REVISTA DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA, mayo de 2004, p. 2074-2079 vol. 42, No.

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0095-1137 / 04 / $ 08.00 + 0 DOI: 10.1128 / JCM.42.5.2074–2079.2004
Copyright © 2004, Sociedad Estadounidense de Microbiología. Reservados todos los derechos.

ENSAYO BASADO EN PCR PARA LA DIFERENCIACIÓN DE PSEUDOMONAS

AERUGINOSA DE OTRAS ESPECIES DE PSEUDOMONAS RECUPERADAS DE
PACIENTES CON FIBROSIS QUÍSTICA.
Theodore Spilker, 1 Tom Coenye, 2 Peter Vandamme, 2 y John J. LiPuma1 *
Departamento de Pediatría y Enfermedades Transmisibles, Facultad de Medicina de la Universidad de
Michigan, Ann Arbor, Michigan, 48109,1 y Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent, Gante, Bélgica2
Recibido el 1 de diciembre de 2003 / Devuelto para su modificación el 15 de enero de 2004 / Aceptado el 20
de enero de 2004.

Pseudomonas aeruginosa es el principal patógeno bacteriano oportunista en personas con

fibrosis quística (FQ); La infección pulmonar ocurre en aproximadamente el 80% de los pacientes
adultos con FQ. Gran parte del tratamiento de pacientes con FQ depende de la identificación
precisa de P. aeruginosa a partir del cultivo de esputo. Sin embargo, la identificación de esta
especie puede ser problemático debido a la marcada variabilidad fenotípica demostrada por los
aislados de esputo de FQ y la presencia de otras especies estrechamente relacionadas. Para
facilitar la identificación de especies, utilizamos ADN ribosómico 16S (ADNr) secuencia de datos
para diseñar ensayos de PCR destinados a proporcionar identificación a nivel de género o
especie. Ambas cosas los ensayos produjeron fragmentos de ADN del tamaño predicho.
Probamos 42 cepas de recolección de cultivos (incluidas 14 P. aeruginosa y 28 cepas que
representan otras 16 especies de Pseudomonas estrechamente relacionadas) y 43 cepas que
previamente identificado como perteneciente a 28 especies no pseudomonas también
recuperadas de pacientes con FQ esputo. Con base en estas 85 cepas, la especificidad y
sensibilidad de ambos ensayos fueron del 100%. Para evaluar más a fondo la utilidad de los
ensayos de PCR, probamos 66 aislados recientes de esputo de FQ. Los resultados indicaron que
preliminar las pruebas fenotípicas habían identificado erróneamente varios aislamientos. Se
determinó la secuencia del rDNA 16S para 38 aislamientos, y en todos los casos confirmó los
resultados de los ensayos de PCR. Por lo tanto, hemos diseñado dos ensayos de PCR: uno es
específico para el género Pseudomonas, mientras que el otro es específico para P. aeruginosa.
Ambos ensayos muestran 100% sensibilidad y especificidad.

