Estabilidad real de una formulacin parenteral liofilizada de estreptoquinasa recombinante a temperatura ambiente

@ Ernesto Urrutia, Diana R Orta, Natacha Prez, Daisy Barbera, Maribel Vega, Luciano Hernndez
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa. Ave 31 e/ 158 y 190, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba. AP 6162, CP 10600. Telf. (53-7) 271 6022; Fax: (53-7) 33 8008; E-mail: ernesto.urrutia@cigb.edu.cu RESUMEN Se estudi la estabilidad de la estreptoquinasa recombinante liofilizada, bajo condiciones normales de almacenamiento y a temperaturas entre 25 y 30 C. Estas temperaturas representaron una ventaja importante en el almacenamiento y transportacin del producto al no necesitarse cadena de fro. Se estudiaron tres lotes del producto liofilizado en un perodo de 50 meses. El anlisis de las especificaciones de calidad establecidas para el producto se realiz en tiempo real; algunas de ellas fueron: actividad biolgica, contenido de pirgenos, caractersticas organolpticas del producto liofilizado y reconstituido, pH y humedad. Para el anlisis de los datos se utiliz el mtodo de Snedecor y Cochran para combinar los resultados de potencia obtenidos en los diferentes lotes y la prueba de F de Fisher con un lmite de confianza para = 0,25. Los resultados demostraron que el producto es estable al menos por 50 meses, almacenado entre 25 y 30 C. Palabras claves: estreptoquinasa recombinante, estabilidad
Biotecnologa Aplicada 2002;19:34-36

ABSTRACT Real-time Stability Study of Parenteral Freeze-dried Recombinant Streptokinase Stored at Room Temperature. The stability of freeze-dried recombinant streptokinase was studied under normal conditions of storage at temperatures between 25 and 30 C. These temperatures represented an important advantage in the storage and transportation of the product upon not needing chain of cold. Three batches of freeze-dried product were studied in a period of 50 months. The analysis of quality specifications for this product was carried out in real time, some of them were: biological activity, pyrogen content, organoleptic characteristics of freeze-dried and reconstituted product, pH and humidity. For the analysis of the data we used the method of Snedecor and Cochran in order to combine the results of biological activity obtained in the batches, and the F test of Fisher with a confidence limit of = 0.25. The results demonstrated that recombinant streptokinase is stable at least for 50 months, stored between 25 and 30 C. Keywords: recombinant streptokinase, stability

Introduccin
Los estudios de estabilidad tienen como objetivo determinar cmo vara la calidad de un producto en el tiempo bajo la influencia de diferentes factores ambientales y que pueden afectar las especificaciones de calidad de la sustancia tales como su actividad, propiedades organolpticas, fsico-qumicas y microbiolgicas [1]. La estabilidad de una sustancia puede ser evaluada a travs de un estudio acelerado exagerando las condiciones de almacenamiento de modo que se incremente la velocidad fsica o qumica de degradacin o por un estudio en tiempo real en las condiciones establecidas para su almacenamiento [2]. Los anlisis que se realizan tienen como objetivo obtener informacin que permita proponer un tiempo de vida til para un producto medicinal y recomendar sus condiciones de almacenamiento. El diseo para la estabilidad de un producto liofilizado debe incluir al menos tres lotes diferentes del producto de modo que pueda luego existir un nivel aceptable de confianza para el perodo que se propone [3]. La inestabilidad inherente a las protenas frecuentemente limita la preparacin de formulaciones en soluciones acuosas; sin embargo, si el agua es eliminada durante un proceso de liofilizacin la protena debe ser tericamente ms resistente a daos durante su almacenamiento an cuando se trate de temperaturas ms elevadas [4, 5]. Diferentes sustancias han sido empleadas como estabilizadores de las preparaciones proteicas, entre stas las ms utilizadas son la albmina de suero humano y los azcares [6, 7]. La estreptoquinasa recombinante es una molcula proteica obtenida por tcnicas de ingeniera gentica a partir del clonaje de un gen que codifica para la estreptoquinasa aislado del Streptococcus equisimilis y expresado en Escherichia coli [8]. Esta protena es capaz de convertir el plasmingeno humano y de varias especies de mamferos a plasmina [9]. La estreptoquinasa posee una eficacia demostrada en el tratamiento del infarto agudo de miocardio, la trombosis venosa profunda y en otros trastornos trombticos [10, 11]. Esta protena se produce en forma liofilizada, lo cual es una ventaja para su almacenamiento y conservacin. El objetivo de este trabajo fue estudiar la estabilidad del producto final de estreptoquinasa recombinante en tiempo real, almacenado a temperaturas entre 25 y 30 C, para demostrar la capacidad de este producto de conservar sus especificaciones, asegurando su identidad, potencia, pureza y seguridad.
1. Commission of the European Communities. The rules governing medicinal products in the European Community. Volume III. Guidelines on the quality, safety and efficacy of medicinal products for human use. Revised and completed edition January, 1989. 2. Center for Drugs and Biologics, Department of Health and Human Services. Guideline for submitting documentation for the stability of human drugs and biologics. Meryland, USA: The Center; 1992. 3. ICH Expert Working Group on Quality of Biotechnology Testing of New Drug Substances and Products. Quality of biotechnological products: stability testing of biotechnological/biological products (Q5C). London, England: The ICH Expert Working Group; 1995. 4. Chang BS, Beauvais RM, Aichun D, Carpenter JF. Physical factors affecting the storage stability of freeze-dried interleukin-1 receptor antagonist: glass transition and protein conformation. Archives of Biochemistry and Biophysics 1996;331 (2):249-58. 5. Jerne NK, Perry WL The stability of biological standards. Bulletin of the World Health Organization 1956;14:167-82. 6. Bruce Roser. Trehalose drying: a novel replacement for freeze-drying. BioPharm 1991;47-53.

