NMX-F-700-COFOCALEC-2012 NORMA MEXICANA /NMX-F-700-COFOCALEC-2012 SISTEMA PRODUCTO LECHE - ALIMENTO - LACTEO = LECHE CRUDA “DE VACA ~ ESPECIFICACIONES FISIGOQUIMICAS, SANITARIAS Y METODOS DE PRUEBA (Cancela a la NMX-F-700-COFOCALEC-2004) Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche ‘PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NWMX F-700-COFOCALEC-2012 PROLOGO EI Consejo para el Fomento de la Calidad de la Leche y sus Derivados, A.C. (COFOCALEC) es un organismo privado sin fines de lucro, fundado el 4 de noviembre de 1997, con el propésito de impulsar la calidad de los producios lacleos a través de la normalizacién, la evaluacién de la conformidad y el fornento. Obtuvo de la Direccién General de Normas de la Secretaria dé Economia el Certificado de Registro Nimero 0007, como Organismo Nacional de Normalizacién, con fundamento en lo establecido por los articulos 39, fraccién IV, 65, 66 de la Ley Federal sobre Metrologia y Normalizacién, 68, 69 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrologia y Normalizacién, y 23, fraccién IV del Reglamento Interior de la Secretaria de Economla, como se indica en el Oficio nimero OGN.312,01.2002.331, de fecha 11 de junio de 2002, para elaborar, actualizar, expedir y cancelar normas mexicanas en el rea de ‘productos, equipos, procesos, servicios y métodos de prueba de Leche y sus Derivados, excepto alimentos para animales’, Esta Norma Mexicana ha sido elaborada por el Subcomité Técnico de Normalizacién de Producto y aprobada por el Comit Técnico Nacional de Normalizacién del COFOCALEC ~ Sistema Producto Leche. Declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacién el 20 de marzo. de 2014, Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche 7 PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C,NMX-F-700-COFOCALEC-2012 NORMA MEXICANA NMX-F-700-COFOCALEC-2012 SISTEMA PRODUCTO LECHE - ALIMENTO - LACTEO — LECHE CRUDA DE VACA -— ESPECIFICACIONES FISICOQUIMICAS, SANITARIAS Y METODOS DE PRUEBA. (Cancela a la NMX-F-700-COFOCALEC-2004) PREFACIO En la elaboracién de la presente Norma Mexicana, participaron las siguientes empresas e instituciones: - ASOCIACION DE PROFESIONALES EN TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, AC. (APTA, A.C.) - CAMARA NACIONAL DE INDUSTRIALES DE LA LECHE (CANILEC) - CONFEDERACION,NACIONAL DE ORGANIZACIONES GANADERAS (CNos) - CONSEJO PARA EL FOMENTO DE LA CALIDAD DE LA LECHE Y SUS DERIVADOS) A\G;(GOFOCALEG, A.C.) = GANADEROS PRODUCTORES DE LECHE PURA, S.A. DE CV. (ALPURA) - INSTITUTO 30 minutos, afiada pocas gotas de alcohol y diluya a volumen con la solucién de sacarosa (sucrosa), Mezcle muy bien y vierta en un vaso de precipitado de 250 mL. o cualquier otro recioiente adecuado y agite con un agitador mecanico 0 magnético a una velocidad tal (200 a 300 rpm) que la mezcla sea completamente agitada pero cuidando que no se Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche ™ PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C.NMX-F-700-COFOCALEC-2012 formen burbujas en la suspensién. Observe contra la luz brillante que la suspension se encuentre uniformemente mezclada. Transfiera, mientras agita, una porcién de 10 mL (200 mg de sedimento estandar) ‘con una pipeta graduada de punta amplia a un matraz volumétrico de 1 Ly diluya al volumen con la solucién de sacarosa (sucrosa) al 50%. Cuando se enouentre completamente mezclada, cada mL contiene 0,2 mg de sedimento. Mezcle y vierta en un vaso de precipitado y agite de la misma manera que anteriormente. Si las particulas se acumulan en los lados del vaso, resuspéndalas con la misma ‘suspension de materia extrafia o con la punta de la pipeta. Mientras agita, saque con la pipeta volimenes definidos de la suspension con materia extrana y agréguelas a 0,35 L de leche descremada dulce filrada. Mezcle bien y pase la mezcla a través del disco de materia extrafia estandar del equipo de filtracion (véase A.2.2.3 y A.2.2.3.1). Con cuidado vierta la leche hacia el equipo de filtrado: y fitre con muy poca o nada de succién. Lave el recipiente rapidamente con un 0,11 L de leche descremada filtrada, Deje que la iiltima parte de la leche fluya a través de la almohadilla_sin aplicar succién. Si la materia extrafia no parece estar uniformemente distribulda ‘én»la almotadilla, agregue 15 0 20 mL de leche descremada y filtréla sin succi6n.Repita este procedimiento hasta que la materia extrafia aparezca homogéneamente distribuida. Aspire aire a través del disco por aproximadamente 1 minuto pafa remover el exceso de leche descremada. Para registros permanentes, ‘monte y rocie los discos con solucién de formaldehido al 40%'0.con una solucién alcohdlica que contenga 2,5 g tanto de mentol como de timol en 100 mL. No! obstante, si toda la leche es eliminada a través de la aspiracion no es necesario aplicar conservadores. Las almohadillas secas pueden ser récubiértas! con ceménto plastico transparente diluido con 1:3 volimenes de acetona de tal manera que la mezcla sea lo suficientemente delgada que permita su facil aplicacién. Si la acetona disuelve el pigmento del papel o mancha las almohadillas, coloque éstas ultimas en un cristal plano para la aplicacién del cemento diluido. Mueva las almohadillas mientras se secan para evitar que se peguen al cristal. Cuando las almohadillas estan casi seoas, coloque un objeto ligero (por ejemplo caja de Petri) encima de las mismas para evitar que se enrosquen. Las almohadillas pueden ser montadas con cemento plastioo. (Los discos estandar hechos con estiércol de vaca contienen grandes cantidades de clorofila y no pueden ser recubiertos con cemento plastic debido a que el solvente extrae la clorofila y mancha de verde las almohadillas. Utilice este método de conservacién de las almohadillas solo si no hay deslave de pigmentos del sedimento al aplicarse cemento plastico diluido), Después de llevar a cabo el método antes descrito, prepare diferentes discos con la mezcla de materia extrafa utilizando las siguientes cantidades: 0,0, 0,2, 0,5, 4,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 12,0, y 14,0 mg, Marque el disco con la cantidad de materia exlrafia utiizada para preparar cada almohadilla. Evite utilizar como estandar aquellas almohadillas en las que la materia extrafia no se encuentre uniformemente distribuida, 8 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL. 