TESIS DOCTORAL

INMOVILIZACIÓN Y CO-INMOVILIZACIÓN DE LIPASAS

UTILIZANDO SOPORTES HIDROFÓBICOS.
NUEVAS ESTRATEGIAS PARA REUSAR LAS ENZIMAS
MÁS ESTABLES EN LOS COMBI-BIOCATALIZADORES

Sara Arana Peña

Madrid, 2021

Facultad de Ciencias
Departamento de Biología Molecular
 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología Molecular

INMOVILIZACIÓN Y CO-INMOVILIZACIÓN DE
LIPASAS UTILIZANDO SOPORTES HIDROFÓBICOS.
NUEVAS ESTRATEGIAS PARA REUSAR LAS ENZIMAS
MÁS ESTABLES EN LOS COMBI-BIOCATALIZADORES

SARA ARANA PEÑA

Memoria presentada para optar al grado de Doctor
en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid

Director:
Prof. Roberto Fernández Lafuente
Instituto de Catálisis y Petroleoquímica
Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Tutora:
Prof. Elena Bogónez Peláez
Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias
Universidad Autónoma de Madrid

Instituto de Catálisis y Petroleoquímica

Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Madrid, 2021
 MINISTERIO DE CIENCIA E

INNOVACIÓN

Madrid, 7 de septiembre de 2021

A quien pueda interesar:

D. Roberto Fernández Lafuente, Profesor de Investigación del Instituto de Catálisis y

Petroleoquímica del CSIC.

CERTIFICA:

Que el trabajo titulado “INMOVILIZACIÓN Y CO-INMOVILIZACIÓN DE LIPASAS

UTILIZANDO SOPORTES HIDROFÓBICOS. NUEVAS ESTRATEGIAS PARA
REUSAR LAS ENZIMAS MÁS ESTABLES EN LOS COMBI-BIOCATALIZADORES”
presentada por Dª Sara Arana Peña para optar al título de doctor por la UAM, ha sido
realizada bajo su dirección en el Grupo de Optimización de Biocatalizadores y Bioprocesos del
Departamento de Biocatálisis del Instituto de Catálisis y Petroleoquímica.

Para que así conste, firmo el presente Certificado en Madrid, a 7 de septiembre de 2021

Fdo.: Prof. Dr. Roberto Fernández Lafuente

Departamento de Biocatálisis. Instituto de Catálisis y Petroleoquímica – CSIC
C/Marie Curie 2. Campus UAM – CSIC. Cantoblanco 28049 Madrid, España
Fax.: + 34 91 585 47 60 Email: rfl@icp.csic.es
A mis padres
 Agradecimientos
Es complicado plasmar en unas cuantas líneas lo agradecida que estoy hacia todas las
personas que me han apoyado de una u otra forma durante esta etapa de mi vida, una etapa de
gran esfuerzo y crecimiento personal, que culmina con la presentación de esta tesis doctoral. De
antemano, pido perdón por si olvido mencionar a alguien o si mis palabras son escuetas, ya
sabréis que escribir con sensibilidad no es el mayor de mis atributos.
Siempre estaré agradecida a mi director de tesis, Roberto Fernández Lafuente, por
permitirme formar parte de su grupo de investigación y darme la oportunidad de desarrollarme
como científica. Es increíble cómo sus ideas y todo lo que me ha enseñado ha hecho que cambie
completamente mi forma de ver la ciencia. Gracias por depositar tanta confianza en mí y mi
trabajo y por ser una persona tan cercana, pese a ser el jefe.
Mi más sincero agradecimiento al Ministerio de Economía, Industria y Competitividad
del Gobierno de España por la financiación recibida mediante la concesión del proyecto
CTQ2017-86170-R, la cual me ha permitido desarrollar mi investigación.
Gracias al director Enrique Sastre de Andrés y a todo el personal del Instituto de
Catálisis y Petroleoquímica, que han permitido que mi estancia en el centro sea muy
satisfactoria. Con una mención especial a Cristina Otero y Malcom Yates por su colaboración
con nuestro laboratorio y a Lara, Janaina y Javi, por ser unos grandes compañeros.
Al Sr. R. Martínez (Novozymes® España) por la amable donación de las enzimas
empleadas en la presente tesis doctoral.
A mi tutora del programa de doctorado, Elena Bogónez Peláez, por ayudarme con todos
los trámites del doctorado y mostrarse siempre tan amable.
Gracias a Fernando López Gallego por acogerme en su laboratorio en Donostia y por
todo lo que pude aprender allí pese a la breve estancia, más breve aun si cabe debido a la
aparición de una pandemia mundial.
A todas las personas que tuve la oportunidad de conocer en el CIC biomaGUNE, por
hacerme sentir una más desde el primer momento, en especial a Eleftheria, por ayudarme y
acompañarme en los ensayos y a Nicoll, por tratarme como a una amiga sin apenas conocerme e
incluso abrirme las puertas de su casa.
Muchísimas gracias a todos mis compañeros del labo 301 por pasar conmigo por esta
experiencia, en ocasiones tan dura y en ocasiones tan gratificante:
A mi equipo lipasa, Nathalia, Yuli y Carmen, no puedo creer todo lo que conseguimos
juntas y los buenos recuerdos que nos llevamos. Y eso que se ha ido ya la mañana...
A Diego, Bob y Hocine, por aguantar mi cháchara y mis dotes de DJ sin acabar
tirándome una pipeta a la cabeza. Sé que conseguí que os gustase Chayanne.
A Carlos y Cándido, que fueron cómo uno más del laboratorio, por nuestros cotilleos
mientras comíamos infiltrados en la sala de profesores de derecho.
A todos los que compartieron poyata conmigo, Javi, Priscila, Lucas, Sabrina, Juan,
Saeid, Diandra, Chafiaa y Hossein por tantos momentos compartidos. Todo lo que he aprendido
trabajando con vosotros es incalculable, no puedo estar más agradecida de haberos tenido como
compañeros.
 Gracias a todas las mujeres de mi vida, por ser mi fuente de inspiración, Almu, Andrea,
Aroa, Estefi, Esti, Fani, Lau, María, Mimi y Patri. Nunca dudasteis de mí (de hecho, tuvisteis
más fe en mí que yo misma) y teneros en mi vida, después de tantos años, me hace
inmensamente feliz.
Por supuesto a Jakub. Gracias por acompañarme en este viaje, que también es el tuyo.
Pocos pueden entender lo que nosotros hemos compartido durante este tiempo, por lo que todo
lo que pueda decirte es poco.
Y, sobre todo, gracias a mi madre, a mi padre y a mi tate, las personas más importantes
de mi vida. Gracias por darme tanto, animarme a seguir mis sueños y apoyarme ante cualquier
adversidad. Espero que estéis orgullosos de lo que he conseguido, porque todo ello ha sido
gracias a vosotros. Pd.: nos vemos en la mejor hora del día.
 Resumen
La utilización industrial de biocatalizadores de lipasas se ve facilitada por su
inmovilización, la cual permite su recuperación y puede mejorar otras propiedades enzimáticas.
El peculiar mecanismo de acción catalítica que poseen las lipasas, denominado activación
interfacial, les permite adsorberse en superficies hidrofóbicas a baja fuerza iónica, tales como
aquellas que muestran los soportes hidrofóbicos. Estos soportes permiten la inmovilización
reversible, purificación, hiperactivación y estabilización de las lipasas en un solo paso, fijando
la forma monomérica y abierta de las lipasas.
En la presente tesis doctoral se ha explotado el potencial de estos soportes en la
inmovilización y co-inmovilización de las lipasas. En primer lugar, el uso de este método de
inmovilización ha permitido comparar adecuadamente las propiedades (actividad, especificidad,
estabilidad) de diferentes lipasas. Así, la estabilidad de las lipasas inmovilizadas por activación
interfacial en el soporte hidrofóbico octil agarosa posee una dependencia específica con respecto
al medio de reacción, siendo la presencia de aniones fosfato a pH 7,0 muy negativa, pero no
tanto cuando se inmovilizan por otros métodos. Además, se ha demostrado que las condiciones
de inmovilización estudiadas determinan significativamente las propiedades de algunas lipasas
inmovilizadas en este soporte (la lipasa de Rhizomucor miehei (RML), la lipasa de
Pseudomonas fluorescens (PFL) y la lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL)), mientras que
apenas afectan a las propiedades del biocatalizador en el caso de la lipasa B de Candida
antarctica (CALB) y la lipasa de Candida rugosa (CRL). Esto puede limitar la reproducibilidad
de los biocatalizadores, pero, si se controla adecuadamente, puede utilizarse para producir una
biblioteca de biocatalizadores inmovilizados de la misma lipasa usando el mismo soporte, con
diferentes propiedades, únicamente cambiando las condiciones de inmovilización.
Por otro lado, la estrategia de inmovilización de lipasas en multicapas utilizando
polietilenimina (PEI) como agente conector entre las capas de lipasas y glutaraldehído como
agente entrecruzante, ha aumentado la capacidad de carga de soportes porosos. Asimismo, el
uso de esta estrategia ha permitido co-inmovilizar cinco lipasas diferentes, controlando la
distribución espacial de las mismas simplemente controlando el orden de inmovilización. Sin
embargo, los problemas de difusión y el aumento en la tortuosidad del camino que debe seguir
el sustrato hasta las capas inferiores de enzima pueden provocar una disminución en la actividad
de las enzimas inmovilizadas al añadir una nueva capa de enzima.
Por último, se han diseñado dos estrategias que solucionan el problema de co-
inmovilizar lipasas con estabilidades muy diferentes. En la primera estrategia, se usan soportes
heterofuncionales octil-glioxil agarosa, y una inmovilización enzima a enzima. La enzima más
estable (CALB) es inmovilizada primero por activación interfacial y después unida
covalentemente. Tras reducir el soporte, las enzimas menos estables (LEU y RML) son
inmovilizadas sobre la superficie libre únicamente vía activación interfacial, de forma que
pueden ser liberadas al medio tras su inactivación, al incubarse con detergentes. Esta estrategia
ha permitido reutilizar CALB inmovilizada, manteniendo su actividad y estabilidad, durante
varios ciclos de inactivación, desorción con detergente y recarga de las enzimas menos estables.
La segunda estrategia, consiste en inmovilizar las lipasas más estables (la lipasa A de Candida
antárctica (CALA), CALB y TLL) sobre soportes hidrofóbicos vía activación interfacial,
recubrirlas con PEI, e inmovilizar sobre esta capa de polímero las lipasas menos estables (LEU
y RML) mediante intercambio iónico. Tras la inactivación de las enzimas menos estables
inmovilizadas reversiblemente, estas pueden liberarse al medio por incubación a elevada fuerza
iónica. Esta estrategia ha permitido reutilizar CALA, CALB y TLL inmovilizadas primero por
activación interfacial y después por unión covalente en octil-vinilsulfona agarosa, sin afectar a
su actividad o estabilidad, durante cinco ciclos de inactivación, desorción con alta fuerza iónica
de LEU y RML, recubrimiento con PEI y recarga de las enzimas menos estables.
 Abstract
The industrial use of lipase biocatalysts is facilitated by their immobilization, which
allows their recovery and can improve other enzymatic properties. The peculiar mechanism of
catalytic action that lipases possess, called interfacial activation, allows them to be adsorbed on
hydrophobic surfaces at low ionic strength, such as those exhibited by hydrophobic supports.
These supports admit the reversible immobilization, purification, hyperactivation and
stabilization of the lipases in a single step, fixing the monomeric and open form of the lipases.
In the present doctoral thesis, the potential of these supports in the immobilization and
co-immobilization of lipases has been exploited. In the first place, the use of this immobilization
method has made it possible to compare the properties (activity, specificity, stability) of
different lipases with the same conformation. Thus, the stability of lipases immobilized via
interfacial activation on the octyl agarose hydrophobic support has a specific dependence on the
reaction medium, the presence of phosphate anions at pH 7.0 has a very negative effect, but not
so much when the enzymes are immobilized by other methods. In addition, it has been shown
that the immobilization conditions studied, significantly determine the properties of some
lipases immobilized on this support (Rhizomucor miehei lipase (RML), Pseudomonas
fluorescens lipase (PFL) and Thermomyces lanuginosus lipase TLL), while only the properties
of the biocatalyst in the case of Candida antarctica lipase B (CALB) and Candida rugosa lipase
(CRL). This can limit the reproducibility of biocatalysts, but if properly controlled, it can be
used to produce a library of immobilized biocatalysts from the same lipase using the same
support, with different properties, only by changing the conditions of immobilization.
On the other hand, the immobilization strategy of lipases in multilayers using
polyethyleneimine (PEI) as a connecting agent between the lipase layers and glutaraldehyde as a
crosslinking agent, has made it possible to increase the loading capacity of porous supports.
Likewise, the use of this strategy has made it possible to co-immobilize five different lipases,
controlling their spatial distribution by simply controlling the order of immobilization.
However, diffusion problems and the increase in the tortuosity of the path that the substrate
must follow to the lower enzyme layers can cause a decrease in the activity of the immobilized
when a new enzyme layer is added.
Finally, two strategies have been designed that solve the problem of co-immobilizing
lipases with very different stabilities. In the first strategy, heterofunctional octyl-glyoxyl agarose
supports are used, with an enzyme-by-enzyme immobilization. The most stable enzyme
(CALB) is immobilized first via interfacial activation and then covalently attached. After
reducing the support, the less stable enzymes (LEU and RML) are immobilized on the free
surface only via interfacial activation, so that they can be released into the medium after
inactivation, when incubated with detergents. This strategy has allowed the reuse of
immobilized CALB, maintaining its activity and stability, during several cycles of inactivation,
desorption with detergent and reloading of the less stable enzymes. The second strategy consists
of immobilizing the more stable lipases (Candida antarctica lipase A (CALA), CALB and
TLL) on hydrophobic supports via interfacial activation, coating them with PEI, and
immobilizing the less stable lipases (LEU and RML) on this polymer layer by means of ion
exchange. After inactivation of the reversibly immobilized and less stable enzymes, these can be
released into the medium by incubation at high ionic strength. This strategy has made it possible
to reuse CALA, CALB and TLL immobilized first by interfacial activation and then covalently
in octyl-vinylsulfone agarose, without affecting their activity or stability, for five cycles of
inactivation, desorption with high ionic strength of LEU and RML, coating with PEI and
reloading of less stable enzymes.
 Índice

Índice

Clave de abreviaturas ................................................................................. 1

1. Introducción general ............................................................................. 2

1.1. Biocatálisis y química verde ............................................................................ 2

1.2. Catalizadores sostenibles: Las enzimas ......................................................... 2

1.2.1. Lipasas ........................................................................................................ 3
1.2.1.1. Activación interfacial de las lipasas .................................................................. 4

1.3. Inmovilización de enzimas .............................................................................. 5

1.3.1. Inmovilización de lipasas en soportes hidrofóbicos vía activación
interfacial .................................................................................................................. 6
1.3.1.1. Peculiaridades del efecto del medio sobre la estabilidad de las lipasas
inmovilizadas vía activación interfacial ............................................................................ 7
1.3.1.2. Modulación de las propiedades enzimáticas por la alteración de las
condiciones de inmovilización .......................................................................................... 8

1.3.2. Inmovilización por intercambio iónico ...................................................... 9

1.3.2.1. Soportes activados con grupos monoaminoetil-N-aminoetil (MANAE) .......... 9
1.3.2.2. Soportes activados con polietilenimina (PEI) ................................................... 9

1.3.3. Inmovilización en soportes heterofuncionales ......................................... 10

1.3.3.1. Soportes amino-glutaraldehído........................................................................ 10
1.3.3.2. Soportes acil heterofuncionales ....................................................................... 11
1.3.3.2.1. Octil-glioxil .............................................................................................. 11
1.3.3.2.2. Octil-vinilsulfona ...................................................................................... 11

1.3.4. Modificación físico-química post-inmovilización .................................... 12

1.3.4.1. Recubrimiento con PEI ................................................................................... 12
1.3.4.2. Entrecruzamiento con glutaraldehído .............................................................. 13

1.3.5. Aumento de la capacidad de carga y la actividad volumétrica de

biocatalizadores de enzimas inmovilizadas ............................................................ 13

1.4. Reacciones multienzimáticas......................................................................... 15

1.4.1. Modificación total de aceites y grasas ..................................................... 15
1.4.1.1. Síntesis de biodiesel ........................................................................................ 16

1.4.2. Concepto de combilipasas ........................................................................ 17

i
 Índice

1.5. Co-inmovilización de enzimas....................................................................... 17

1.5.1. Problemas de la co-inmovilización de enzimas ........................................ 18
1.5.1.1. Diferentes tamaños de las enzimas involucradas ............................................ 18
1.5.1.2. Reducción de la capacidad de carga del soporte para cada enzima específica 18
1.5.1.3. Importancia de la distribución espacial de las enzimas ................................... 19
1.5.1.4. Necesidad del mismo protocolo, superficie del soporte y condiciones de
inmovilización ................................................................................................................. 19
1.5.1.5. Diferencia significativa en las estabilidades de las enzimas
co-inmovilizadas ............................................................................................................. 20

2. Objetivos .............................................................................................. 22

3. Publicaciones ....................................................................................... 23

3.1. Capítulo I. Inmovilización de lipasas en soportes hidrofóbicos vía

activación interfacial ................................................................................................. 23
3.1.1. Capítulo I.I. Comparación de algunas propiedades de diferentes lipasas
inmovilizadas en soportes hidrofóbicos .................................................................. 24
3.1.1.1. Inmovilización en partículas de octil-agarosa y algunas características
catalíticas de las preparaciones comerciales de la lipasa A de Candida antarctica
(Novocor ADL): Comparación con la lipasa B de Candida antarctica inmovilizada .... 24
3.1.1.2. Inmovilización de la lipasa de Eversa® en partículas de octil agarosa y
caracterización preliminar de las características de estabilidad y actividad .................... 27
3.1.1.3. Biocatalizadores inmovilizados de Eversa® Transform 2.0 y la lipasa de
Thermomyces lanuginosus: Comparación de algunas propiedades y rendimiento en la
producción de biodiésel ................................................................................................... 30

3.1.2. Capítulo I.II. Efecto de la composición del medio en la estabilidad de las

lipasas en función del método de inmovilización y las condiciones
experimentales ......................................................................................................... 33
3.1.2.1. Influencia de los aniones fosfato sobre la estabilidad de enzimas
inmovilizadas. Efecto de la naturaleza de la enzima, protocolo de inmovilización y
condiciones de inactivación............................................................................................. 33
3.1.2.2. Efecto de soluciones de sales concentradas sobre la estabilidad de las enzimas
inmovilizadas: Influencia de las condiciones de inactivación y protocolo de
inmovilización ................................................................................................................. 36
3.1.2.3. Efecto positivo del glicerol sobre la estabilidad de las enzimas inmovilizadas:
¿Es un hecho universal? .................................................................................................. 39

3.1.3. Capítulo I.III. Posibilidad de modulación de las propiedades funcionales

de las lipasas mediante la alteración de las condiciones de inmovilización sobre
soportes hidrofóbicos .............................................................................................. 42

ii
 Índice

3.1.3.1. Modulando las propiedades de la lipasa de Thermomyces lanuginosus

inmovilizada en partículas de octil agarosa alterando las condiciones de
inmovilización ................................................................................................................. 42
3.1.3.2. Efectos de las condiciones de carga e inmovilización enzimática sobre las
características catalíticas de la lipasa de Pseudomonas fluorescens inmovilizada en
partículas de octil agarosa ............................................................................................... 45
3.1.3.3. Inmovilización de lipasas mediante activación interfacial sobre soportes
hidrofóbicos: Producción de bibliotecas de biocatalizadores mediante la alteración de las
condiciones de inmovilización ........................................................................................ 48

3.2. Capítulo II. Preparación de multicapas de lipasas inmovilizadas en

soportes hidrofóbicos porosos para incrementar la capacidad de carga y la
actividad volumétrica de los biocatalizadores ........................................................ 51
3.2.1. Uso de polietilenimina para producir biocatalizadores multicapas de
lipasas inmovilizadas con actividad volumétrica muy alta utilizando partículas de
octil agarosa: Evitando la liberación de enzimas durante la producción de
múltiples capas ........................................................................................................ 52

3.3. Capítulo III. Preparación de multicapas de diferentes lipasas co-

inmovilizadas en soportes hidrofóbicos porosos: Control de la distribución
espacial de las enzimas ............................................................................................. 55
3.3.1. Co-inmovilización de diferentes lipasas: Orden espacial enzimático
simple capa por capa .............................................................................................. 56

3.4. Capítulo IV. Nuevas estrategias para la co-inmovilización de lipasas con

diferentes estabilidades en soportes hidrofóbicos que permitan reusar las
enzimas inmovilizadas más estables ........................................................................ 59
3.4.1. Capítulo IV.I. Co-inmovilización enzima a enzima de lipasas en soportes
heterofuncionales octil-glioxil agarosa .................................................................. 60
3.4.1.1. Nuevas aplicaciones del octil-glioxil agarosa en la co-inmovilización de
lipasas: Estrategias para reutilizar la lipasa más estable ................................................. 60

3.4.2. Capítulo IV.II. Co-inmovilización de la enzima menos estable sobre la

enzima más estable inmovilizada en soportes hidrofóbicos y
recubierta con PEI .................................................................................................. 63
3.4.2.1. Multi-combilipasas: Lipasas co-inmovilizadas con estabilidades muy
diferentes que combinan la inmovilización mediante activación interfacial e intercambio
iónico. Reutilización de las enzimas co-inmovilizadas más estables tras la inactivación
de las menos estables....................................................................................................... 63

4. Discusión global ................................................................................... 66

5. Conclusiones ........................................................................................ 81

iii
 Índice

6. Bibliografía .......................................................................................... 83

Anexos....................................................................................................... 100

I. Revisiones relacionadas con la tesis doctoral ................................................ 100

II. Otros artículos publicados durante el desarrollo de la tesis doctoral ..... 104

iv
 Abreviaturas

Clave de abreviaturas
Abreviaturas independientes a las que aparecen en las publicaciones presentadas en la tesis
doctoral.

β-gal β-galactosidasa de Aspergillus niger

BCL Partículas entrecruzadas
CALA Lipasa A de Candida antarctica
CALB Lipasa B de Candida antarctica
CRL Lipasa de Candida rugosa
Combi-
Biocatalizador de combilipasas co-inmovilizadas
biocatalizador
CTAB Cetiltrimetilamonio bromuro
D-pNPP Dietil p-nitrofenilfosfato
EVT Lipasa Eversa® Transform 2.0 FG
Glutaraldehído- Lipasa inmovilizada en amino-glutaraldehído agarosa (Lipasa es
lipasa sustituida por la abreviatura de una enzima)
GRAS Generalmente reconocido como seguro
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil) piperazin-1-iletanosulfónico
IMAC Cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados
Imax Intensidad de fluorescencia máxima
LEU Fosfolipasa Lecitase® Ultra
MANAE Monoaminoetil-N-aminoetil
MANAE-EVT Lipasa Eversa® Transform 2.0 FG inmovilizada en MANAE agarosa
Octil-lipasa Lipasa inmovilizada en octil agarosa
Octil-glioxil-CALB Lipasa B de Candida antarctica inmovilizada en octil-glioxil agarosa
Octil-vinilsulfona-
Lipasa inmovilizada en octil-vinilsulfona agarosa
lipasa
PEI Polietilenimina
PFL Lipasa de Pseudomonas fluorescens
pNPB p-nitrofenil butirato
RML Lipasa de Rhizomucor miehei
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
TLL Lipasa de Thermomyces lanuginosus
TRIS Tris(hidroximetil)aminometano
U Unidad de actividad enzimática.

1
 Introducción

1. Introducción general
1.1. Biocatálisis y química verde
El concepto de desarrollo sostenible, introducido en el informe Our Common Future de
la Comisión Mundial sobre Medio Ambiente y Desarrollo publicado en 1987, fue definido
como “un desarrollo que cumple las necesidades de la generación actual sin comprometer la
capacidad de las generaciones futuras para satisfacer sus propias necesidades” [1,2]. Para que un
proceso sea sostenible, los recursos naturales deben utilizarse de forma que no agoten
inaceptablemente sus suministros a largo plazo, y los residuos no deben generarse en valores
superiores a los que pueden ser asimilados fácilmente por el medio natural [3].
El interés de la industria química en el desarrollo de procesos más sostenibles dio lugar
a la aparición de la denominada química verde a principios de la década de 1990, cuyo
propósito es prevenir la contaminación en lugar de la eliminación de los residuos producidos.
Este término, que ha sido ampliamente adoptado en los círculos industriales y académicos, fue
introducido por Anastas y Warner en 1998 con la publicación de los 12 principios de la química
verde recogidos en su libro Green Chemistry: Theory and Practice [4]: 1. Prevención; 2.
Economía de átomos; 3. Productos químicos menos tóxicos; 4. Productos más seguros; 5.
Reducción del uso de sustancias auxiliares; 6. Reducción del consumo energético; 7. Uso de
materias primas renovables; 8. Reducción de la derivatización innecesaria; 9. Uso de
catalizadores; 10. Diseño para la degradación; 11. Desarrollo de tecnologías analíticas para la
monitorización en tiempo real; 12. Minimización del riesgo de accidentes químicos. Estos
principios se pueden aplicar en diferentes sectores de la industria química de manera eficiente,
permitiendo maximizar la utilización de materias primas, desarrollar procesos y productos más
seguros, reducir el uso de sustancias tóxicas y disolventes, minimizar las emisiones de residuos
y ahorrar energía y agua, produciendo una química alternativa más limpia y sostenible [5].
La denominada biotecnología blanca o biotecnología industrial es un campo emergente
de la biotecnología moderna con utilidad industrial, cuyo concepto es la aplicación de
herramientas biotecnológicas para producir compuestos de interés, considerando los principios
de la química verde [1,2]. La biocatálisis se encuentra enmarcada dentro de la biotecnología
blanca y se define como el uso de sistemas biológicos, que incluyen células completas o sus
enzimas aisladas, para catalizar reacciones que conducen a la obtención de compuestos
químicos de interés [6]. La biocatálisis posee una gran variedad de características atractivas que
le permiten cumplir 10 de los 12 principios de la química verde y la sostenibilidad.

1.2. Catalizadores sostenibles: Las enzimas

Las enzimas son biocatalizadores con excelentes propiedades: exhiben una alta
actividad, una alta selectividad (quimio-, regio- y estereo-) ofreciendo productos de mayor
pureza que los procesos químicos tradicionales y una alta especificidad de sustrato (por ejemplo,
estereoespecificidad) y, en general, no necesitan pasos de activación, protección y desprotección
de los grupos funcionales del sustrato [7–9]. Al ser catalizadores de origen biológico se obtienen
de fuentes renovables de fácil acceso, son biodegradables y fundamentalmente inocuas e
inofensivas. Además, son capaces de realizar los procesos químicos más complejos en las
condiciones experimentales y ambientales más benignas (presión atmosférica, temperatura
ambiente, pH fisiológico, medio acuoso) y generan menos residuos que los procesos
convencionales, lo que conduce a rutas sintéticas más eficientes en el consumo de energía y
materias primas. En consecuencia, los métodos biocatalíticos son más atractivos tanto
medioambiental como económicamente y por lo tanto más sostenibles que la catálisis
tradicional [1,2,10].