Materiales y Mtodos
Producto Formulacin parenteral liofilizada de estreptoquinasa recombinante (SKr), producida por el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB) de La Habana, Cuba [12].

@ Autor de correspondencia

Ernesto Urrutia y cols.

Estabilidad de la SKr a temperatura ambiente

Lotes Se incluyeron en el estudio tres lotes del producto liofilizado: 4004, 4005 y 4006, de 500 000 unidades internacionales por bulbo (UI/b), fabricados en Febrero de 1994 y aprobados por la Subdireccin de Calidad del CIGB por cumplir las especificaciones de calidad establecidas para dicho producto. Condiciones de almacenamiento Las muestras estudiadas fueron almacenadas en un local de trabajo con temperatura controlada entre 25 y 30 C, la que fue una ventaja importante en el almacenamiento y transportacin del producto al no necesitarse cadena de fro. Cronograma de muestreo El tiempo de anlisis de los lotes fue de 50 meses. Los muestreos se realizaron a los 0, 7, 12, 25, 38 y 50 meses. Pruebas realizadas al producto Se analizaron de acuerdo al cronograma todas las especificaciones de calidad establecidas para el producto final de estreptoquinasa: actividad biolgica [13], lmite de aceptacin: entre 90 y 111 % que para la dosificacin de 500 000 UI/b se corresponde con un rango entre 450 000 y 550 000; esterilidad [14], lmite de aceptacin: pasa la prueba; pirgenos [15], lmite de aceptacin: pasa la prueba; inocuidad [16], lmite de aceptacin: pasa la prueba; caractersticas organolpticas del producto liofilizado (COL) y reconstituido (COR) [17], lmite de aceptacin: pasa la prueba; pH [18], lmite de aceptacin: entre 6,8 y 7,8 y humedad [19], lmite de aceptacin: 4%). Todos los anlisis se realizaron en los laboratorios de Control de la Calidad del CIGB, siguiendo los mismos procedimientos utilizados en el control de calidad de los lotes de estreptoquinasa recombinante y por el mismo personal. Todas las tcnicas analticas empleadas estn validadas segn lo referido en las Farmacopeas. Se realiz un estudio en tiempo real en las condiciones establecidas para su almacenamiento. Anlisis estadstico Se utiliz el mtodo propuesto por Snedecor y Cochran [20] para combinar los resultados de potencia obtenidos en los diferentes lotes analizados y obtener la curva de degradacin comn. Este es uno de los mtodos ms recomendados para determinar el perodo de vencimiento de un producto [21]. Para esto se evalu la homogeneidad de las pendientes y los interceptos mediante una prueba F de Fisher y se calcul el lmite de confianza para = 0,25.

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Resultados y Discusin
En la Tabla se muestran los resultados de las especificaciones evaluadas para los tres lotes estudiados al tiempo inicial y su posterior variacin en el tiempo. Las caractersticas que demuestran la seguridad del producto (esterilidad, pirgenos e inocuidad) se cumplen en las determinaciones realizadas y para los tres lotes evaluados. Las caractersticas fsico-qumicas del producto liofilizado fueron medidas a travs del pH y la humedad. Estos indicadores se mantienen dentro de las especificaciones establecidas, los cua-