Pseudomonas aeruginosa es la bacteria instancia a alrededor del 80% de los

más común
patógeno que causa infección del tracto
respiratorio en personas con fibrosis
quística (FQ). La infección ocurre
durante la niñez, afecta en última
pacientes adultos con FQ, y es asociado
con mayores tasas de morbilidad y
mortalidad (9,13). P. aeruginosa es
también un conocido oportunista y
nosocomial. Patógeno, cuya
identificación presenta típicamente
pequeño desafío. Sin embargo, la
identificación precisa de los aislados de
FQ puede ser difícil. Los aislados
derivados de CF a menudo demuestran
diversidad fenotípica debido a la pérdida
de producción de pigmento,
exopolisacárido producción (mucoidía) y
síntesis de lipopolisacárido rugoso (23).
Sistemas de prueba comerciales y otros
métodos de identificación basados en el
fenotipo pueden, por tanto, identificar
erróneamente
P. aeruginosa (15, 18, 28, 29, 31). La
identificación es a menudo
obstaculizado aún más por la presencia
de otros estrechamente relacionados
Bacilos gramnegativos no
fermentadores, incluidas otras
Pseudomonas especies (2, 6). El
potencial de identificación errónea de
este especies de cultivo de esputo
presentan un obstáculo para el paciente
con FQ manejo, particularmente con
respecto a la terapia antimicrobiana,
pronóstico del paciente y control de
infecciones. Los métodos de
identificación basados en genotipos
eluden el problema de fenotipo variable
para proporcionar especies más precisas
identificación. Sin embargo, la
complejidad taxonómica, incierta
filogenia, y la escasez de datos de
secuencia genómica de la
docenas de especies dentro del amplio
género Pseudomonas presentes un
obstáculo para los ensayos de
identificación genotípica.
Aprovechamos
de una reciente reevaluación completa
de la filogenia
afiliación de las pseudomonas basadas
en el ribosoma 16S Datos de la secuencia
de ADN (ADNr) (1) para identificar
género y especie secuencias de firma de
ADNr 16S específicas. Basado en estos
secuencias que diseñamos ensayos de
PCR simples, rápidos y precisos que
permiten la diferenciación de P.
aeruginosa de otras Especies de
Pseudomonas que también pueden
recuperarse de la FQ cultivos de esputo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas y condiciones de crecimiento
bacteriano. Cuarenta y dos cepas de
Pseudomonas fueron obtenido de la
colección de bacterias BCCM / LMG
(Laboratorium voor Microbiologie,
Universiteit Gent, Gante, Bélgica) o la
cultura tipo americana Colección
(Manassas, Va.). Esto incluyó 14 cepas
de P. aeruginosa y al menos una cepa de
cada una de las otras 16 especies de
Pseudomonas (Tabla 1; Fig. 1). Otros 43
en estudios previos se habían
identificado cepas pertenecientes a 28
cepas no pseudomonales.
especies (4–8, 21, 22, 24, 33). Este grupo
incluía 15 Burkholderia cepacia
complejo, 5 Pandoraea spp., 5 Ralstonia
spp., 5 Achromobacter xylosoxidans, 4
Stenotrophomonas maltophilia, 2 anteriormente. (22). En resumen, se
Acinetobacter spp. Y 2 Serratia
marcescens cepas y 1 cepa de cada una
de Herbaspirillum frisingense, Klebsiella
pneumoniae,
Morganella morganii, Moraxella
osloensis y Escherichia coli. 66
adicionales los aislamientos
(recuperados de 66 pacientes con FQ) se
seleccionaron de los aislamientos
referidos el Laboratorio y Repositorio de
Investigación Burkholderia cepacia
(BcRLR, Universidad de Michigan) para
su análisis. Este grupo estaba formado
por aislamientos que habían sido
referido al BcRLR identificado como P.
aeruginosa (n 14 aislamientos) o
otra especie de Pseudomonas (n 20).
También incluyó aislamientos que
habían sido no identificado (n 12) o
identificado por el laboratorio remitente
como no pseudomonal especies (n 20)
pero que fueron identificadas por el
BcRLR como Pseudomonas
especies mediante el uso del sistema
RapID NF Plus (Remel, Lenexa, Kans.).
Todas las bacterias se almacenaron a 80
° C. Las bacterias de las cepas congeladas
se cultivaron aeróbicamente a 34 ° C
durante 48 h en medio Mueller-Hinton
suplementado con Agarosa al 1,6%
(peso / volumen).
Preparación de ADN. El ADN se preparó
a partir de bacterias como se describió
suspendió una sola UFC en 20 l de
tampón de lisis que contenía Dodecil
sulfato de sodio al 0,25% (vol / vol) y
NaOH 0,05 N. Después de calentar
durante 15 mín. a 95 ° C, 180 l de H2O de
calidad para cromatografía líquida de
alta resolución Se añadió (Fisher) y la
suspensión de lisis se almacenó a 20 ° C.
Diseño de imprimación. Secuencias de
ADNr 16S relevantes disponibles en
GenBank La base de datos se alineó
utilizando el paquete de software
MegAlign (DNASTAR Inc., Madison,
Wisconsin). Estos incluyeron 136
secuencias de 42 descritas válidamente.
* Autor correspondiente. Dirección
postal: Universidad de Michigan,
Facultad de Medicina, 8323 MSRB III,
Box 0646, 1150 W. Medical Center, Dr.
Ann Arbor, MI 48109-0646. Teléfono:
(734) 936-9767. Fax: (734)764-4279.
Correo electrónico:jlipuma@umich.edu.
 IDENTIFICACIÓN POR PCR DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA
TABLA 1. RECOLECCIÓN DE CULTIVOS CEPAS DE PSEUDOMONAS UTILIZADAS EN ESTE ESTUDIO