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NMDX-F-700-COFOCALEC-2012 Para realizar comparaciones entre muestras se pueden utilizar series completas de discos pero por lo general es mas conveniente seleccionar pocos discos que demuestren diferencias en el contenido de materia extrafia que sean aplicables a la investigacién que se esté llevando a cabo. En aquellos caso en que se elaboren informes y tablas comparativas, es importante sefialar el tipo de muestra utilizada (mezclada o muestra del fondo de la cantara), Si los estindares se van a utilizar Por un periodo prolongado, protéjalos con cristal 0 con hojas de plastic o cualquier otro material adecuado. Al utilizar estindares, use cualquier de los siguientes métodos: Califique el disco de materia extrafia con el disco estandar mas cercano sin importar si la cantidad de sedimento es inferior o superior al estandar; 0 Califique el disco de materia extrafta de la muestra como “mas de __m “menos de__ mag". Elja los estandares que se ajusten al método de callificacion, Cuando califique los discos, elimine las piezas burdas (moscas completas, pelos, pedazos grandes de estiércol 0 lodo, etc.), pero si dichos materiales se encuentran presentes sefidlelos de manera separada en el informe. A.2.3.2 Preparacién de estandares de discos con materia extrafia fina. A.2.3.2.1 Estandar de 28,6 mm de diametro. Muela estiércol de vaca secado en el horno (100 °C), tierra de jardin y carbén de madera (entero) en un molino Wiley (o equivalente) con malla o tamiz fino. Pase el estigrcol de vaca por el molino 2 6 3 veces. Separe los materiales en cantidades maximas de 50 g, como sigue: Seque 25 a 50 g a 100°C por 3 a4 horas. Mientras esta todavia caliente, coloque en una malla o tamiz de 203 mm No. 140 que se encuentre unido a una mala o tamiz No. 230. Ponga la cubierta y el recibidor. Sacuda los tamices con la mano durante 5 minutos a 120 movimientos por minuto. Separe los tamices y elimine e! material que se haya pegado en la parte de abajo del tamiz 230 y elimine antes de vaciar el tamiz, Seque el material retenido en el tamiz No, 230 por aproximadamente 2 horas (cantidad maxima de 20 g) y vuelva a sacudir durante 5 minutos, como se describié anteriormente. Separe los tamices y elimine el material que se haya pegado a la parte de abajo del tamiz No, 230 antes de vaciarlo. Utilice las fracciones del tamiz No. 230 de la segunda sacudida y mézclelas uniformemente en las siguientes proporciones: estiércol de vaca 66%, tierra de jardin 28% y carbon 6%. Combine las dos fracciones de arriba "140" de cada uno de los materiales y sacuda nuevamente como se hizo anteriormente, con la excepcién de utilizar un tamiz No, 120 conectado sobre el No. 140, Reagite la fraccién nueva "140", relenga la fraccién “140° de la segunda agitada. (Seque antes de cada agitada y elimine el material acumulado en la parte baja del tamiz No. 140 antes de Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche “ PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NWX-F-700-COFOCALEC-2012 vaciarlo). Mezcle el estiérool, la tierra y el carbon en las proporciones mencionadas anteriormente. Coloque 1,8 g de la mezcla de la fraccién "230" y 0,2 g de la mezcla de la fraccion “440” en un matraz volumétrico de 100 mL. Repetir los mismos pasos que se describen en A.2.3.1, empezando en ... *humedezca completamente con 4 a 6 mL de solucin Aerosol OT al 1%..." excepto que se utliza agua en lugar de la solucién al 50% de sacarosa (sucrosa) para diluir una alicuota de 10 mL. a 1 L. En donde se describe en A.2.3.1 que “Mientras agita, saque con la pipeta volimenes definidos...", proceda de la siguiente manera: Determine la capacidad del embudo del equipo de fitrado (véase A.2.2.3.1), al vaciar agua destilada en el equipo ensamblado con la salida de aire del frasco de filtrado cerrado. Incluya el agua destilada que se filtra como parte de la capacidad del embudo. Mientras agita, transfiera alicuotas de la suspensién de materia extrafia hacia los vasos de precipitado. Agregue agua destilada para hacer un volumen total de 20 a 50 mL menor que la capacidad del embudo, utiizando el volumen total de entre 60 a 400 mL. Con la salida dél aire del mattaz de ifiltacion cefrada para evitar la filtracion, mezcle la alicuota diluida y vaciela al equipo (véase A.2.2.3.1), provisto con un disco estandar humedoy (véase A.2.2.2.) (Use alcohol o agente humidificador cuando sea necesatio para mojar el disco). Aniada 20 a 50 mL de agua al vaso de precipitado y enjuague girando el vaso. Vacie en el embudo, manteniendo el lablo del vaso tocando la superficie de agua en lo posible. (El agua de enjuague debe casi llenar el embudo si la capacidad. es de < 450 mL). Abra la salida de aire del matraz. Después de qué él aglia‘ha sido filtada a través de la almohadilla, aplique vacio y aspire el disco por espacio de 1 minuto. Remueva la almohadilla y déjela secar en una caja cubierta, Si la materia extrafia no se encuentra uniformemente distribuida, elimine la almohadilla. Después de algo de practica, aproximadamente el 75% de las almohadillas preparadas deben ser aceptables. No se requiere conservador. Las almohadillas pueden ser cubiertas con cemento plastico diluido y utilizadas como se describe en A.2.3.1. A.2.3.2.2 Estandar de 10,2 mm de didmetro, Mientras agita, transferir con la pipeta 100 mL de la suspensién fina diluida descrita anteriormente en un contenedor apropiado y diluir a 800 mL con agua destilada. Cada mL contiene 0,025 mg de sedimento y cuando se