. con tapén de rosca
Microtubos con tapa de seguridad tipo Eppendorf de 2,0 ml. de
capacidad.
Capilar de silice fundida (30 cm x 50 ym de d.i.)
Viales con tapas para instrumento de electroforesis capilar de 2 mL.
y 800 ul.
Viales con tapas y soporte para instrumento de electroforesis
capilar de 250 ul.
Material requerido para llevar a cabo la separacién conforme al
equipo de electroforesis capilar.
Preparaci6n de disoluciones
Disolucién amortiguadora de extraccién para leche en polvo (pH 8,3,
£0,1)
Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche
PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C.
gaaacq
& 6.3.1.1 Disolver en aproximadamente 50 mL de agua 1,1558 g de
tetraborato de sodio decahidratado (30 mM) y 1,489 g de sal
sédica dihidratada del acido etilendiamino-tetraacético (40 mM), en
un vaso de precipitados de 100 mL.
6.3.1.2 Transferir cuantitativamente la disolucién a un matraz aforado de
100 mL. Diluir y aforar la disolucion con agua
6.3.1.3 Medir el pH. No es aceptable ajustar el pH con dloalis 0 acidos.
Conservar la disolucién en un frasco limpio con tapa y a
temperatura de refrigeracién (4-6 °C)
6.3.2 Disolucion amortiguadora de extraccién para leche fluida (pH 7,90 +
0.1)
63.2.1 Disolver en aproximadamente 20 mL de agua 1,1558 g de
tetraborato de sodio decahidratado (120 mM) y 1.4889 g de sal
sédica dihidratada del acido etilendiamino-tetraacetico (160 mM),
en un vaso de precipitados de 30 mL.
6.3.2.2. Transferir cuantitativamente la disolucién a un matraz aforado de 25
mL. Diluiry aforar la disolucién con agua.
6.3.2.3. Medir el pH. No es aceptable ajustar el pH con alcalis 0 acidos.
Conservar. la. disolucion en un frasco limpio con tapa y a
temperatura de refrigeracién (4-6 °C).
63.3 Disolucién de hidréxido de sodio (100 mM)
6.3.3.1. Disolver en aproximadamente 50 mL. de agua 408,1 mg de NaOH,
en un vaso de precipitados de 100 ml.
6.3.3.2. Transferir cuantitativamente la disolucion a un matraz aforado de
100 mL. Diluir y aforar la disolucién con agua.
6.3.3.3 Conservar la disoluci6n en un frasco limpio con tapa a temperatura
ambiente.
6.3.4 _Disolucion de acido clorhidrico (100 mM)
6.3.4.1. Tomar una alicuota de 0,8 mL de HCI concentrado con una pipeta
graduada y disolver en aproximadamente 80 mL de agua, en un
vaso de precipitados de 100 mL.
6.3.4.2. Transferir cuantitativamente la disolucién a un matraz aforado de
100 mL. Diluir y aforar la disolucién con agua.
6.3.4.3 Conservar la disolucion en un frasco limpio con tapa a temperatura
ambiente.
Organismo Nacional de Normalizacion del Sistema Producto Leche
PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC. 635
6.3.5.1
6.3.5.2
6.3.5.3
NOTA.
636
Disolucién amortiguadora de muestra
Disolver en aproximadamente 80 mL de agua 606 mg de
tris(hidroximetil)-aminometano (50 mM), 1,0195 g de dodecil sulfato
de sodio (35 mM) y 37 mg de sal sédica dihidratada del acido
etilendiamino-tetraacetico (1mM). Agregar 14,7 mL de la disolucién
de Acido clorhidrico del punto 6.3.4.
Mezclar y transferir cuantitativamente Ia disolucién a un matraz
aforado de 100 mL. Diluir y aforar la disolucién con agua.
Verificar el pH que debera tener un valor de 8,7 0,1. No es
aceptable ajustar el pH con dlcalis 0 acidos. Reservar la disolucin
en un frasco limpio con tapa y a temperatura de refrigeracion (4-6
°C)
SDS-MW Sample Buffer de Beckman Coulter Inc., es un ejemplo de disolucién
‘amortiguadora de muestra, accesible de forma comercial. En caso de utlizarse esta
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