ESPECIES CEPASa

P. aeruginosa ............................................... .............................. ATCC 10145, ATCC 14207, ATCC 19154,

ATCC 19429, ATCC 23993, ATCC 25006,
ATCC 25010, ATCC 25619, ATCC 27315,
ATCC 27316, ATCC 35032, ATCC 35422,
ATCC 35554, ATCC 9721
P. agarici ............................................... .................................... LMG 2112T
P. alcaligenes ............................................... .............................. LMG 1224T, LMG 6353
P. chlororaphis ............................................... ........................... LMG 5004T
P. flavescens ............................................... ............................... LMG 18387T
P. fluorescens ............................................... ............................. LMG 14564, LMG 1794T, LMG 5940
P. fulva ............................................... ....................................... LMG 11722T
P. fuscovaginae ............................................... .......................... LMG 2158T
P. mendocina ............................................... ............................. LMG 1223T, LMG 5941, LMG 6396
P. oleovorans ............................................... .............................. LMG 2229T
P. pertucinogena ............................................... ........................ LMG 1874T
P. pseudoalcaligenes ............................................... .................. LMG 1225, LMG 2854, LMG 5516
P. putida ............................................... ..................................... LMG 2257T, LMG 2259
P. resinovorans ............................................... ........................... LMG 2274T
P. stutzeri ............................................... .................................... ATCC 17588, LMG 11199T, LMG 1228,
LMG2232
P. syringae ............................................... .................................. LMG 1247T, LMG 12648
P. tolaasii ............................................... .................................... LMG 2342

aATCC, Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Va.; Colección de bacterias LMG, BCCM / LMG, Laboratorium voor
Microbiologie, Universiteit Gent, Gante, Bélgica.

Especies de Pseudomonas (1), así como varias otras -
Proteobacteria filogenéticamente relacionadas y
especies relevantes para CF. Sobre la base de esta
alineación, género putativo y se diseñaron cebadores
específicos de especies.
PCR. La amplificación del ADN objetivo se llevó a cabo
en volúmenes de reacción de 25 µl, cada uno contiene
MgCl2 2 mM, Trizma 50 mM (pH 8,3; Sigma, St. Louis,
Mo.), 250 µM (cada uno) de trifosfatos de
desoxinucleósido (Promega, Madison, Wis.), 0,4 µM
(cada uno) de cebador, 1 U de polimerasa Taq
(Invitrogen, Carlsbad, California) y 2 µl de lisado
bacteriano de células enteras y se ajusta a 25 µl
mediante la adición de H2O de grado de cromatografía
líquida de alto rendimiento. Se llevó a cabo la
amplificación
en un termocontrolador RapidCycler (Idaho Technology
Inc., Salt Lake City, Utah). Después de una
desnaturalización inicial durante 2 min a 95 ° C, se
completaron 25 ciclos, cada uno consta de 20 sa 94 ° C,
20 sa la temperatura de recocido apropiada (Tabla 2) y
40 sa 72 ° C. Una extensión final de 1 min a 72 ° C fue
aplicada. Con este programa, el tiempo total para la
amplificación del ADN diana fue aproximadamente 45
min.
Amplificación y determinación de secuencia de rDNA
16S. Para confirmar resultados de identificación
basados en PCR, realizamos una secuencia comparativa
de ADNr 16S análisis. Genes de ARNr 16S casi completos
(correspondientes a las posiciones 9 a 1500 en el
sistema de numeración de E. coli) se amplificaron
mediante PCR utilizando ADN de Pfu polimerasa
(Stratagene, La Jolla, California) con cebadores
conservados UFPL y URPL como se describió
anteriormente (22). El ADN amplificado se purificó con
QIA-quick Kit de purificación de PCR (Qiagen Inc.,
Valencia, Calif.) De acuerdo con el fabricante
instrucciones. La secuenciación del ADN se realizó con
Applied Biosystems Secuenciador ABI modelo 3700 y los
protocolos del fabricante (PE Applied Biosystems, Foster
City, California) utilizando el ciclo BigDye Terminator kit
de reacción listo para secuenciación. Las secuencias
resultantes se visualizaron como cromatogramas. y
editado manualmente con Chromas versión 2.22
(Technelysium Pty. Ltd., Helensvale, Australia). Las
secuencias editadas se ensamblaron usando EditSeq
(DNASTAR Inc.) e identificado mediante BLASTN y
comparación con secuencias actualmente disponible en
la base de datos NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/EXPLOSIÓN). Los aislamientos
se consideraron P. aeruginosa si sus secuencias de rDNA
16S mostró el mayor grado de similitud con las
secuencias de rDNA 16S de P. aeruginosa
cepas de referencia de la colección de cultivos.
Número de acceso a la secuencia de nucleótidos. Los
números de acceso de GenBank para las secuencias de
rDNA 16S generadas en este estudio son AY486350
hasta AY486387.