filtra a través de un area de 0,40 de didmetro es equivalente a un filtrado de 0,2 mg a través de un Area de 28,6 de diametro. Prepare varios esténdares filtrando alicuotas adecuadas a través de los discos en el equipo (véase A.2.2.3.2), Diluya cada alicuota a 50 a 60 mL y filtre con una succion minima, Enjuague el vaso con un volumen pequefio de agua destilada y vierta al embudo. Con mucho culdado enjuague los lados del embudo con un volumen pequefio de agua destilada. Utllice la succién minima necesaria para remover el exceso de agua del disco. Designar el diémetro de 10,2 mm como "_mg equivalente" y utilice en la calificacién 473 mL de la muestra 15 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NIMX-F-700-COFOCALEC-2012 mezclada para discos de prueba de la misma manera en que son utilizados los estindares de 28,6 mm de didmetro. A.2.3.3 Esténdares en fotografia. Pueden ser utilizados como una guia en la calificacién de las almohadillas de materia extraiia, sin embargo es preferible usar discos reales como los preparados segun se describid en A2.3.1 y A232. (véanse puntos) En cada caso se deben utilizar los estandares que mas se acerquen al disco que esta siendo calificado. No utllice fotografias que se han deteriorado, manchado o dafiado. A.2.3.4 Verificacién de los analizadores de materia extrafia. Para verificar los aditamentos para evaluacién de materia extrafia es necesario llevar a cabo las siguientes actividades: Mida el volumen real de leche entregado para asegurarse que los 473 mL son retirados y pasados a través del disco, Transfiera 10 mL de la soluci6n al 2% de la suspensién de sedimento en sacarosa (véase A.2.2.4), utilizando una pipeta graduada de punta amplia a un bote de leche con 37,8 L de agua destilada limpia filtrada, Después de agitar la mezcla bien, remueva 473 mL con un medida que asegure dicho volumen y filtrelos a través de un disco de sedimentos con un area diémetro de 28,6 mm (véase ‘A.2.2.2), ensamblado en un embudo apropiado de tamafio correcto (por ejemplo véase A.2.2.3.1), Después de una agitacién adecuada del contenido de la cantara de leche, de nuevo remueva una muestra de 478 mL con el aditamento de prueba de sedimentos y paselo a través del disco exactamente de ia misma forma en que se evalia la leche. Repita esta operacién con el analizador varias veces para determinar si los discos obtenidos de esta manera proporcionan la misma materia extrafia que el disco obtenido a través de la filracion por el embudo (véase A2.2.3.1). A.2.3.5 Obtencién de la muestra A.2.3.5.1 Método de muestra de prueba mezclada. Para cantaras de leche, de 20 a 40 L, y tanques de almacenamiento, utilizar muestras de 473 mL 6 3,78 L. Antes de mezclar la leche, transfiera con un colador pequefio cualquier materia extrafia flotante, tal como moscas, pelo, pedazos grandes de restos, etc., al disco instalado (véase A.2.3.6.1), 0 instale un disco separado adecuadamente identificado. Mezcle adecuadamente la leche en la cantara antes de tomar la muestra para prueba, Evite contaminar la muestra con materia extrafia que vaya en los agitadores 0 por cualquier otro medio. Para contenedores de comercializadores tome 473 mL del contenedor mezclado o el numero suficiente de muestras para lograr un volumen de 3,78 L. Lleve a cabo las actividades de acuerdo con lo descrito en A.2.3.6.4 A.2.3.5.2 Método del fondo. Para céntaras de leche de 20 a 40 L tome muestras de 473 mL mediante cualquiera de los probadores de fondo de cantaras de leche sin agitar. Antes de sacar la muestra, remueva con un colador pequerto cualquier materia extrafa flotante como en el punto anterior. Tome una muestra a < 6,4 mm z 16 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC,NMX-F-700-COFOCALEC.2012 del fondo de una cantara de leche sin agitar introduciendo el aditamento para muestrear y, durante el movimiento hacia arriba del embolo, mover la cabeza del instrumento cruzando una vez el didmetro del fondo de la céntara o alrededor de la circunferencia si el bote tiene un centro elevado, Expulse la leche con la pistola en la cantara y después con un golpe corto remueva el exceso de fluido de la almohadilla. Proceder como se describe en A.2.3.6.2. A.2.3.6 Determinacién A.2.3.6.1 Muestras mezcladas. Pase las muestras de prueba a través del disco apropiadamente ajustado (véase A.2.2.2) sostenido en la posicién correcta el analizador. Caliente 473 mL de leche a una temperatura de 32 a 38 °C y fillre a través del area restringida del diametro. de 10,2 mm (véase A.2.2.1.1). Si se utiliza una unidad sencilla del analizador del fondo con cabeza especial, caliente una muestra mayor de 473 mL a una temperatura de 32 a 38 °C y retire 473 mL con el analizador mientras agita o retire 473 ml hacia el analizador y caliente la leche sosteniendo el analizador bajo el chorro de agua caliente antes de,descaiganla leche en el disco. Caliente 3,78 L de la,muestra a/una temperatura de 26 a 32° Co fillre en frio.a través del area del disco.con didmetto de 28,6 mm (véase A.2.2.2). Sila leche es filtrada a temperatura de'32 °C, enjuague el disco,con 236 mL de agua destilada caliente libre de sedimentos antes de removerlo del probador. Si la leche va a ser recuperada no dillit con agua. (La leche varia en su velocidad de flujo a través de los discos; la leche pasteurizada puede ser més diffc de fltrar que la leche cruda Otros factores que pueden influir en, Ia. velocidad de flujo son. la temperatura, contenido de grasa, grado de agrupamiento de los glébulos de grasa, la etapa de lactacién, presencia de leche de vacas con mastitis y cantidad de sedimentos en la muestra). Quitar el disco del analizador y colocarlo en papel de tamatio especial o almacenar en sobres individuales transparentes y encerados. (Si el disco es colocado en papel o en sobre cuando todavia se encuentra hiimedo, el secado de la leche puede actuar como adhesivo). Califique por comparacién con discos estindar (véase A.2.3.1 y A2.3.2), indicar en el reporte si la almohadilla fue calificada himeda o seca, (El cardcter de la materia extrafia puede ser determinada a través del examen microsoépico). Para prevenir la descomposicién durante el almacenamiento, e! disco puede ser rociado con una solucién de formaldehido 0 una solucién alcohdlica de mentol ~ timol como se describe en 2.3.1 No utilice pegamento para fijar el disco al papel; si el disco se desprende, humedezca con pocas gotas de agua y vuélvalo a fijar. Protéjalos de la contaminaci6n. 2.3.6.2 Muestras del fondo. Remueva disco del analizador (véase A.2.3.5.2) y proceda como lo indica el punto anterior, parrafo tercero, empezando “...colocarlo en papel de tamafio especial..." 