2
 Introducción

El número de aplicaciones biocatalíticas ha aumentado en muchos sectores industriales

en las últimas décadas, desde en la química fina y farmacéutica hasta en la producción
alimentaria y energética [11–13]. Existen muchos tipos de reacciones que pueden ser catalizadas
por enzimas disponibles comercialmente [14]. Sin embargo, las enzimas han sido diseñadas por
la naturaleza para cumplir su función biológica y poseen algunas características que no se
ajustan a los requisitos de la industria química, la cual trabaja en condiciones bastante alejadas
de las fisiológicas y sobre sustratos sintéticos [15]. Esto genera limitaciones en los
biocatalizadores, como la disponibilidad limitada de enzimas, el alcance del sustrato y la
estabilidad operativa.
Estas limitaciones pueden solucionarse gracias a los grandes avances logrados
recientemente en numerosas áreas científicas relacionadas con el diseño de biocatalizadores,
como la metagenómica [16,17], el modelado enzimático y la mutagénesis dirigida [18], la
evolución dirigida [19,20], la modificación química o física enzimática [21], la inmovilización
enzimática [22–25] o el diseño del reactor [26] e incluso el uso combinado de varias de estas
técnicas para obtener efectos sinérgicos [27,28]. Con la ayuda de estas técnicas, es probable que
en los próximos años surjan numerosas aplicaciones de la biocatálisis en la síntesis industrial.

1.2.1. Lipasas
Entre las enzimas de interés industrial, las hidrolasas (EC 3, según Enzyme
Commission) son sin duda las más utilizadas en biotransformaciones [29,30]. Entre ellas, las
lipasas (EC 3.1.1.3) son el grupo más destacado, tanto a nivel académico como a nivel industrial
[31,32].
Las lipasas se presentan ampliamente en la naturaleza y se pueden encontrar en la
mayoría de los microorganismos, siendo su función natural la hidrólisis de aceites y grasas
(triglicéridos) a ácidos grasos libres, diglicéridos, monoglicéridos y glicerol [33]. Estas enzimas,
poseen una amplia especificidad de sustrato unida en muchos casos, a una alta regio- o
enantioselectividad y han sido utilizadas para catalizar una gran variedad de reacciones en
medios no acuosos, como modificaciones de trigicéridos (esterificaciones [34,35],
transesterificaciones [35,36], acidólisis [37,38], interesterificaciones [39,40]), resolución de
mezclas racémicas [41], reacciones regio- o enantioselectivas [42], etc., siendo incluso capaces
de catalizar reacciones promiscuas [43], muy alejadas de su función fisiológica (p.ej.
peroxidación [44]). Además, las lipasas no requieren de cofactores y son muy estables en una
gran variedad de medios de reacción, incluyendo medios acuosos, pero también disolventes
orgánicos [45,46] y nuevos medios cómo líquidos iónicos o fluidos supercríticos [47,48].
Gracias a estas características, las lipasas han sido utilizadas ampliamente a nivel
industrial, mayoritariamente en la producción de fármacos y cosméticos [49], en la modificación
de alimentos [50] o en la producción de biodiésel [33,51], y su aplicación en
biotransformaciones sigue siendo un campo de investigación inmensamente atractivo [31,32].
La gran biodiversidad de las lipasas en la naturaleza unida a sus múltiples aplicaciones a
nivel industrial, ha desembocado en que muchas lipasas se encuentren disponibles
comercialmente a muy gran escala. Durante el desarrollo de esta tesis doctoral se han utilizado
varias de estas lipasas: la lipasa A de Candida antarctica (CALA) [52], la lipasa B de Candida
antarctica (CALB) [53], la lipasa de Candida rugosa (CRL) [54], la lipasa de Pseudomonas
fluorescens (PFL) [55], la lipasa de Rhizomucor miehei (RML) [56,57], la lipasa de
Thermomyces lanuginosus (TLL) [58], la evolución industrial de TLL Eversa® Transform
(EVT) [51], y la fosfolipasa quimérica Lecitase® Ultra (LEU) [59], la mayoría producidas por
Novozymes®, exceptuando CRL y PFL, producidas por Sigma-Aldrich .

3
 Introducción

1.2.1.1. Activación interfacial de las lipasas

Las lipasas son enzimas interfaciales, capaces de realizar su función catalítica en la
interfaz de las gotas de sus sustratos naturales (los triglicéridos son moléculas muy poco
solubles en agua). Para realizar esta función, las lipasas tienen un mecanismo de acción
peculiar, llamado activación interfacial [60,61].
La mayoría de las lipasas tienen una estructura, denominada lid o tapadera, que incluye
una cadena polipeptídica que tiene una cara interna hidrofóbica y una cara externa hidrofílica
[62,63]. En la llamada forma cerrada de la lipasa, el área hidrofóbica del lid interactúa con las
áreas hidrofóbicas que rodean el centro activo, aislándolo del medio de reacción y haciendo que
la enzima se encuentre inactiva en muchos casos. Este lid puede ser una estructura muy
pequeña y simple, sin aislar completamente el centro activo de la enzima en la forma cerrada (p.
ej., en el caso de CALB [64,65]), o incluso poseer una estructura bastante compleja que
involucra un gran porcentaje de los aminoácidos de la enzima y forma una doble tapadera (p.
ej., en el caso de la lipasa de Geobacillus thermocatenulatus [66]). La forma cerrada de la lipasa
se encuentra en equilibrio con la llamada forma abierta de la lipasa, una forma donde el lid se
desplaza, exponiendo al medio un gran bolsillo hidrofóbico que contiene el centro activo y
permitiendo la actividad de la enzima [67]. En medio acuoso homogéneo, esta forma es
inestable y la lipasa tiende a estar en su forma cerrada, sin embargo, en presencia de un sustrato
hidrofóbico (Figura 1.1), la lipasa se adsorbe fuertemente a través de este gran bolsillo
hidrofóbico y el centro activo queda expuesto al medio de reacción, desplazándose el equilibrio
conformacional hacia la forma abierta de la lipasa [68–71]. De esa manera la lipasa fijada en su
forma abierta puede atacar la gota insoluble de aceite y experimentando un incremento en su
actividad, razón por la cual a este mecanismo se le denomina activación interfacial [60,61].

Forma cerrada Forma abierta Gota de aceite

de la lipasa de la lipasa
(inactiva) (activa)
Enzima libre
Proteína hidrofóbica

Lipasa

Soporte
hidrofóbico

Figura 1.1. Adsorción física de las lipasas sobre superficies hidrofóbicas vía activación
interfacial.
Una molécula de lipasa puede adsorberse en cualquier superficie hidrofóbica a través de
este mecanismo (Figura 1.1), lo cual puede producir algunos problemas para su estudio y
utilización al interactuar con componentes hidrofóbicos del extracto crudo. Por ejemplo, estas
enzimas tienden a agregarse formando dímeros de lipasa que involucran la forma abierta de
cada una de las moléculas implicadas, cuyas propiedades pueden ser muy diferentes a la de los

4
 Introducción

monómeros de lipasa [72,73]. Las lipasas también pueden adsorberse en cualquier otro
componente hidrofóbico del extracto crudo, como proteínas hidrofóbicas [74], por lo que las
formas de lipasa libres y adsorbidas puede presentar comportamientos de estabilidad y actividad
completamente diferentes. Además, el porcentaje de agregación de la lipasa puede depender del
grado de pureza y de la concentración de enzima en el extracto crudo, por lo que la
reproducibilidad puede ser complicada. Estos problemas pueden resolverse utilizando soportes
hidrofóbicos para inmovilizar la lipasa [75–79].

1.3. Inmovilización de enzimas

El uso de catalizadores relativamente caros como son las enzimas, requiere, en muchos
casos, su recuperación y reutilización para hacer el proceso económicamente viable. Bajo este
contexto, la inmovilización de enzimas surgió como una herramienta para superar el problema
de la solubilidad enzimática [80,81], ya que las enzimas forman una solución coloidal difícil de
separar del medio de reacción [82], mediante la formación de un biocatalizador heterogéneo.
Además, la inmovilización simplifica enormemente el diseño del reactor y el control de la
reacción y puede mejorar la economía de los procesos biocatalíticos [80,81], por lo que suele
ser un requisito para el uso de una enzima como biocatalizador industrial [83,84].
De hecho, una inmovilización adecuada puede resolver muchas otras limitaciones
enzimáticas, ya mencionadas en el apartado 1.2: mejorando la estabilidad, por ejemplo,
mediante la unión covalente multipuntual de las enzimas al soporte (que permite la
rigidificación de la estructura enzimática, ya que, si el soporte es rígido y el brazo espaciador es
corto, los grupos enzimáticos implicados en la inmovilización no pueden alterar sus posiciones
relativas) o al reducir la presencia de compuestos perjudiciales en el entorno de la enzima [22–
24]; la actividad, la especificidad o la selectividad, al obtenerse una conformación más activa de
la enzima (como en el caso de la forma abierta de las lipasas [75–79]), al evitar la distorsión de
la enzima en condiciones adversas o reduciendo la inhibición de la enzima [23,25,85]; y/o la
pureza al acoplar la inmovilización enzimática a su purificación [86]. Todo ello es debido a que
la inmovilización enzimática puede producir cierta distorsión en el centro activo, reduciendo la
movilidad general de sus grupos, lo cual puede ser beneficioso si se realiza de forma adecuada
[22–25].
El uso de diferentes soportes de inmovilización con diferentes grupos reactivos produce
la inmovilización de una enzima a través de diferentes regiones, lo que confiere distinta rigidez
y distorsiona la enzima de formas muy diversas [85,87–89]. Esto permite obtener una biblioteca
de enzimas inmovilizadas en una gran variedad de soportes, quizás con propiedades muy
diferentes. Por ejemplo, la misma lipasa inmovilizada en distintos soportes puede exhibir muy
diferente enantioselectividad en las mismas condiciones experimentales [85,90].
La selección del soporte es en muchos casos decisiva para la implementación final de
los biocatalizadores [91]. El coste del soporte incrementará el coste final del biocatalizador y
debe tenerse en cuenta durante el diseño [80]. El uso de sólidos preexistentes para inmovilizar
enzimas es quizás la estrategia de inmovilización más extendida [92–95]. En algunos casos, la
inmovilización sobre la superficie de estos soportes se realiza mediante métodos físicos
reversibles de inmovilización (adsorción hidrofóbica, intercambio iónico [76,96]), por lo que la
enzima puede ser liberada del soporte una vez se haya inactivado, pudiéndose recuperar y
reutilizar el soporte [91]. En otros casos, la inmovilización se realiza utilizando un protocolo
irreversible (como puede darse con la unión covalente [23,24]), donde la enzima queda unida al
soporte de forma definitiva, haciendo necesario desechar el biocatalizador formado por la
enzima y el soporte cuando la enzima se inactiva [91].
Entre los soportes sólidos preexistentes, los porosos permiten un fácil manejo del
biocatalizador, al poder seleccionar la resistencia mecánica del soporte, que debe ser compatible

5
 Introducción

con el sistema del reactor, y el tamaño de partícula, que debe ser adecuado para los filtros.
Además poseen una gran área específica gracias a su estructura macroporosa [91]. En la
presente tesis doctoral se han empleado como soporte de inmovilización perlas o partículas
porosas de agarosa entrecruzada (BCL).
La agarosa es un heteropolisacárido gelificante neutro que se extrae de las algas de los
géneros Gelidium y Gracilaria. Se trata de un polímero lineal formado lRVPRQRVDFiULGRVȕ-D-
galactosa y 3,6-anhidro-Į-L-JDODFWRVDXQLGRVSRUHQODFHVĮ- \ȕ-glicosídicos dando lugar a dos
unidades de disacáridos que se repiten, la neoagarobiosa y la agarobiosa. Además, se considera
un producto generalmente reconocido como seguro (GRAS) y es muy hidrofílica [92]. Las
partículas de agarosa entrecruzada en forma de microesferas de diferentes diámetros y porosidad
se producen de forma comercial, siendo algunos de los mayores distribuidores Sepharose® y
Agarose Beads Technologies. Este soporte posee una serie de características que lo hacen ideal
para llevar a cabo la inmovilización de enzimas, como su resistencia a altas temperaturas, a
agentes físicos, químicos y mecánicos y al ataque microbiano, y su transparencia óptica, que
permite seguir la actividad de las enzimas inmovilizadas mediante análisis espectrofotométrico.
Además, la naturaleza polihídrica del polímero permite su activación y derivatización de manera
sencilla, dando lugar a soportes funcionalizados con diversos grupos reactivos que pueden
utilizar diferentes metodologías de inmovilización [92].

1.3.1. Inmovilización de lipasas en soportes hidrofóbicos vía activación

interfacial
En el caso de las lipasas, la inmovilización a baja fuerza iónica vía activación interfacial
(el mecanismo catalítico específico de las lipasas, previamente mencionado en el apartado
1.2.1.1. [60,61]) sobre la superficie de un soporte hidrofóbico, es un método reversible que a
menudo da muy buenos resultados ya que permite la inmovilización, hiperactivación,
estabilización y purificación de las lipasas en un solo paso (Figura 1.2) [75–79]. Mediante este
protocolo, la inmovilización se produce de manera monomérica, sin riesgo de que haya dímeros
lipasa-lipasa o agregados lipasa-componente del medio [72–74], y mediante la forma abierta de
la lipasa, estabilizada por interacción con la superficie del soporte [75–79]. Esta forma abierta
estabilizada de la lipasa es muy estable, incluso más que las lipasas inmovilizadas mediante
unión covalente multipuntual intensa [97,98] (un método de inmovilización que ha mostrado las
mejores estabilizaciones para la mayoría de las enzimas [23,24,91]). Además, el protocolo tiene
otras ventajas adicionales: es un método sencillo, se puede realizar a casi cualquier pH (siempre
que la enzima sea soluble y estable), es rápido y posee una alta tasa de inmovilización, los
soportes pueden ser almacenados durante largos tiempos sin ningún riesgo de alteración y
aunque el centro activo enzimático se enfrenta a la superficie del soporte, la capa de acilo y el
gran bolsillo hidrofóbico de la enzima permiten la entrada de grandes sustratos [75–79].

Lavado del
biocatalizador

Extracto crudo de proteínas

Soporte Hidrofóbico Adsorción selectiva de lipasas Lipasa inmovilizada y purificada
Baja fuerza iónica

Figura 1.2. Inmovilización de lipasas en un solo paso sobre soportes hidrofóbicos mediante
activación interfacial: hiperactivación, estabilización y purificación de la lipasa.

6
 Introducción

La inmovilización de lipasas sobre soportes hidrofóbicos mediante activación

interfacial, no sigue una adsorción hidrofóbica convencional, dónde una alta fuerza iónica es
necesaria para inmovilizar las enzimas. De hecho, el uso de una alta fuerza iónica ralentiza la
inmovilización de la lipasa al desplazar el equilibrio hacia la forma cerrada de la lipasa, forma
en la cual no se puede inmovilizar [75–79]. Por esta razón, la estrategia puede utilizarse para
purificar lipasas de otras enzimas. Además, este método de inmovilización por adsorción física
es muy fuerte, pero reversible, por lo que permite reutilizar el soporte tras la inactivación de la
enzima. Sin embargo, esto implica que la lipasa puede liberarse durante la operación, tanto en
condiciones drásticas como altas temperaturas o en presencia de un disolvente orgánico [99–
101], como en presencia de sustratos o productos con propiedades detergentes [101,102]. Esta
liberación de enzima puede evitarse mediante el uso de soportes heterofuncionales [103] o
mediante el entrecruzamiento físico o químico de las enzimas inmovilizadas [104,105].
En la presente tesis doctoral se han utilizado, principalmente, soportes hidrofóbicos octil
agarosa (partículas porosas de agarosa que poseen una capa de grupos octil en su superficie
[92]) para inmovilizar las lipasas seleccionadas vía activación interfacial, en su forma
monomérica y abierta sobre una superficie idéntica [75–79].

1.3.1.1. Peculiaridades del efecto del medio sobre la estabilidad de las lipasas
inmovilizadas vía activación interfacial
El incremento en la estabilidad enzimática es una forma de mejorar el manejo de
cualquier enzima, incluidas las lipasas. De hecho, la mejora en la estabilidad de una enzima
también aumenta la variedad de condiciones dónde puede utilizarse y la vida útil del
biocatalizador. Publicaciones recientes han demostrado que algunas lipasas inmovilizadas en
octil agarosa pueden estabilizarse por la presencia de ciertos aditivos en el medio de reacción
[106–108]. Por ejemplo, los cationes manganeso y calcio (a una concentración de 5 mM) son
capaces de estabilizar en gran medida CRL y RML inmovilizadas vía activación interfacial en el
soporte octil agarosa, cuando están presentes durante la inactivación a pH 5,0 y 7,0 (en un factor
de 20 a 50 veces) [106]. Esta estabilización no se observó para las lipasas libres o inmovilizadas
solo covalentemente, por lo que el efecto del aditivo sobre la estabilidad de la enzima depende
del protocolo de inmovilización. De hecho, el protocolo de inmovilización tiene un papel
fundamental sobre las propiedades de la enzima [22–25], por lo que este hecho no es
sorprendente, y puede deberse a las diferentes formas que adquiere la enzima al inmovilizarse
en las diferentes preparaciones enzimáticas (Figura 1.3): las lipasas inmovilizadas vía activación
interfacial en octil agarosa poseen su forma abierta adsorbida y estabilizada en la superficie
hidrófoba de los soportes [75–79], mientras que las lipasas inmovilizadas por unión covalente
mantienen el equilibrio entre la conformación cerrada y abierta de la lipasa libre [60,61,68–71].
En cuanto a los datos obtenidos mediante el uso de enzimas libres, estos pueden ser objeto de
debate, teniendo en cuenta la tendencia de las lipasas libres a formar agregados de lipasa-lipasa
dependiendo de las condiciones de reacción [72,73], que pueden influir en los resultados finales.
(a) (b)
Equilibrio
Forma abierta conformacional
estabilizada

Figura 1.3. Conformación de las lipasas inmovilizadas en distintos soportes. (a) Lipasa
inmovilizada vía activación interfacial sobre soportes hidrofóbicos: forma abierta y
estabilizada de la lipasa. (b) Lipasa inmovilizada por unión covalente en el soporte: mantiene
el equilibrio entre la conformación cerrada y abierta de la lipasa.

7
 Introducción

En otro ejemplo, la presencia de una alta concentración de NaCl durante la inactivación,

supuso un incremento en la estabilidad de TLL inmovilizada en octil agarosa [108]. Además,
este efecto positivo sobre la estabilidad fue mucho más significativo en la preparación altamente
cargada, lo cual puede ser debido a las interacciones intermoleculares entre las enzimas
inmovilizadas (interacciones enzima-enzima), debido a su proximidad en el soporte [108,109].
Sin embargo, también se ha demostrado que el efecto de un aditivo sobre la estabilidad
de las lipasas inmovilizada sobre soportes hidrofóbicos no siempre es positivo. En un artículo
científico, los autores analizaron el efecto de los aniones fosfato sobre la estabilidad de CALB,
LEU y TLL inmovilizadas vía activación interfacial y posteriormente de manera covalente en el
soporte heterofuncional octil-glioxil agarosa [110]. Las enzimas se inactivaron
significativamente usando fosfato de sodio a pH 7,0 (incluso 100 mM), por lo que la presencia
de aniones fosfato producía una disminución significativa en la estabilidad de las enzimas
inmovilizadas.

1.3.1.2. Modulación de las propiedades enzimáticas por la alteración de las condiciones

de inmovilización
Debido a la gran flexibilidad del centro activo de las lipasas [60,61,68–71], las
propiedades de estas enzimas pueden modificarse en gran medida por las condiciones del medio
y durante su inmovilización (alterando el grado de unión covalente multipuntual, la orientación
de la enzima, el entorno enzimático, etc.) [22–25]. Aunque la inmovilización vía activación
interfacial sobre soportes hidrofóbicos se basa en una interacción reversible, involucra el gran
bolsillo hidrofóbico de la enzima, es decir, la adsorción es causada por muchas interacciones
superficiales débiles y se vuelve bastante fuerte [75–79]. Por lo tanto, es posible que tras la
inmovilización de las lipasas sobre estos soportes, se mantenga la estructura producida bajo
unas condiciones de inmovilización específicas, dando lugar a enzimas inmovilizadas con
diferentes propiedades (Figura 1.4). De hecho, una publicación previa sugiere que las
propiedades de TLL inmovilizada mediante activación interfacial en soportes hidrofóbicos
depende del valor de pH de inmovilización produciendo biocatalizadores con o sin la capacidad
de modificar la posición 2 de los triglicéridos, es decir, con diferente regioselectividad [111]. En
este informe se utilizaron altas cargas de enzima, por lo que no se descarta que esta variación en
las propiedades de la enzima esté relacionada con las interacciones entre las moléculas de lipasa
inmovilizadas en el soporte al encontrarse muy cerca las unas de las otras [108,109].

Soporte 2 Condición 2

Figura 1.4. Modulación de las propiedades de la lipasa mediante su inmovilización.

Producción de diferentes estructuras de lipasa al alterar el soporte o las condiciones de
inmovilización.

8
 Introducción

1.3.2. Inmovilización por intercambio iónico

El segundo método de inmovilización reversible empleado en esta tesis doctoral, es la
unión por intercambio iónico sobre soportes cargados positivamente (intercambiadores
aniónicos). Este protocolo de inmovilización permite la formación de varios enlaces iónicos
entre la enzima y el soporte (desplazando los contraiones que poseen ambas superficies) y por lo
tanto, la recuperación del soporte tras la incubación de la enzima inmovilizada con alta fuerza
iónica. Pese a que las uniones no son muy fuertes, si abundan son suficientes para generar una
inmovilización estable de la enzima. Los soportes empleados en la presente tesis doctoral están
formados por partículas porosas de agarosa activada con grupos amino.

1.3.2.1. Soportes activados con grupos monoaminoetil-N-aminoetil (MANAE)

El soporte MANAE agarosa posee grupos reactivos que exhiben estructuras de
monoaminoetil-N-aminoetil y se prepara introduciendo en la superficie del soporte grupos
amino primarios y secundarios de soportes de agarosa activados con grupos aldehído (glioxil o
epoxi) [112]. El grupo amino primario tiene un interés especial, ya que su pKa es inferior a 7,0,
lo que permitirá inmovilizar la enzima por unión covalente, a través de los grupos carboxilo de
las proteínas que utilizan la ruta de la carbodiimida [27]. Además, la existencia de una segunda
capa de aminas secundarias ionizadas (con un pKa de 10,0, confieren a estos soportes excelentes
propiedades como método para la inmovilización de proteínas por diferentes mecanismos).
Estas mismas cualidades hacen que el soporte sea un intercambiador iónico relativamente débil.

1.3.2.2. Soportes activados con polietilenimina (PEI)

La PEI es un polímero policatiónico formado por la unión de unidades de etilenimina,
que contiene grupos catiónicos amino primarios (25%), secundarios (50%) y terciarios (25%).
Además, posee varias características atractivas para su uso en biocatálisis, como una alta
densidad de cargas iónicas, pKa de entre 7,9 y 9,6, baja toxicidad, facilidad de separación del
medio y reciclaje, y es inodoro [113]. Este polímero es capaz de adsorberse físicamente sobre la
superficie del soporte o enzimas inmovilizadas mediante un fuerte intercambio iónico, y los
soportes recubiertos con PEI pueden inmovilizar otras moléculas de enzima también mediante
este tipo de adsorción física [114]. Se debe considerar que la PEI ejerce muchos efectos
positivos sobre las propiedades de las enzimas [105]: estabilización en presencia de radicales
libres o compuestos hidrofóbicos [115], prevención de la disociación de subunidades en
enzimas multiméricas [116], prevención de la desorción de enzimas físicamente inmovilizadas
[117–119] e incluso la co-inmovilización de varias enzimas [120,121] o enzimas y cofactores
[122].
La activación de los soportes recubriendo su superficie con PEI permite la
inmovilización reversible de enzimas por intercambio iónico. El carácter tridimensional del
soporte produce una adsorción física de la enzima bastante fuerte, debido a que la PEI posee
múltiples grupos de cationes a diferentes distancias, que pueden adaptarse a la distancia entre
los grupos enzimáticos. Además, este tipo de unión no proporciona ninguna rigidez estructural
significativa a la enzima, menos aun teniendo en cuenta la flexibilidad del polímero, por lo que
la estructura de la enzima no se distorsiona [105,114].
Utilizando esta estrategia, se ha encontrado que la PEI puede tener algunos efectos
positivos sobre la estabilidad de la enzima, que no están basados en la rigidificación enzimática,
por ejemplo, al generar una partición de los compuestos hidrofóbicos (como disolventes
orgánicos o gases como oxígeno) del entorno enzimático [115] o al inmovilizar enzimas
multiméricas involucrando todas las subunidades [116]. Sin embargo, la estabilización de las
enzimas es relativamente baja en comparación con la estabilización que se puede lograr con la
mayoría de enzimas utilizando inmovilización covalente multipuntual [22–24] o en las lipasas

9
 Introducción

vía activación interfacial [75–79], por lo que este tipo de inmovilización se recomienda
principalmente para enzimas muy estables o cuando el soporte es tan caro que conviene
reutilizarlo.

1.3.3. Inmovilización en soportes heterofuncionales

La inmovilización de enzimas puede ser más versátil si utilizamos soportes
heterofuncionales, con diferentes funcionalidades en su superficie, es decir, que han sido
activados con distintos grupos reactivos [103]. Los soportes utilizados en la presente tesis
doctoral poseen grupos capaces de adsorber enzimas (a través de diferentes mecanismos, como
intercambio iónico o activación interfacial) y grupos que promueven la unión covalente de las
enzimas [23,24,91]. Los grupos propuestos para realizar la adsorción física son amino y octil,
mientras que los grupos propuestos para realizar la unión covalente son glutaraldehído [104],
glioxil [123,124] o vinil sulfona [97,98]. De esta forma se produce una primera adsorción
reversible de la enzima seguida de una unión covalente, que permite la inmovilización en un
solo paso y una alta purificación de las enzimas [103]. Si el investigador puede beneficiarse de
este hecho puede ser una ventaja, pero si no tiene en cuenta la multifuncionalidad del soporte, la
comprensión de los resultados puede ser realmente compleja.