FIG.
1.
Árbol

filogenético generado mediante el uso de alineación basada en ClustalV para secuencias de rDNA 16S de Pseudomonas
seleccionadas y otras relacionadas con la FQespecies. P. resinovorans, P. aeruginosa, P. alcaligenes y P. oleovorans son especies
dentro del grupo de P. aeruginosa (1).VOL. 42, 2004 IDENTIFICACIÓN POR PCR DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA 2075
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TABLA 2. Conjuntos de cebadores basados en rDNA 16S

Cebador Secuencia (5’-3’) Objetivo Temp. De recocido (° C) Localizacióna Tamaño del
producto(pb)

PA-GS-F GACGGGTGAGTAATGCCTA Especies de Pseudomonas 54 95–113 618

PA-GS-R CACTGGTGTTCCTTCCTATA 693–712

PA-SS-F GGGGGATCTTCGGACCTCA P. aeruginosa 58 189–206 956

PA-SS-R TCCTTAGAGTGCCCACCCG 1124–1144
 RESULTADOS
Diseño de imprimación. Basado en la
alineación de secuencias de rDNA 16S
disponible en GenBank, se diseñaron
dos pares de cebadores. Cebador El par
PA-GS-F y PA-GS-R estaba destinado a
amplificar todas las especies de
Pseudomonas, mientras que el par PA-
SS-F y PA-SS-R fue diseñado para
amplificar solo P. aeruginosa (Tabla 2).
El último cebadores dirigidos a
secuencias de firmas específicas de
especies en 16S Regiones variables de
ADNr 2 y 8 (V2 y V8), respectivamente.
Sensibilidad y especificidad de los
ensayos de PCR. Ensayos de PCR que
emplean cada par de cebadores
produjo productos de ADN de la
predicción tamaños (Fig.2). La
sensibilidad y especificidad de lo
putativo Los ensayos de PCR
específicos de género y especie fueron
determinado mediante la prueba de la
colección de 42 cultivos de
Pseudomonas cepas (Tabla 1; Fig.1) y
las 43 identificadas previamente no
Cepas de Pseudomonas. Los resultados
se resumen en la Tabla 3; la
sensibilidad y especificidad de cada
ensayo de PCR fueron del 100%.
Evaluación adicional de los ensayos de
PCR. Como otra prueba de la utilidad
de los dos nuevos ensayos de PCR,
investigamos 66 muestras de esputo
cultivos aislados (recuperados de 66
pacientes con FQ) que habían sido
remitido al BcRLR para su análisis. Los
resultados se resumen en la Tabla 4. Se
identificaron catorce aislamientos en
este grupo por los laboratorios
referentes como P. aeruginosa. Trece
de estos también se identificaron como
P. aeruginosa mediante un ensayo de
PCR; ADNr 16S se realizó un análisis de
secuencia en seis de estos, lo que
confirmó todo como P. aeruginosa. El
aislado único que no era un la especie
de Pseudomonas por ensayo de PCR se
identificó como Burkholderia especies
mediante análisis de secuencia de
rDNA 16S. El laboratorio remitente
había identificado veinte aislamientos
como "Pseudomonas sp." (n=10), P.
alcaligenes (n=1), P. mendocina (n=2),
P. oleovorans (n=1), P. fluorescens
(n=3), P. putida (n=2) o P. stutzeri