7 Organismo Nacional de Normalizaci6n del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NMX-F-700-COFOGALEC-2012 ‘A.2.4 CALCULOS Y EXPRESION DE RESULTADOS: Califique el disco de la muestra, eliminando la materia burda (moscas completas, pelos, trozos grandes de estiétcol o lodo, etc.), contra el disco estandar mas cercano y reporte la cantidad de materia extrafia de la muestra como "mas de ____ mg" o “menos de ___ mg’, incluyendo en el informe, si es el caso, de la presencia de materia burda. A.3. Conteo de células somaticas (Método de referencia) A.3.1 OBJETIVO Y ALCANCE Establecer el método de prueba microscépico (método de referencia) para el conteo de células somaticas en leche cruda y leche conservada por medios quimicos, EI método es aplicable para el conteo de células somaticas en la leche de vaca, siempre que los requisitos antes mencionados se cumplan Este método es adecuado para la preparacién de muestras patron de prueba y la determinacion de los valores del método de referencia requeridos para la calibraci6n del método mecdnico y automatizado de enumeracién de células somiaticas. ADVERTENCIA- El uso de éste método de prueba implica el manejo de materiales peligrosos, ‘operaciones y equipos, El alcance de este procedimiento no aborda todos los problemas asociados con su utlizacion, Es responsabilidad del usuario del método establecer las medidas de seguridad ‘adecuadas, y determinar la aplicacion de restricciones reglamentarias antes de su utlizacin. 3.2 DeFINICIONES Para los fines de este método de prueba aplica la siguiente definicion: A324 Células somaticas, son células con niicleo (leucocitos y células epiteliales), que se utiizan como un indicador del estado de salud de la ubre, de acuerdo con el procedimiento descrito en este método de prueba A.3.3 FUNDAMENTO A partir de un volumen determinado de muestra se prepara un frotis, para tefir las células somaticas y poder contarlas usando un microscopio. A.3.4 REACTIVOS Y MATERIALES Los reactivos deben ser grado analitico a menos que se especifique algtin otro requerimiento y por agua se entiende agua destilada o desionizada o agua de pureza equivalente, st ' 18 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C.NMX--700-COFOCALEC-2012 3.4.1 Disoluciones colorantes ADVERTENCIA.- El tetracloroetano es venenoso. El bromuro de etidio es mutagenico, Atiencla las medidas de seguridad vigentes para su manejo, uso y disposicién. La preparacién y aplicacién de la disolucién colorante debe llevarse a cabo en una campana de extraccién de ‘humos, utlizendo equipos de proteccién. 3.4.1.1 Disolucién colorante modificada Newman-Lampert (Modificacién Levowitz - Weber) A3.4.4.4.1 Componentes Etanol 95% 540 mL Tetracloroetano: 40,0 mL. 7 ‘Azul de metileno: 069 Acido acético, glacial 6,0 mL ‘Alterativamente puede usarse xileno en la misma cantidad de volumen que la descrita para el tetracloroetano. A3.4.1.1.2 Prepafacion Mezclar el etanol y ¢l tetracloroetano en un frasco con tapa. Calentar la mezcla en tun bafio Maria a 65 °C, agregar ¢! azul de metileno en una campana de extraccion de humos y mezclar culdadosamente. Enfriar la mezciaa 4 °C. Agregar el acido acético glacial y mezclar de nuevo cuidadosamente. Fillrar la disolucién, colocarla en un, frasco adecuado con,tapa,de cciere hermético y ‘almacenarla en dichas condiciones. NOTA - El colorante de Newman Lampert puede dejarse madurar antes de su uso, por 8 dias ‘eproximadamente, para una mejor observacion de las células, Antes de usar la disolucién de tincion Newman Lampert filtrarla de nuevo. A3.4.1.2 Disolucién colorante de bromuro de etidio A.3.4.1.2.1 Disolucion patrén colorante. A.3.4.1.2.1.4 Composicion Bromuro de etidio 0.259 ‘Agua desmineralizada | 100 A.3.4.1.2.2 Preparacion La preparacién de la disolucién debe realizarse en una campana de extraccién de humos. i 19 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C.NWX-F-700-COFOCALEC-2012 Disolver el bromuro de etidio en agua desmineralizada previamente calentada a 40 °C. Enfriar la disolucién a temperatura ambiente. Ajustar a 100 mL con agua desmineralizada. La disolucién patrén colorante de bromuro de etidio se puede mantener durante dos meses maximo cuando se almacena en la oscuridad a 2 °C +/- 2 °C. 3.4.1.3 Disolucién amortiguadora. A3.4.1.3.1 Composicién Fialato Scido de polasio [0,519 Hidrbxido de potasio 0,162 ‘Agua desmineraizada | 100 A3.4.1.3.2 Preparacién Disolver por separado el ftalato Acido de potasio y el hidr6xido de potasio en agua desmineralizada, La disolucién amortiguadora se conservara durante dos meses maximo cuando se almacena en la oscuridad a 2 °C +/- 2 °C. A3.4.1.4 Disolucién colorante de trabajo de bromuro de etidio. A3.4.1.4.1 Composicion Disolucién patrén colorante de bromuro de etidio | 2 mL Disolucién amortiguadora. ‘emi. Triton X100 ‘Of mb ‘Aqua desmineralizada 90 mL “Temperaturas elevadas pueden reducir la capacidad de fincién del bromuro de etidio. A.3.4.1.4.2 Preparacion Sucesivamente afiadir en el agua desmineralizada la disolucién colorante patron de bromuro de etidio, la disolucién amortiguadora y el Triton X-100 y mezclar cuidadosamente. Preparar la disolucién colorante de trabajo de bromuro de etidio inmediatamente antes de su uso. A.3.4.1.5 Disolucion amortiguadora de fosfato (PBS) A.3.4.1.5.1 Composicion " 20 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NMK-F-700-COFOCALEC-2012 NaCl 89 KCI 02g NagHPO,7H20 4,159 KH.PO. 029 ‘Agua desmineralizada 4000 A3.4.1.5.2 Preparacion Disolver las sales en agua desmineralizada, Ajustar a 1000 ml. con el agua desmineralizada restante. Ajuste el pH a 7,2 +/-0,1 NOTA - También es posible ullizar una disolucién amortiguadora de fosfato comorcialmente disponible con un pH = 7,2 A.3.5 APARATOS Y EQUIPOS ‘Material habitual de laboratorio y, en particular, los siguientes: A3.5.1 Bafio Maria, capaz de mantener una temperatura de 40 °C +2 °C, 50°C #2°Cy 65°C 42°C. 3.5.2 Filtro, resistente a los solventes utllizados, con un tamafio de poro de 10 w ata. 3.5.3 Microscopio, con ampliacién de 500x a 1000x, pueden ser utilizados objetivos de inmersién en aceite. 