1.3.3.1. Soportes amino-glutaraldehído

El glutaraldehído es uno de los reactivos más utilizados en el diseño de
biocatalizadores. Se ha utilizado en muchos casos como agente entrecruzante de enzimas, de
enzimas y soportes y como activador de soportes [104,125–127]. El glutaraldehído es un
reactivo bifuncional con capacidad para polimerizar que puede reaccionar covalentemente con
los grupos amino primarios (ε-NH2) de la enzima (las lisinas de la enzima son los residuos
nucleófilos mayoritarios de la superficie proteica) y en menor medida con otros grupos (tioles,
fenoles e imidazoles) [128].
Por lo tanto, se espera que los soportes activados con glutaraldehído reaccionen
principalmente con los grupos amino primarios de las lisinas, sin embargo, la estructura
resultante de la reacción entre el glutaraldehído y los grupos amino esta todavía bajo discusión.
Después de la primera inmovilización por adsorción física, pueden establecerse algunos enlaces
covalentes entre la enzima y el soporte, siendo posible alcanzar cierta unión covalente
multipuntual [23,24,91]. Sin embargo, el pH utilizado para llevar a cabo la inmovilización en
soportes activados con glutaraldehído es entre 7 y 8,5 debido a la baja estabilidad del
glutaraldehído a valores de pH alcalino. En estas condiciones de inmovilización, los grupos
amino primario de las lisinas (pKa cercano a 10,5) son muy poco reactivos, dificultando una
interacción muy intensa entre la enzima y el soporte [103,104].
La multifuncionalidad de estos soportes es una consecuencia directa de la forma en que
están preparados [103,104]. Su preparación comienza con la modificación de los soportes, que
poseen grupos amino primarios, con glutaraldehído. El resultado final óptimo es un soporte que
tiene brazos espaciadores que poseen uno o dos grupos amino (grupos catiónicos que pueden
funcionar como intercambiadores de aniones), un resto bastante hidrofóbico formado por el
dímero de glutaraldehído y el grupo reactivo covalente [129]. Utilizando soportes altamente
activados, el primer evento de inmovilización suele ser por intercambio iónico, involucrando los
grupos amino del soporte, pero usando lipasas, su activación interfacial sobre las superficies
hidrofóbicas formadas por el dímero de glutaraldehído puede llegar a dar tasas de adsorción
similares a las de intercambio iónico [130]. Ambos mecanismos de inmovilización son mucho
más rápidos que la unión covalente, la cual se da posteriormente [23,24,91]. Sin embargo,
dependiendo de la enzima, el soporte y las condiciones de inmovilización, una u otra causa de
inmovilización puede ser predominante. Esto dificulta la comprensión de los resultados si no se

10
 Introducción

controla, pero puede ser una ventaja si se usa correctamente, al dar una mayor versatilidad a
estos soportes [103,104].

1.3.3.2. Soportes acil heterofuncionales

Otra función de los soportes heterofuncionales, puede ser evitar la liberación de lipasas
inmovilizadas en soportes hidrofóbicos [103]. El requisito es que la primera inmovilización
debe ser vía activación interfacial. Posteriormente, variando las condiciones, otros reactivos
introducidos en el soporte pueden establecer interacciones covalentes con la enzima, haciendo la
desorción enzimática prácticamente imposible. En esta tesis doctoral se han desarrollado dos
soportes acil heterofuncionales, activando el soporte hidrofóbico octil agarosa con grupos
glioxil (aldehído) o con grupos vinil sulfona.

1.3.3.2.1. Octil-glioxil
El uso de octil-glioxil agarosa permite una primera y rápida inmovilización a pH neutro
de las lipasas mediante activación interfacial sobre la capa grupos octil de la superficie del
soporte [75–79]. Posteriormente, la incubación a largo plazo en pH 10,0 incrementa la
reactividad del grupo amino primario de las lisinas de la enzima, y permite el establecimiento de
enlaces tipo base de Schiff (imino) entre las lipasas adsorbidas y los grupos glioxil del soporte
[99,100]. Tras la reducción del biocatalizador con borohidruro de sodio (NaBH4) el soporte
pierde su reactividad química y los enlaces imino se transforman en enlaces amino secundario
muy estables (Figura 1.5).

H3+
NH

Reducción
pH 10 NaBH4

pH 7 24 h

Soporte heterofuncional Inmovilización vía Formación del Enlace amino secundario y

octil-glioxil activación interfacial enlace imino soporte inerte

Figura 1.5. Inmovilización de lipasas sobre el soporte heterofuncional octil-glioxil.

Esta estrategia ha permitido mejorar la estabilidad de algunas enzimas, manteniendo las

ventajas de la inmovilización de lipasas vía activación interfacial sobre soportes hidrofóbicos
octil agarosa, incluso cuando la inmovilización de lipasas sobre este soporte ha permitido
obtener las preparaciones más estables descritas en la literatura [75–79]. Sin embargo, pese a
que este método ha demostrado ser de gran utilidad, presenta algunos problemas sumados a la
complejidad del protocolo de inmovilización. Por ejemplo, la enzima necesita ser estable a un
valor de pH alcalino para que se produzca la reacción covalente [99,100] y resistente a la
reducción con borohidruro de sodio. Pese a que esto no ocurre con todas las lipasas, puede
resolverse en presencia de algún agente estabilizante [107]. Además, algunas lipasas poseen
muy pocos grupos amino primarios frente al centro activo por lo que, en estos casos, un
porcentaje significativo de moléculas enzimáticas no se unen covalentemente al soporte
[99,100]. Esto puede resolverse mediante la aminación química de las lipasas, que incrementa
de forma sencilla su reactividad hacia los grupos glioxil del soporte [131].

1.3.3.2.2. Octil-vinilsulfona
Los soportes activados con divinil sulfona han demostrado ser reactivos bajo una amplia
gama de valores de pH (inmovilizando proteínas incluso a pH 5,0). Además, pueden reaccionar
con más grupos que el glioxil: grupos amino primarios y secundarios, hidroxilo, fenilo, tiol o
imidazol en diferentes condiciones de pH [97–100,132]. Tiene un brazo espaciador más largo

11
 Introducción

que el glioxil, lo que reduce los impedimentos estéricos generados por las cadenas de acilo y
facilita la reacción con grupos de la proteína que pueden no estar correctamente localizados,
produciendo una unión covalente multipuntual más intensa [133].
Los soportes de octil agarosa activados con divinil sulfona (para introducir grupos vinil
sulfona en su superficie mediante la modificación de los grupos hidroxilo), permiten una
primera inmovilización vía activación interfacial sobre los grupos reactivos hidrofóbicos y una
segunda inmovilización covalente bajo una amplia gama de valores de pH (lenta a un valor de
pH ácido, pero mucho más rápida a pH neutro o alcalino) [99,100]. Además, el bloqueo de los
grupos vinil sulfona restantes puede realizarse con una gran variedad de nucleófilos, lo cual
puede alterar positivamente las propiedades de la lipasa [133]. Esto se explica por las diferentes
interacciones entre la enzima y el soporte, que podrían promover algunos cambios
conformacionales de la enzima [23,24,91].

1.3.4. Modificación físico-química post-inmovilización

La modificación física o química de las enzimas inmovilizadas es otra solución para
evitar la liberación de las enzimas inmovilizadas reversiblemente [99–102]. Además, hay
algunas propuestas que muestran cómo estos tratamientos post-inmovilización pueden mejorar
las propiedades de la enzima inmovilizada.

1.3.4.1. Recubrimiento con PEI

Como se mencionó en el apartado 1.3.2.2., la PEI ejerce muchos efectos positivos sobre
las propiedades enzimáticas, que también se producen cuando se recubre la enzima
inmovilizada con este polímero [105]. Cabe destacar, que el entrecruzamiento físico
intermolecular de las enzimas inmovilizadas sobre soportes hidrofóbicos permite solucionar el
problema de la liberación de las lipasas bajo condiciones drásticas o en presencia de sustratos
con propiedades detergentes, sin perder la reversibilidad de la inmovilización (Figura 1.6) [117–
119]. También, puede mejorar significativamente las propiedades de las enzimas inmovilizadas,
por ejemplo, algunas lipasas inmovilizadas en octil agarosa, CALB, LEU, RML o TLL han sido
estabilizadas recubriéndolas con PEI [117,134–136]. Además, el recubrimiento con PEI ha
permitido co-inmovilizar enzimas [120,121] o enzimas y cofactores [122] y ha sido utilizado
como agente conector para la formación de multicapas de enzima [137–141].

Alta temperatura, presencia

de disolventes o detergentes

PEI
+

+
+

- -
+ +

+ +
+

- -
- -
Alta temperatura, presencia
+

de disolventes o detergentes
+

- -
- -
- -

Figura 1.6. Recubrimiento con PEI de las lipasas inmovilizadas vía activación interfacial para
evitar la liberación de las enzimas bajo condiciones drásticas o en presencia de detergentes.

12
 Introducción

1.3.4.2. Entrecruzamiento con glutaraldehído

Una de las primeras estrategias de entrecruzamiento químico de enzimas fue el uso de
glutaraldehído [104,125–127]. El tratamiento de enzimas inmovilizadas con glutaraldehído
permite prevenir la desorción enzimática y ha demostrado mejorar la estabilidad de la enzima
[125,142,143]. El entrecruzamiento intermolecular solo funcionará cuando las moléculas
inmovilizadas se encuentren muy próximas (ya sea por el uso de altas cargas de enzima, o por
una rápida tasa de inmovilización), tan cerca unas de otras que la distancia entre ellas se
encuentre en el rango de entrecruzamiento del glutaraldehído. Además, si dos grupos reactivos
de la misma molécula se enfrentan convenientemente, se producirá un entrecruzamiento
intramolecular, reforzando en algunos casos los efectos de estabilización [104,130].
Este método de entrecruzamiento produce una unión prácticamente irreversible, debido
a que la liberación de grandes agregados químicos puede ser completamente imposible incluso
bajo las condiciones más drásticas. Además, si el soporte posee aminos primarios en su
superficie, también puede darse la unión covalente entre la enzima y el soporte. Por lo tanto, es
necesario evaluar cuidadosamente la conveniencia de este tratamiento, considerando los
requisitos de estabilidad de la enzima y los riesgos reales de desorción enzimática durante el uso
del biocatalizador frente a la posibilidad de tener que descartar el soporte después de la
inactivación de la enzima [104,130].
En algunos casos, las enzimas inmovilizadas en soportes activados con PEI han sido
tratadas con glutaraldehído para conseguir una inmovilización covalente (Figura 1.7). El
tratamiento con glutaraldehído de las enzimas adsorbidas también entrecruzará el polímero que
se volverá más rígido y quizás capaz de transmitir algo de rigidez a la enzima [104,105].
Además, la enzima se modificará con glutaraldehído, en algunos casos mejorando su estabilidad
o actividad [125,142,143], pero en algunos puede ejercer efectos muy perjudiciales sobre las
propiedades enzimáticas.

Soporte activado Inmovilización por Entrecruzamiento con

con PEI intercambio iónico glutaraldehído

Figura 1.7. Entrecruzamiento con glutaraldehído de enzimas inmovilizadas reversiblemente

en soportes activados con PEI. Establecimiento de enlaces covalentes entre la enzima y el
soporte, produciéndose la pérdida de la reversibilidad.

1.3.5. Aumento de la capacidad de carga y la actividad volumétrica de

biocatalizadores de enzimas inmovilizadas
La capacidad de carga de un soporte, definida como la cantidad de enzima que puede
inmovilizarse por gramo de soporte, puede ser decisiva para la implementación final de los
biocatalizadores. Si un soporte posee una baja capacidad de carga, el biocatalizador puede
descartarse incluso si su precio, el tamaño de partícula y la resistencia mecánica son las
adecuadas para un proceso específico [91]. La selección de un soporte de inmovilización
adecuado puede reducir el impacto de la capacidad de carga en el coste total de los
biocatalizadores, ya que, si la capacidad de carga del soporte aumenta, este puede reducirse
[80].
La formación de multicapas enzimáticas, una capa de enzima sobre la anterior, puede
permitir multiplicar la capacidad de carga final del soporte y de esta forma utilizar una cantidad

13
 Introducción

menor de soporte al aumentar su actividad volumétrica o de masa, lo que disminuirá el coste del
proceso. Esta estrategia se ha utilizado principalmente en soportes y biosensores no porosos
[144,145], debido a que los soportes no porosos macroscópicos tienen un área específica baja,
pero también puede ser interesante utilizarla con soportes porosos.
Usando soportes no porosos, no hay límites para el número de capas de enzimas (Figura
1.8a), mientras que, utilizando soportes porosos, el límite será el tamaño de poro remanente en
la partícula, ya que el radio disminuirá después de la inmovilización de cada capa de enzima
(Figura 1.8b) [105]. Además, la adición de nuevas capas de enzimas puede incrementar los
problemas de difusión del sustrato: al disminuir el tamaño de los poros se produce una
reducción de la velocidad de entrada del sustrato en la partícula de biocatalizador y por lo tanto
hay una menor disponibilidad de sustrato para las enzimas de las capas inferiores [146–148].
También genera una mayor tortuosidad en la vía que debe seguir el sustrato para llegar a las
capas internas de la enzima, de forma que el sustrato no puede llegar al centro activo siguiendo
la vía más directa, sino que debe evitar las moléculas de enzima (Figura 1.8b) [149]. El
problema se maximiza si el sustrato es grande y puede sufrir problemas estéricos para penetrar
la red formada por las diferentes capas de enzimas (por ejemplo, proteasas [150]). Usando un
soporte no poroso, el único problema relevante será el incremento en la tortuosidad en el camino
que debe seguir el sustrato desde la capa superior de enzima a la capa inferior de enzima que se
encuentra en contacto con el soporte (Figura 1.8a) [149]. El punto principal a considerar para
que esta estrategia sea exitosa es mantener la actividad enzimática de las capas intermedias. La
actividad de la enzima puede jugar un papel importante en la intensidad de estos problemas, y
una enzima poco activa puede ser un buen modelo.

(a) (b)

Sustrato

Figura 1.8. Efecto de los problemas de difusión en las multicapas enzimáticas. (a) Soportes no
porosos: se incrementa la tortuosidad del camino que debe recorrer el sustrato para alcanzar
las capas internas de enzima; (b) Soportes porosos: se incrementan los problemas de difusión
(al añadir nuevas capas de enzima que disminuyen el tamaño del poro) y la tortuosidad.

El uso de polímeros, como agente conector entre capas de enzima, o cualquier otra molécula, se
encuentra ampliamente extendido [137–141]. El uso de PEI, es una buena elección ya que las
enzimas de dos capas conectadas por este polímero no interaccionarán entre ellas, sino
solamente con la PEI. Además, su uso puede aportar numerosas ventajas, como se ha descrito
en los apartados 1.3.2.2. y 1.3.4.1. [105].

14
 Introducción

1.4. Reacciones multienzimáticas

El uso simultáneo de varias enzimas en un solo reactor en forma libre, inmovilizadas o
co-inmovilizadas, produce efectos positivos sobre el rendimiento de la reacción y tiene
aplicaciones en muchos casos [33]. Por ejemplo, reacciones sencillas con sustratos
monofuncionales pueden verse beneficiadas del uso de varias enzimas, si las condiciones de
reacción van variando a medida que trascurre la misma (debido a cambios de pH [151,152] o en
la relación entre las concentraciones de sustrato y producto cuando el producto es un inhibidor
[97,153]) y ya no son óptimas para una enzima específica. En el caso de sustratos
multifuncionales puros, una enzima puede hidrolizar de forma óptima el sustrato inicial pero no
reconocer igual de bien los productos intermediarios [154–156], haciendo interesante buscar
enzimas que sean óptimas para estos sustratos. El caso de sustratos multifuncionales y
heterogéneos se discutirá en el siguiente apartado.
Las reacciones en cascada, un tipo de reacciones multienzimáticas donde el producto de
una enzima es el sustrato de la siguiente enzima y el producto de interés es el producto de la
última enzima, son indudablemente ventajosas sobre las síntesis clásicas paso a paso al eliminar
la necesidad de aislamiento y purificación de los productos intermediarios de la reacción, lo que
permite utilizar un solo reactor y reducir el coste del proceso [157–159]. Además, el uso de un
único reactor produce efectos positivos en el rendimiento de las reacciones en cascada,
permitiendo la reducción de productos intermediarios inestables o inhibidores de alguna de las
enzimas involucradas en la cascada y el desplazamiento de los equilibrios de reacción hacia la
dirección deseada. Sin embargo, existe la posibilidad de que uno de los productos de la cascada
pueda generar efectos inhibidores o inactivadores sobre las enzimas [157–159].
El diseño adecuado de las reacciones multienzimáticas en un solo reactor es complejo, y
en ciertos casos, puede ser inviable. El rango de condiciones en el que se podrá diseñar el
proceso será reducido debido a los diferentes perfiles de actividad y de estabilidad que poseerá
cada enzima, lo que dificultará encontrar las condiciones donde todas las enzimas involucradas
tengan una estabilidad y actividad suficientemente altas [33].

1.4.1. Modificación total de aceites y grasas

Los aceites y grasas son sustratos multifuncionales y heterogéneos debido a la gran
complejidad de su composición. Están formados principalmente de triglicéridos, presentando
ácidos grasos, en diferentes posiciones y dando lugar a diferentes enantiómeros, y cantidades
muy minoritarias de diglicéridos y monoglicéridos [33,160,161].
El hecho de que un aceite natural pueda presentar docenas o cientos de triglicéridos
diferentes hace que la modificación completa de aceites sea muy compleja y la especificidad
enzimática, una característica positiva en la selección de un catalizador en catálisis
convencional, puede convertirse en un problema [33,160,161]. Además, elegir una lipasa óptima
para la modificación de un aceite puede ser complicado, pues a la heterogeneidad inicial del
sustrato, se une la aparición de productos intermediarios, como diglicéridos o monoglicéridos
durante la hidrólisis de un aceite, con una gran diversidad en su composición [154–156].
En la modificación completa de aceites, el uso de una lipasa optimizada para los
componentes principales puede promover que algunos sustratos, como sustratos iniciales o
productos intermediarios, no sean reconocidos como tales y, en el peor de los casos, puedan
actuar como inhibidores, impidiendo alcanzar una conversión completa [157–159]. Además, si
se trata de un proceso hidrolítico, el pH puede variar a lo largo de la reacción [162,163] y no es
posible controlarlo utilizando agentes titrantes (ya que pueden promover la formación de
jabones). Por lo tanto, la lipasa óptima para los componentes originales bajo las condiciones de
reacción iniciales, puede ser totalmente inadecuada para modificar algunos de los

15
 Introducción

monoglicéridos finales a un pH más ácido. A causa de estos problemas, la lipasa con mejores
velocidades iniciales podría no alcanzar la modificación completa del aceite o ralentizaría la
reacción en las etapas finales [33].
Existen dos casos en los que se desea la modificación completa de todos los glicéridos
contenidos en un aceite o grasa: la hidrólisis de los sustratos para transformar todos los
glicéridos en ácidos grasos libres [162,163] y la alcoholisis de los sustratos para producir
biodiesel [51,164,165].

1.4.1.1. Síntesis de biodiesel

El biodiesel es una alternativa energética verde y renovable al uso tradicional de
combustibles derivados del petróleo. Este compuesto está formado por un conjunto de ésteres
metílicos o etílicos de ácidos grasos, generalmente derivados de aceites o grasas. Estos ésteres
no son tóxicos, son biodegradables y miscibles con diésel estándar y las emisiones durante la
combustión son menores a las del diésel [51,164,165].
La producción estándar de biodiésel se realiza mediante una transesterificación
catalizada por catalizadores alcalinos, un método muy rápido y eficiente, pero presenta algunos
problemas, como un gran consumo de energía y la aparición de algunas reacciones secundarias
que implican la oxidación de los ácidos grasos libres y la modificación de la glicerina [166,167].
Además, este tipo de catálisis requiere el uso de aceites que no contengan ácidos grasos libres
para evitar la inactivación de los catalizadores y la formación de jabones [168]. Dado que la
tendencia en la elección de materias primas para producir biodiesel es evitar la competencia con
las fuentes de alimentación humana , el uso de materiales de partida de baja calidad y mayor
acidez [169] (tales como destilados de procesamiento de aceite industrial, aceite de cocina
usado, residuos de la industria alimentaria, insectos, grasas de desechos animales, levaduras
oleaginosas, residuos orgánicos en general o aceite de algas), hacen necesario un paso previo
para la esterificación de los ácidos grasos libres utilizando otras técnicas [170,171]. Una
alternativa es la catálisis ácida, la cual reduce los requisitos de la pureza del aceite, pudiendo
catalizar tanto la esterificación como reacciones de transesterificación. Sin embargo, es un
proceso mucho menos eficaz y requiere temperaturas más altas, un gran exceso de alcohol y el
uso de reactores resistentes a la corrosión producida por el catalizador ácido [172,173].
Ante esta situación, se ha propuesto la biocatálisis y las lipasas están ganando
popularidad como catalizadores en la producción de biodiésel [36,51,165]. Estas enzimas
pueden catalizar reacciones de transesterificación y esterificación, lo que permite el uso de
aceites que presenten una gran acidez. Además, debido a su gran selectividad y especificidad y
las condiciones de reacción suaves, las lipasas no generan reacciones secundarias de las cadenas
de los ácidos grasos y producen glicerina de calidad farmacéutica (lo que facilita su purificación
y la del biodiésel). Pese a ello, la síntesis de biodiésel catalizada por lipasas es más lenta que los
procesos que utilizan catálisis alcalina o ácida y también más costosa debido al precio y la
estabilidad de las enzimas [36,51,165].
Debido al interés creciente en el uso de formulaciones líquidas de enzimas para la
producción de biodiésel [165], Novozymes® ha lanzado EVT, una lipasa que se ha propuesto
para ser utilizada como biocatalizador en la producción de biodiésel en forma libre [51]. Esta
enzima es una evolución industrial de TLL, una lipasa tradicional. Como la lipasa libre
permanece en la fase hidrofílica, la reutilización de enzimas después de un ciclo de producción
de biodiésel es factible en algunos casos, disminuyendo los costes. Sin embargo, el uso de
enzimas libres impide aprovechar las ventajas de la inmovilización para mejorar las
características de la enzima [22–25].

16
 Introducción

Como se mencionó en el apartado 1.3., una adecuada inmovilización puede mejorar las
propiedades de las enzimas [22–25] y reducir los costes gracias a la reutilización del
biocatalizador [80,81]. Por ejemplo, TLL inmovilizada en un soporte muy hidrofóbico
(partículas porosas de octadecil metacrilato), ofrece mejores rendimientos en la producción de
biodiésel que los obtenidos con catalizadores alcalinos o ácidos [174,175]. El uso de algunos
soportes de inmovilización puede producir efectos no deseados, como la acumulación de
glicerina o agua en la partícula de biocatalizador y su consecuente inactivación [176,177]. Esto
ocurre con soportes hidrofílicos como la agarosa [92], por lo que se recomienda el uso de
soportes muy hidrofóbicos para reducir la acumulación de estos compuestos hidrófilos en la
partícula de biocatalizador, como el utilizado en el ejemplo anterior.
Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente y pese a los buenos resultados
conseguidos en la síntesis de biodiesel con EVT en su forma líquida y TLL inmovilizada, la
heterogeneidad de los aceites dificulta la selección de una lipasa óptima para la producción de
biodiésel.

1.4.2. Concepto de combilipasas

Teniendo en cuenta los problemas de la modificación completa de los aceites, debido a
la multifuncionalidad y heterogeneidad del sustrato, los investigadores han propuesto como
solución el uso de mezclas de varias enzimas con diferente especificidad, selectividad y que se
ven afectadas de forma diferente bajo las condiciones de reacción, para catalizar estas
reacciones [178,179]. Estas mezclas de lipasas se han denominado combilipasas y pueden
ofrecer resultados mucho mejores, que el uso de una sola lipasa que exhibe una actividad inicial
muy alta o incluso el mejor curso de reacción global [33,180]. Sin embargo, el uso simultáneo
de varias enzimas puede ser complejo, ya que es necesario encontrar condiciones en las que
todas las enzimas puedan realizar su función de forma adecuada. Estas combilipasas pueden ser
mezclas de diferentes lipasas en su forma líquida, inmovilizadas o co-inmovilizadas o incluso
mezclas de la misma lipasa inmovilizada sobre diferentes soportes [181]. Puede encontrarse
información más detallada de los diferentes tipos de combilipasas en la revisión de Arana-Peña,
et al. [33] que puede encontrarse en los anexos.

1.5. Co-inmovilización de enzimas

La creciente relevancia de las reacciones en cascada en la biocatálisis ha despertado un
gran interés por la co-inmovilización de enzimas [157–159], la cual se define como la
inmovilización de dos o más enzimas en un mismo espacio limitado (por ejemplo, en la misma
partícula) y produce ciertas ventajas cinéticas en estas reacciones multienzimáticas, que influyen
de forma directa en la facilidad de operación, los costes, y la viabilidad del proceso [182,183].
La co-inmovilización de enzimas en un espacio confinado (como en el interior de los
poros en soportes porosos o en las multicapas en los no porosos), puede generar un aumento en
la velocidad de reacción inicial debido a que todas las enzimas de la reacción multienzimática
están expuestas a altas concentraciones de su respectivo sustrato desde el inicio de la reacción,
expresando toda su actividad en esos momentos, lo que reduce o incluso elimina el tiempo de
retardo que generalmente se encuentra usando las enzimas inmovilizadas en diferentes
partículas o en su forma libre [182,183]. Este tiempo de retardo se produce porque la
concentración de los productos intermediarios es inicialmente muy baja y no permite que las
otras enzimas implicadas en la reacción puedan expresar su actividad desde el inicio de la
reacción [157–159].
Sin embargo, pese a que el efecto real en el curso de la reacción global puede no ser tan
significativo [24], en algunos casos esta rápida acción es necesaria para alcanzar el producto
final, por ejemplo, si el producto intermediario es inestable o puede racemizar [184] o si algún

17
 Introducción

producto secundario (que se busca eliminar), destruye uno de los productos intermediarios o el
producto final [185,186]. Además, la co-inmovilización también es necesaria si se utiliza una
enzima bacteriolítica para proteger la enzima diana de los ataques de bacterias [187]. Por otro
lado, algunos artículos muestran cómo ciertos cofactores pueden reutilizarse cuando son co-
inmovilizados junto a las enzimas en la misma partícula [122,188], por lo que la co-
inmovilización puede ser un requisito y no solo una forma de mejorar el comportamiento del
proceso cinético.

1.5.1. Problemas de la co-inmovilización de enzimas

La co-inmovilización solo es razonable cuando se obtiene alguna ventaja clara, de
hecho, presenta algunos requisitos que pueden convertirse en problemas si no se tienen en
cuenta en la preparación del biocatalizador [24,182]. En algunos casos, estos problemas se
ignoran y se co-inmovilizan varias enzimas sin ninguna justificación previa o prueba alguna de
las ventajas que la co-inmovilización puede aportar al proceso global, incluso afirmando que la
intención no es producir un biocatalizador para catalizar reacciones en cascada en un reactor,
sino producir los denominados biocatalizadores multipropósito [189,190]. En este sentido, el
mejor biocatalizador multipropósito es una célula completa, donde todas las enzimas estarán
presentes y el sistema de reciclaje del cofactor estará listo para funcionar [191,192].
En cualquier caso, antes de decidir utilizar una enzima co-inmovilizada en lugar de las
enzimas inmovilizadas individualmente, se deben considerar los problemas derivados de la co-
inmovilización de enzimas. Estos se presentan a continuación y se abordan más ampliamente en
la revisión de Arana-Peña et al. [182] que puede encontrarse en los anexos.