(n=1). Diecisiete de estos fueron
identificados como P. aeruginosa por
ensayo de PCR; ADNr 16S el análisis de
secuencia de seis de estos confirmó
que eran P. aeruginosa. Un aislado se
identificó como no aeruginosa.
especies de pseudomonas por PCR y
confirmadas como P. synxantha por
Análisis de rDNA 16S. Los dos
aislamientos restantes no fueron
Pseudomonas sp. por PCR y fueron
identificados como Burkholderia sp. y
S. maltophilia mediante análisis de
secuencia de rDNA 16S. Los
laboratorios de referencia aislamientos como pseudomonas no
identificaron veinte aislamientos como aeruginosa especies y dos como
especies distintas de Pseudomonas sp. especies no Pseudomonas; ADNr 16S
Doce de estos fueron identificados El análisis de secuencia de estos cuatro
como P. aeruginosa por PCR; seis aislamientos confirmó la PCR.
fueron probados por 16S rDNA análisis resultados. En resumen, los nuevos
de secuencia y confirmado como P. ensayos de PCR específicos de especie
aeruginosa. Cinco de los Se y género indicó que varios de los 66
identificaron 20 aislamientos mediante aislados clínicos habían sido
el ensayo de PCR y el rDNA 16S análisis identificados erróneamente por los
como especies de pseudomonas no laboratorios remitentes. Treinta y ocho
aeruginosa. Tres aislamientos no (58%) de estos fueron examinados más
fueron Pseudomonas sp. por PCR y a fondo mediante análisis de secuencia
fueron identificados como de rDNA 16S, y en cada caso los
Herbaspirillum sp. por análisis de rDNA resultados fueron consistentes con la
16S. Los 12 restantes los aislamientos resultados de los ensayos de PCR. Por
no fueron identificados por los lo tanto, cuando se evalúa contra 16S
laboratorios remitentes. Ocho de estos Análisis de la secuencia de ADNr de
se identificaron como P. aeruginosa este conjunto de aislamientos, la
mediante un ensayo de PCR; cuatro sensibilidad y la especificidad de
fueron examinados por 16S rDNA y ambos ensayos de PCR fue
confirmados como P. aeruginosa Los nuevamente del 100%.
ensayos de PCR identificaron dos

FIG. 2. Análisis por PCR de P. aeruginosa, especies de Pseudomonas y bacterias relevantes para la FQ. (A) PCR usando cebadores PA
específicos del género Pseudomonas GS-F y PA GS-R. (B) PCR usando cebadores específicos de P. aeruginosa PA SS-F y PA SS-R. Carriles
M, marcadores de referencia; carril 1, P. aeruginosa; carriles 2 a 5, P. pertucinogena, P. stutzeri, P. putida y P. syringae,
respectivamente; carriles 6 a 9, géneros relevantes para la FQ (Burkholderia, Pandoraea, Ralstonia y Achromobacter,
respectivamente); carril 10, control negativo (agua).
 TABLA 3. Sensibilidad y especificidad de los ensayos de PCR

PCR usando un par Objetivo No. de PCR positivo / no. Probado Sensibilidad (%) Especificidad (%)
de cebadores Pseudomonas sp.a P. aeruginosab Otrac

