INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA

PRACTICA DE LABORATORIO N° 2

ESTRUCTURA BACTERIANA Y COLORACIONES

OBJETIVOS

• Determinar la presencia y cantidad de bacterias así como su morfología y agrupación

características.
• Conocer las diferentes técnicas de coloración o tinción para la identificación de bacterias.

INTRODUCCIÓN

Las técnicas de observación microscópica pueden dividirse en: exámenes en fresco que son
preparaciones sin teñir y exámenes de preparaciones coloreadas, que pueden ser vitales para
microorganismos vivos y tinciones, para células muertas.

 Examen en fresco: esta técnica permite conocer algunas de las características de los
microorganismos como la morfología, el tamaño y el movimiento, etc.

Es una técnica fácil de realizar que consiste en depositar el material a estudiar entre un
portaobjetos y un cubre objetos (laminilla), para posteriormente observarlo con objetivo de mediano
poder (40X). Si el material a evaluar es sólido se debe emulsionar en una gota de agua destilada o
solución salina, si es líquido, se debe depositar directamente entre lámina y laminilla.
Si el producto va a permanecer mucho tiempo en el portaobjetos, es conveniente prevenir la
desecación mediante la aplicación de parafina en los bordes inferiores del cubreobjetos.

La desventaja del examen en fresco es que los microorganismos vivos son casi incoloros y no se
pueden visualizar fácilmente al microscopio óptico normal cuando se encuentran suspendidos en
agua, de ahí que se utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea
y de esta forma hacerlos visibles.

 Examen de preparaciones coloreadas: Las técnicas de coloración permiten la

observación morfológica con un mejor contraste que en el examen en fresco, así como la
observación de estructuras celulares.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos solubles en agua (generalmente en forma
de sales) que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Pueden dividirse en
dos grupos: ácidos y básicos. El colorante es ácido si la porción coloreada tiene carga negativa, es
decir, si tiene un anión coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras de la célula que
presenten la misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se denomina
básico si la porción coloreada es el catión, cargado positivamente y con afinidad por estructuras de
la célula con carga negativa, como es la superficie celular.
Las bacterias toman mejor los colorantes básicos, como son el cristal violeta, el azul de metileno y
la safranina. La eosina es un colorante de tipo ácido, así como la nigrosina.

Existen distintos tipos de tinción:

1
10, agosto de 2022 SEMESTRE I - 2022
 INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA

1. Tinción simple: Se utilizan para observar la morfología celular, el tamaño y el

agrupamiento bacteriano. Esta técnica utiliza sólo un colorante, que generalmente tiñe a
los microorganismos y se denomina coloración directa. Cualquier colorante es válido para
este tipo de tinción, aunque los más utilizados son: el Azul de metileno, el Cristal violeta y
la Fucsina

El método para realizar una tinción simple:

a. Hacer un frotis sobre un porta objetos y dejar secar.
b. Fijar al calor.
c. Cubrir la preparación con el colorante elegido, durante el tiempo especificado.
d. Lavar con agua, arrastrando todo el exceso de colorante
e. Secar al aire o al calor suave
f. Observar al microscopio con objetivo de 100x o alto poder.

Las bacterias se verán teñidas del mismo color que el colorante que se utilizó.

2. Tinción diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente 2 colorantes, los cuales

permiten detectar varios tipos de microorganismos basados en las diferencias de su
estructura y de su composición química. En Bacteriología las coloraciones diferenciales
más utilizadas son la coloraciones basadas en las propiedades de la pared celular
bacteriana, y dentro de este grupo sobresale la coloración de Gram, que es la más
importante en Microbiología, ya que diferencia a las bacterias en dos grandes grupos:
Gram positivas y Gram negativas.

COLORACIÓN DE GRAM

INTRODUCCIÓN

La coloración de Gram es una tinción diferencial usada para clasificar las bacterias de acuerdo a su
forma, tamaño morfología celular y afinidad tintorial de la pared celular. Es adicionalmente una
prueba empleada para el diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos y para la evaluación de la
calidad de especímenes clínicos. La coloración fue desarrollada por Christian Gram en 1884. La
modificación realizada por Hucker en 1921 es la actualmente usada ya que provee mayor
estabilidad a los reactivos y mejor diferenciación de los microorganismos. La modificación de
Kopeloff es útil para colorear anaerobios y para organismos que se tiñen débilmente Gram
negativos como Legionella spp, Campylobacter spp, Brucella spp y otros y se usa carbol fuscina o
fuscina básica como contraste.