1.5.1.1. Diferentes tamaños de las enzimas involucradas

Un factor generalmente ignorado en el diseño de biocatalizadores co-inmovilizados es
la diferencia de tamaño de las enzimas co-inmovilizadas. En el caso de soportes porosos, el
diámetro de los poros vendrá determinado por el tamaño de la enzima más grande. Sin embargo,
si el diámetro de los poros aumenta, el área específica del soporte disminuirá y con ello la
capacidad de carga de la enzima y la resistencia mecánica del soporte [91]. Esto implica una
menor actividad volumétrica de los biocatalizadores inmovilizados, con la repercusión
económica que pueda suponer. En la presente tesis doctoral se han utilizado partículas de
agarosa 4 BCL (partículas con un grado de entrecruzamiento del 4%) por lo que el tamaño del
poro es lo suficientemente grande para inmovilizar las enzimas seleccionadas.

1.5.1.2. Reducción de la capacidad de carga del soporte para cada enzima específica
Un soporte posee un área específica limitada, por lo que, si se co-inmovilizan varias
enzimas sobre la misma partícula, la cantidad de cada una de las enzimas que puede
inmovilizarse (y su actividad volumétrica) se verá reducida en comparación con la
inmovilización de las enzimas en partículas individuales [91]. Esta reducción en la carga de
cada enzima co-inmovilizada puede volverse crítica si el efecto catalítico perseguido usando una
de las enzimas solo se logra usando altas cargas de esta enzima [193]. Por lo tanto, la co-
inmovilización de dos enzimas que no se utilizan de forma simultánea no tiene sentido.
Esta competencia en la carga entre enzimas co-inmovilizadas puede resolverse si se
utilizan biocatalizadores enzimáticos multicapa [137–141,144,145] como los mencionados en el
apartado 1.3.5. Usando soportes no porosos, no hay límites para el número de capas de enzimas,
por lo que se pueden co-inmovilizar muchas enzimas diferentes usando esta estrategia.
Utilizando soportes porosos, el límite será el tamaño de poro remanente en la partícula, que
debe ser lo suficientemente grande para permitir inmovilizar la nueva capa de enzima [105].

18
 Introducción

1.5.1.3. Importancia de la distribución espacial de las enzimas

La distribución espacial de las enzimas en la partícula puede alterar las ventajas de la
co-inmovilización enzimática [194–197]. Por ejemplo, utilizando soportes porosos como los
empleados en esta tesis doctoral, si la segunda enzima implicada en la reacción se encuentra
inmovilizada en el núcleo de la partícula y la primera enzima implicada está inmovilizada en la
superficie más externa, una gran cantidad de producto de la primera enzima se difundirá hacia el
exterior y no estará disponible para la segunda enzima de la reacción [182]. Por lo tanto, la
distribución espacial óptima presentará la primera enzima de la reacción inmovilizada en el
núcleo de la partícula y la segunda en el exterior de la superficie del poro, de forma que el
producto de la primera enzima difundirá hacia la segunda enzima al salir de la partícula de
biocatalizador y será modificado en altas concentraciones. Sin embargo, esta configuración es
difícil de obtener porque es necesario que la inmovilización de las diferentes enzimas sea muy
rápida, para que su difusión hacia el interior de los poros sea muy corta y se formen coronas
concéntricas de las diferentes enzimas. De esta forma, la primera enzima inmovilizada se
encontrará en la zona más externa de los poros y sucesivamente las otras enzimas serán
inmovilizadas hacia el interior del poro [182].
En el caso de un sistema multicapa (por ejemplo de tres capas), si la enzima que se
encuentra sobre la superficie del soporte es la primera enzima en la reacción multienzimática y
la última enzima inmovilizada es la última enzima de la reacción, se pueden encontrar efectos
positivos, ya que la segunda enzima estará expuesta a una alta concentración de su sustrato
(producido por la enzima ubicada debajo de ella) y así sucesivamente (Figura 1.9) [139,140].
Enzima C, última en la reacción

Enzima B, segunda en la reacción

Enzima A, primera en la reacción

Producto 1, sustrato de B

Producto 2, sustrato de C
Orden correcto de las multicapas
Producto Final para la reacción multienzimática

Figura 1.9. Importancia de la distribución espacial en reacciones multienzimáticas utilizando

enzimas co-inmovilizadas en multicapas.

Las nuevas estrategias para conseguir una distribución espacial óptima de las enzimas
basadas en scaffolds y mutaciones enzimáticas pueden ser soluciones muy adecuadas a este
problema, ya que la reactividad de los grupos añadidos a las enzimas será, a primera vista,
similar [194–197].

1.5.1.4. Necesidad del mismo protocolo, superficie del soporte y condiciones de

inmovilización
No se puede olvidar que la inmovilización puede ser una herramienta clave para mejorar
muchas propiedades enzimáticas, desde la actividad y la estabilidad, hasta la pureza [22–25].
Utilizando enzimas inmovilizadas de forma independiente, cada enzima puede inmovilizarse
siguiendo un protocolo de inmovilización diferente y un soporte de inmovilización diferente con
diferentes grupos reactivos en su superficie [24]. Sin embargo, si todas las enzimas están
inmovilizadas en la misma partícula, todas deben estar en condiciones de inmovilización
similares (al menos durante algún tiempo) y todas deben inmovilizarse en la misma superficie
de soporte con los mismos grupos reactivos. Por lo tanto, la co-inmovilización puede hacer
imposible aprovechar al máximo la mejora de la inmovilización de las propiedades de todas las
enzimas, a menos que por coincidencia, el protocolo de inmovilización óptimo sea idéntico para
todas las enzimas involucradas [182].

19
 Introducción

Como se discutió en el apartado 1.3.3., los soportes heterofuncionales son soportes que
presentan diferentes grupos reactivos en su superficie y que pueden ser una posible solución a
este problema, ya que las enzimas pueden inmovilizarse utilizando diferentes estrategias [103].
Sin embargo, la superficie del soporte puede no ser la ideal para todas las enzimas implicadas
[91], y si se busca una solución de compromiso, puede disminuir la optimización de la enzima.
Además, sigue siendo un requisito que todas las enzimas estén en las mismas condiciones, al
menos hasta que la última enzima esté inmovilizada.
En una publicación reciente, los autores utilizaron un soporte heterofuncional formado
por dos grupos reactivos diferentes, quelato de metal (cromatografía de afinidad de iones
metálicos inmovilizados (IMAC)) y grupos glioxil (glioxil-IMAC agarosa), para co-inmovilizar
dos deshidrogenasas utilizadas para producir dihidroxiacetona a partir de glicerol [195]. Una de
las enzimas se mantenía estable y activa durante su inmovilización sobre grupos glioxil,
mientras que la otra sufría grandes disminuciones en la actividad enzimática al inmovilizarse en
esas condiciones. Dado que todas las enzimas deben encontrarse en las mismas condiciones, al
menos hasta que la última enzima esté inmovilizada, la idea es que esta última enzima sea la que
se inmovilice en las condiciones experimentales más suaves. Por lo tanto, utilizando el soporte
glioxil-IMAC agarosa, se inmovilizó en primer lugar la enzima que se mantuvo estable y activa
a pH 10 por unión covalente multipuntual sobre los grupos glioxil [123,124] y posteriormente se
inmovilizó la otra enzima mediante colas de polihistidinas en los grupos IMAC en condiciones
suaves [198,199]. Sin embargo, la menor densidad de grupos glioxil (debido a que algunos
grupos en el soporte se utilizan para introducir los grupos IMAC) y los posibles impedimentos
estéricos producidos por los grupos IMAC [103], disminuyen la intensidad de la unión
covalente multipuntual de la enzima inmovilizada sobre los grupos glioxil produciendo una
menor estabilización de la misma en comparación con los resultados obtenidos usando un
soporte monofuncional.

1.5.1.5. Diferencia significativa en las estabilidades de las enzimas co-inmovilizadas

Otro problema grave en el uso de enzimas co-inmovilizadas, es la posibilidad de que
existan diferencias muy grandes entre las estabilidades de las enzimas involucradas [24]. Este
problema, puede reducir en gran medida la viabilidad de la implementación industrial del
proceso multienzimático, ya que después de la inactivación de la enzima menos estable, será
necesario descartar no solo el soporte de inmovilización, sino un biocatalizador mucho más caro
que contiene todas las enzimas co-inmovilizadas, incluso si algunas de ellas mantienen
completamente su actividad (Figura 1.10a) [120,121]. En el caso de usar un método de
inmovilización reversible, será posible recuperar el soporte, pero las enzimas más estables serán
liberadas junto a las menos estables (Figura 1.10b).

(a) (b)

Inmovilización Inactivación de la Imposibilidad de Inmovilización Inactivación de la Liberación de ambas

irreversible enzima menos estable liberar las enzimas reversible enzima menos estable enzimas del soporte

Figura 1.10. Problemas de co-inmovilizar enzimas con diferentes estabilidades. (a) Enzimas
inmovilizadas irreversiblemente: tras la inactivación de la enzima menos estable, ambas
enzimas y el soporte deben ser descartados; (b) Enzimas inmovilizadas reversiblemente: tras
la inactivación de la enzima menos estable, ambas enzimas pueden ser liberadas del soporte,
el cual puede reutilizarse.

20
 Introducción

Sin embargo, este hecho suele ignorarse en los artículos relacionados con
biocatalizadores enzimáticos co-inmovilizados, y fue discutido por primera vez en una revisión
de García-Galán et al. [24] publicada en el año 2011.

Usando enzimas inmovilizadas de forma independiente, la solución será agregar

biocatalizadores frescos de esta enzima inestable cuando sea necesario, sin desechar o tratar los
otros biocatalizadores enzimáticos. Sin embargo, usando enzimas co-inmovilizadas, no es
posible agregar únicamente la enzima menos estable y será necesario utilizar un exceso de esta
enzima para mantener un nivel razonable de la actividad global de los biocatalizadores co-
inmovilizados, lo cual conlleva una disminución en las actividades volumétricas de las otras
enzimas [182]. Esto dificulta la optimización recomendada del diseño y modelado de los
biocatalizadores [157–159], pues debe considerarse la variación en las actividades enzimáticas a
lo largo de la vida operativa de los biocatalizadores. Además, la importancia de la inactivación
de esta enzima dependerá de su posición en la cadena de reacción.
Recientemente se ha desarrollado una estrategia que soluciona el problema de co-
inmovilizar enzimas con diferentes estabilidades, mediante la inmovilización de una enzima a
través de un mecanismo reversible (la enzima menos estable) y la inmovilización de la otra
enzima (la enzima más estable) siguiendo una estrategia diferente que permite aumentar en gran
medida sus propiedades [120]. Esta estrategia es principalmente útil cuando la enzima menos
estable es difícil de estabilizar mediante la inmovilización y la enzima más estable se inmoviliza
mediante una estrategia que aumenta enormemente su rendimiento, lo que hace factible
descartar estos efectos estabilizadores para la enzima menos estable y centrarse en la
reutilización de la enzima más estable. En este trabajo, la enzima más estable, CALB, se
inmovilizó en octil agarosa mediante activación interfacial [75–79], se recubrió con PEI y la
HQ]LPD PHQRV HVWDEOH OD ȕ-galactosidasa de Aspergillus niger ȕ-gal), se co-inmovilizó
mediante intercambio iónico [117–119]. Gracias a las diferentes estrategias de inmovilización
empleadas para cada enzima, ȕ-gal inactivada pudo liberarse al medio usando una alta fuerza
iónica, junto con algunas de las moléculas de polímero catiónico, sin afectar la actividad de la
lipasa inmovilizada. Tras un nuevo recubrimiento con la PEI, se pudo inmovilizar un nuevo lote
de ȕ-gal sobre la lipasa inmovilizada (Figura 1.11). Este proceso pudo repetirse durante muchos
ciclos, manteniéndose la actividad de la lipasa más estable intacta y recuperándose la actividad
global del biocatalizador co-inmovilizado en cada ciclo [120].

Reuso de la enzima más estable inmovilizada

CALB ȕ-gal
Alta fuerza
iónica

Inmovilización vía Recubrimiento con Inmovilización vía Inactivación de la Liberación de la

activación interfacial PEI intercambio iónico enzima menos estable enzima menos estable

Figura 1.11. Reuso de la enzima co-inmovilizada más estable: biocatalizadores preparados

inmovilizando la enzima más estable en la superficie del soporte y la menos estable sobre ella
mediante una estrategia reversible que permite su desorción.
En un informe posterior, el uso del soporte heterofuncional octil-glioxil y el tratamiento
con glutaraldehído evitaron la liberación de PEI durante la desorción de ȕ-gal y mejoraron aún
más la estabilidad de la lipasa (y en algunos casos, incluso la actividad), lo que hizo que la
estrategia de co-inmovilización fuera muy adecuada [121].

21
 Objetivos

2. Objetivos
La presente tesis doctoral afronta varios objetivos dentro de un ámbito común, el diseño
y desarrollo de nuevas estrategias para la inmovilización y la co-inmovilización de lipasas sobre
soportes hidrofóbicos. Los objetivos planteados son los siguientes:

1. Evaluación de las propiedades de lipasas inmovilizadas vía activación interfacial sobre

soportes hidrofóbicos. Este objetivo principal se desglosa en varios sub-objetivos:
a. Inmovilización de diferentes lipasas vía activación interfacial sobre soportes
hidrofóbicos para estudiar sus propiedades (por ejemplo, estabilidad) en
condiciones similares (forma monomérica y abierta).
b. Comparación de los efectos de las condiciones experimentales y del medio de
reacción sobre la estabilidad de biocatalizadores de diferentes lipasas
inmovilizadas siguiendo diferentes protocolos.
c. Estudio de la posibilidad de modulación de las propiedades finales de lipasas
inmovilizadas vía activación interfacial en soportes hidrofóbicos por alteración de
las condiciones de inmovilización.

2. Diseño de estrategias para la co-inmovilización de lipasas en soportes hidrofóbicos y

desarrollo de nuevas estrategias que solucionen los problemas derivados de la co-
inmovilización de enzimas. Este objetivo principal se desglosa en varios sub-objetivos:
a. Aumento de la capacidad de carga y actividad volumétrica de los biocatalizadores
de soportes porosos mediante la inmovilización en multicapas de lipasas
utilizando polímeros iónicos como agentes conectores entre las capas de enzimas.
b. Co-inmovilización de diferentes lipasas (combilipasas) utilizando la estrategia de
inmovilización de enzimas en multicapas unidas por polímeros iónicos.
c. Desarrollo de estrategias que permitan co-inmovilizar distintas lipasas y reusar la
enzima más estable tras la inactivación de la enzima menos estable.
i. Uso de soportes acil heterofuncionales y una inmovilización enzima a
enzima de las lipasas: inmovilización covalente de la enzima más estable
tras la primera inmovilización por activación interfacial e inmovilización
tan solo vía adsorción interfacial de la enzima menos estable.
ii. Co-inmovilización de lipasas mediante la inmovilización de la enzima más
estable por activación interfacial en soportes hidrofóbicos, su
recubrimiento con PEI e inmovilización de la enzima menos estable por
intercambio iónico sobre la capa de PEI.

22
 Publicaciones

3. Publicaciones
A continuación, se presentan las copias completas de las publicaciones que conforman
cada uno de los capítulos y subcapítulos, precedidas de una breve introducción que facilitará el
seguimiento de la presente tesis doctoral.

3.1. Capítulo I. Inmovilización de lipasas en soportes hidrofóbicos vía

activación interfacial
La inmovilización reversible de lipasas sobre soportes hidrofóbicos mediante su
mecanismo específico de adsorción física, la activación interfacial, produce la hiperactivación,
estabilización y purificación de las lipasas en un solo paso. Además, presenta las lipasas de
forma monomérica y abierta, estabilizada frente a la superficie, evitando interacciones con otros
componentes del medio que podrían interferir en los resultados.
Bajo esta premisa, en el Capítulo I de la presente tesis doctoral se han evaluado las
propiedades de varias lipasas inmovilizadas vía activación interfacial sobre soportes
hidrofóbicos, mayormente en soportes porosos de octil agarosa. Debido a la versatilidad de este
tipo de inmovilización, se ha subdividido el capítulo en tres partes para poder abordar tres ideas
muy interesantes relacionadas con este objetivo principal.
En primer lugar, se realizó una comparación de las propiedades de diferentes lipasas
inmovilizadas, aprovechando las ventajas del uso de estos soportes. Este tipo de soportes
permitieron incluso comparar las propiedades de algunas lipasas en la producción de biodiesel.
Los resultados evidenciaron que una lipasa no puede descartarse para una aplicación específica
por un resultado negativo en una condición concreta, ni se tiene garantías de que los resultados
obtenidos con una lipasa en una condición determinada se puedan extrapolar a otra.
Posteriormente se desarrolló un estudio del efecto del medio sobre la estabilidad de
varias lipasas inmovilizadas mediante este protocolo de inmovilización. Ya anteriores informes
mostraban como el efecto de algunos iones en el medio producían un incremento o un descenso
en la estabilidad de la enzima inmovilizada, que no siempre se observaba en la enzima libre o
inmovilizada bajo otros métodos. Los distintos aditivos produjeron diferente efecto sobre la
estabilidad que dependieron de múltiples variables y la interacción entre estas.
Por último, bajo la hipótesis de que las lipasas pueden presentar diferentes
conformaciones bajo diferentes condiciones, se comprobó que la inmovilización de lipasas
sobre soportes hidrofóbicos bajo distintas condiciones era capaz de mantener los cambios
producidos en la enzima, alterando así las propiedades finales de los biocatalizadores. Sin
embargo, esto solo ocurrió con algunas lipasas y no es una regla general (bajo las condiciones
estudiadas).
Todas estas investigaciones han permitido obtener valiosa información acerca de este
método de inmovilización y sus posibles aplicaciones. Además, demuestran una vez más que un
protocolo de inmovilización adecuado puede producir grandes mejoras en las propiedades
enzimáticas.

23
 Publicaciones

3.1.1. Capítulo I.I. Comparación de algunas propiedades de diferentes

lipasas inmovilizadas en soportes hidrofóbicos
3.1.1.1. Inmovilización en partículas de octil-agarosa y algunas características
catalíticas de las preparaciones comerciales de la lipasa A de Candida
antarctica (Novocor ADL): Comparación con la lipasa B de Candida
antarctica inmovilizada
Sara Arana-Peña, Yuliya Lokha y Roberto Fernández-Lafuente
En el contexto de la presente tesis doctoral, la comparación de las propiedades, sobre
todo de las estabilidades, de diferentes lipasas adquiere gran importancia. Sin embargo, la
comparación de la forma libre de las lipasas puede ser problemática debido a la posible
presencia de moléculas estabilizantes en los crudos comerciales, o a que se puedan formar
dímeros lipasa-lipasa con propiedades diferentes a las propiedades de la enzima aislada.
En el caso de las lipasas, su inmovilización vía activación interfacial sobre soportes
hidrofóbicos utiliza un mecanismo de adsorción física, específico de las lipasas, que permite la
inmovilización, purificación, hiperactivación y estabilización de las lipasas en un solo paso. La
inmovilización de lipasas mediante esta estrategia es reversible y se produce de manera
monomérica, sin riesgo de que haya dímeros lipasa-lipasa. Esto permite comparar enzimas con
la misma conformación, presentando la forma abierta de la lipasa, estabilizada por interacción
con la superficie del soporte. Además, el uso de una baja carga enzimática en el soporte evita
que se den interacciones intermoleculares entre las moléculas de lipasa (generadas por la
proximidad de las enzimas inmovilizadas) y evita que se generen problemas difusionales que
pueden alterar los resultados. El lavado final del biocatalizador inmovilizado eliminará los
demás componentes del crudo, evitando que puedan interferir en el estudio de sus propiedades.
De esta forma, la comparación entre varias lipasas tras su inmovilización utilizando este
protocolo podría ser más adecuada que si se utiliza la enzima en su forma libre o mediante otros
protocolos de inmovilización.
CALA y CALB se encuentran entre las enzimas más utilizadas en biocatálisis. Aunque
hay una gran cantidad de artículos que describen el uso de ambas enzimas inmovilizadas,
incluso en algunos casos catalizando la misma reacción, falta una comparación de ambas
enzimas cuando se inmovilizan siguiendo exactamente el mismo protocolo. Con el objetivo de
poder comparar las propiedades de ambas lipasas en las mismas condiciones, se ha seleccionado
el soporte hidrofóbico octil agarosa (partículas porosas de agarosa que poseen una capa de
grupos octil en su superficie) para inmovilizar las lipasas vía activación interfacial, en su forma
monomérica y abierta sobre una superficie idéntica (octil-lipasa).
El recubrimiento adicional de los biocatalizadores con PEI permite prevenir la
liberación de enzimas del soporte en ciertas condiciones de reacción y puede producir un efecto
positivo en las propiedades de la lipasa inmovilizada, como se había comprobado anteriormente
con CALB.
De esta forma se prepararon los biocatalizadores octil-CALA, octil-CALA recubierto
con PEI y octil-CALB, y las propiedades de las preparaciones fueron analizadas. Por un lado, se
realizó un perfil de actividad a distintos valores de pH frente a pNPB (pH de 4,0 a 9,0 a 25 ºC) y
se compararon la actividad y especificidad de ambas enzimas inmovilizadas utilizando
diferentes sustratos (p-nitrofenil butirato (pNPB), triacetina, (R)- y (S)- metil mandelato a pH
7,0 y 25 ºC) y, por otro lado, se inactivaron las preparaciones en diferentes valores de pH (pH
5,0; 7,0 y 9,0 a su temperatura de inactivación correspondiente) o en presencia de diferentes
disolventes orgánicos (90% acetonitrilo, dioxano y metanol a pH 7,0 y 25 ºC) ya que a menudo
estos disolventes se necesitan para mejorar la solubilidad de muchos compuestos hidrofóbicos,

24
 Publicaciones

para cambiar el equilibrio de una reacción en la dirección de síntesis, y en algunos casos

pueden ser uno de los sustratos de la reacción (por ejemplo, metanol o etanol para producir
biodiésel).
Tras analizar los resultados se descubrió que la inmovilización de CALA sobre octil
agarosa produjo un incremento significativo en la actividad enzimática frente a pNPB (en un
factor de 7), y el recubrimiento de este biocatalizador con PEI no tuvo efecto en la actividad de
la enzima, mientras que la inmovilización de CALB en octil agarosa redujo su actividad.
Al estudiar el perfil de actividad a distintos valores de pH frente a pNPB se observó que
después de inmovilizar la enzima en octil agarosa, se redujo la dependencia de la actividad con
el pH, dándose la actividad más alta al valor de pH más alto estudiado. El recubrimiento de
octil-CALA con PEI produjo un cambio en este perfil, con un máximo al pH más alto estudiado
(pH 9,0) y otro al valor mínimo de pH estudiado (pH 4,0). Por último, octil-CALB fue
claramente menos activo que octil-CALA en todo el rango de valores de pH estudiados, con un
máximo al valor de pH más alto estudiado.
Siguiendo con la actividad de los diferentes biocatalizadores frente a los distintos
sustratos, octil-CALA fue el biocatalizador más activo (2,5 veces) frente a pNPB mientras que
octil-CALB fue mucho más activo frente a triacetina o ambos isómeros de metil mandelato (100
veces). El recubrimiento con PEI de octil-CALA solo afectó a su actividad frente a triacetina,
reduciéndola significativamente.
En cuanto a la estabilidad a distintos valores de pH, octil-CALA fue ligeramente más
estable que octil-CALB a pH 5,0 (reteniendo un 45% frente a un 38% de la actividad),
significativamente más estable a pH 7,0 y menos estable a pH 9,0. En esta ocasión, el
recubrimiento de octil-CALA con PEI aumentó su estabilidad a pH 9,0 pero no tuvo un efecto
significativo en los otros valores de pH de inactivación.
En presencia de disolventes orgánicos, octil-CALB fue la preparación enzimática más
estable en presencia de 90% de acetonitrilo (principalmente en las primeras etapas de
inactivación) y más significativamente en 90% de metanol, dónde las preparaciones de CALA
se inactivaron completamente tras solo 10 minutos mientras que octil-CALB mantuvo el 40%
de la actividad tras 2 días. La situación fue diferente usando 90% de dioxano, siendo el octil-
CALA tratado con PEI la preparación más estable, seguida de octil-CALA y octil-CALB, que
fueron muy similares. El recubrimiento de octil-CALA con PEI aumentó significativamente la
estabilidad de octil-CALA en presencia de dioxano y marginalmente en presencia de
acetonitrilo.
El punto que podría propiciar un mayor uso de CALB podría ser la gran actividad de
esta enzima frente a triacetina o ambos isómeros de metil mandelato. Considerando la
estabilidad de los biocatalizadores los resultados son mixtos, mostrando que CALA es más
estable a pH neutro y CALB es más estable a pH alcalino, mientras que, en presencia de
disolventes orgánicos, la enzima más estable depende del mismo, destacando que octil-CALB
es mucho más estable en presencia de metanol, con el impacto que esto puede tener en la
producción de biodiésel. Así, dependiendo de la reacción específica y las condiciones
experimentales, el uso de CALA o CALB pueden ofrecer diferentes ventajas e inconvenientes.