PA GS-F y PA GS-R Especies de Pseudomonas 28/28 14/14 0/43 100 100

PA SS-F y PA SS-R P. aeruginosa 0/28 14/14 0/43 100 100

a
Recolección de cultivos Especies de Pseudomonas distintas de P. aeruginosa (detalladas en la Tabla 1).
b
Recolección de cultivos P. aeruginosa solamente (detallado en la Tabla 1).
c
Especies no Pseudomonas previamente identificadas recuperadas de esputo de FQ (incluye 15 complejo de B. cepacia, 5 Pandoraea sp., 5 Ralstonia sp., 5 A. xylosoxidans, 4
S. maltophilia, 2 cepas de Acinetobacter sp. Y 2 cepas de S. marcescens y 1 cepa de cada una de H. frisingense, K. pneumoniae, M. morganii, M. osloensis y E. coli).

DISCUSIÓN
Las personas con FQ son susceptibles a enfermedades crónicas del tracto respiratorio. infección por una serie
de patógenos bacterianos oportunistas, incluyendo P. aeruginosa, S. maltophilia, A. xylosoxidans y varias
especies del complejo Ralstonia, Pandoraea y B. cepacia (2, 20). Un trabajo reciente ha demostrado que los
pacientes con FQ también pueden infectarse con otros taxones inusuales o nuevos, como Acinetobacter sp.,
Bordetella sp., Moraxella sp., Comomonas sp., Chryseobacterium sp., Rhizobium sp., Herbaspirillum sp. Y
Inquilinus limosus (6). Identificación precisa de estos fenotípicamente especies similares de muestras
respiratorias es fundamental para el manejo del paciente. Esto es particularmente cierto con respecto a P.
aeruginosa. La infección sostenida por esta especie se considera típicamente como un indicador de mal
pronóstico en pacientes jóvenes con FQ (13, 19). Además, la evidencia reciente de propagación entre
pacientes de P. aeruginosa entre los pacientes con FQ (14) ha provocado cada vez más estrictas medidas de
control de infecciones en los centros de atención de la FQ; La eficacia de tales medidas se basa en primera
instancia en identificación precisa de especies. La diferenciación de P. aeruginosa de otras especies de
Pseudomonas también es fundamental para esfuerzos para comprender mejor la historia natural de P.
aeruginosa infección en la FQ y para desarrollar y evaluar nuevas terapias estrategias (por ejemplo, terapia
antimicrobiana agresiva dirigida a la erradicación de la infección pulmonar inicial) (19). De hecho, la entrada a
Los ensayos clínicos que evalúan nuevas terapias se basan en la precisión e identificación rápida de P.
aeruginosa y otras infecciones especies.
 TABLA 4. Análisis por PCR de aislados de esputo de FQ referidos a BcRLR
Laboratorio de referencia identificacióna Análisis de PCRb
P. aeruginosa Pseudomonas sp. (no aeruginosa) No Pseudomonas sp.

P. aeruginosa 13 (6c) 1 (1d)

Pseudomonas sp.(no aeruginosa) 17 (6c) e
1 (1 ) 2 (2f)
No Pseudomonas sp. 12 (6c) 5 (5g) 3 (3h)
Sin identificación 8 (4c) 2 (2i) 2 (2j)

a
Identificación proporcionada por el laboratorio de referencia.
b
Resultados obtenidos con ensayos de PCR utilizando cebadores específicos de especie PA SS-F y
PA SS-R y cebadores específicos de género PA GS-F y PA GS-R. Números en los paréntesis indican el número de aislamientos para los que el análisis de la secuencia del rDNA 16S
se realizó. El superíndice, las letras en cursiva de la c a la j indican la especie tentativamente identificado por análisis de secuencia de rDNA 16S como sigue: c, P. aeruginosa; d,
Burkholderia sp .; e, P. synxantha; f, Burkholderia sp. y S. maltophilia; g, P. fluorescens, P. stutzeri, P. lundensis / fragi y dos Pseudomonas sp .; h, H. seropedicae
y dos Herbaspirillum sp .; i, P. lundensis / fragi y P. pseudoalcaligenes; j, estafilococo sp. y Acinetobacter sp.