3.5.4 Cuando se utiliza el bromuro de etidio, se requiere de microscopio de fluorescencia. A3.5.5 Microjeringa, 0 micropipeta calibrada o verificada, para la distribucién de un volumen fijo de 0,01 mL de leche, con un maximo de tolerancia de un 2%, A.3.5.6 Micrémetro calibrado: 3.5.7 Portaobjetos, previamente marcado con un contomo de forma rectangular © circular. Con una superficie de 1 cm* + 5 % (95 mm* 6 105 mm’) o un portaobjeto estandar con una plantila de dimensiones de 20 mm x § mm o con un diametro de 11,28 mm. 3.5.7.4 Seleccién del portaobjeto Trabajar preferentemente con un area fija previamente marcada o una plantila, a fin de evitar un nuevo calculo del factor de trabajo en cada conteo. a Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.MX F-700-COFOCALEC-2012 A3.5.7.2 Formas Para obtener una forma rectangular, el ancho interno superior e inferior y la altura derecha e izquierda, no deben diferir en mas de 0,2 mm. Para obtener una forma circular, el diametro interno vertical y horizontal no debe diferir en mas de 0,2 mm A.3.6 MUESTREO. Debe enviarse al laboratorio una muestra representativa. La muestra no debe dafiarse o alterarse durante el transporte o el almacenamiento. EI muesireo no es parte de este procedimiento. La NMX-F-718-COFOCALEC- 2006 describe los requisitos y recomendaciones para el muestreo (Ver punto 2. Referencias de esta Norma Mexicana). A.3.7 PREPARACION DE LA MUESTRA PARA ENSAYO 3.7.1 Almacenamiento Conservar las muestras de ensayo almacendndolas a una temperatura de 4 °C + 2 “Ci Analizar las muestras de ensayo dentro de 6 horas después del muestreo. En caso de requeritse un almacenamiento prolongado, afiadir conservadores quimicos como el acido bérico, bronopol o dicromato de potasio. La concentracién del acido bérico no excedera 0,6 g por cada 100 ml de muestra para ensayo. La concentracién final de bronopol no deberd exceder de 0,05 g por cada 100 ml de prueba muestra. La concentracién final de dicromato de potasio no debe de exceder de 0,1 g por cada 100 mL de muestra para ensayos. Conservar la muestra a una temperatura de 2°C a 4 °C por un tiempo no mayor a 6 dias. Por razones ambientales, se recomienda restringir el uso del dicromato de potasio solamente para muestras que requieren una larga vida tt A.3.7.2 Preparacién Calentar la muestra de ensayo en un bafio Maria mantenido a 40 °C y mezclarla cuidadosamente para su homogeneizacién. Enfriar la muestra a la temperatura a la que la microjeringa o micropipeta ha sido calibrada o verificada, por ejemplo, a 20°C. Diluir las muestras de ensayo con una cuenta estimada de células sométicas por encima de 1 000 000 células/mL, con una solucion amortiguadora de fosfato, para obtener una cuenta aproximada de células somaticas de 500 000 células/mL para cada muestra diluida, 2 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL O TOTAL : DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C,NMWX-F-700-COFOGALEC-2012 ¥, ¥e<% En donde: d, es el factor de dilucién para obtener un andlisis adecuado de células ‘somaticas en la toma de muestra de alrededor de 500 000 células/mL. Vs, es el volumen de la muestra en mL. Vb, es el volumen del amortiguador utilizado para diluir la muestra en mL, Registrar el factor de dilucién necesario d, el volumen de la muestra Vs y el volumen del amortiguador Vb utilizado para obtener la dilucién requerida, A.3.8 PROCEDIMIENTO Preparar por lo menos dos frotis por cada muestra y considerar el mejor para la enumeracién (por ejemplo el frotis no datfatio por el proceso de tincién). Sumergir los portaobjetos en etanol (95% viv) por unos segundos. Sacarlos del recipiente, flamear y dejar enfriar. \ A.3.8.1 Preparacién del frotis y tinclén. Para la preparacién del frotis y la tincién, siga cualquiera de los procedimientos deseritos en A.3.8.1.1 6enA.3.8.1.2. NOTA - La tincién de la leche de cabra se describe en el Apéndice Informativo B. 3.8.1.1 Preparacién del frotis y tincién con disolucién colorante Newman - Lampert. Tomar con la microjeringa 0 micropipeta 0,01 mL de la muestra (eventualmente diluida), Enjuagar la microjeringa o micropipeta con la muestra de ensayo. Limpiar cuidadosamente con papel absorbente la parte exterior de la miorojeringa micropipeta que ha estado en contacto con la muestra. Colocar la muestra en un portaobjetos limpio con una superficie de 1 om?. Con la punta extender la muestra de manera uniforme sobre toda el area definida, garantizando al mismo tiempo que la zona cercana al perimetro esté cubierta uniformemente. Dejar el frotis a temperatura ambiente hasta que esté completamente seco. Empapar el portaobjetos con el frotis seco con la disolucién colorante modificada de Newman-Lampert, por lo menos durante 15 minutos. Secar el frotis a temperatura ambiente. 