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Publicaciones

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 Publicaciones

3.1.1.2. Inmovilización de la lipasa de Eversa® en partículas de octil agarosa y

caracterización preliminar de las características de estabilidad y actividad
Sara Arana-Peña, Yuliya Lokha y Roberto Fernández-Lafuente
Como se ha mencionado anteriormente, la inmovilización de las lipasas vía activación
interfacial sobre soportes hidrofóbicos, es un mecanismo de adsorción física que permite la
inmovilización de la lipasa en su forma monomérica y abierta sobre la superficie idéntica del
soporte y su purificación, hiperactivación y estabilización en un solo paso, por lo que este
protocolo es el muy interesante para el estudio de las propiedades de las lipasas. Por estos
motivos, Eversa® Transform (EVT), una lipasa comercial desarrollada por Novozymes®, que se
ha utilizado principalmente en la producción de biodiésel en forma libre, se ha inmovilizado
sobre soportes hidrofóbicos y se ha realizado una primera evaluación de algunas de sus
propiedades. Para analizar cómo el uso de diferentes métodos de inmovilización puede alterar
las propiedades de la enzima, EVT también se ha inmovilizado en soportes aminados.
Para ello, EVT fue inmovilizada en el soporte octil agarosa mediante activación
interfacial (octil-EVT) y se recubrió con PEI para evitar la liberación de enzimas y estudiar su
efecto en las propiedades de la lipasa. EVT también fue inmovilizada en soportes aminados
MANAE agarosa (partículas porosas de agarosa que poseen grupos amino primarios y
secundarios en su superficie) a través de intercambio iónico (MANAE-EVT), y todas las
preparaciones de EVT se compararon con CALB, una de las lipasas más utilizadas en
biocatálisis, también inmoviliza en octil agarosa (octil-CALB).
Esta comparación de las propiedades funcionales de las diferentes preparaciones de
enzimas se llevó a cabo mediante estudios de actividad frente a pNPB a varios valores de pH
(de 4,0 a 9,0 a 25 ºC), estudios de actividad y especificidad frente a varios sustratos (pNPB,
triacetina, (R)- y (S)- metil mandelato) y a diferentes valores de pH (pH 5,0; 7,0 y 9,0 a 25 ºC) y
estudios de estabilidad, en función del pH (pH 5,0; 7,0 y 9,0 a su temperatura de inactivación
correspondiente), en presencia de disolventes orgánicos (90% acetonitrilo, dioxano y metanol a
pH 7,0 y 25 ºC) y en presencia de iones (a su temperatura de inactivación correspondiente), pues
se ha publicado recientemente que los aniones fosfato tienen un efecto muy negativo sobre la
estabilidad a pH 7,0 de varias lipasas inmovilizadas en octil agarosa y hay algunos cationes
como el calcio que han demostrado tener efectos positivos sobre la estabilidad de algunas
lipasas.
Tras la inmovilización de EVT sobre octil o MANAE agarosa, mantuvo su actividad y
el recubrimiento de octil-EVT con PEI no tuvo efecto en la actividad de la enzima, mientras que
la inmovilización de CALB en octil agarosa redujo su actividad. Los rendimientos de
inmovilización en octil fueron superiores al 95% mientras que para la inmovilización de EVT en
MANAE agarosa fue alrededor del 80%.
Al comparar la actividad frente a pNPB a distintos valores de pH, todas las
preparaciones de EVT fueron mucho más activas que octil-CALB, excepto MANAE-EVT y
EVT libre (a pH 4,0), las cuales, además, se comportaron de manera muy similar en todos los
valores de pH. La actividad máxima se observó en todos los casos al pH más alto estudiado (pH
9,0) y en el caso de EVT todas las preparaciones tuvieron una actividad similar a pH 7,0. La
mayor diferencia al comparar las actividades de las distintas preparaciones de EVT se dio entre
el octil y la enzima libre a pH 9,0. Después de la inmovilización de EVT en octil agarosa, se
redujo la dependencia de la actividad con el pH: la actividad casi permaneció inalterada a pH
7,0; a valores de pH más ácidos esta aumentó y a pH más alcalinos se redujo. El recubrimiento
de octil-EVT con PEI no tuvo un efecto significativo a pH neutro, pero en todos los demás
valores de pH produjo un aumento muy significativo en la actividad (por ejemplo, a pH 4,0; de
33 a 130 Unidades de actividad enzimática (U, definida como la cantidad de enzima que cataliza

27
 Publicaciones

la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto) por mg de enzima y a pH 9,0; de 240 a 330 U

por mg de enzima).
Continuando con la actividad de los diferentes biocatalizadores frente a los distintos
sustratos, octil-EVT fue más activa que octil-CALB frente a pNPB y triacetina, pero mucho
menos activo frente a ambos isómeros de metil mandelato, mientras que octil-CALB fue más
activo que MANAE-EVT frente a todos los sustratos (excepto frente a triacetina a pH 9,0).
Además, la especificidad y la respuesta a los cambios en el medio de EVT fueron modulados en
gran medida por el método de inmovilización. Por ejemplo, frente a triacetina y los isómeros de
metil mandelato, octil-EVT presentó la actividad máxima a pH 5,0 con una caída a pH 9,0 (en
oposición al comportamiento con pNPB), mientras que MANAE-EVT, con triacetina como
sustrato tuvo una actividad óptima a pH 9,0 y la menor a pH 5,0; y frente a los isómeros de
metil mandelato posee una actividad óptima a pH 7,0 y la menor a pH 5,0. Esta alteración en la
especificidad también se dio por el recubrimiento de la enzima inmovilizada con PEI,
aumentando su actividad frente a pNPB y triacetina (a pH 5,0 y 9,0) y disminuyéndola frente a
los isómeros de metil mandelato.
La inmovilización sobre el soporte hidrofóbico mejoró en gran medida la estabilidad de
EVT bajo todas las condiciones estudiadas, mucho más que la inmovilización sobre el soporte
aminado, sin embargo, el recubrimiento con PEI no tuvo un efecto claro sobre estabilidad de
octil-EVT. Octil-EVT fue mucho más estable que octil-CALB a pH 9,0 (reteniendo el 60% de la
actividad tras 2 horas, mientras que octil-CALB se inactivó hasta el 15% de su actividad inicial
a los 15 minutos), similar a pH 7,0, pero menos estable a pH 5,0 (reteniendo solo un 15% de la
actividad, frente al 60% que retuvo octil-CALB tras 2 horas). En presencia de 90% de
acetonitrilo todas las preparaciones de EVT fueron más estables que octil-CALB, sufriendo
MANAE-EVT una gran hiperactivación que se mantuvo en el tiempo. En 90% de dioxano,
ambas enzimas mantuvieron la actividad de forma similar después de 45 días, mostrando octil-
EVT recubierto con PEI la actividad más alta (120%) seguida de cerca por octil-CALB. Sin
embargo, en 90% de metanol, los resultados fueron muy diferentes, y octil-CALB se volvió
mucho más estable que las preparaciones de EVT. Por último, la presencia de iones tuvo
algunos efectos sobre la estabilidad de octil-EVT: un efecto positivo del calcio y un efecto
negativo del fosfato (factores de 2 a 3 veces), que se redujo en la preparación recubierta con
PEI, mientras que para MANAE-EVT y octil-CALB solo los aniones fosfato fueron negativos
para su estabilidad.
La inmovilización de la enzima en octil agarosa ha permitido mejorar la estabilidad de
la enzima en una amplia gama de condiciones, mucho más que la inmovilización en MANAE
agarosa y en algunos casos es más estable y activo que CALB. Por todo ello, EVT puede ser un
biocatalizador prometedor para muchos procesos diferentes a la producción de biodiésel y sus
propiedades pueden mejorarse en gran medida siguiendo un protocolo de inmovilización
adecuado, como su inmovilización sobre soportes hidrofóbicos.

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 Publicaciones

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 Publicaciones

3.1.1.3. Biocatalizadores inmovilizados de Eversa® Transform 2.0 y la lipasa de

Thermomyces lanuginosus: Comparación de algunas propiedades y
rendimiento en la producción de biodiésel
Javier A. Martínez-Sánchez, Sara Arana-Peña, Diego Carballares, Malcom Yates, Cristina
Otero y Roberto Fernández-Lafuente
Dado que EVT es una formulación enzimática desarrollada por Novozymes® como una
evolución de TLL, especializada en la producción de biodiésel en forma líquida, se han
comparado las propiedades de diferentes biocatalizadores de TLL o EVT inmovilizadas bajo el
mismo protocolo, para estudiar las diferencias funcionales reales entre la enzima original y la
nueva propuesta industrial. Para ello, ambas enzimas se han inmovilizado en soportes
hidrofóbicos, ya que en anteriores informes ha mostrado mejorar TLL, incrementando su
rendimiento como catalizador para la producción de biodiésel. Además, es el protocolo más
interesante para la comparación entre varias lipasas, al inmovilizarlas en su forma monomérica
y abierta sobre la misma superficie.
En un primer estudio, se compararon las estabilidades de ambas enzimas inmovilizadas
en octil agarosa (octil-TLL y octil-EVT) en función del pH (pH 5,0; 7,0 y 9,0 a su temperatura
de inactivación correspondiente) y en presencia de disolventes orgánicos (90% acetonitrilo,
dioxano o metanol a pH 7,0 y 25 ° C) o iones (aniones fosfato y cationes calcio a pH 7,0 y su
temperatura de inactivación correspondiente). Sin embargo, la agarosa no se recomienda para su
uso en la producción de biodiésel debido a la relevancia del agua en la estructura de este
soporte. Si el soporte es hidrofílico, los subproductos hidrofílicos de la producción de biodiésel
(agua o glicerina), tienden a acumularse en el entorno enzimático inhibiendo o inactivando la
enzima inmovilizada, por lo que se recomienda el uso de un soporte muy hidrofóbico para
reducir la acumulación de estos compuestos hidrófilos en la partícula de biocatalizador. Por esta
razón, TLL y EVT se inmovilizaron en partículas de octadecil metacrilato, un soporte
hidrofóbico poroso producido por Purolite® que es válido para su uso en cualquier medio
anhidro y que anteriormente ha permitido mejorar el rendimiento de TLL en la producción de
biodiésel. A diferencia de los otros ensayos, se prepararon biocatalizadores con cargas cercanas
al máximo de la capacidad del soporte de ambas enzimas para realizar una comparación
equitativa de ellos en la síntesis de biodiésel. Posteriormente, los biocatalizadores de enzima
inmovilizada se recubrieron con PEI, para evitar la liberación de la enzima del soporte y
analizar cómo afecta esta modificación a la actividad hidrolítica de ambas enzimas
inmovilizadas, y se realizó un estudio del diámetro del poro del soporte con la ayuda del Prof.
Malcom Yates. Finalmente, se estudió la actividad de ambos biocatalizadores frente a diferentes
sustratos (triacetina, (S)- metil mandelato a pH 7,0 y 4 o 25 ° C respectivamente) y con la ayuda
de la Prof. Cristina Otero, se comparó el rendimiento de ambas enzimas inmovilizadas como
catalizadores en la producción de biodiésel a partir de metanol y aceite de girasol, utilizando
tert-butanol como disolvente para conseguir una buena mezcla de los sustratos y reducir los
problemas de difusión del sustrato.
Los resultados obtenidos al inmovilizar una baja carga de las lipasas en octil agarosa
mostraron que el incremento de la actividad frente a pNPB después de la inmovilización sobre
octil agarosa fue de 2,5 veces para octil-TLL y 1,6 veces para octil-EVT, pero esta
hiperactivación se redujo significativamente al incrementar la carga de enzima inmovilizada en
el soporte.
Siguiendo con la estabilidad, EVT libre e inmovilizada en octil agarosa fueron más
estables que las preparaciones de TLL en todos los valores de pH estudiados (más intensamente
a pH 9,0 y 7,0) y presenta menor sensibilidad a la presencia de aniones fosfato que TLL, donde
el efecto del fosfato de sodio fue más significativo con octil-TLL, que se volvió menos estable
que TLL libre. Octil-EVT fue más estable en presencia de 90% de metanol (reteniendo el 75%

30
 Publicaciones

de la actividad, mientras que octil-TLL solo retuvo el 37% tras 6 horas) o en 90% de dioxano
(reteniendo el 90% de la actividad, mientras que octil-TLL solo retuvo el 20% tras 1750 horas).
Por otro lado, las enzimas fueron inmovilizadas en octadecil metacrilato, utilizando
biocatalizadores completamente cargados para realizar una comparación justa en la síntesis de
biodiésel. Ambos biocatalizadores presentaron una carga de enzima cercana al máximo de la
capacidad del soporte (el cual posee un diámetro medio de poro de 38 nm en condiciones de
secado) muy similar, de 20-22 mg de enzima por g de soporte. Esto produjo una reducción del
diámetro de poro muy similar para ambas enzimas, a 20,8 nm con EVT y a 22,5 nm con TLL, lo
que confirma que la enzima llena los poros.
Siguiendo con la actividad de TLL y EVT inmovilizadas en octadecil metacrilato frente
a triacetina y (S)- metil mandelato, los valores fueron similares usando triacetina como sustrato,
sin embargo, el biocatalizador de TLL fue más activo que el de EVT frente a (S)- metil
mandelato (2,1 U por g frente a 1,54 U por g de biocatalizador). Estos resultados sugieren
algunas diferencias en la especificidad enzimática, pero no fueron muy significativas. El
recubrimiento de los biocatalizadores de enzimas inmovilizadas con PEI promovió una
disminución del 20% en la actividad frente a triacetina en ambos casos (estos resultados
negativos del efecto del recubrimiento con PEI sobre las lipasas difieren con publicaciones
anteriores), mientras que con (S)- metil mandelato la variación no fue significativa.
Finalmente, se analizó el rendimiento de ambas enzimas inmovilizadas en la producción
de biodiésel utilizando metanol y aceite de girasol como sustratos. Como referencia, se utilizó
Lypozyme® TL IM, una preparación comercial de TLL inmovilizada. Los biocatalizadores
inmovilizados en octadecil metacrilato de EVT y TLL ofrecieron cursos de reacción más
rápidos que los observados usando la enzima inmovilizada comercial, pero muy similares entre
ellos. Además, el recubrimiento del biocatalizador EVT con PEI no fue positivo para el
rendimiento de la enzima inmovilizada en esta reacción bajo estas condiciones, disminuyendo la
velocidad de reacción. Es decir, la ventaja esperada de EVT frente a TLL en la producción de
biodiésel no se encontró con las lipasas inmovilizadas sobre el mismo soporte en las
condiciones estudiadas.
Por lo tanto, pese a que la inmovilización de EVT y TLL en soportes hidrofóbicos
permite comparar las propiedades de la nueva propuesta industrial y de la enzima original, esta
comparación solo mostró una mejora en la estabilidad para octil-EVT en todas las condiciones
estudiadas. El rendimiento de ambas enzimas es bastante similar en la producción de biodiésel
pese a que EVT se desarrolló principalmente para mejorar su rendimiento en este proceso, pero
en forma líquida. Por lo tanto, la inmovilización en octadecil metacrilato, que había mostrado
gran mejoría para TLL, minimiza la ventaja inicial de EVT frente a la enzima original como
catalizador en la producción de biodiésel.

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3.1.2. Capítulo I.II. Efecto de la composición del medio en la estabilidad

de las lipasas en función del método de inmovilización y las
condiciones experimentales
3.1.2.1. Influencia de los aniones fosfato sobre la estabilidad de enzimas inmovilizadas.
Efecto de la naturaleza de la enzima, protocolo de inmovilización y
condiciones de inactivación
Jakub F. Kornecki, Diego Carballares, Roberto Morellón-Sterling, El Hocine Siar, Saeid
Kashefi, Mazri Chafiaa, Sara Arana-Peña, Nathalia S. Rios, Luciana R.B. Gonçalves y Roberto
Fernández-Lafuente
Recientemente, se ha demostrado que los aniones fosfato tienen un efecto muy negativo
sobre la estabilidad a pH 7,0 de varias lipasas inmovilizadas vía activación interfacial en
soportes heterofuncionales octil-glioxil garosa. En el marco de la presente tesis doctoral, se
intenta comprobar si este efecto negativo de los aniones fosfato sobre la estabilidad de la lipasa,
cuando se inmovilizan mediante activación interfacial, puede considerarse un fenómeno
universal extensible a otras lipasas y si se mantiene al utilizar otros métodos de inmovilización y
en otras condiciones.
Se seleccionaron algunas de las lipasas más utilizadas para realizar el estudio (CALA,
CALB, CRL y RML) y se inmovilizaron vía activación interfacial en octil agarosa (octil-lipasa)
y mediante unión covalente en el soporte heterofuncional amino-glutaraldehído agarosa
(partículas porosas de agarosa que poseen grupos amino y glutaraldehído en su superficie)
(glutaraldehído-lipasa). Posteriormente, los biocatalizadores fueron inactivados en presencia de
100 mM de fosfato de sodio, HEPES o TRIS a pH 7,0 (a su temperatura de inactivación
correspondiente). Además, las preparaciones de octil-lipasa fueron inactivadas en presencia de
aniones fosfato a diferentes valores de pH (pH 5,0; 7,0 o 9,0 a su temperatura de inactivación
correspondiente) y también se estudió si la presencia de altas concentraciones de NaCl era capaz
de revertir los posibles efectos negativos que puede ocasionar la presencia de aniones fosfato.
Los resultados mostraron que cuando la enzima fue inmovilizada en octil agarosa, la
estabilidad de los biocatalizadores en presencia de fosfato de sodio fue mucho más baja
mientras que las diferencias entre HEPES y TRIS no fueron muy grandes.
Sin embargo, los resultados fueron muy diferentes cuando se inmovilizaron las lipasas
en amino-glutaraldehído agarosa. Con glutaraldehído-CALA y glutaraldehído-CRL se mantuvo
el efecto negativo de los aniones fosfato (siendo las diferencias mucho menores que las
encontradas con octil agarosa) y el uso de HEPES y TRIS dieron estabilidades similares en
ambos casos. Sin embargo, el fosfato no tuvo efecto sobre la estabilidad de la enzima para
glutaraldehído-CALB, siendo las estabilidades muy similares a las obtenidas en presencia de
HEPES y TRIS (resultado muy diferente al obtenido con octil-CALB). Finalmente, para
glutaraldehído-RML, el uso de HEPES y fosfato de sodio dio una estabilidad similar y menor
que con TRIS, en contraposición a los resultados obtenidos con octil-RML, donde el HEPES
permitió obtener la mayor estabilidad de la enzima.
Estudiando más a fondo las preparaciones de octil, el uso de altas concentraciones de
NaCl en octil-RML pudo revertir los efectos negativos del fosfato de sodio en las primeras
etapas de inactivación, pero tuvo un efecto negativo usando TRIS. Las estabilidades de octil-
CALA y octil-CRL se redujeron cuando se inactivaron en presencia de esta sal, tanto usando
fosfato de sodio como TRIS.
También se estudió el efecto de los aniones fosfato en las preparaciones de octil agarosa
a diferentes valores de pH. Cuando la inactivación se realizó a pH 5,0 sólo octil-CALB se
desestabilizó en gran medida por los aniones fosfato. A pH 9,0 (utilizando bicarbonato de sodio

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como tampón), la presencia de 100 mM de fosfato de sodio no tiene un efecto negativo

significativo, de hecho, las mayores diferencias de estabilidad se dan entre 10 mM y 100 mM de
bicarbonato de sodio para CALB y CRL.
Los resultados obtenidos confirmaron el efecto negativo de los aniones fosfato para la
estabilidad a pH 7,0 de todas las lipasas estudiadas cuando son inmovilizadas en octil agarosa,
mientras que cuando fueron inmovilizadas en amino-glutaraldehído agarosa el efecto observado
fue menor, menos significativo para glutaraldehído-CALA y llegando a desaparecer en el caso
de glutaraldehído-CALB. Al variar el pH a 5,0 o 9,0; sólo se produjo un efecto negativo de los
aniones fosfato para octil-CALB a pH 5,0. De esa forma, parece que cuando las lipasas se
inmovilizan mediante activación interfacial son especialmente sensibles a la presencia de
aniones fosfato a pH 7,0 (lo cual difiere con las lipasas inmovilizadas en amino-glutaraldehído
agarosa), siendo realmente negativos para la estabilidad de las lipasas de forma universal,
estando más relacionado con alguna peculiaridad de la estructura de las lipasas inmovilizadas en
estos soportes que con el grado de ionización del fosfato.

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3.1.2.2. Efecto de soluciones de sales concentradas sobre la estabilidad de las enzimas

inmovilizadas: Influencia de las condiciones de inactivación y protocolo de
inmovilización
Sabrina Ait Braham, El Hocine Siar, Sara Arana-Peña, Hossein Bavandi, Diego Carballares,
Roberto Morellón-Sterling, Diandra de Andrades, Jakub F. Kornecki y Roberto Fernández-
Lafuente
Como han demostrado publicaciones anteriores, las lipasas inmovilizadas por activación
interfacial en el soporte hidrofóbico octil agarosa poseen algún tipo de peculiaridad en su
estructura que les hace sensibles a la presencia de aniones fosfato a pH 7,0, disminuyendo
significativamente su estabilidad. Para comprobar si este comportamiento puede extrapolarse a
otras condiciones, se ha propuesto estudiar el efecto de una alta fuerza iónica sobre la
estabilidad de las enzimas, ya que, de forma habitual, estas pueden conservarse, purificarse o
incluso utilizarse en medios que contengan altas concentraciones de sales.
Por todo ello se estudió el efecto de la alta fuerza iónica sobre la estabilidad de varias
lipasas (CALA, CALB, CRL, RML y EVT), empleando diferentes sales en el medio de
inactivación para analizar el efecto de la naturaleza y concentración de la sal (1 o 3 M de sulfato
de amonio, (NH4)2SO4; 1 M de sulfato de sodio, Na2SO4 y 1 o 3 M de cloruro de sodio, NaCl),
usando enzimas inmovilizadas en octil agarosa (octil-lipasa) o amino-glutaraldehído agarosa
(glutaraldehído-lipasa), para evitar la agregación enzimática que puede dificultar la
comprensión de los resultados y para comprobar si el uso de diferentes técnicas de
inmovilización permite alterar la respuesta de las propiedades de la enzima a los cambios en el
medio, como se ha observado anteriormente. Por último, las inactivaciones se realizaron a
diferentes valores de pH (pH 5,0; 7,0 y 9,0 a su temperatura de inactivación correspondiente).
Los resultados mostraron que, a diferencia de los datos obtenidos con iones fosfato, no
existe una regla universal que indique que un protocolo de inmovilización dará los
biocatalizadores finales más sensibles a la presencia de estas altas concentraciones de sales. Sin
embargo, el efecto de una alta fuerza iónica sobre la estabilidad de las lipasas dependió de la
naturaleza de la sal, su concentración y el valor de pH de inactivación.
Como regla general, pero no universal, la presencia de 3 M de (NH4)2SO4 estabilizó las
lipasas, siendo esta la condición que promovió la mayor estabilización en la mayoría de los
casos. Ambas preparaciones de CALA inactivadas a pH 9,0 y octil-EVT a pH 5,0 fueron las
únicas excepciones a este comportamiento. Mientras tanto, el NaCl no siguió una regla
específica, siendo negativo para la estabilidad de algunas de las lipasas inmovilizadas analizadas
en determinadas condiciones, como en las preparaciones de CALA para todos los valores de pH,
salvo octil-CALA a pH 5,0; en el caso de glutaraldehído-CALB a pH 9,0; en las preparaciones
de CRL a pH 7,0 y 9,0; en octil-RML a pH 7,0 y glutaraldehído-RML a pH 9,0 o para ambas
preparaciones de octil-EVT en todas las condiciones estudiadas. La explicación no siempre se
debió a los cationes sodio, ya que en algunos casos la presencia de NaCl desestabiliza mientras
que el Na2SO4 estabiliza, cómo es el caso de glutaraldehído-CALA a pH 5,0; de glutaraldehído-
CALB a pH 9,0; en glutaraldehído-CRL a pH 7,0 e incluso más que el 1M de (NH4)2SO4 cómo
es el caso de octil-CALA y glutaraldehído-CALA a pH 7,0 o de octil-RML a pH 7,0.
Además, el efecto de una sal específica dependió de su concentración. Hubo casos
donde el efecto negativo de la sal disminuyó al aumentar su concentración, como fue el caso de
NaCl en glutaraldehído-CALA a pH 5,0; en glutaraldehído-CALB a pH 9,0; en octil-RML a pH
7,0 o en el caso de (NH4)2SO4 en las preparaciones de octil-CALA a pH 9,0 u octil-EVT a pH
5,0 y en algunos casos llegando incluso a ser positivo, como en el caso de NaCl en
glutaraldehído-RML a pH 9,0 o el caso de (NH4)2SO4 en las preparaciones de octil-CRL a pH
7,0; octil-RML a pH 7,0 u octil-EVT a pH 7,0. Mientras que, en otros casos, el efecto negativo
de la presencia de sales sobre la estabilidad de la enzima aumentó con la concentración de sal,

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como en el caso de NaCl en las preparaciones de octil-CALA a pH 7,0; CRL a pH 7,0; octil-
EVT a pH 7,0 y 9,0.
En cuanto a la relación del pH de inactivación con la presencia de sal sobre los efectos
sobre la estabilidad enzimática, normalmente (nuevamente no es una regla universal) los efectos
estabilizantes pudieron encontrarse con mayor frecuencia a pH 5,0 o 7,0, mientras que a pH 9,0
se pudo observar un efecto muy negativo una alta fuerza iónica en las preparaciones de CALA y
CRL. Pero una vez más y al igual que ocurre con en el efecto de una alta fuerza iónica sobre la
estabilidad de las lipasas en función del protocolo de inmovilización, no existen reglas
generales.
Si bien el uso de una alta concentración de sal suele tener algunos efectos sobre la
estabilidad de las lipasas, la intensidad y la condición de estos efectos dependen en gran medida
de la naturaleza y la concentración de la sal, el pH de inactivación o el método de
inmovilización. La misma sal puede ser un agente estabilizador o desestabilizador de una lipasa
específica dependiendo de alguno de estos factores, por ejemplo, se ha observado que el uso de
altas concentraciones de (NH4)2SO4 generalmente produce las estabilidades más altas, pero no
es universal. Por lo tanto, los resultados confirman la gran imposibilidad de prever el efecto de
una alta fuerza iónica en una determinada lipasa inmovilizada, incluso en ausencia de
agregaciones, siendo necesario estudiarlo empíricamente en cada caso.

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3.1.2.3. Efecto positivo del glicerol sobre la estabilidad de las enzimas inmovilizadas:
¿Es un hecho universal?
Sabrina Ait Braham, El Hocine Siar, Sara Arana-Peña, Hossein Bavandi, Diego Carballares,
Roberto Morellón-Sterling, Diandra de Andrades, Jakub F. Kornecki y Roberto Fernández-
Lafuente
Tras detectarse el efecto negativo de los aniones fosfato sobre la estabilidad de las
lipasas (el cual sólo es universal cuando estas son inmovilizadas vía activación interfacial sobre
soportes hidrofóbicos y a pH 7,0), se ha planteado si esta sensibilidad de las lipasas
inmovilizadas sobre soportes hidrofóbicos a ciertos componentes en el medio puede ser
extrapolable cuando se usan otros compuestos, por ejemplo, agentes estabilizantes como el
glicerol.
El glicerol se ha descrito como un compuesto capaz de estabilizar algunas enzimas, muy
barato y que interfiere mínimamente con la función catalítica enzimática. La mayoría de estos
estudios están relacionados con enzimas libres, por lo que la posible agregación enzimática
podría explicar los efectos estabilizadores del glicerol, al menos parcialmente. Sin embargo, una
publicación reciente concluyó que el glicerol incrementó la estabilidad de TLL inmovilizada
mediante activación interfacial en octil agarosa, además, ha sido utilizado como aditivo para
estabilizar las enzimas a un valor de pH alcalino, necesario en el protocolo de inmovilización de
enzimas en soportes glioxil agarosa.
En este trabajo se presenta un estudio del efecto del glicerol en las estabilidades de
algunas lipasas, CALA, CALB, CRL, RML y EVT, inmovilizadas en octil agarosa (octil-lipasa)
y amino-glutaraldehído agarosa (glutaraldehído-lipasa). Ambas estrategias de inmovilización
siguen mecanismos de inmovilización completamente diferentes, lo que permite analizar si el
efecto del glicerol sobre la estabilidad enzimática depende de la estrategia de inmovilización o
no, como ha ocurrido con otros aditivos. Además, se estudió si este posible efecto estabilizador
del glicerol sobre las lipasas inmovilizadas depende de su concentración (15%, 30%, 45% y
60%) o del valor del pH de inactivación (pH 5,0; 7,0 y 9,0 a su temperatura de inactivación
correspondiente).
Tras analizar los resultados, se pudo observar que el efecto estabilizador enzimático del
glicerol no es universal para todas las lipasas y condiciones ensayadas (el glicerol no presentó
ningún efecto en el caso de glutaraldehído-EVT a pH 5,0 y 7,0), pero las estabilizó en la
mayoría de los casos, dependiendo en gran medida de la enzima, el método de inmovilización,
la concentración de glicerol y el pH de inactivación. Pese a ello, se encontraron algunas
tendencias en los efectos del glicerol en determinadas condiciones.
En la mayor parte de los casos, la estabilidad se incrementó al incrementar la
concentración de glicerol en el medio de inactivación, pudiendo ser las diferencias entre estos
valores mayores o menores dependiendo de la preparación estudiada. Sin embargo, esto no
ocurrió siempre, en algunos casos, la estabilidad alcanzó un máximo a una concentración de
glicerol y luego el efecto estabilizador decayó al incrementarla, como en el caso de octil-CALA
a pH 9,0 que presentó la máxima estabilización al 15% de glicerol, o de octil-CRL a pH 5,0, que
lo presentó al 45%, teniendo el resto de concentraciones valores de estabilización inferiores. En
otros casos, el efecto estabilizador se mantiene cuando las concentraciones de glicerol superan
el valor donde se encuentra la estabilización óptima, como en octil-CALA a pH 5,0 o en las
preparaciones de CALB a pH 7,0, que alcanzaron la máxima estabilización al 45% de glicerol y
se mantuvo al aumentar la concentración del mismo. También hubo casos, dónde bajas
concentraciones de glicerol promovieron una desestabilización de la enzima, por ejemplo, octil-
CALB y octil-CRL a pH 5,0. Mientras que en otros casos, la concentración de glicerol casi no
fue relevante, como en el caso de octil-CALB a pH 9,0; de glutaraldehído-CRL a pH 5,0 o de
octil-EVT a pH 9,0. Por lo tanto, la concentración de glicerol debe optimizarse en cada caso.