El pulmón con FQ, sin embargo, constituye un
microambiente que promueve la alteración fenotípica
de bacterias que infectan crónicamente (26). En
consecuencia, los fenotipos atípicos a menudo
exhibían por aislamientos de Pseudomonas CF
presentan un desafío para los sistemas de prueba
comúnmente utilizados en laboratorios de
microbiología clínica (15, 18, 28, 29, 31). Métodos de
identificación genotípica se esperaría que evitara este
problema, y Se han descrito ensayos basados en genes
específicos. Estas incluyen ensayos de PCR dirigidos a
P. aeruginosa oprL (11), algD (10, 25) y genes de
exotoxina A (17, 32). El rendimiento de estos ensayos
para diferenciar P. aeruginosa de otros estrechamente
especies de Pseudomonas relacionadas no se han
examinado, sin embargo, y la escasez de datos de
secuencia para estos loci de no P. aeruginosa limita las
predicciones basadas en análisis in silico. Más
recientemente, Clarke y colegas (3) describieron una
PCR ensayo que amplifica un fragmento de la proteína
de choque térmico groE gen de varias especies de
Pseudomonas. Fragmento de restricción Se informó el
análisis de polimorfismo de longitud del ADN
amplificado para diferenciar P. aeruginosa de P.
stutzeri, P. fluorescens, y P. putida. Qin y sus colegas
(28) utilizaron Amplificación por PCR de múltiples
dianas, incluida la exotoxina A, algD, oprL y gyrB, junto
con pruebas bioquímicas y 16S Secuenciación de ADNr
para identificar P. aeruginosa fenotípicamente atípica
aislamientos recuperados de muestras de FQ. La
secuencia de rDNA 16S se ha utilizado durante mucho
tiempo como "Estándar de oro" para determinar las
filogenias de bacterias especie (35). Amplificación
selectiva de Pseudomonas 16S ADNr por PCR seguido
de polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción análisis o electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante se ha utilizado para detectar y
diferenciar especies de Pseudomonas a partir de
muestras clínicas y ambientales (12, 27, 30, 34). Karpati
y Jonasson (16) utilizaron un cebador de ADNr 16S
conservado con un cebador específico del género
Pseudomonas en un ensayo de PCR para detectar ADN
de Pseudomonas en esputo de FQ; este ensayo no fue
diseñado para diferenciar P. aeruginosa de otras
Pseudomonas especies. En este estudio,
aprovechamos una reevaluación reciente de la
afiliación filogenética de las pseudomonas (1) para
reexaminar los datos de secuencia de ADNr 16S en
rápida expansión disponibles en bases de datos
públicas. Basado en una alineación de 136 16S
Secuencias de ADNr de 42 especies de Pseudomonas
descritas válidamente así como varias otras -
Proteobacteria, identificamos Firma específica de
género de Pseudomonas y firma específica de P.
aeruginosa secuencias. Ensayos de PCR que utilizan
cebadores dirigidos a estas secuencias fueron
diseñados y probados contra un panel de 85
previamente cepas identificadas. Incluimos en este
panel de prueba 43 cepas que representan 28 especies
no pseudomonas que también se encuentran en
Esputo de FQ, así como 42 colección de cultivos de
Pseudomonas son. En el último grupo tuvimos cuidado
de incluir cepas de las especies de Pseudomonas más
estrechamente relacionadas filogenéticamente a P.
aeruginosa. Este grupo incluyó P. resinovorans, P.
alcaligenes, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P.
mendocina, y P. flavescens, todos los cuales se agrupan
dentro de P. aeruginosa grupo descrito por Anzai y
colegas (1). También probamos nuestros ensayos de
PCR contra P. putida, P. fluorescens, P. stutzeri y
P. syringae, pseudomonas ambientales comunes que
pueden también se pueden recuperar ocasionalmente
del esputo de la FQ. Tanto el género- ensayos