23 Organismo Nacional de Normalizaci6n del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NWIX-E-700-COFOCALEG-2012 Mojar suavemente el frotis con agua de Ia lave hasta que todo el colorante excedente se elimine con el lavado. Secar de nuevo y almacenar protegido del polvo. A.3.8.1.2 Tincién con disolucién colorante de bromuro de etidio y preparacién del frotis, Mezclar 1 mL de la muestra preparada con 1 ml de solucién colorante de trabajo de bromuro de etidio en un tubo de ensayo. Mantener la muestra protegida de la luz. Calentar el tubo en un bafio de agua a 50 °C por 3 min. Enfriar a temperatura ambiente. Con la microjeringa o micropipeta tomar 0,01 mL de la mezcla. Enjuagar la mictojeringa © micropipeta con la mezcla. Limpiar cuidadosamente con papel absorbente Ia parte exterior de la microjeringa 0 mioropipeta que ha estado en contacto con la mezcla. Colocar la muestra en un portaobjetos con una superficie de 1.cm®. Con la punta, distribuir la mezcla uniformemente sobre toda el area definida, asegurando al mismo tiempo que la zona cercana al perlmetro esté cubierta uniformemente. Mantener el frotis a temperatura ambiente hasta que esté completamente seco. 3.8.2 Determinacién 3.8.2.1 Optimizacién de la lectura. Con el microscopio contar los nticleos de las células en el frotis, Elegir la ampliacion (de 500x a 1000x) que mejor permita tener un niéimero promedio maximo de 20 células en cada campo. Las células poseen un nicleo teftido. Las células generalmente son de 8 yo mas grandes. No contar las células menores de 4 ul (véase figura 1). Contar fragmentos solo si mas del 50% del material nuclear es visible. Contar grupos de células solo si la(s) unidad(es) nuclear(es) esta claramente separada, Véase también figuras 2 y3. COrganismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche ** PROHI 1A SU REPRODUCCION PARCIAL O TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.PMN 40-14 ym 20% do la mastitis ‘aguca 180% crbnica. La relacén onto ‘toplasmalndcleo es pequefa, Fagootois Primera linea de dofonsa conta la ‘masiis. FIGURA 1 - Ejemplos de células NMX-F-700-COFOCALEC-2012 Linfoctos 540 jm La releci6n ontre ‘toplasmainicieo es pequets. Nuctoos inlensamnents tefidos. T auiliares y 3 de cbluas B Longitudes de oélules: Lt = 9,79 um y L2= 2,7 um Célula epitelial 10-14 pm Nocleo redondb. CRopiasma debimente tefido FIGURA 2 - Ejemplos de células de leche de vaca a granel (aumento 1 000x) 25 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A. NNMX-F-700-COFOCALEC-2012 (aumento 500%) (Aumento 1000x) Longitudes de clues: L22 = 9,08 pm; L23 = 8,27 pr; L24 = 4.95 ym; L25 = 7.99 um: 28 = 637 um and L27 = 3,68 pm. FIGURA 3 - Ejemplos de células de leche de vaca a granel NOTA - El entrenamiento y Ia habilidad del analista es el principal factor crtico de éxito para la correcta ejecucién del método. La frecuente ejecucién del método y la participacién en | ‘ensayos Interlaboratorio son esenciales para garantizar un nivel adecuado de contar. Generalmente, las células en la leche se distribuyen segun una distribucién de | Poisson (véase Apéndice Informativo C). El numero minimo (N) de células que deben ser contadas en relacién con el nivel de recuento de células, para llegar a los coeficientes de variacién enumerados, se indican en la tabla 3 (véase tabla). Para una correcta ejecucién del método, es esencial que se cuente el numero minimo de células. Los campos y las lineas a contar se elegiran de forma que se ‘obtenga un recuento representativo de todo el frotis.. 26 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C.NMX-F-700-COFOGALEC-2012 TABLA 3 - Numero minimo de células cxtooo. causa.) ue Ncélulas < 160 40 100 150 a 250 7 200 250 a 400 6 300 > 400 5 400 A3.8.2.2 Contar en campos sucesivos. Contar los nticleos en campos sucesivos, en lineas verticales de campos espaciados regularmente (véase figura 4 y tabla 3). a).- Comenzar en la:@istancia, dL, desde el lado izquierdo. En forma circular, empezar desde una distancia suficiente, dL, desde el lado izquierdo del diametro horizontal, a fin de poder contar con un minimo de § campos en la parte superior de la linea. Una distancia, dL, de 0,8 mm es adecuada tanto para las formas rectangulares como para las circulares. »)~ Colocar el borde superior o inferior de la circunferencia del campo tangencial en el interior de los limites superior o inferior de la plantila (este Ultimo no debe aparecor on el campo). En el caso de una superficie al descubierto cerca del borde de la plantilla, ajustar el campo al borde del frotis. c). Después de haber contado el primer campo, mover el objetivo a una distancia de espacio fijo, dH, abajo o arriba de la siguiente graduacién en la direccién del borde inferior o superior y contar en el nuevo campo. Una distancia, dH, de 1mm se considera adecuada. d).=A partir del ultimo campo contado, repetir el procedimiento descrito en el inciso c), hasta que el lado opuesto (parte inferior 0 superior) de la linea se alcance Elegir entre las siguientes dos opciones. = Opcién 1 El Ultimo campo no debe ser contado. = Opcién 2. Si el borde inferior 0 superior aparece y ocupa menos de fa mitad de la superficie del campo, el conteo se realiza después de subir el objetivo hasta que el borde desaparece por completo del campo y solo cubre el frotis. 2 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC. > |NIX F-700-COFOCALEC-2012 e).- A continuacion, desplazar el objetivo hacia la derecha a una distancia, dw (por ejemplo dw = 1,5 mm o dw = 2 mm dependiendo del numero de campos necesarios), y comenzar una nueva linea en la direccién opuesta (parte superior o inferior. {).= Repetir el procedimiento desde el inciso b) al inciso e) hasta que se llegue al lado derecho de la plantilla, g).- En caso que se cuente un niimero insuficiente de campos (véase tabla 3), se pueden contar campos adicionales. Para ello, enfocar el objetivo del microscopio en otros lugares (por ejemplo, cambiando el punto de partida y/o adecuando paso a paso las distancias por recorrer) a fin de obtener un niimero adecuado de ‘campos que sean representativos de todo el frotis. h)- Calcular el resultado como se describe en el A3.9.1 para una forma rectangular, o en A.3.9.3 para una forma circular. NOTA. Para formas rectangulares, son posibles 5 campos seperados a 1 mm en lineas verticales y 10 lineas espaciadas a2 mm, por lo que es posible contar 60 campos. Se obliene aproximadamente el mismo némero de campos para formas circulares, utiizando las rmismas distancias. Las distancias de los desplazamientos (espacios) se miden con el vvernier desde la misma ubicacién de los campos (ajuste en el borde superior o inferior) para que incluya el didmetro del campo. 