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Además, el glicerol tendió a tener un efecto estabilizador mayor para las preparaciones
de octil, por ejemplo, hubo un menor efecto del glicerol sobre la estabilidad de la enzima
inmovilizada en amino-glutaraldehído agarosa cuando se inactivó a pH alcalino, el cual pudo
observarse claramente en las preparaciones de CALA, CALB y CRL.
Por todo ello, el efecto estabilizador enzimático del glicerol no es universal, pero sí
estabiliza las lipasas en la mayoría de los casos en mayor o menor medida, por lo que podemos
hablar de tendencias en función del protocolo de inmovilización, de la concentración de glicerol
o del pH del medio de inactivación más que de reglas generales. Además, se trata de un
compuesto bastante común, sencillo de usar y muy económico, por lo que, si es necesario un
estabilizador enzimático para una lipasa específica y en unas condiciones concretas, puede
estudiarse su efecto para concluir si es el estabilizador adecuado.

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3.1.3. Capítulo I.III. Posibilidad de modulación de las propiedades

funcionales de las lipasas mediante la alteración de las condiciones
de inmovilización sobre soportes hidrofóbicos
3.1.3.1. Modulando las propiedades de la lipasa de Thermomyces lanuginosus
inmovilizada en partículas de octil agarosa alterando las condiciones de
inmovilización
Yuliya Lokha, Sara Arana-Peña, Nathalia S. Rios, Carmen Méndez-Sánchez, Luciana R.B.
Gonçalves, Fernando López-Gallego y Roberto Fernández-Lafuente
Las lipasas son enzimas cuyas propiedades catalíticas dependen en gran medida de las
condiciones de reacción, por lo que pequeñas variaciones en el medio pueden resultar en
alteraciones de dichas propiedades, que podrían deberse a cambios conformacionales en la
estructura terciaria de las enzimas o cambios en la estructura del centro activo. Por lo tanto, en
el marco de esta tesis doctoral, se pretende estudiar si la inmovilización reversible sobre
soportes hidrofóbicos mediante activación interfacial puede fijar los cambios conformacionales
generados por el medio en las moléculas de enzima, haciendo que estos cambios no sean
fácilmente reversibles y produciendo lipasas inmovilizadas con diferentes propiedades.
Actualmente existen publicaciones que sugieren que las propiedades de TLL
inmovilizada mediante activación interfacial en soportes hidrofóbicos dependen del valor de pH
de inmovilización, pero se estudió con el soporte completamente cargado de enzima, lo cual
puede dar lugar a interacciones enzima-enzima producidas por la proximidad de las lipasas
inmovilizadas y puede alterar las propiedades finales de la enzima.
En este nuevo trabajo, se ha investigado si la inmovilización reversible de TLL en octil
agarosa mediante activación interfacial bajo condiciones diferentes puede afectar a las
propiedades finales de TLL inmovilizada. Para ello se utilizaron 16 condiciones diferentes de
inmovilización (a 25 ºC) incluyendo pH 5,0; 7,0 y 9,0 a diferentes concentraciones de NaCl (0,
100 y 250 mM) y en presencia o ausencia de glicerol al 30% y la presencia de cationes calcio
(10 mM) y aniones fosfato (5, 100 y 250 mM) a pH 7,0. Estas condiciones fueron seleccionadas
para asegurar que la enzima fuera completamente estable, y porque presentan algunos efectos
sobre las propiedades de las lipasas. Además, se empleó una baja carga de enzima por g de
soporte, para prevenir cualquier riesgo de interacción enzima-enzima que podría ser responsable
de los cambios en las propiedades de la enzima.
Las propiedades finales de los biocatalizadores de TLL inmovilizada bajo distintas
condiciones se analizaron mediante estudios de actividad y especificidad frente a diferentes
sustratos (pNPB, triacetina, (R)- y (S)- metil mandelato a pH 7,0 y 25 ºC) y de estabilidad a pH
7,0 (a su temperatura de inactivación correspondiente). Además, con la ayuda del Prof.
Fernando López Gallego, se realizó un estudio de fluorescencia de los residuos triptófano para
analizar las posibles diferencias en la estructura de TLL inmovilizada bajo diferentes
condiciones.
Los resultados mostraron grandes diferencias en las propiedades de los biocatalizadores
de TLL inmovilizados en diferentes condiciones. Tras la inmovilización sobre octil agarosa,
TLL se hiperactivó de diferente forma según la condición de inmovilización, con un factor que
varió de 2 a 8 veces. Se observaron grandes variaciones en la actividad de los biocatalizadores
frente a todos los sustratos. Por ejemplo, usando pNPB como sustrato, el biocatalizador de TLL
más activo se obtuvo a pH 7,0; mientras que utilizando triacetina como sustrato, las actividades
de los biocatalizadores aumentaron cuando aumentó el pH de inmovilización hasta 1,5 veces,
mostrando un cambio en la especificidad de la enzima. Así mismo las actividades de los
biocatalizadores inmovilizados a diferentes valores de pH frente a (R)- y (S)- metil mandelato

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no solo mostraron un cambio en la especificidad de la enzima al comparar las actividades

enzimáticas de los tres sustratos sino que también alteraron la enantiopreferencia de los
isómeros de metil mandelato, siendo la enzima inmovilizada a pH 5,0 el biocatalizador más
activo con el isómero (R)- (2,3 veces más activo que con el isómero (S)-), mientras que usando
el isómero (S)-, la mayor actividad pertenecía a la enzima que se inmovilizó a pH 7,0 (1,5 veces
más activa que con el isómero (R)-). También se dieron interacciones entre las variables. Por
ejemplo, la actividad frente a los isómeros de metil mandelato de TLL inmovilizada a pH 7,0 en
concentraciones crecientes de NaCl disminuyó su actividad (al 65% para el isómero (R)- y al
43% para el isómero (S)-), mientras que a pH 9,0 la actividad aumentó en un factor de 6 veces
para el isómero (R)- y permanece casi inalterado frente al isómero (S)-. De igual forma, la
presencia de 30% de glicerol durante la inmovilización disminuyó la actividad enzimática a pH
5,0 y la incrementó a pH 9,0. Sin embargo, en algunos casos, la variación de la actividad con
algunas de las condiciones de inmovilización fue igual para todos los sustratos utilizados, como
la adición de cationes calcio durante la inmovilización, que aumentó ligeramente la actividad, o
el aumento de la concentración de aniones fosfato durante la inmovilización, que produjo una
progresiva disminución de la misma.
Se encontraron diferencias significativas en el espectro de fluorescencia de los residuos
triptófano que confirman que los diferentes biocatalizadores presentan diferentes estructuras
tridimensionales y pueden relacionarse con las grandes variaciones encontradas en la estabilidad
de la lipasa al inmovilizarse bajo distintas condiciones. Por ejemplo, la inmovilización en
condiciones ácidas (pH 5,0) dio lugar a moléculas de TLL inmovilizadas con una menor
intensidad de fluorescencia máxima (Imax) que la enzima inmovilizada a pH 7,0. Este resultado
sugiere que la inmovilización de TLL en esas condiciones fija una proteína más desplegada, lo
cual concuerda con los resultados de estabilidad, ya que la enzima inmovilizada a este valor de
pH fue 3 veces menos estable que a pH 7,0, que fue el biocatalizador más estable (vida media de
80 minutos frente a 240 minutos). Sin embargo la compactación de la enzima y la estabilidad de
la enzima no siempre estuvieron relacionados y otras condiciones de inmovilización, como la
presencia de cationes calcio durante la inmovilización (que dio lugar a una estructura más
compacta pero la estabilidad se redujo) o como el efecto del fosfato de sodio durante la
inmovilización, que dio lugar a una estabilidad menor a altas concentraciones (usando 250 mM
de fosfato de sodio durante la inmovilización se obtiene el biocatalizador menos estable, con
una vida media de 24 minutos), lo cual no se explica por los resultados de fluorescencia.
Los resultados indican que las condiciones de inmovilización determinan las
propiedades finales de TLL inmovilizada en octil agarosa, alterando la actividad y especificidad
de la enzima y su estabilidad. Por lo tanto, las moléculas individuales de lipasa habrían
adquirido diferentes conformaciones debido a las condiciones de inmovilización, que se fijarían
sobre la superficie del soporte hidrofóbico haciendo que estos cambios no fuesen fácilmente
reversibles y produciendo biocatalizadores con diferentes propiedades. Sin embargo, no existe
un biocatalizador óptimo, ni un cambio óptimo de una variable específica, la condición óptima
depende de la reacción y condición estudiada.

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3.1.3.2. Efectos de las condiciones de carga e inmovilización enzimática sobre las

características catalíticas de la lipasa de Pseudomonas fluorescens
inmovilizada en partículas de octil agarosa
Sara Arana-Peña, Nathalia S. Rios, Diego Carballares, Carmen Méndez-Sánchez, Yuliya Lokha,
Luciana R. B. Gonçalves y Roberto Fernández-Lafuente
Usando TLL, se ha demostrado que al inmovilizar una carga enzimática muy baja vía
activación interfacial en octil agarosa (para evitar cualquier interacción enzima-enzima), bajo
diferentes condiciones, se encuentran propiedades muy diferentes en las enzimas inmovilizadas.
Usando biocatalizadores poco cargados se puede estudiar cómo las moléculas individuales de
lipasa inmovilizadas se ven afectadas por las condiciones de inmovilización mientras que,
usando biocatalizadores altamente cargados, se puede analizar si las interacciones
intermoleculares enzima-enzima se pueden ver afectadas por estas condiciones. Por lo tanto, en
este artículo se ha estudiado el efecto de las condiciones de inmovilización sobre las
propiedades finales de una lipasa inmovilizada en octil agarosa y si las interacciones
intermoleculares entre enzimas inmovilizadas, cuando se usa una alta carga de enzima, pueden
verse alteradas por estos efectos.
PFL fue seleccionada debido a que presenta un gran lid, y se ha utilizado como modelo
en diferentes estudios sobre las interacciones enzima-enzima, que promueven la formación de
agregados de lipasa-lipasa que involucran dos estructuras de lipasa abiertas. Así, se
inmovilizaron 1 o 60 mg de enzima por gramo de soporte (baja y alta carga) vía activación
interfacial en soportes octil agarosa, bajo 16 condiciones diferentes de inmovilización (a 25 ºC)
incluyendo pH 5,0; 7,0 y 9,0 a diferentes concentraciones de NaCl (0, 100 y 250 mM) y en
presencia o ausencia de glicerol al 30% y la presencia de cationes calcio (10 mM) y aniones
fosfato (5, 100 y 250 mM) a pH 7,0. Las propiedades finales de los biocatalizadores de PFL
inmovilizada bajo distintas condiciones se analizaron mediante estudios de actividad frente a
diferentes sustratos (pNPB y triacetina a pH 7,0 y 25 ºC) y de estabilidad a pH 7,0 (a su
temperatura de inactivación correspondiente).
Los resultados mostraron fuertes discrepancias en las propiedades de PFL inmovilizada
bajo diferentes condiciones y cuando se utilizó baja y alta carga de enzima. Los rendimientos de
inmovilización de PFL con baja carga fueron bastante similares (más del 90%) y la
hiperactivación de la actividad frente a pNPB de la enzima inmovilizada osciló entre el 115% y
el 200% según la condición de inmovilización. Mientras que los rendimientos de inmovilización
de alta carga oscilaron entre 68 y 93%, dependiendo de la condición, produciéndose una
disminución significativa de la actividad enzimática frente a pNPB.
Comenzando con la actividad frente a pNPB y triacetina, se dio una variación de hasta
1,5 y 1,6 veces en la actividad para baja carga y 1,7 y 1,9 veces para alta carga. Además, se
pudo encontrar un aumento en la actividad enzimática específica (por mg de enzima
inmovilizada) en casi todos los casos. Por ejemplo, la actividad específica de la enzima
inmovilizada a baja carga a pH 5,0 fue alrededor 3 U por mg de enzima, pero con una alta carga
fue de 6 U por mg de enzima.
El efecto de las condiciones de inmovilización sobre la actividad final de las enzimas
inmovilizadas fue opuesto en la mayoría de los casos al comparar las preparaciones de alta y
baja carga. Así, frente a pNPB, la actividad del biocatalizador inmovilizado con baja carga a pH
7,0 fue menor que cuando se inmovilizó a pH 5,0 o 9,0; mientras que con alta carga, a pH 9,0 la
actividad del biocatalizador fue menor que cuando se inmovilizó a pH 7,0. Además, la presencia
de cationes calcio a pH 7,0 durante la inmovilización con baja carga produjo un efecto positivo
aumentando la actividad enzimática del biocatalizador (cerca del 25%), mientras que con alta
carga disminuyó en gran medida (dando el biocatalizador menos activo con esta carga),
tendencia que siguió el uso de una concentración creciente de fosfato de sodio (incrementando o

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disminuyendo la actividad, para baja o alta carga respectivamente, alrededor del 30%). Cuando
se usó triacetina como sustrato, usando preparaciones poco cargadas, se obtuvo la actividad más
alta al inmovilizar la enzima en pH 9,0 (en comparación con los otros valores de pH), mientras
que, con alta carga, la actividad al inmovilizar el enzima a pH 9,0 dio lugar al biocatalizador
menos activo. La adición de cationes calcio a pH 7,0 durante la inmovilización presentó un
efecto negativo sobre la actividad enzimática del biocatalizador altamente cargado, lo cual no se
ajusta a los resultados obtenidos utilizando con la preparación poco cargada, donde esta
condición de inmovilización incrementó la actividad alrededor del 50%.
Este efecto contrario de las condiciones de inmovilización al comparar ambas cargas,
pudo observarse incluso cuando se dieron interacciones entre las diferentes variables. Por
ejemplo, la presencia de glicerol durante la inmovilización a pH 7,0 fue positiva a baja carga
para su actividad frente a pNPB, pero negativa con alta carga, mientras que a pH 9,0 (aunque el
efecto no fue significativo a baja carga), se vuelve positivo en el biocatalizador más cargado.
Usando triacetina como sustrato, la presencia de glicerol en el medio de inmovilización tuvo un
efecto claramente positivo al inmovilizar la enzima a pH 5,0 y 7,0, pero fue negativo con pH 9,0
(dando lugar al biocatalizador menos activo con baja carga), mientras que con alta carga la
actividad disminuyó un tercio cuando la enzima se inmovilizó a pH 7,0 y aumentó en un 20%
cuando se inmovilizó la enzima a pH 9,0.
Al comparar la estabilidad enzimática de las preparaciones, la estabilidad de los
biocatalizadores inmovilizados con alta carga fue mucho mayor que el de los de baja carga, por
ejemplo, la preparación con alta carga inmovilizada en presencia de cationes calcio mantuvo un
85% de la actividad inicial después de 24 h a 75 ºC, mientras que con poca carga mantuvo solo
el 27% a 70 °C (resultado muy similar al obtenido en ausencia de este aditivo).
Por otro lado, los cambios en estabilidad causados por las condiciones de
inmovilización dieron vidas medias que variaron hasta 4,5 veces con baja carga, mientras que,
con alta carga, las diferencias entre los biocatalizadores inmovilizados bajo diferentes
condiciones fueron mucho más significativas en la mayoría de los casos, encontrándose la
mayor diferencia al comparar las preparaciones inmovilizadas en presencia de cationes calcio,
con las preparaciones inmovilizadas sin este aditivo, que presentaron una vida media de solo 1,5
horas. Una vez más se encontraron efectos opuestos en el comportamiento de las enzimas con
baja y alta carga inmovilizadas bajo diferentes condiciones. Por ejemplo, considerando el efecto
del pH de inmovilización, con alta carga la preparación más estable fue la inmovilizada a pH 9,0
y la menos estable fue la inmovilizada a pH 7,0 (un incremento del 70% en la vida media
cuando se inmoviliza a pH 9,0), mientras que entre las preparaciones de baja carga la enzima
inmovilizada a pH 7,0 fue claramente la más estable. En una forma similar a la presencia de
cationes calcio, la presencia de fosfato de sodio fue positiva para las preparaciones de alta carga
y usando 100 y 250 mM de este búfer durante la inmovilización, la estabilidad del
biocatalizador se volvió extremadamente alta (manteniendo el 60% de la actividad inicial
después de 24 horas), mientras que el efecto positivo de este tampón fue mucho menor usando
la preparación con poca carga. Este comportamiento también se observó cuando interactuaron
algunas variables, por ejemplo, mejorando la estabilidad a pH 7,0 y 9,0 (alrededor del 45%) por
la presencia de glicerol durante el proceso de inmovilización para las preparaciones altamente
cargadas, lo cual no tuvo efecto en las preparaciones de baja carga.
Estos resultados sugieren que las condiciones de inmovilización afectan en gran medida
a las propiedades de PFL inmovilizada en octil agarosa, en menor medida usando preparaciones
poco cargadas, pero de forma mucho más relevante utilizando preparaciones muy cargadas, al
alterar algunas interacciones intermoleculares enzima-enzima. Además, los resultados,
comparando la alta carga y la baja carga, sugieren que las interacciones enzima-enzima juegan
un papel muy importante en las propiedades de las enzimas inmovilizadas y sobre cómo afectan
las condiciones de inmovilización a estas propiedades.

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3.1.3.3. Inmovilización de lipasas mediante activación interfacial sobre soportes

hidrofóbicos: Producción de bibliotecas de biocatalizadores mediante la
alteración de las condiciones de inmovilización
Sara Arana-Peña, Nathalia S. Rios, Diego Carballares, Luciana R.B. Gonçalves y Roberto
Fernández-Lafuente
Anteriormente se ha demostrado que inmovilizando TLL y PFL en el soporte octil
agarosa, las propiedades de la enzima pueden modularse por las condiciones de inmovilización.
La variación de estas condiciones puede alterar profundamente la conformación de la enzima y
la adsorción de las distintas formas enzimáticas a través de activación interfacial sobre soportes
hidrofóbicos no se puede revertir fácilmente, manteniendo los distintos cambios conformaciones
cuando se incuban en otros medios. Esto ha permitido obtener, utilizando un mismo soporte y
protocolo de inmovilización, una colección de biocatalizadores con propiedades bastante
diferentes (especificidad, actividad y estabilidad), convirtiéndose en una estrategia muy
interesante para enriquecer la biblioteca de biocatalizadores de estas lipasas.
Estos resultados pueden generar un gran impacto en la inmovilización de lipasas a
través de la activación interfacial en soportes hidrofóbicos, ya que, si bien abre la posibilidad de
utilizar esta estrategia para ampliar la biblioteca de biocatalizadores inmovilizados de una
misma lipasa en un mismo soporte solamente variando las condiciones de inmovilización,
también se requerirá un control muy estricto de estas condiciones para tener resultados
reproducibles. Por este motivo, en esta nueva investigación se ha comprobado si esta estrategia
para modular las propiedades de las lipasas simplemente alterando las condiciones de
inmovilización en soportes hidrofóbicos, puede ser aplicable a otras lipasas o solo ocurre en el
caso específico de TLL y PFL.
Se seleccionaron algunas de las lipasas más utilizadas en la literatura (CALA, CALB,
CRL y RML) y como soporte, octil agarosa. Se inmovilizaron bajas cargas de enzima, para
prevenir interacciones intermoleculares enzima-enzima que podría alterar las propiedades
finales de la lipasa, bajo 16 condiciones diferentes de inmovilización (a 25 ºC) incluyendo pH
5,0; 7,0 y 9,0 a diferentes concentraciones de NaCl (0, 100 y 250 mM) y en presencia o ausencia
de glicerol al 30% y la presencia de cationes calcio (10 mM) y aniones fosfato (5, 100 y 250
mM) a pH 7,0. Las propiedades finales de los biocatalizadores inmovilizados bajo distintas
condiciones se analizaron mediante estudios de actividad frente a diferentes sustratos (pNPB,
triacetina, (R)- y (S)- metil mandelato a pH 7,0 y 25 ºC) y de estabilidad a pH 7,0 (a su
temperatura de inactivación correspondiente).
Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron que la gran modulación de las
propiedades de la enzima por las condiciones de inmovilización observadas usando TLL y PFL
no es una regla general cuando se inmovilizan lipasas mediante activación interfacial en octil
agarosa, al menos bajo las condiciones estudiadas.
En el caso de octil-CALB, solo se dieron pequeñas alteraciones de la actividad y la
especificidad por las condiciones de inmovilización. Usando pNPB como sustrato hubo
variaciones de hasta un 55% en la actividad entre la preparación más y menos activa y
solamente el aumento de la fuerza iónica durante la inmovilización enzimática a pH 7,0 produjo
un efecto negativo sobre la actividad enzimática. En los otros parámetros estudiados no se
encontraron diferencias significativas.
Con octil-CRL las propiedades de la lipasa solo se alteraron cuando se utilizan
condiciones en las que la enzima libre se inactiva antes de la inmovilización (es parcialmente
inactivado a pH 9,0, pero en menor medida en presencia de glicerol). Se encontró una actividad
significativamente menor frente a todos los sustratos y un incremento en las vidas medias (110-

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 Publicaciones

120 minutos frente a más de 200 minutos), en los biocatalizadores inmovilizados a pH 9,0
menos cuando fue inmovilizado en presencia de glicerol.
CALA mostró ciertas alteraciones en sus propiedades derivadas de las condiciones de
inmovilización. Durante la inmovilización de CALA en octil agarosa la hiperactivación
enzimática de la lipasa varió, con incrementos de actividad desde 1,6 veces hasta casi 2,4.
Utilizando ambos isómeros de metil mandelato, las diferencias en la actividad de la enzima se
volvieron significativas en algunos casos, llegando casi a doblarse la actividad cuando se
inmovilizó a pH 5,0 y dando la presencia de glicerol a este pH el biocatalizador más activo. El
aumento de la concentración de NaCl fue positivo a pH 7,0 y la presencia de cationes calcio y
aniones fosfato durante la inmovilización aumentó la actividad de los biocatalizadores entre un
10 y un 40%. No se encontraron diferencias en la actividad frente a los otros sustratos y las
diferencias en las vidas medias de los diferentes biocatalizadores de CALA no fueron
significativas.
En contraposición con estas lipasas, las propiedades de RML fueron muy modulables
por las condiciones de inmovilización, por lo que estas condiciones deben controlarse
cuidadosamente utilizando RML para tener resultados reproducibles. Se pudo observar una
oscilación en la hiperactivación de la enzima al inmovilizarse de entre 4 y 9 veces y un rango de
4 y 5 veces en las variaciones de actividad para algunos sustratos. La enzima fue mucho más
activa frente a todos los sustratos utilizados cuando se inmovilizó a pH 5,0 llegando a ser hasta
5 veces más activo que a pH 7,0 usando los isómeros de metil mandelato, y presentando a pH
9,0 las actividades más bajas.
La situación fue tan compleja que en algunos casos los biocatalizadores no mostraron
ninguna diferencia en el efecto que ejerce el medio de inmovilización sobre la actividad de las
preparaciones frente a distintos sustratos, por ejemplo, la presencia de glicerol durante la
inmovilización fue claramente negativa para la actividad de la enzima frente a triacetina y los
isómeros de metil mandelato, mientras que las diferencias fueron muy claras en otros casos. Por
ejemplo, utilizando triacetina como sustrato, la adición de NaCl (a pH 7,0 y pH 9,0) y de
cationes calcio durante la inmovilización, incrementó la actividad de la enzima inmovilizada
alrededor de 1,8 y 1,4 veces respectivamente, mientras que utilizando pNPB como sustrato,
ninguno de estos compuestos tuvo un efecto tan significativo sobre la actividad de los
biocatalizadores, lo que sugiere un cambio en la especificidad de la enzima. Además, se dieron
algunas interacciones entre las variables, por ejemplo, usando metil mandelato, el aumento de
las concentraciones de NaCl durante la inmovilización produjo una disminución progresiva de
la actividad enzimática a pH 5,0 (a menos de 60%) y un aumento progresivo a pH 7,0 (casi un
70%), mientras que a pH 9,0 el efecto fue insignificante. Usando pNPB como sustrato, la
presencia de glicerol durante la inmovilización fue ligeramente positiva al inmovilizar la enzima
a pH 5,0; casi neutra a pH 7,0 y ligeramente negativa a pH 9,0.
También se pudieron encontrar algunos efectos significativos sobre la estabilidad de
RML inmovilizada bajo distintas condiciones, con un incremento de hasta 4 veces para las vidas
medias en inactivaciones térmicas utilizando las distintas sales, siendo la presencia de cationes
calcio a pH 7,0 la condición que más mejoró la estabilidad.
Este estudio nos presenta una biblioteca de biocatalizadores inmovilizados (en un
mismo soporte) de distintas lipasas en distintas condiciones, y el efecto de dichas condiciones
sobre las propiedades finales de la lipasa inmovilizada. Con los resultados obtenidos, se puede
concluir que, la variación en las propiedades de las lipasas por las condiciones de
inmovilización al inmovilizar las lipasas en octil agarosa a través de activación interfacial, no es
una regla general y depende de la lipasa inmovilizada.

