Reacciones de reconocimiento de Proteinas Las reacciones de coloracién para el reconocimiento de proteinas se basan principalmente en la identificacién de grupos estructurales de algunos de sus aminodcidos en particular (1). 1. Reaccién de la Ninhidrina La ninhidrina es especifica para aminodcidos y proteinas, para diferenciar entre carbohidratos y aminodcidos y proteinas. Reacciona con todos los a-aminodcidos contenidos en la proteina dando lugar a la formacién de un complejo color purpura cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, a excepcién de la prolina e hidroxi-prolina que dan lugar a complejos de color amarillo. Este complejo colorido (llamado pirpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, el cual es independiente de la coloracién original del aminodcido y/o proteina. Esta prueba es positiva tanto para proteinas como para aminodcidos. Por ejemplo, en aquelios casos donde la prueba de Biuret es negativa y positiva la de Ninhidrina, indica que no hay proteinas, pero si hay aminodcidos libres (2). ? 9 on mL ‘on t ( R 3 SS RCHO + | NH <—— yk Complejo Ny Figura 1. Reaccién de un aminodcido con la ninhidrina. Aplicacién: Esta prueba es cominmente usada en quimica forense para detectar huellas dactilares, debida a que en dichas huellas quedan restos de aminodcidos de proteinas que pueden reaccionar dando el color caracteristico (2); ademas de las pruebas cualitativas para la identificacién de proteinas en algunos productos naturales y procesados.Reaccién de Biuret Reactivo formado por una solucién de sulfato de cobre en medio alcalino, este reacciona con el enlace peptidico de las protefnas mediante la formacién de un complejo de coordinacién entre los iones Cu y los pares de electrones no compartidos del nitrégeno que forma parte de los enlaces peptidicos, lo que produce una coloracién rojo-violeta presentando un maximo de absorci6n a S40 fam (2-4) Complejo Figura 2. Reaccién de una proteina con el reactivo de Biuret. Aplicacién: EI método normalizado se usa normalmente para le cuantificacién de proteinas totales, 3. Reaccién de Millon Este reactivo esté formado por una mezcla de nitrito y nitrato mercurico disuelto en dcido nitrico. Esta reaccién se lleva a cabo con residuos fendlicos, es decir proteinas que contienen tirosina para la formacién de nitrotirosina. Las proteinas se precipitan por accién de los acidos inorgénicos fuertes del reactivo, dando un precipitado blanco que se vuelve gradualmente rojo al calentar por formacién de una sal mercirica (5)ENO. R- 0 why | PA oH \, N—on : nitrotirosina Proteina (resto | ag? de tirosina) 9 y ro O=N \ \ ‘Hg Complejo Figura 3. Formacién de! complejo (sal merctirica) a partir de una proteina con restos de tirosina. 4, Reaccién Xantoproteica Reactivo a base de dcido nitrico que sirve para la identificacion de proteinas con grupos aromaticos que son derivados del benceno como la fenilalanina, tirosina y triptéfano, mediante la formacién de compuestos nitrados amarillos. La intensidad del color amarillo se intensifica cuando la reaccién ocurre en una solucién bésica. Los aminodcidos tirosina y triptéfano contienen anillos, de benceno activados y se someten facilmente a ia nitracion, mientras que la fenilalanina no se somete facilmente la nitracién, debido a que el anillo no esté activado (2,4,6).. 2HNO; =— = NO," + H,0 + NO; aa wwe naneR wwe anne coor z NaOH + No.” ——» —> O,N ON OH OH -ONa Amarillo Naranja - AmarilloFigura 4. Formacién de productos nitrados a partir de aminoicidos con grupos aromiaticos (4), 5. Prueba de Nitroprusiato Es especifico para aminodcidos 0 proteinas que contienen azufre, -SH (cisteina y cistina) da un color rojo-pirpura llamado “prueba de Mérner”(7). 