les son aspectos que favorecen la invariabilidad de la potencia de la preparacin. Las caractersticas organolpticas fueron evaluadas para el producto liofilizado y para el producto reconstituido en agua para inyeccin, con el objetivo de determinar si sus caractersticas de color, transparencia y ausencia de partculas se mantienen con respecto a las especificaciones establecidas. Los resultados obtenidos demostraron que en las condiciones de este estudio, estas caractersticas se mantienen durante todo el tiempo de prueba, corroborando que el almacenamiento de esta formulacin en el envase y temperatura propuesto garantizan su conservacin. La potencia constituye el parmetro de mayor importancia en este tipo de estudio, porque refleja de forma directa las afectaciones de la preparacin en las condiciones estudiadas y en el perodo de almacenamiento propuesto. En la Tabla tambin se observa que los tres lotes estudiados tuvieron un comportamiento similar, todas las determinaciones realizadas se encuentran dentro del rango de aceptacin del mtodo de lisis de cogulo. En el anlisis estadstico realizado, el requisito de igualdad de las pendientes se cumple para una probabilidad de 0,25; sin embargo, no se cumple para la igualdad de los interceptos con esa probabilidad. Por esta razn se procede a hacer las estimaciones con la pendiente comn y el menor intercepto y del cual se obtenga el menor resultado para el tiempo que se estima que ocurrir una prdida del 10%. El grfico obtenido con estos datos se muestra en la Figura donde se observa que el comportamiento de la potencia durante todo el perodo de estudio se encuentra dentro de los lmites establecidos y aunque se observa

7. OMS: Serie de Informes Tcnicos 1990; (800) Anexo 4:201-5. 8. Estrada MP Hernndez L, Prez A, , Rodrguez P Serrano R, Rubiera R, et al. , High level expression of streptokinase in Escherichia coli. Biotechnology 1992;10: 1138-42. 9. Vitaly NN. On the plasminogen-activating function of streptokinase (minireview). Int J Biochem 1992;24(1):47-53. 10. Hernndez L, Rodrguez P Serrano R, , Muoz E, Estrada MP de la Fuente J, et al. , Recombinant streptokinase for the treatment of thrombotic disorders. Annals New York Academy of Sciences1992;667:424-7. 11. Dsir C. Coronary thrombolysis: streptokinase or recombinant tissue-type plasminogen activator? (review). Annals of Internal Medicine 1990;112(7):529-38. 12. Estrada MP Felipe A, Rubiera R, Doce R, , Hernndez L, Collazo P et al. Method for , the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant DNA and transformed microorganisms. USA Patent 5296366. 1994 Mar. 13. Farmacopea Britnica BP 98 Apndice XIV F, XIV O. 1998. 14. US Pharmacopeia National Formulary, USP 24, 2000:1818-22. 15. Farmacopea Britnica BP 98 A217, Apndice XIV E. 1998. 16. Farmacopea Britnica BP 98 A218, Apndice XIV F. 1998.

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Biotecnologa Aplicada 2002; Vol.19, Nos. 1 y 2

Ernesto Urrutia y cols.

Estabilidad de la SKr a temperatura ambiente

550 000 Actividad biolgica (UI) 500 000 450 000 400 000 350 000 300 000 0 10 20 30 40 50 60

ya que an al mayor tiempo estudiado los resultados obtenidos estn dentro de los lmites (Figura). El lmite de confianza para = 0,25 arroj una confiabilidad de 36 meses la cual coincide con el tiempo de vencimiento establecido para este producto.

Conclusiones
Los resultados de la actividad biolgica y las caractersticas fsico-qumicas y de seguridad de la estreptoquinasa recombinante obtenidos de este estudio permitieron concluir que el producto es estable al menos por 50 meses, almacenado entre 25 y 30 C, con la metodologa empleada en el estudio de estabilidad en tiempo real y las caractersticas estudiadas que avalan esta afirmacin. Adems, el lmite de confianza se obtuvo a los 36 meses que es el tiempo de vencimiento establecido para la estreptoquinasa recombinante.

17. Procedimiento patrn de operacin 4.09.140.98. Determinacin de las caractersticas organolpticas de un producto. Direccin de Calidad, Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa, 1998. 18. US Pharmacopeia National Formulary, USP 24, NF 19, 2000. 19. US Pharmacopeia, USP 23, 1995: 1840-43. 20. Snedecor GW, Cochran WR. Statistical methods. 6th ed. Iowa State: Iowa State University Press; 1967. 21. Sanford B. Pharmaceutical statistics: practical and clinical applications. 3rd ed. New York: Marcel Dekker; 1997.

Tiempo (meses)
Potencia Lmite de confianza

Figura. Curva de degradacin comn de los lotes estudiados.

una tendencia a la disminucin en el tiempo del valor de la potencia, no resulta significativa de acuerdo con la especificacin establecida para la estreptoquinasa,
Recibido en diciembre del 2001. Aprobado en febrero del 2002.

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