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3.2. Capítulo II. Preparación de multicapas de lipasas inmovilizadas en

soportes hidrofóbicos porosos para incrementar la capacidad de carga
y la actividad volumétrica de los biocatalizadores
El Capítulo II de la presente tesis doctoral, explora el potencial del uso de multicapas de
enzimas, para incrementar la capacidad de carga enzimática en soportes porosos. Dado que esta
estrategia ha sido utilizada principalmente en soportes y biosensores no porosos, esta
investigación aporta información muy interesante acerca del comportamiento de los
biocatalizadores y sus propiedades (actividad, especificidad).
La estrategia desarrollada en esta publicación fue exitosa en la producción de
biocatalizadores con una gran carga enzimática y puede ser extrapolada a cualquier enzima y a
cualquier protocolo de inmovilización para la primera capa.
Además, pese a que el incremento de los problemas de difusión al añadir nuevas capas
de enzima supuso, en algunos casos, una reducción de la actividad volumétrica, el tipo de
inmovilización y las modificaciones físicas y químicas realizadas durante la construcción de las
multicapas de enzima produjeron diferentes formas de lipasa, con diferentes propiedades. Por lo
tanto, esta estrategia permite obtener un tipo especial de combilipasas (mezclas de lipasas con
diferentes propiedades) utilizando la misma enzima, lo que la hace especialmente interesante
para la producción de biocatalizadores que hidrolicen sustratos multifuncionales y heterogéneos.

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3.2.1. Uso de polietilenimina para producir biocatalizadores multicapas

de lipasas inmovilizadas con actividad volumétrica muy alta
utilizando partículas de octil agarosa: Evitando la liberación de
enzimas durante la producción de múltiples capas
Sara Arana-Peña, Nathalia S. Rios, Carmen Méndez-Sánchez, Yuliya Lokha, Luciana R.B.
Gonçalves y Roberto Fernández-Lafuente
Uno de los asuntos decisivos para seleccionar un soporte es su capacidad de carga (la
cantidad de enzima que puede inmovilizarse por gramo de soporte) dado que, si la capacidad de
carga del soporte aumenta, su impacto en el costo total de los biocatalizadores puede ser
reducido. De hecho, si el soporte posee una baja capacidad de carga, este puede descartarse
incluso si el precio, el tamaño de partícula y la resistencia mecánica son adecuadas para un
proceso determinado. Bajo esta premisa, se ha propuesto una estrategia (utilizada
principalmente en soportes y biosensores no porosos) que puede permitir mejorar la capacidad
de carga de soportes porosos e incrementar la actividad volumétrica: la formación de multicapas
de enzimas mediante la inmovilización sucesiva de una capa de enzima sobre la anterior.
Para desarrollar esta estrategia y obtener un enfoque general, se seleccionaron varias
lipasas (CALA, CALB, LEU, RML y TLL), como soporte octil agarosa (así la primera capa de
lipasa será inmovilizada vía activación interfacial) y PEI como agente conector, el cual recubrirá
por completo la capa de enzima, formando una cama polimérica dónde podrá inmovilizarse una
nueva capa de enzima (mediante intercambio iónico en ambos casos). Para estudiar cómo la
construcción de las multicapas de lipasas afecta a la actividad volumétrica de los
biocatalizadores, se utilizaron varios sustratos (pNPB, (R)- y (S)- metil mandelato a pH 7,0 y
triacetina a pH 5,0), en algunos casos en diferentes condiciones, para variar la velocidad de la
reacción (25 ºC, 4 ºC y 4 ºC en presencia de 30% de acetonitrilo).
Los resultados obtenidos al construir los biocatalizadores formados por multicapas de
lipasas utilizando PEI como agente conector, mostraron la liberación de un alto porcentaje de
las enzimas inmovilizadas mediante intercambio iónico durante el recubrimiento con PEI de la
segunda capa de lipasa para formar octil-enzima-PEI-enzima-PEI (excepto cuando se utilizó
LEU). Para resolver este problema, se utilizó glutaraldehído para entrecruzar covalentemente las
moléculas de PEI con ambas capas de enzima (capas inferior y superior). Esta estrategia se
utilizó con todas las enzimas para producir los biocatalizadores de tres capas (octil-enzima-PEI-
enzima-glutaraldehído-PEI-enzima) y produjo tres formas diferentes de la misma lipasa en
función del protocolo de inmovilización y la modificación física o química a la que son
sometidas las enzimas.
En el caso de RML, el tratamiento con glutaraldehído de la segunda capa de enzima,
disminuyó la actividad frente a todos los sustratos, mientras que el recubrimiento posterior con
PEI produjo un incremento del 40% en la actividad usando triacetina, es decir, la especificidad
de la enzima se alteró significativamente. La inmovilización de la tercera capa de RML mejoró
enormemente la actividad volumétrica del biocatalizador usando ambos isómeros de metil
mandelato, siendo su actividad alrededor de 34 veces mayor que la preparación de una capa.
Usando triacetina y pNPB, la actividad del biocatalizador después de la inmovilización de esta
tercera capa disminuyó ligeramente, posiblemente debido a que la adición de nuevas capas
aumenta los problemas de difusión de sustrato y/o la tortuosidad en el camino que debe seguir el
sustrato para alcanzar las capas internas. A 4 °C y usando acetonitrilo al 30%, que disminuye la
incidencia de las limitaciones de difusión del sustrato al reducir la actividad enzimática, la
situación se invirtió y el biocatalizador de tres capas RML se volvió 3,5 veces más activo que
los biocatalizadores de dos capas frente a triacetina.

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La inmovilización de la segunda y tercera capa de CALA permitió inmovilizar

alrededor del doble de la cantidad de enzima en la primera capa, y esto aumentó
significativamente la actividad del biocatalizador. Así, la actividad volumétrica del
biocatalizador aumentó al inmovilizar cada nueva capa de CALA frente a todos los sustratos
(salvo con pNPB en la tercera capa). CALA inmovilizada en PEI fue mucho más activa que
cuando estaba inmovilizada en octil agarosa para los isómeros de metil mandelato y la
enantiopreferencia por el isómero (R)- observada usando octil-CALA desapareció, mientras que
en el caso de triacetina y pNPB, el aumento de la actividad fue menor de lo esperado al
aumentar la carga enzimática. El tratamiento con glutaraldehído tuvo un efecto sobre la
actividad poco significativo en comparación con las otras dos lipasas estudiadas (salvo frente a
pNPB donde la actividad se vio bastante reducida) y la adición de PEI aumentó la actividad
frente a todos los sustratos, devolviendo la enantiopreferencia por el isómero (R)-.
Al construir el biocatalizador multicapas de CALB, la actividad de los biocatalizadores
de tres capas fue mayor que la de todos los biocatalizadores de CALB de una o dos capas, con la
excepción de (S)- metil mandelato y pNPB, debido a la reducción en la actividad ocasionada por
los distintos tratamientos, y posiblemente, al incremento en los problemas de difusión de
sustrato y la tortuosidad del camino que debe seguir el sustrato. El tratamiento con
glutaraldehído disminuyó la actividad en un 25-45% dependiendo del sustrato y el
recubrimiento con PEI sólo fue positivo frente a triacetina. La acumulación de todos los
cambios en la especificidad de la enzima a causa de las modificaciones químicas o físicas
sufridas por la enzima con los diferentes tratamientos, incrementó la enantiopreferencia del
biocatalizador por el isómero (R)- de 6 a más de 9.
Siguiendo con TLL, la inmovilización de una segunda y tercera capa de TLL en el lecho
de PEI involucró 2,5 veces más enzima que la primera capa de enzima, lo que produjo un
aumento significativo de la actividad volumétrica del biocatalizador. Así, todos los
biocatalizadores de tres capas aumentaron su actividad volumétrica, excepto frente a triacetina,
dónde el catalizador bicapa sin tratar tuvo mayor actividad que la tercera capa. El tratamiento
con glutaraldehído redujo ligeramente la actividad con los isómeros de metil mandelato, pero
seriamente con triacetina y pNPB (alrededor del 50%) y el tratamiento con PEI incrementó la
actividad con todos los sustratos salvo con (S)- metil mandelato.
Finalmente, aunque no se observó liberación de LEU tras el recubrimiento con PEI, se
prepararon biocatalizadores de multicapas de LEU con y sin glutaraldehído, para estudiar el
efecto del tratamiento con glutaraldehído. La modificación con glutaraldehído incrementó la
actividad del biocatalizador frente a (R)- metil mandelato (alrededor de un 20%) pero disminuyó
casi un 20% usando pNPB y un 40% con triacetina. El efecto del recubrimiento con PEI de esta
preparación incrementó su actividad frente a los isómeros de metil mandelato, mientras que esta
disminuía significativamente en la no tratada. El biocatalizador de tres capas tratado con
glutaraldehído fue más activo con los isómeros de metil mandelato (en un 32-40%), tuvo menor
actividad con triacetina (en casi un 50%) y una actividad muy similar usando pNPB que cuando
se empleó el biocatalizador sin tratar, pero la actividad de la última capa fue similar en ambos
casos; las diferencias provienen de la actividad de los biocatalizadores de dos capas.
Pese al incremento en los problemas de difusión y la tortuosidad, los biocatalizadores de
3 capas fueron más activos que los biocatalizadores de una o dos capas con algunos de los
sustratos analizados. Así, esta estrategia es completamente funcional para generar
biocatalizadores de multicapas con una gran carga enzimática, pero debido a los cambios en la
actividad y especificidad de las enzimas, debe ser optimizada para cada proceso específico para
lograr la actividad volumétrica deseada. Además, puede ser extrapolada a cualquier enzima,
seleccionando el método apropiado de inmovilización para la primera capa y siempre que las
enzimas resistan los tratamientos con PEI y glutaraldehído.

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3.3. Capítulo III. Preparación de multicapas de diferentes lipasas co-

inmovilizadas en soportes hidrofóbicos porosos: Control de la
distribución espacial de las enzimas
El uso de combilipasas en la hidrólisis de sustratos multifuncionales y heterogéneos ha
dado muy buenos resultados en la literatura, por lo tanto, es de esperar que la co-inmovilización
de las lipasas que componen estas mezclas pueda ser ventajosa. Sin embargo, la co-
inmovilización de enzimas solo tiene sentido si presenta alguna mejora frente al uso individual
de las enzimas.
Para conseguir una co-inmovilización favorable, será necesario tener en cuenta los
problemas que pueden presentarse derivados de este protocolo. Por ejemplo, una disposición
espacial adecuada de las enzimas que componen una reacción multienzimática es un requisito
importante a tener en cuenta durante la co-inmovilización de enzimas.
Bajo este contexto, en el Capítulo III de la tesis doctoral, se ha desarrollado una
estrategia para la co-inmovilización de varias lipasas, utilizando la inmovilización de enzimas
en multicapas.
Esta estrategia permitió controlar fácilmente la disposición espacial de las enzimas,
simplemente controlando el orden de inmovilización de las multicapas. Sin embargo, los efectos
de la disposición espacial sobre la actividad de los biocatalizadores no fueron necesariamente
positivos y dependieron del sustrato y de las condiciones de reacción, por lo que el orden debe
decidirse como una respuesta a una reacción específica.
Además, el uso de multicapas permitió solucionar otro problema derivado de la co-
inmovilización, al eliminar la competencia que normalmente se da entre las cargas de las
enzimas co-inmovilizadas sobre la superficie del soporte, ya que cada enzima se inmoviliza en
una capa diferente.

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3.3.1. Co-inmovilización de diferentes lipasas: Orden espacial enzimático

simple capa por capa
Sara Arana-Peña, Nathalia S. Rios, Carmen Méndez-Sánchez, Yuliya Lokha, Diego Carballares,
Luciana R.B. Gonçalves y Roberto Fernández-Lafuente
La co-inmovilización de enzimas en la misma partícula se está volviendo cada vez más
popular en la literatura científica, principalmente porque mejora la cinética en las reacciones en
cascada, eliminando el tiempo de retardo habitual en estos procesos al estar las enzimas
expuestas a altas concentraciones de los productos intermediarios desde el inicio de la reacción.
Sin embargo, inmovilizar varias enzimas en la misma superficie de la partícula supone la
reducción de la carga de cada enzima en el soporte, y puede dar lugar a un orden de las enzimas
co-inmovilizadas desventajoso. Para solventar estos problemas, se ha propuesto una estrategia
basada en la co-inmovilización de distintas enzimas en multicapas, donde no es necesario
reducir la carga de una enzima para inmovilizar varias en la misma partícula de soporte y puede
hacer posible elegir la distribución espacial de las enzimas.
Entre los muchos usos de las lipasas, podemos destacar la modificación completa de
aceites mediante su hidrólisis para transformar todos los glicéridos en ácidos grasos libres y la
alcoholisis de los sustratos para la producción de biodiésel. Los aceites son sustratos
multifuncionales y heterogéneos compuestos por la mezcla de triglicéridos y ácidos grasos que,
tras su hidrólisis, producen diferentes diglicéridos y monoglicéridos. Los investigadores han
propuesto el uso combinado de varias enzimas (combilipasas), con diferentes especificidades
enzimáticas, selectividades o diferente sensibilidad a los cambios en las condiciones de
reacción, para catalizar estas reacciones, produciéndose una reacción más rápida y un mayor
rendimiento de conversión. Bajo este contexto, se ha comprobado si es posible desarrollar
biocatalizadores de multicapas de combilipasas inmovilizadas, y si pueden co-inmovilizarse de
forma ordenada.
Esta estrategia de inmovilización de enzimas en multicapas ha sido utilizada
previamente con éxito en esta tesis doctoral, utilizando PEI como agente conector entre las
capas de lipasa y glutaraldehído para promover el entrecruzamiento intermolecular de las capas
y prevenir la liberación de enzimas inmovilizadas por intercambio iónico (menos en el caso de
LEU). Como soporte, se seleccionó octil agarosa (siendo la primera inmovilización vía
activación interfacial), para generar dos biocatalizadores de combilipasas (combi-
biocatalizadores) multicapas diferentes formados por varias lipasas (CALA, CALB, LEU,
RML, TLL) variando el orden de inmovilización de las enzimas co-inmovilizadas. Además, se
desarrollaron biocatalizadores previamente inactivados, usando dietil p-nitrofenilfosfato (D-
pNPP), para confirmar la inmovilización de cada capa de enzima y se estudió la actividad de las
distintas capas de los combi-biocatalizadores, utilizando diferentes sustratos (pNPB, triacetina,
(R)- y (S)- metil mandelato a pH 7,0), en algunos casos en diferentes condiciones, para variar la
velocidad de la reacción (25 ºC, 4 ºC y 4 ºC en presencia de 30% de acetonitrilo).
Los biocatalizadores inactivados con D-pNPP y un análisis SDS-PAGE mostraron que
la distribución espacial de las capas de lipasas se puede controlar fácilmente al controlar el
orden de inmovilización. Sin embargo, los efectos sobre la actividad de los biocatalizadores,
dependieron de la distribución espacial de la enzima, la modificación física y química de la
enzima producida por PEI y glutaraldehído, el sustrato (y las actividades de las enzimas con este
sustrato) y las condiciones de reacción, sin ser necesariamente positivos.
Empezando con el combi-biocatalizador de octil-LEU-PEI, al añadir CALA la actividad
volumétrica del combi-biocatalizador frente a pNPB aumentó alrededor de 170 U por g de
biocatalizador para alcanzar 308 U por g de biocatalizador, pero los tratamientos con
glutaraldehído y PEI la redujeron e incrementaron a alrededor de 159 y 200 U por g de

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biocatalizador consecutivamente. Cuando CALB se inmovilizó en octil-LEU-PEI-CALA-

glutaraldehído-PEI, la actividad frente a pNPB de los biocatalizadores incluso disminuyó a poco
más de 185 U por g de biocatalizador, pudiendo estar relacionado con un aumento de los
problemas de difusión y la tortuosidad. La inmovilización de TLL dio lugar a una actividad
alrededor de 325 U por g de biocatalizador y la modificación con glutaraldehído produjo una
disminución drástica en la actividad volumétrica (a casi 214 U por g de biocatalizador) mientras
que el recubrimiento de PEI produjo un incremento marginal en la actividad. En el combi-
biocatalizador de cinco capas, la actividad final frente a pNPB fue superior a 270 U por g de
biocatalizador. El resto de sustratos se analizaron a 4 ºC con ambos combi-biocatalizadores para
intentar reducir los problemas de difusión de sustratos observados con pNPB. Usando (R)- metil
mandelato, octil-LEU-PEI-CALA-glutaraldehído-PEI-CALB-glutaraldehído-PEI dio más de 15
U por g de biocatalizador, cuando las otras dos capas solo habían dado casi 3 U por g de
biocatalizador, esto se debe a que CALB es mucho más activa con este sustrato. Al añadir TLL
aumentó la actividad a 20 U por g de biocatalizador, y la adición de RML no incrementó la
actividad volumétrica. Usando el isómero (S)-, se observó un incremento en la actividad al
añadir capas de enzima, pero menor, debido a la menor actividad de CALB frente a este
sustrato. Con triacetina, octil-LEU-PEI dio una actividad 12,5 U por g de biocatalizador, pero la
adición de CALA disminuyó la actividad. Las siguientes capas de enzima fueron incrementando
la actividad hasta que al añadir RML, la actividad dio un salto y este combi-biocatalizador de
cinco capas presentó una actividad con triacetina de casi 22 U por g de biocatalizador.
Siguiendo con el combi-biocatalizador octil-CALB-PEI-CALA-glutaraldehído-PEI-
TLL-glutaraldehído-PEI-LEU-PEI-RML, en la mayoría de los casos la adición de cada nueva
capa mejoró la actividad volumétrica del combi-biocatalizador usando pNPB. La actividad se
incrementó tras añadir CALA y su tratamiento con glutaraldehído y PEI de poco menos de 90 U
por g de biocatalizador a alrededor de 155 U por g de biocatalizador. La actividad solo volvió a
incrementarse al inmovilizar LEU, desde 133 U por g a casi 160 U por g de biocatalizador y la
actividad final del combi-biocatalizador de cinco capas fue de aproximadamente 190 U por g de
biocatalizador. La situación fue diferente usando (R)- metil mandelato como sustrato, octil-
CALB-PEI presentó una actividad de 84,5 U por g de biocatalizador, mientras que octil-CALB-
PEI-CALA-glutaraldehído-PEI solo dio 25,5 U por g de biocatalizador debido a que CALA es
mucho menos activa que CALB con este sustrato. Octil-CALB-PEI-CALA-glutaraldehído-PEI-
TLL-glutaraldehído-PEI tuvo incluso menos actividad que el combi-biocatalizador de 2 capas
(22,5 U por g de biocatalizador) y la inmovilización de LEU no mejoró la situación siendo la
actividad ligeramente menor. Por último, tras inmovilizar RML, dio casi 28 U por g de
biocatalizador. Usando (S)- metil mandelato, octil-CALB-PEI dio alrededor de 11 U por g de
biocatalizador y la actividad del combi-biocatalizador de 5 capas dio poco más de 10 U por g de
biocatalizador (todavía menor que el octil-CALB inicial). Estos resultados fueron totalmente
diferentes a lo observado en la otra configuración, y también diferente a los resultados
utilizando pNPB y pueden estar relacionados con el incremento en los problemas de difusión
del sustrato y en la tortuosidad del camino que el sustrato debe seguir para llegar a CALB, que
es la capa más activa. Con triacetina, la imagen es similar, octil-CALB-PEI tiene casi la misma
actividad que los biocatalizadores de 5 capas (25 U por g de biocatalizador), incluso a 4 °C. Al
agregar 30% de acetonitrilo a la reacción, para reducir la actividad, octil-CALB-PEI todavía es
más activa que los combi-biocatalizadores intermedios, pero el biocatalizador de 5 capas se
convierte en el más activo, pasando de 4,1 U por g de biocatalizador usando octil-CALB a casi
8 U por g de biocatalizador.
Los resultados obtenidos muestran que la estrategia de inmovilización de enzimas en
multicapas puede ser utilizada para desarrollar combi-biocatalizadores con las lipasas
inmovilizadas de forma ordenada y la importancia de una distribución espacial adecuada para
conseguir una respuesta específica a una reacción. Además, los diferentes cambios producidos
en la actividad y especificidad deben ser estudiados en cada caso.

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3.4. Capítulo IV. Nuevas estrategias para la co-inmovilización de lipasas

con diferentes estabilidades en soportes hidrofóbicos que permitan
reusar las enzimas inmovilizadas más estables
Durante el desarrollo de esta tesis doctoral se han propuesto soluciones, mediante el uso
de diferentes protocolos y estrategias, para algunos de los problemas que pueden surgir al co-
inmovilizar enzimas (abordados en el apartado 1.5.1. de la introducción). Así el uso de
multicapas permitió, eliminar la competencia entre las cargas de enzimas inmovilizadas y
conseguir controlar la disposición espacial de las enzimas co-inmovilizadas, simplemente
controlando el orden de inmovilización.
Además, la inmovilización de lipasas sobre soportes hidrofóbicos (como octil agarosa)
ha demostrado ser un método casi universal y que puede mejorar ampliamente las propiedades
enzimáticas de las lipasas, por lo que la co-inmovilización de lipasas sobre este soporte podría
ser muy ventajosa. Sin embargo, no soluciona uno de los problemas que más consecuencias
negativas puede ocasionar en el rendimiento de la reacción y en la economía del proceso: la co-
inmovilización de enzimas con diferente estabilidad.
Si dos enzimas co-inmovilizadas presentan una estabilidad muy diferente, todas las
enzimas deberán ser descartadas al inactivarse la enzima menos estable, incluso cuando la
enzima más estable mantiene completamente su actividad. El problema se agrava cuando la
inmovilización es irreversible y tampoco puede recuperarse el soporte.
Este problema suele ser ignorado en la mayor parte de procesos que utilizan enzimas co-
inmovilizadas y apenas hay soluciones en la literatura. Por lo tanto, en el Capítulo IV de esta
tesis doctoral se han desarrollado dos estrategias novedosas para solventarlo, que, debido a su
originalidad, se han dividido en dos subcapítulos.
Para cada una de estas estrategias se utilizaron soportes acil heterofuncionales
desarrollados en el laboratorio y diferentes protocolos de inmovilización, que permitieron reusar
las enzimas más estables inmovilizadas, tras la inactivación y liberación de las menos estables,
aprovechando las ventajas de la inmovilización de las lipasas vía activación interfacial sobre
soportes hidrofóbicos y vía intercambio iónico sobre PEI.

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3.4.1. Capítulo IV.I. Co-inmovilización enzima a enzima de lipasas en

soportes heterofuncionales octil-glioxil agarosa
3.4.1.1. Nuevas aplicaciones del octil-glioxil agarosa en la co-inmovilización de
lipasas: Estrategias para reutilizar la lipasa más estable
Sara Arana-Peña, Carmen Méndez-Sánchez, Nathalia S. Rios, Claudia Ortiz, Luciana R.B.
Gonçalves y Roberto Fernández-Lafuente
Como se ha mencionado anteriormente, la co-inmovilización de enzimas en la misma
partícula presenta grandes ventajas al usarse en reacciones multienzimáticas, sin embargo, el
uso simultáneo de varias enzimas puede ser complejo, ya que es necesario buscar condiciones
en las que todas las enzimas puedan realizar su función de forma adecuada. Además, la co-
inmovilización de enzimas presenta algunos problemas adicionales, solo por el uso y
preparación del combi-biocatalizador. Uno de ellos es la necesidad de inmovilizar todas las
enzimas siguiendo el mismo protocolo. Afortunadamente, la activación interfacial de las lipasas
utilizando soportes hidrofóbicos es un protocolo de inmovilización casi universal y con muchas
ventajas, que puede aplicarse a la mayoría de las lipasas. Otro problema aún más relevante, es la
posibilidad de que las diferentes enzimas presenten una estabilidad muy diferente bajo las
mismas condiciones, lo que hará necesario descartar todas las enzimas inmovilizadas cuando
solo una ha sido inactivada, incluso cuando las demás permanecen intactas. Este problema ya
había sido ejemplificado al usar una lipasa y una β-galactosidasa, y vuelve a presentarse al
encontrar grandes diferencias entre las estabilidades de varias lipasas.
Bajo esta premisa, se ha desarrollado una estrategia que muestra una solución simple
para superar este problema, basada en el uso de soportes acil heterofuncionales para inmovilizar
lipasas enzima a enzima, ya que, utilizando únicamente métodos de inmovilización reversible
(como la activación interfacial), se puede recuperar el soporte, pero la lipasa más estable se
liberará cuando se libere la inactivada. El soporte de octil-glioxil agarosa (partículas porosas de
agarosa que poseen una capa de grupos octil y grupos glioxil en su superficie) permite una
reacción covalente de la enzima con los grupos glioxil a pH alcalino tras la inmovilización de
las lipasas vía activación interfacial en la capa de octil. Tras la reducción del biocatalizador, la
unión covalente se reforzará y el soporte perderá su reactividad química, de forma que otra
lipasa podrá inmovilizarse sobre la superficie inerte solamente vía activación interfacial,
pudiendo ser liberada mediante detergentes. De esa forma, sí se inmoviliza la enzima más
estable covalentemente y la menos estable reversiblemente, tras la liberación de la lipasa menos
estable se podrá reutilizar la lipasa más estable inmovilizada en el soporte.
Como enzimas modelo, se utilizaron CALB, LEU y RML. Primero, se estudió la
estabilidad térmica a pH 7,0 de las enzimas inmovilizadas en octil agarosa para clasificarlas en
más o menos estables y la desorción de las enzimas menos estables del soporte utilizando
detergentes, además del efecto de este tratamiento sobre las propiedades de las enzimas más
estables inmovilizadas. Finalmente, las lipasas se co-inmovilizaron secuencialmente
desarrollándose tres combi-biocatalizadores, que fueron sometidos a varios ciclos de
inactivación de las enzimas menos estables a pH 7,0 (a su temperatura de inactivación
correspondiente), desorción e inmovilización de un nuevo lote de las mismas. La actividad de
los combi-biocatalizadores desarrollados se estudió utilizando pNPB como sustrato (a pH 7,0 y
25 ºC).
CALB fue mucho más estable que LEU o RML en las condiciones de inactivación, por
lo que CALB fue inmovilizada en octil-glioxil agarosa vía activación interfacial y tras su
incubación a pH 10,5 y la reducción con borohidruro de sodio, CALB quedó covalentemente
unida al soporte (octil-glioxil-CALB). La preparación de octil-glioxil-CALB produjo una ligera
disminución de la actividad de la enzima (alrededor del 20-30% en función de la carga de

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 Publicaciones

enzima en el soporte). Las lipasas menos estables, RML o LEU, pudieron inmovilizarse
mediante activación interfacial sobre la superficie libre e inerte de octil-glioxil-CALB y
pudieron liberarse del soporte utilizando detergentes: cetiltrimetilamonio bromuro (CTAB) y
Tritón X-100. Tras incubar el combi-biocatalizador en CTAB y su lavado exhaustivo con agua,
se dio una disminución en la estabilidad de CALB durante las inactivaciones térmicas. Además,
al inmovilizar las enzimas menos estables en el soporte previamente incubado en CTAB y
lavado exhaustivamente, también se observó una disminución en su estabilidad. Al realizar el
mismo experimento con Tritón-X100 al 4%, la estabilidad de las enzimas permaneció intacta,
por lo que fue seleccionado como detergente para la liberación de las lipasas menos estables sin
que este afectase a la actividad o estabilidad de CALB.
Se desarrollaron dos bi-combilipasas, octil-glioxil-CALB-RML y octil-glioxil-CALB-
LEU y una triple-combilipasa, octil-glioxil-CALB-RML/LEU. Tras la inmovilización, en los bi-
combilipasas, RML aumentó su actividad frente a pNPB en un 50%, mientras que LEU incluso
disminuyó la actividad después de la inmovilización en octil-glioxil-CALB (en un 25%).
Usando LEU, alrededor del 15% de la enzima permaneció en el sobrenadante; quizás porque se
excedió la capacidad de carga del soporte. En la triple-combilipasa, RML se inmovilizó muy
rápidamente, y se incrementó la actividad final del combi-biocatalizador frente a pNPB en un
50%. La inmovilización de LEU fue más lenta y se inmovilizó alrededor del 90% de LEU. En
este caso, la actividad aumentó en un 30%.
Para los combi-biocatalizadores de bi-combilipasas, los experimentos de inactivación
mostraron resultados mixtos, con una disminución lenta de la actividad de un 30% usando octil-
glioxil-CALB-RML y una disminución rápida del 40% de la actividad inicial usando octil-
glioxil-CALB-LEU después de 2 h de inactivación, mientras que se da un promedio de la
inactivación de las tres enzimas en la triple-combilipasa.
Posteriormente, los combi-biocatalizadores se incubaron con Tritón X-100 y se lavaron
exhaustivamente con agua. Tras este tratamiento se agregaron nuevos lotes de LEU o RML, o
ambas. Este proceso pudo, repetirse con valores similares de actividad para ambos combi-
biocatalizadores durante 4-5 ciclos pudiendo reutilizarse CALB inmovilizado manteniendo
prácticamente intacta su actividad. El segundo ciclo dio una estabilidad menor y una actividad
mayor que el primer ciclo, muy probablemente como consecuencia de la liberación de alrededor
del 5-10% de CALB en el primer lavado.
De esta manera, usando el soporte heterofuncional octil-glioxil agarosa y un protocolo
de inmovilización enzima a enzima sobre la misma superficie, ya no es necesario descartar
todas las lipasas co-inmovilizadas cuando se inactiva la enzima menos estable, pudiendo
reutilizarse la enzima más estable inmovilizada durante varios ciclos.