específicos y específicos de P. aeruginosa demostraron
100% de sensibilidad y especificidad. Nuestro examen
de aislamientos recientes de esputo de FQ más mostró
la utilidad de los nuevos ensayos de PCR. Sesenta y seis
aislados, recuperado de 66 pacientes y derivado de
varias clínicas laboratorios de microbiología, fueron
examinados. Todos habían sido evaluados
fenotípicamente con un sistema de prueba comercial
por el laboratorio de referencia. Entre estos, 34 habían
sido identificados por el laboratorio de referencia
como P. aeruginosa, otro Especies de Pseudomonas, o
como Pseudomonas (es decir, no identificadas el nivel
de especie). Los 32 restantes habían sido remitidos no
identificado o identificado como una especie no
pseudomonal pero fueron identificadas
preliminarmente por nosotros como Pseudomonas
usando nuestro kit de pruebas fenotípicas de rutina
(sistema RapID NF Plus). Análisis de estos 66
aislamientos con los dos nuevos ensayos de PCR
indicados que las pruebas fenotípicas habían
identificado erróneamente varios aislamientos.
Nosotros realizó análisis de secuencia de ADNr 16S en
más de la mitad de estos aislamientos, y en todos los
casos los datos de secuencia confirmaron los
resultados de la PCR. Aunque nuestros análisis de
secuencia de ADN y PCR revelaron aislamientos que
habían sido identificados erróneamente por pruebas
fenotípicas, Debe ser claro al señalar que nuestro
estudio no fue diseñado para determinar la frecuencia
de identificación errónea del esputo de FQ aisla ni para
comparar la precisión relativa de diferentes fenotípicos
sistemas de identificación. Aislamientos remitidos a
nosotros para realizar pruebas muy probablemente
representan un conjunto sesgado de atípicos y difíciles
de identificar aislamientos y, por lo tanto,
extrapolación de identificación errónea las tasas de
este estudio no son apropiadas. Sin embargo, tal Los
aislamientos estaban bien adaptados para
proporcionar una prueba rigurosa de nuestro nuevo
Ensayos de PCR y cepas representadas para las que el
análisis molecular se esperaría que fuera más útil.
Nuestro estudio también reitera que varias especies de
pseudomonas no aeruginosa ocasionalmente se puede
recuperar del cultivo de esputo de FQ. Entre
aislamientos que dan positivo con la PCR a nivel de
género, pero negativos con la PCR específica de P.
aeruginosa, identificamos P. fluorescens, P. lundensis /
fragi P. pseudoalcaligenes, P. stutzeri y P. synxantha,
basado en el análisis de la secuencia del rDNA 16S.
En resumen, hemos diseñado ensayos de PCR basados
en rDNA 16S que proporcionan una identificación
rápida, simple y confiable de P. aeruginosa y su
diferenciación de otros filogenéticamente especies de
Pseudomonas estrechamente relacionadas. Ambos
ensayos tienen 100% sensibilidad y especificidad para
sus objetivos previstos. Tenemos también demostró la
utilidad de estos ensayos de PCR en precisión
identificación de P. aeruginosa entre aislamientos no
identificados correctamente por análisis fenotípicos.
Estos ensayos deberían ser útiles coadyuvante en la
evaluación de bacterias gramnegativas no
fermentadoras recuperado del cultivo de esputo de
FQ.
 EXPRESIONES DE GRATITUD
Este trabajo fue apoyado por una subvención (a J.J.L.) del Cystic Fundación Fibrosis. Reconocemos la
generosidad y cooperación de los CF participantes centros y laboratorios de microbiología para la presentación
de aislamientos clínicos. T.C. y P.V. están en deuda con el Fondo de Investigación Científica: Flandes (Bélgica)
para un puesto de investigador y becario postdoctoral subvenciones, respectivamente. T.C. también agradece
el apoyo del belga Gobierno Federal (Oficina Federal de Asuntos Científicos, Técnicos y Asuntos Culturales).