3.8.2.3 Contar lineas en forma rectangular Conteo de niicleos espaciados regularmente en lineas verticales (véase figura 5 y Tabla 3). a). Partir de una distancia, dL, desde el lado Izquierdo. Una distancia, dL, de 0,5 mm se considera adecuada. b)- Comenzar a contar desde el borde superior o inferior del area rectangular. Colocar el borde del area en el centro del campo del microscopic. Después de haber contado todas las células, mover el objetivo en direcci6n opuesta del borde y contar todas la células que aparecen en esta banda hasta que el borde opuesto se alcance. Registrar el ntimero de células contadas, ©). A continuacién, desplazar el objetivo hacia la derecha con una distancia, dw, y empezar a contar tna nueva banda (por ejemplo, dw = 3 mm a 4 mm, en funcién del numero de bandas necesarias para una cuenta representativa de todo el frotis) Repetir los incisos b) yc) hasta que el lado derecho de la plantilla se alcance. En el caso de que se cuente un numero insuficiente de bandas (véase tabla 3), se pueden contar bandas adicionales. En este caso el objetivo del micrascopio se centra en otfos lugares (por ejemplo cambiando el punto de partida y/o , 28 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC,NMX-F-700-COFOCALEC-2012 adecuando cw). A fin de obtener las bandas apropiadas que sean representativas de todo el frotis. Caloular el resultado como se describe en A.3.9.2. 4:08 Hn Clave ‘hacia abajo hasta el borde inferior FIGURA 4 - Lineas verticales en campos espaciados regularmente de forma circular o rectangular ‘Cemplamortar bandas quando see neces FIGURA 5 - Bandas verticales espaciadas regularmente 29 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NMX--700-COFOCALED-2012 A.3.9 Célloulo y expresi6n de resultados A.3.9.1 Contando campos sucesivos en forma rectangular Utiizando las graduaciones y el vernier de! microscopio, verificar que los valores objetivo para la longitud Ls, y el ancho, Ws, del frotis fue de 20,0 y 5,0 mm. Calcular la concentracién total, c, de células utilizando la siguiente ecuacién: © con el factor constante de trabajo, Fw Y, f= rs its nx{ BY 2% En donde: c, es laconcentracién total, expresada en un niimero de células por millitro. Ws, eselancho, en milimetros, del frotis, Ls, es la longitud, en milimetros, del frotis. Nt, es el ntimero total de células contadas. Df, esel diametro, en milimetros, del campo del microscopio. Nf, es el ntimero de campos de un recuento completo. Vm, es el volumen, en mililtros, de la muestra tefiida (véase A.3.8.1.1 6 A.3.8.1.2) [Sie utiliz6 la disolucién colorante modificada de Newman - Lampert para la - 4 30 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIOA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NMX-F-700-COFOCALEC-2012 tincién (véase A.3.8.1.1), Vm = 0,01 mL, Si se utilizé la disolucién colorante de bromuro de etidio para la tinoién (véase A.3.8.1.2), Vm = 0,005 mL]. d, es el factor de dilucién utilizado en A.3.7.2 (sino se requirié de diluci6n, d = 1; con dilucién 1:1, d= 0,5). = 3.1416 A.3.9.2 Contando bandas en forma rectangular Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio, verificar que los valores objetivo para la longitud y el ancho del frotis fue de 20,0 y 5,0 mm. Caloular la concentracién total, ¢, de células utilizando la siguiente ecuacién: c= —S hx Dix Npelm En Donde: Nb, es el niimero de bandas contadas por completo Los otros simbolos fueron definidos en A.3.9.1 A.3.9.3 Contando campos sucesivos en forma circular Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio verificar que el diametro del frotis fue de 11,28 mm. ; 7 at Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NMX-F-700-COFOGALEC-2012 a Calcular la concentracién total, ¢, de células utilizando la siguiente ecuacién: Con el factor constante de trabajo, fw. 1 De q fu pe De Vm / En donde: oO Dz, es el diametro, en milimetros, del frots, im Los otros simbolos fueron definidos en A.3.9.1 a A3.9.4 Expresién de resultados. a Expresar los resultados de la prueba en nimeros enteros de miles (por ejemplo 401 586 células/mL expresarlo como 402 000 células/mL). } Si se preparan dos frotis por muestra y en los dos se considera el nimero de u células, reportar el promedio de ambas lecturas. A3.10 Precision ; Los valores de repetiblidad y reproducibilidad se han derivado de los resultados } de un estudio interlaboratorios llevado a cabo de acuerdo con las normas aplicables para determinar la exactitud (veracidad y precisi6n) de resultados y Organismo Nacional de Normalizaci6n del Sistema Producto Leche u PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C. }NMX-F-700-COFOCAL métodos de medicién'. Los detalles de este estudio interlaboratorios se resumen en el Apéndice Informativo A. Los valores de esta prueba interlaboratorios pueden no ser aplicables a rangos de concentracién y matrices distintas de las indicadas. 3.10.1 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo tinico, que se obtiene ulilizando el mismo método, la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo analista, uflizando el mismo equipo, en un corto intervalo de tiempo, serd en no mas del 5% de los casos mayor que los valores dados en la tabla 4 (véase tabla). TABLA 4 - Valores de repetibilidad ‘Concentracién sr t (x 1000 célulasimL) |, (x 1000'¢élulas/mL) | (x 1000 células/mL) 248 i 38. 