0 Na,[Fe(CN),NO].2H,0 HS OH =» Complejo de color rojo NH, Nitroprusiato Cisteina Figura S. Reacci6n del nitroprusiato con te cisteina. 6. Prueba de Sakaguchi Esta prueba es especifica para Arginina 0 proteinas que la contienen. Es positiva para el aminodcido que contiene el grupo guanidina en la Arginina. El grupo guanidina presente en el aminoacido reacciona con a-naftol e hipobromito alcalino para dar un complejo de color rojo (7,8). NH in Br NH a0 og r~ ° Bi ics cy Nu Noe 2NaOH \ / \, Figura 6. Reaccién del grupo guanidina con a-naftol 7. Prueba de aldehido ~ Hopkin-Cole La prueba de Hopkins-Cole es especifica para el tript6fano, el Unico aminodcido que contiene un grupo de indol. El anillo de indol reacciona con el dcido glioxilico en presencia de un dcido fuerte (4cido sulfurico) para formar un producto ciclico color violeta. El reactivo Hopkins-Cole solo reacciona con proteinas que contienen tript6fano. La solucién de protefna se hidroliza mediante el4cido sulftirico concentrado en la interfaz de la solucién. Una vez que el triptéfano esté libre, reacciona con el acido glioxilico para formar el producto de color violeta (en forma de anillo) (2,9). ° | \ H SO, NH gg att SER Compuesto color violeta HO! NH, ° Triptéfano Acido glioxilico Figura 7. Reaccién del grupo indol de triptéfano con un aldehido. Tabla resumen: Procedimiento Observacién —_ Aminoécidos/proteinas 1. Prueba de Ninhidrina : Todos los aminodcidos y Solucién de muestra (1 mil) + reactivo de Ninhidrina proteinas que contienen - (2:3 gotas). Observar el color en frioo de lo contrario, Se formaun NH, @ excepcién de la hervir en un bafio de agua por § min y enfriario color purpura prolina e hidroxiprolina. 2. Prueba de Biuret Todas las proteinas (no A.A.) Solucién de muestra (1 ml) + el reactivo de Biuret(1 Se formaun ya que necesita al menos 2 ml) (de preferencia calentarlo) color violeta _enlaces peptidicos. 3. Prueba de Millon Solucién de muestra (1mL)+ 1mLdel reactivo de —_-Formacién de Millon (HgS0, 0.5 ml +0.5 ml2M HNOs). Hervirenun un color rojoo —Tirosina y proteinas que la bafio de agua por 2 min y enfriarl. precipitado. _contienen. 4, Prueba de Xantoproteica Solucién de muestra (1 ml) + 1 mL del Aminoacidos y proteinas HNO,concentrado. Calentar en un bafio de agua por2 Formacién de que contienen grupos min y enfriario. Agregar gota a gota de NaOH un color aromaticos o derivados del concentrado hasta la aparicién de color. amarillo. benceno Cisteina y cistina (-SH) y 5. Prueba de Nitroprusiato (Mérer test) Solucin de Formacién detainee que la contienen. muestra (1 ml) de proteina/ aminodcido que contiene color rojo-Cisteina. Agregar 3 gotas de la solucién de nitroprusiato de sodio + 3-5 gotas de la solucién de amoniaco. 6. Prueba Sakaguchi Soluci6n de la muestra (1 ml) + 2-3 gotas del reactive de Sakaguchi (4 gotas de NaOH al 40 % + solucién etandlica de a-Naftol]. Agregar 1-2 gotas de agua de bromo (por seguridad, usar agua de cloro). 7. Prueba de Hopkin-Cole (prueba de aldehido) Solucién de muestras (1 ml) + 2-3 gotas de del reactive de Hopkin-Cole (2 gotas de Formalina diluida +4 gotas de sulfato de mercurio 10 %). Mezciar bien, ‘agregar 1-2 ml de H,SO, por un lado del tubo de ensayo. purpura Intenso Formacién de un color rojo. Aparicién de un anillo de color rojo 0 purpura ena interfase de las dos fases. Arginina (contiene el grupo guanidina) y proteinas que contienen restos de la misma.