FISIOLOGÍA VEGETAL APLICADA

Tema 5. Introducción a los cultivos celulares vegetales. Metodología general

Tema 6. Cultivos in vitro de tejidos vegetales.
Tema 7. Aplicaciones actuales del cultivo de células y tejidos vegetales

ANGELES BERNAL PITA DA VEIGA

bernal@udc.es
Organización de la docencia
• Docencia expositiva
• Clases los martes a las 9,00h / jueves a las 10,00h
• Clases invertidas
• Cuestionarios de autoevaluación campus virtual
Introducción a los cultivos
vegetales in vitro
Tema 2. La célula vegetal. Características
generales de las células vegetales. Orgánulos
característicos: pared, cloroplastos y vacuola.
Plasmodesmos.
 Tejidos

Protoplastos: célula vegetal sin pared

Habilidades de las plantas
• Totipotencia
• Potencial o capacidad inherente a las células de las plantas de desarrollarse como un
individuo completo sí se dan los estímulos adecuados

• Diferenciación
• Formación de células, tejidos y órganos con estructuras y funciones
especializadas y que acompaña al crecimiento
 Célula individual
Totipotencia
(zigoto)

Embrión zigótico
Diferenciación

Plántula

Planta

Dediferenciación Callo Suspensión celular Célula individual

(somática)

Rediferenciación Embriones somáticos

Regeneración de raíces y vástagos

Regeneración

Plantas regeneradas

Secuencia de dediferenciación y diferenciación en cultivos de tejidos vegetales

 Célula individual
Totipotencia
(zigoto)

Embrión zigótico
Diferenciación

Plántula

Planta

Dediferenciación Callo Suspensión celular Célula individual

(somática)

Rediferenciación Embriones somáticos

Regeneración de raíces y vástagos

Regeneración

Plantas regeneradas

Secuencia de dediferenciación y diferenciación en cultivos de tejidos vegetales

¿Qué es la micropropagación?
• El arte y la ciencia de multiplicar plantas in vitro
• Cultivo de protoplastos, células, tejidos y órganos
• El factor común es su crecimiento libre de microorganismos
en un ambiente aséptico como puede ser un medio nutritivo
esterilizado

Protoplastos células tejidos y órganos

Habilidades de las plantas
• Totipotencia
• Potencial o capacidad inherente a las células de las plantas de desarrollarse como un
individuo completo sí se dan los estímulos adecuados

• Diferenciación
• Formación de células, tejidos y órganos con estructuras y funciones
especializadas y que acompaña al crecimiento

• Dediferenciación
• Capacidad de las células maduras de retornar a la condición meristemática y
desarrollarse desde un nuevo punto, seguido de la rediferenciación que es la
habilidad para reorganizarse en nuevos órganos
 Célula individual
Totipotencia
(zigoto)

Embrión zigótico
Diferenciación

Plántula

Planta

Dediferenciación Callo Suspensión celular Célula individual

(somática)

Rediferenciación Embriones somáticos

Regeneración de raíces y vástagos

Regeneración

Plantas regeneradas

Secuencia de dediferenciación y diferenciación en cultivos de tejidos vegetales

 Suspensiones
Callos
Totipotencia Célula individual
(zigoto) celulares

Embrión zigótico
Diferenciación

Plántula

Planta

Dediferenciación Callo Suspensión celular Célula individual

(somática)

Rediferenciación Embriones somáticos

Regeneración de raíces y vástagos

Regeneración

Plantas regeneradas
Características del cultivo in vitro
• Microescala
• Optimización de las condiciones ambientales
• No se produce el patrón normal de desarrollo de una
planta
• Hace factible la manipulación de las células individuales
o tejidos. Fundamental para transformación genética
Ventajas del cultivo in vitro de plantas
• Uniformidad y reproducibilidad
• Obtención de un producto “superior”
• Mayor control sanitario
• Aplicable a un amplio espectro de especies
• Mejor planificación durante el año
• Conservar genotipos superiores que determinan características genéticas favorables (resistencia a
plagas y/o enfermedades, crecimiento, producción, calidad de frutos, tolerancia a condiciones
extremas de humedad o sequía, etc). Estas características se pueden “perder” por el cruzamiento
genético en la propagación sexual.
• Obtener plantaciones uniformes o la producción de un determinado número de individuos con
identidad genética

Técnicas de Propagación vegetativas: In vivo e In vitro

 Antecedentes históricos de los cultivos “in vitro”
PIONEROS EN ESPAÑA
• Dr. Ernesto Vieitez y la Dra. Adelina
Vázquez
• Tesis Doctoral en 1963
• 3 trabajos en revistas nacionales
• 1º en completar su formación en el
extranjero
• Su 1º trabajo coincide con la
publicación de Murashige and Skoog Facultad de Farmacia 1960
• Revista más importante en España en
ese momento
LOS PREDECESORES – LOS AÑOS 70
• Dos escuelas
• Dr. White en USA 1934 publica cultivo indefinido de
raíz de tomate
• Dr. Gautheret en Francia 1939 publica el cultivo
indefinido de callos de zanahoria

• Ambos utilizan el cultivo in vitro como

HERRAMIENTA
• Metodología para resolver problemas reales
• Herramienta para el estudio de la histodiferenciación
celular
Equipamiento
• Fuentes de contaminación:
• Explanto
• Recipientes
• Medio
• Ambiente
• Instrumentos utilizados
 Cabinas estériles o habitaciones para la
transferencia aséptica:

• Ideal una habitación separada aséptica.