107 485 43 424 679) 69 192 791 110 308 3.10.2 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de prueba, que se obtiene utlizando el mismo método, misma muestra, en diferente laboratorio, con distinto analista y uliizando equipos diferentes, serd en no més del 5% de los casos mayor que los valores dados en la tabla 5 (véase tabla). ' 180 5725-1, Accuracy (trusness and precision) of measurement methods and resulls — Part 4: General principles and definitions, @ 1SO 5726-2, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2: Basic method for the determination of repeatabilly and reproducibility of a standard measurement method. 33 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche ‘PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.INUAX-F-700-COFOCALE 2012 TABLA 5 - Valores de reproducibilidad Concentracién sR R (1000 célulasimL) | (x 1000 cétulasimL) | (x 1000 célulasimL) 246 4a 114 455 62 174 679 78 218 794 110 308 A.3.11 Informe de prueba El informe de ensayo deberd especificar: a) Toda la informacién necesaria para la identificacién de la muestra; b) El método de muestreo utiizado, si se conoce; ©) El método de prueba, con referencia a esta Norma Mexicana; 4) Todos los detalles de andlis's no establecidos en esta Norma Mexicana, 0 considerados como opcionales, junto con detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el resultado de la prueba; e) El resultado de la prueba obtenido o, si la repeticién se ha comprobado, el resultado final obtenido. i ia 4 Organismo Nacional de Normalizaci6n del Sistema Producto Leche ‘PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL O TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, ACBIBLIOGRAFIA 4, CODEX STAN 206-1999. Norma General para el uso de Términos Lecheros, 2. Intemational Standard ISO 13366-1:2008|IDF 148: Enumeration of somatic cells - Part 1: Microscopic method (Reference method). CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES: Esta Norma Mexicana coincide basicamente con la Norma Internacional ISO 43366-1:2008 Milk — Enumeration of somatic cells ~ Part 1: Microscopic method (Reference method), en el punto 3 del Apéndice Normativo A y los Apéndices Informativos A, B y C. Difiere en el resto de su contenido por no existir Norma Internacional sobre el tema tratado, 35 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL 0 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC.NMXF-700-COFOCALED-2012 APENDICE INFORMATIVO A ~ Ensayo de colaboracién del conteo de células somaticas (Método de referencia) General Un estudio de colaboracién internacional para leche de vaca, que involucré dieciocho laboratorios y trece paises, se llevd a cabo en octubre de 2005. La prueba incluyé 8 muestras en cuatro niveles de célulasimL y se dividié en 16 duplicados ciegos. Los valores medios para cada nivel fueron respectivamente: - Nivel 4, muestras Ay B: 245 000 células/mL; = Nivel 2, muestras Cy D: 455 000 célulasimL; = Nivel 3, muestras Ey F: 679 000 células/mL; = Nivel 4, muestras G y H: 791 000 células/mL. La prueba fue organizada por A.ILA., Laboratorio Standard Latte, Maccarese-Roma (italia), quign también realizé el analisis estadistico de los datos de acuerdo con las normas aplicadas' para dar los datos de precision que se muestran en la tabla AA (véase tabla) TABLA A.1 - Resultados del ensayo interlaboratorios Nivel i 2 zi a Nimero de paricipantes despuds de la eliminacion de valores Mpioe 24 | 23 | 2 | 2 ‘Valor medio (x 1000 oélulasimL) 2a5_| 465 _[679_| 791 Desviacion estandar de repetibiidad, 5, 1000 célulasimt) a Coeficiente de variacion de la repetbilidad (%) wo | 9 | to | 14 sor_| 421 | 192 | 908 Limite de repetibiidad (2,8 S) (x 1000 células/mL) | Desviacion exléndar de reproducbiidad Sx a | 2 | 7 | 110 (1000 células/mL | Coeficiente de variacién de la reproducibilidad (34) v7 14 | 1 4 | Limi de eproducidd (28S) 1000 claw) au_| iva | oe | ooo | Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche 2 | RONDA SU REPRODUCCION PARCIAL 6 TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEG AC.NMX-F-700-COFOCALEC-2012 ApENDICE INFORMATIVO B= Tinci6n de leche de cabra para el conteo de células somaticas B.1 Disoluciones colorantes para leche de cabra B.1.1 Fijador de Carnoy B.1.1.1 Componentes Cloroformo 60 mL Acido acético glacial 20 mL Alcohol etlico 100% 420 mL. B.1.1.2 Preparacion Agregar sucesivamente el cloroformo y el Acido acético glacial en el alcohol ettlico y mezclar cuidadosamente. B.1.2 Disolucién colorante verde de metilo - pironina Y B.1.2.1 Componentes Pirohina Y. 10 9 Verde de metilo 0,569 Agua desmineralizada 196 mL B.1.2.2 Preparacion ‘Sucesivamente: adicionar, la, pironina,Y yy el verde de metilo en una botella con agua desmineralizada y mezclar con cuidado. Fitrar a través de un filtro adecuado (tamafio de poro de 10 ya 12 y) y guardar en un frasco ambar. Antes de usar filtrar nuevamente a través de un filtro adecuado. B.2 Preparacién del frotis, Preparar el frotis con el esquema de tincién siguiente: 1, Fijador Camoy, durante § minutos; 2. Etanol al 50%, durante 1 minuto; 3. Etanol al 30%, durante 1 minuto; 4, Agua, durante 1 minuto; 5. Disolucién colorante verde de metilo ~ pironina Y, durante 6 minutos; 6. Lavar brevemente con N-buttl alcohol y luego con xileno; 7. Almacenar el frotis protegido del polvo. 37 Organismo Nacional de Normalizacién del Sistema Producto Leche PRONIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, AC. NNMX-F-700-COFOCALEC:2012 ApENDICE INFORMATIVO C Distribucién de Poisson Generalmente, las células en la leche estan distribuidas de acuerdo a la distribucién de Poisson. La distribucién de Poisson presupone que: M=V=s donde M es el valor promedio; Ves la varianza; ses la desviacién estandar. El coeficiente de variacién, CV, es entonces: CV=_s_ x 100% M oon En donde: M, es el valor promedio el cual, en el caso de contar el niimero de células soraticas, es el ntimero de particulas (células) contadas. Organismo Nacional de Normalizacion del Sistema Producto Leche PROHIBIDA SU REPRODUCCION PARCIAL © TOTAL - DERECHOS RESERVADOS COFOCALEC, A.C,