2
10, agosto de 2022 SEMESTRE I - 2022
 INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA

PRINCIPIO

La célula bacteriana intacta se tiñe fácilmente con colorantes básicos como cristal violeta, azul de
metileno y fuscina básica pero tiñe pobremente con colorantes ácidos como la eosina. Debido a la
carencia de envoltura nuclear en las células procarióticas, el protoplasma bacteriano es ácido por
contener grandes cantidades de ácidos nucleícos presentando una marcada afinidad por los
colorantes básicos.
Las bacterias pueden ser coloreadas como Gram positivas o Gram negativas de acuerdo con las
diferencias en la composición de la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa
capa de peptidoglicano y una gran cantidad de ácidos teicoicos, ellas no son afectadas por la
decoloración con alcohol y retienen su coloración inicial. Las bacterias Gram negativas tienen una
sola capa de peptidoglicano unida a una bicapa compuesta por proteínas, fosfolípidos y
lipoproteínas la cual es disuelta y decolorada con el alcohol removiendo el complejo cristal violeta-
lugol y reemplazando el color con el colorante de contraste.

PROCEDIMIENTO

El frotis debe ser lo suficientemente grueso de tal manera que cada campo microscópico contenga
algunos elementos morfológicos identificables, pero no tan grueso que las células queden
superpuestas. Se deja que el frotis se seque al aire y luego debe fijarse con calentamiento lento
(una o dos pases por la llama sin que la placa se caliente demasiado), también puede colocarse
sobre una plancha eléctrica o con 0.5 ml de metanol sobre la preparación hasta que se evapore,
una vez fijada se procede a colorear de la siguiente forma:

 Cubrir la preparación con solución de cristal violeta 1min

 Lavar con agua corriente
 agregar la solución de lugol por 1min
 Lavar con agua corriente
 Decolorar con alcohol acetona por 30 seg
 Lavar con agua corriente
 Agregar la solución de safranina por 1min
 Lavar con agua corriente
 Dejar secar
 Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100X)

Figura 1. PASOS PARA REALIZAR LA COLORACIÓN DE GRAM

3
10, agosto de 2022 SEMESTRE I - 2022
 INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA

PREGUNTAS

1) ¿Todas las bacterias se colorean con la coloración de Gram? mencione algunos ejemplos.

Con el método de tinción de gram se pueden identificar todas las bacterias incluso otros
organismos cómo hongos.

Ejemplosde estás:

Streptococcus aglactiae
Streptococcus faecalis

Streptococcus sanguis

Clostridium perfringes

2) ¿De qué manera las diferencias entre las paredes celulares Gram negativas y Gram positivas
influencian las posibilidades de detección por el laboratorio?

Las Gram positivas responden al pigmento y aparecerán al microscopio en color morado; mientras
que las Gram negativas resisten la tinción y lo harán de color rojo o rosado.

Fuente: https://www.ejemplos.co/20-ejemplos-de-bacterias-gram-positivas-y-gram-negativas/
#ixzz7cS0PkbyE

Esta diferencia se debe a sus envolturas celulares las cuales son distintas, las gram positivas al
tener una gruesa las hace retener mejor el tinte aplicado mientras que las negativas poseen una
doble membrana de lípidos muy fina que no permite un fácil paso de tinte.

3. Escriba que Estructura Morfológica observa.

Figura 4. Morfologías celulares

4
10, agosto de 2022 SEMESTRE I - 2022
 INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA

1- Estafilococos
2- Estreptococo
3- Terraza
4- Estreptobacilo

4. Investiga (5) bacterias Gram positivas y cinco (5) bacterias Gram negativas.

 Gram(+)
 Streptococcus.aglactiae
 Staphylococcus aureus
 Bacillus antracis
 Clostridium tetani
 Clostridium botullinum

 Gram (-):
 Neisseria meningitidis
 Neisseria gonorrhoeae
 Escherichia coli
 Haemophilus influenzae
 Francisella tularensis

5. Consulta en la resolución 2115 de 2007, los parámetros microbiológicos que debe tener
agua de consumo humano entubada

5
10, agosto de 2022 SEMESTRE I - 2022
 INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA

Estudiantes Grupo (V- A)

1. Luis Carlos Rentería mena

2.
3.

6
10, agosto de 2022 SEMESTRE I - 2022