• Orden, limpieza y con el material necesario.
• Tipos de recipientes de cultivo:
 Recipientes de plástico o cristal con distintas formas y
tamaños, por ejemplo:
- Placas petri.
- Viales.
- Matraces.
- Contenedores de plástico con tapas.
Cabinas estériles o habitaciones para la
transferencia aséptica:

• Para técnicas de asepsia uso de Cámaras de Flujo

Laminar:
- Algunas con lámparas UV.

• Alternativa: Habitación de inoculación:

- Menos eficiente.
Cabinas de flujo laminar
• Es un recinto que emplea un ventilador para forzar el
paso de aire a través de un filtro y proporcionar aire
limpio a la zona de trabajo libre de partículas de hasta
0.1 micras.
Cabinas de flujo laminar
• Las cabinas de este tipo existen tanto en
configuración vertical como en horizontal, según que
la posición del filtro esté en la parte superior o en la
parte trasera de la zona de trabajo sin embargo el
flujo de aire siempre va hacia el operador por lo cual
estos equipos ofrecen protección únicamente a la
muestra que se maneja en su interior, pero nunca al
operador
Cámara de flujo laminar
• Las cabinas de flujo laminar pueden tener una lámpara de rayos
ultravioleta con acción germicida para esterilizar el recinto y su
contenido, cuando no se utiliza.
• Es importante apagar la lámpara durante la utilización de la cabina, ya
que rápidamente se producirían quemaduras de sol en
la piel expuesta, y también puede causar cataratas oculares
• Autoclavado del medio y de la cristalería:
- Necesario para eliminar las potenciales fuentes
de contaminación.
- Esterilización por vapor en el autoclave.
- Proceso rápido y efectivo.
- No se debe colocar el autoclave en la
habitación de cultivo.
- Existen distintos tipos de autoclave con igual
fundamento de funcionamiento.

• Métodos para conocer el éxito del autoclavado:

- Los más modernos tienen sensores.
- Cintas para el autoclave.
- Tubos de esterilización.
Temperatura y requerimientos lumínicos para el
crecimiento:

• Principal requerimiento para mantenimiento y crecimiento:

temperatura constante ~ 25ºC
• Pequeña escala: incubador microbiológico con luz
• Gran escala: habitación de cultivo con:
- Termostato.
- Estantes.
- Fluorescentes.
• Tiempo luz- oscuridad controlado.
• Cultivos en suspensión: agitadores.
Componentes de los medios de cultivo
 AGUA

Nutrientes minerales

Luz

CO 2
Composición del Medio:

• Los grupos de componentes mayoritarios son:

- Macronutrientes (mM)
- Micronutrientes (uM)
- Hierro en forma quelada.
- Vitaminas
Funcionan como coenzimas
- Fuentes de carbono (no realizan fotosíntesis).
- Nitrógeno orgánico.
- Reguladores del crecimiento.
- Agar.
• A veces es necesario añadirles otros componentes
nutritivos.
Auxin is an indispensable hormone

Regulator of cell length,

morphogen, developmental
trigger, transcriptional
regulator.....

© 2013 American Society of Plant Biologists

Auxin action in whole-plant processes
Auxin in Promote lateral organ
Responses to pathogens
initiation at the shoot
action! apical meristem Inhibit
branching in
Light responses the shoot
Cell elongation Integrate growth
signaling pathways
Control patterning
and vascular
development
Maintain stem- Promote
cell fate at the branching
Integrate growth root apical in the root
signaling pathways meristem Response to nutrient
Responses to symbionts – distribution and
nodule formation abundance
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Wolters, H., and Jürgens, G. (2009). Survival of the flexible:
Hormonal growth control and adaptation in plant development. Nat. Rev. Genet. 10: 305–317. Copyright 2009.

© 2013 American Society of Plant Biologists

Cytokinins contribute to developmental
patterning and meristem functions
CK promotes
cell division and
stem cell fate at
the shoot apical
meristem

CK inhibits root
meristem size
and cell division
and promotes
cell differentiation
at the root apical
meristem

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Wolters, H., and Jürgens, G. (2009). Survival of the flexible:
Hormonal growth control and adaptation in plant development. Nat. Rev. Genet. 10: 305–317. Copyright 2009.
Cytokinin and auxin regulate organogenesis in
tissue culture

+ CK

+ auxin + auxin
and CK

Tobacco leaf discs are placed

into sterile culture dishes on
medium containing various TIME
hormones

Images courtesy of Richard Amasino.