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3.4.2. Capítulo IV.II. Co-inmovilización de la enzima menos estable sobre

la enzima más estable inmovilizada en soportes hidrofóbicos y
recubierta con PEI
3.4.2.1. Multi-combilipasas: Lipasas co-inmovilizadas con estabilidades muy diferentes
que combinan la inmovilización mediante activación interfacial e intercambio
iónico. Reutilización de las enzimas co-inmovilizadas más estables tras la
inactivación de las menos estables
Sara Arana-Peña, Diego Carballares, Vicente Cortés Corberán y Roberto Fernández-Lafuente
Anteriormente se ha desarrollado una estrategia para solucionar algunos de los
problemas derivados de la co-inmovilización, como la necesidad de inmovilizar todas las
enzimas siguiendo el mismo protocolo y las diferencias en la estabilidad de las lipasas que hace
que sea necesario descartar todas las enzimas inmovilizadas cuando solo una ha sido inactivada,
aunque el resto mantengan su actividad. Esta estrategia consiste en el uso de soportes
heterofuncionales octil-glioxil agarosa y la inmovilización enzima a enzima de las lipasas. Pese
a que permitió la reutilización de las lipasas más estables co-inmovilizadas, también presentó
algunos problemas, pues la eliminación del detergente adsorbido en el soporte requería lavados
exhaustivos y, además, la limitación en la superficie del soporte supone que la carga de una
lipasa específica solo podría aumentarse si se reduce la carga de las otras enzimas.
Por estos motivos se ha empleado la estrategia de co-inmovilización de lipasas, basada
en la inmovilización de las lipasas más estables en soportes hidrofóbicos mediante activación
interfacial, su recubrimiento con PEI, y la inmovilización de las lipasas menos estables sobre
este compuesto mediante intercambio iónico. Para completar esta estrategia se liberará la
enzima menos estable del soporte, tras su inactivación, mediante el uso de soluciones salinas
concentradas, que no liberarán las lipasas inmovilizadas por activación interfacial,
simplificándose así la recuperación de los biocatalizadores enzimáticos inmovilizados más
estables. Esta estrategia ya había sido utilizada con éxito para co-inmovilizar CALB y β-gal.
Se utilizaron diferentes lipasas (CALA, CALB, LEU, RML y TLL) y el soporte
heterofuncional octil-vinilsulfona agarosa (partículas porosas de agarosa que poseen una capa
de grupos octil y grupos vinil sulfona en su superficie). Así, las enzimas más estables se
inmovilizaron sobre octil-vinilsulfona agarosa, primero por activación interfacial y después por
unión covalente (incubándolas a pH 8,0) para evitar la desorción de las enzimas más estables
bajo cualquier condición (octil-vinisulfona-lipasa). A continuación, el soporte se bloqueó con
ácido aspártico (para incrementar la adsorción entre el soporte y la PEI) y las enzimas menos
estables se inmovilizaron mediante intercambio iónico sobre el polímero policatiónico. En
primer lugar, se compararon las estabilidades a pH 7,0 de las cinco enzimas inmovilizadas en
octil agarosa y se estudió la desorción de las enzimas menos estables del soporte previamente
bloqueado y recubierto con PEI, mediante soluciones salinas altamente concentradas.
Posteriormente, se desarrollaron dos combi-biocatalizadores alterando el orden de
inmovilización de las enzimas para estudiar el efecto de la distribución espacial de las enzimas
co-inmovilizadas en la actividad del biocatalizador frente a diferentes sustratos (pNPB,
triacetina, (R)- y (S)- metil mandelato a pH 7,0 y 25 ºC). Por último, los combi-biocatalizadores
se sometieron a varios ciclos de inactivación de las enzimas menos estables a pH 7,0 (a su
temperatura de inactivación correspondiente), desorción con alta fuerza iónica y recarga de las
enzimas menos estables, para comprobar cómo afectaba a las enzimas más estables.
Los resultados mostraron que CALA, CALB y TLL conservaron su actividad en
condiciones dónde LEU y RML estaban completamente inactivadas, por lo que las primeras se
clasificaron cómo las enzimas más estables y las segundas como las menos estables. CALA,
CALB y TLL se co-inmovilizaron de forma covalente en octil-vinilsulfona agarosa. A

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 Publicaciones

continuación, se bloqueó el soporte con ácido aspártico y el combi-biocatalizador se recubrió

con PEI, de forma que las enzimas menos estables, LEU y RML, pudieran inmovilizarse una a
una sobre la PEI a través de intercambio iónico. Por último, las enzimas menos estables se
liberaron del soporte utilizando 0,5 M de (NH4)2SO4 a pH 7,0, sin que este afectase a la
actividad o estabilidad de las enzimas más estables. El uso de concentraciones menores o
mayores de (NH4)2SO4 resultaron en una menor liberación de enzima del soporte.
La inmovilización de las enzimas menos estables por intercambio iónico sobre el PEI
mejoró su actividad y estabilidad en comparación con los biocatalizadores de octil-agarosa, pero
no lo suficiente como para cambiar su clasificación de menos estables. La actividad del combi-
biocatalizador formado por la co-inmovilización de las 3 enzimas más estables covalentemente
en octil-vinilsulfona agarosa, posteriormente bloqueado con ácido aspártico y recubierto con
PEI, se mantuvo completamente activo después de 3 horas en condiciones donde las enzimas
menos estables inmovilizadas por intercambio iónico en octil-vinilsulfona agarosa previamente
bloqueado con ácido aspártico y recubierto con PEI, se inactivaron rápidamente (después de 30
minutos solo mantuvieron el 50% de la actividad)).
De esa forma, se desarrollaron dos combi-biocatalizadores con dos configuraciones
diferentes según el orden en el que se inmovilizaron sobre el soporte: Octil-vinilsulfona-CALA-
TLL-CALB-PEI-LEU-RML y octil-vinilsulfona-CALB-TLL-CALA-PEI-RML-LEU. Los
resultados mostraron, cómo diferentes protocolos de inmovilización pueden alterar la
especificidad enzimática. Además, sugieren que el orden de inmovilización de la enzima afecta
realmente a la actividad de los biocatalizadores con los diferentes sustratos, pero no de forma
muy relevante, ya que octil-vinilsulfona-CALA-TLL-CALB-PEI-LEU-RML solo fue
ligeramente más activo que octil-vinilsulfona-CALB-TLL-CALA-PEI-RML-LEU frente a todos
los sustratos (las diferencias no superaron el 12%).
Tras la inactivación de RML y LEU, ambos combi-biocatalizadores se incubaron con
0,5 M de (NH4)2SO4 a pH 7,0. Como se observó que el uso de esta sal ocasionaba cierta
liberación de PEI, los biocatalizadores fueron incubados nuevamente con este polímero para
asegurar un recubrimiento similar al de los biocatalizadores iniciales y luego se agregaron
nuevos lotes de LEU y RML. Este proceso pudo repetirse, con valores similares de actividad de
las enzimas más estables, durante al menos 5 ciclos después de la inactivación térmica y
liberación de la enzima menos estable por su incubación en alta fuerza iónica, recubrimiento
con PEI de los combi-biocatalizadores con las enzimas más estables y recarga con LEU y RML
frescos.
De esa manera, la estrategia de co-inmovilización en dos capas puede considerarse
exitosa, ya que las enzimas más estables podrían reutilizarse después de la inactivación de las
enzimas menos estables, solventando los problemas derivados de la co-inmovilización de
enzimas con distintas estabilidades en la misma partícula y los problemas de la estrategia de co-
inmovilización enzima a enzima sobre soportes heterofuncionales octil-glioxil agarosa.

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 Publicaciones

65
 Discusión

4. Discusión global
El Capítulo I.I de la presente tesis doctoral está conformado por varias publicaciones en
las que se ha realizado la evaluación y comparación de algunas de las propiedades de varias
lipasas comerciales (CALA, CALB, TLL y EVT). Para conseguir una comparación adecuada,
en contraste con el uso de la enzima en su forma libre o inmovilizadas mediante otros
protocolos, las lipasas se han inmovilizado sobre soportes hidrofóbicos, a través de un
mecanismo de adsorción física específico de las lipasas, llamado activación interfacial [60,61],
que inmoviliza las lipasas en su forma monomérica y abierta sobre la superficie del soporte [75–
79], sin la posibilidad de que existan agregados lipasa-lipasa o lipasa-componente del extracto
crudo [72–74]. Además, el lavado final del biocatalizador inmovilizado elimina los demás
componentes contenidos en el crudo, evitando que puedan interferir en la evaluación de sus
propiedades.
En todos los casos, las lipasas se inmovilizaron muy rápido y casi totalmente sobre
partículas porosas de octil agarosa (octil-lipasa) [92] y la mayoría aumentaron su actividad
frente a pNPB después de la inmovilización, como CALA, que se hiperactivó siete veces
(Figura 1b del apartado 3.1.1.1.). Esta hiperactivación coincide con lo descrito en la literatura
[75–79], y se explica por el desplazamiento del equilibrio conformacional de las lipasas desde
su forma cerrada (en la que el centro activo se encuentra aislado del medio), hacia su forma
abierta y activa, que se encuentra estabilizada por interacción con la superficie del soporte,
unido a la rotura de los dímeros de lipasa-lipasa [75–79]. La excepción a esta hiperactivación se
dió con CALB (Figura 1a del apartado 3.1.1.1.), lo cual también se había descrito previamente y
se asocia al pequeño tamaño del lid, que no aísla completamente el centro activo de la enzima
del medio, por lo que la inmovilización de su forma abierta no produce un aumento significativo
de la actividad [64,65]. La menor hiperactivación que presentaban TLL y EVT al aumentar la
carga de la enzima en el soporte, como puede verse en las Figuras 2 y 3 del apartado 3.1.1.3.,
puede corresponder a un aumento de los problemas de difusión del sustrato causados por las
actividades catalíticas más altas: el sustrato se consume más rápidamente de lo que puede
difundir dentro del poro de la partícula, lo que provoca que las enzimas que se encuentran
inmovilizadas en las partes más internas del poro no reciban sustrato [108,146–148]. Por lo
tanto, el uso de bajas cargas de enzima asegurará que el comportamiento observado de la lipasa
sea derivado de las propiedades intrínsecas de las moléculas de enzima, al reducir al mínimo los
problemas de difusión del sustrato y al evitar que se generen interacciones intermoleculares
entre las enzimas inmovilizadas debido a la proximidad de las mismas en el soporte
(interacciones enzima-enzima), que podrían interferir en los resultados [108,109].
La inmovilización de lipasas sobre soportes hidrofóbicos presentó algunas ventajas
frente a la inmovilización por intercambio iónico en partículas porosas de MANAE agarosa
[92,112]. La ausencia de hiperactivación de EVT inmovilizada en MANAE agarosa (MANAE-
EVT) puede ser debida a que la inmovilización por intercambio iónico no provoca alteraciones
severas de la estructura de la enzima y a que mantiene la posibilidad de un equilibrio
conformacional entre una forma abierta y una forma cerrada, de forma similar a la lipasa libre
[60,61,68–71]. Sin embargo, EVT mantuvo la actividad tras inmovilizarse, lo cual es un
resultado positivo, dado que muchos métodos de inmovilización producen un descenso en la
actividad de la enzima [97,124]. El hecho de que no toda la enzima se inmovilizase sobre el
soporte MANAE agarosa (Figura 1b del apartado 3.1.1.2.), podría deberse a que algunas
moléculas de enzima se encuentran tan glicosiladas que la parte proteica de la enzima no puede
interaccionar con el soporte.
El menor efecto del pH en la actividad de CALA y EVT cuando se inmovilizan sobre el
soporte octil agarosa (Figura 2 del apartado 3.1.1.1. y Figura 4 del apartado 3.1.1.2.), puede
deberse a la estabilización de la forma abierta de la lipasa, por su interacción sobre la superficie

66
 Discusión

hidrofóbica del soporte [75–79], lo cual impide que el pH influya en el equilibrio

conformacional de la enzima. Asimismo, parece que podría disminuir los cambios en la
estructura de la enzima producidos por el medio. De hecho, parte de los efectos causados en las
propiedades de las lipasas libres o inmovilizadas vía intercambio iónico al variar el pH, podrían
deberse precisamente a su efecto en la estructura de las lipasas y la conformación que estas
pueden adquirir en las diferentes condiciones. Las grandes variaciones en las curvas de
actividad/pH ocasionados por el recubrimiento con PEI de las enzimas inmovilizadas en octil
(sobre todo a pH muy ácidos y básicos), pueden deberse a un cambio en la conformación de la
enzima, causado por la interacción iónica de la enzima con la PEI, o bien a que la interacción
enzima-polímero pueda reforzarse o debilitarse cuando se altera el pH [105]. Este efecto no
puede relacionarse con que el pH interno del biocatalizador no sea el del medio, ya que se
esperaba el tiempo suficiente para conseguir que los pH interno y externo se equilibraran.
Como se ha comentado anteriormente, el uso de este método de inmovilización
garantiza que las diferencias observadas correspondan a las propiedades intrínsecas de la forma
abierta en todas las lipasas estudiadas [75–79,108,109]. Por lo tanto, las diferencias en la
actividad de las diferentes enzimas inmovilizadas en octil agarosa, como la mayor actividad de
CALB en comparación con CALA frente a triacetina o los isómeros de metil mandelato (Tabla
1, apartado 3.1.1.1.), podrían ser explicadas por las diferentes estructuras que poseen las
enzimas estudiadas, que producirán centros activos diferentes con diferentes propiedades de
especificidad o selectividad [64,65,200–202]. Otras diferencias en la actividad, como las
presentes en las preparaciones de EVT frente a varios sustratos y valores de pH (Tabla 1,
apartado 3.1.1.2.), pueden estar relacionadas con la inmovilización de la enzima en diferentes
soportes [85,87–90] y/o con el tratamiento físico o químico posterior de las enzimas
inmovilizadas [105,203], que puede alterar en gran medida la especificidad de la enzima y su
respuesta a los cambios en el medio. De esta forma, el porcentaje de moléculas en la forma
abierta y por lo tanto activa [60,61], la estructura de la forma abierta que se obtiene a cada valor
de pH y la fuerza de la interacción entre la enzima y los grupos catiónicos (MANAE, PEI) o
incluso aniónicos en el soporte [23,24,91], pueden influir en la actividad de cada preparación.
La mayor estabilidad de las enzimas inmovilizadas en octil agarosa en comparación con
la de las enzimas libres o inmovilizadas en MANAE agarosa (CALB ya había sido estudiada en
publicaciones anteriores [136]), como se observa claramente en la Figura 2 del apartado
3.1.1.2., ya se había reportado previamente [75–79]. De hecho, se ha descrito que esta
preparación interfacialmente activada frente a una capa de grupos octil es aún más estable que
las preparaciones multipuntuales unidas covalentemente [97,98] y, por lo tanto, era de esperar
que pudiese ser más estable que la enzima adsorbida iónicamente, donde la estabilización es
difícil de alcanzar [23,24,91]. Esta mayor estabilidad de la lipasa inmovilizada en octil agarosa
es debida a que la forma abierta y estabilizada con la superficie hidrofóbica del soporte [75–79]
es termodinámicamente más estable que la estructura en equilibrio conformacional de la enzima
libre y de la enzima inmovilizada por intercambio iónico [60,61,68–71]. Además, pese a que la
presencia de altas temperaturas y disolventes orgánicos está asociada con la liberación de
enzima del soporte hidrofóbico y, por lo tanto, con la inactivación de las enzimas [99–101] (lo
cual no ocurre con las enzimas inmovilizadas por intercambio iónico), octil-EVT no fue menos
estable que MANAE-EVT (Figura 3 del apartado 3.1.1.2.), por lo que aparentemente, se
encuentra tan fuertemente adsorbida al soporte que este efecto no es relevante.
Por otra parte, las grandes diferencias en la estabilidad de las diferentes enzimas
inmovilizadas en octil agarosa en función de las condiciones del medio, también deberían
basarse, en diferencias en la estructura particular de las enzimas, ya que todas ellas se
encuentran inmovilizadas en el mismo soporte en su forma monomérica y abierta [75–79] y
utilizando una baja carga de enzima en el soporte para evitar interacciones enzima-enzima o
problemas de difusión del sustrato [108,109] que podrían interferir en los resultados. Por

67
 Discusión

ejemplo, considerando el efecto de la presencia de disolventes orgánicos en la estabilidad de las

lipasas inmovilizadas (los cuales a menudo se requieren para mejorar la solubilidad de sustratos
hidrófobicos, para cambiar el equilibrio en la dirección de síntesis [204,205] y en algunos casos
pueden ser uno de los sustratos de la reacción [34,206]), el metanol, un sustrato en la síntesis de
biodiésel, fue el disolvente más negativo para la estabilidad de las lipasas, siendo CALA y EVT
menos estables que CALB (Figura 4b del apartado 3.1.1.1. y Figura 3c del apartado 3.1.1.2.).
Esto es sorprendente dado que EVT fue diseñada para llevar a cabo esa reacción [51], sin
embargo, se puede esperar que en medios anhidros el efecto del metanol sea diferente.
Por último, el menor efecto del recubrimiento de octil-lipasa con PEI en la estabilidad
de las enzimas, incluso llegando a ser negativo, no coincide con el efecto positivo reportado
usando otras enzimas [105,115,116,134,135] (entre ellas CALB [117,136]), el cual podría estar
relacionado con el entrecruzamiento físico intermolecular que evita la liberación de enzima del
soporte hidrofóbico [105,117–119] (producida por la presencia de disolventes orgánicos y altas
temperaturas y que está asociada con la inactivación de las enzimas [99–101]). Este menor
efecto del recubrimiento con PEI puede deberse a que los biocatalizadores tienen una carga
enzimática baja, lo que dificulta el entrecruzamiento físico intermolecular de las moléculas de
enzima inmovilizadas [105] y/o porque la presencia de un polímero catiónico puede estabilizar
estructuras incorrectas, con efectos negativos sobre la estabilidad de la enzima [207]. Sólo en
algunos casos, el recubrimiento de octil-CALA y octil-EVT con PEI produjo una mejora en su
estabilidad, como por ejemplo, frente a dioxano (Figura 4c del apartado 3.1.1.1. y Figura 3b del
apartado 3.1.1.2.), pero esto puede ser causado por la mayor hidrofobicidad del disolvente, que
facilita una cierta partición del medio donde se encuentra el polímero policatiónico, reduciendo
su concentración en el entorno de la enzima [208].
Analizando los resultados, se puede concluir que las propiedades de EVT mejoran en
gran medida siguiendo un protocolo adecuado de inmovilización, cómo la inmovilización en
soportes hidrofóbicos, a pesar de que esta enzima se recomienda para su uso en forma libre [51].
De hecho, EVT es una formulación enzimática desarrollada por Novozymes® como una
evolución de TLL, para ser utilizada como biocatalizador en la producción de biodiésel en esta
forma [51], por lo que es interesante comparar ambas lipasas inmovilizadas en soportes
hidrofóbicos, para comprobar si las ventajas funcionales descritas usando la forma libre se
mantienen al inmovilizarse. Como se ha explicado anteriormente, este protocolo inmoviliza las
lipasas a través de su forma monomérica y abierta, estabilizada sobre la misma superficie, y sin
posibilidad de interacciones enzima-enzima [75–79,108,109], por lo que es el método idóneo
para la comparación de ambas enzimas. Para evaluar el rendimiento en la producción de
biodiesel la inmovilización se realizó en partículas de octadecil metacrilato (un soporte muy
hidrofóbico), debido a que la relevancia del agua en los soportes de agarosa puede producir
efectos indeseados, como la acumulación de glicerina o agua en la partícula de biocatalizador y
su consecuente inactivación [176,177].
La mayor estabilidad de octil-EVT en comparación con la estabilidad de octil-TLL en
todas las condiciones analizadas (diferentes valores de pH y en presencia de disolventes
orgánicos), podría ser la principal, y única, mejora derivada de la evolución realizada sobre la
enzima nativa (observada con las enzimas inmovilizadas en soportes hidrofóbicos), siendo
interesante su mayor estabilidad frente a metanol (Figura 6a del apartado 3.1.1.3.), ya que este
es un sustrato en la producción de biodiésel y EVT se desarrolló principalmente con este
propósito [51]. De hecho, no se encontró una mejora de la nueva propuesta industrial frente a la
enzima original en la hidrólisis de sustratos complejos ni en la producción de biodiésel (en las
condiciones estudiadas), pese a que la evolución de la enzima nativa se dirigió principalmente a
mejorar su rendimiento en este proceso.
Por ejemplo, la actividad de estas lipasas inmovilizadas en partículas de octadecil
metacrilato [88], frente a triacetina y (S)- metil mandelato (Tabla 2 del apartado 3.1.1.3.), no

68
 Discusión

mostró un incremento significativo de EVT frente a TLL, incluso siendo EVT menos eficaz en
la hidrólisis de (S)- metil mandelato (pese a que la carga máxima de enzima en el soporte fue
muy similar para ambas lipasas). Además, al comparar el rendimiento en la producción de
biodiésel (Figura 9 del apartado 3.1.1.3.), ambos biocatalizadores inmovilizados ofrecieron
cursos de reacción muy similares. Esto puede ser debido a que la inmovilización de TLL en
partículas de octadecil metacrilato ya produce una mejora de la enzima en la producción de
biodiésel, la cual había sido reportada en anteriores publicaciones [174,175], generando un
biocatalizador competitivo en comparación con otros tipos de catálisis. Pese a que la presencia
de tert-butanol como disolvente ha mostrado anteriormente no ser positiva para la síntesis de
biodiésel con un catalizador similar de TLL [209], la inmovilización sigue produciendo una
gran mejora en TLL y no debería interferir en la comparativa. Por lo tanto, al haber sido EVT
optimizada para desempeñar su función en forma líquida [51] es posible que la inmovilización
no pueda mejorar más esta propiedad.
Es interesante mencionar que la disminución significativa de la actividad de los
biocatalizadores inmovilizados en octadecil metacrilato frente a triacetina, producida por el
tratamiento con PEI (Tabla 2 del apartado 3.1.1.3.), no coincide con publicaciones previas que
muestran como la modificación con PEI puede incrementar la actividad de las lipasas
inmovilizadas por activación interfacial [105,210]. Esto puede estar relacionado: con la alta
actividad volumétrica de las preparaciones debida a la alta carga de enzima inmovilizada, con
una disminución en el diámetro de los poros causada por el recubrimiento de la enzima con PEI
(Tabla 1 del apartado 3.1.1.3.) que disminuye la velocidad de difusión del sustrato y aumenta
los problemas de gradiente de concentración de sustrato en los biocatalizadores y/o con el
aumento de la tortuosidad de en el camino que debe seguir el sustrato para llegar al centro
activo de la enzima [146–149] (se muestra una representación esquemática de estos problemas
en la Figura 8 del apartado 3.1.1.3.). De hecho, en experimentos realizados durante el desarrollo
de esta tesis doctoral, que utilizan TLL inmovilizada en octil agarosa (Tabla 9, apartado 3.2.1.),
el tratamiento con PEI tuvo un efecto completamente opuesto sobre la actividad enzimática al
observado en este caso, quizá porque el tamaño de la partícula de octadecil metacrilato es mayor
y el diámetro del poro menor [92], lo que podría aumentar los problemas de difusión del
sustrato [146–148]. Esto explicaría por qué no hay diferencias significativas en la actividad
frente a (S) -metil mandelato cuando se recubre de biocatalizador con PEI (Tabla 2, apartado
3.1.1.3.), ya que la actividad de los biocatalizadores frente a este sustrato es muy baja y no se
generan estos problemas de difusión del sustrato [146–149]. En cuanto al efecto negativo del
recubrimiento con PEI para el rendimiento de los catalizadores en la producción de biodiésel
(Figura 9 del apartado 3.1.1.3.), puede ser debido a la mayor hidrofobicidad del sustrato, que
facilita una cierta partición del triglicérido hidrofóbico en el medio de reacción, reduciendo su
concentración en el entorno de la enzima [208]. También en este caso, podría considerarse que
el menor tamaño de poro y mayor tamaño de partícula podrían aumentar los problemas
difusionales de los sustratos [146–148].
Al igual que un método de inmovilización adecuado es necesario para mejorar las
propiedades de las enzimas, el diseño del medio juega un papel importante en la determinación
de la estabilidad enzimática [211,212], y por lo general, los investigadores comprueban el efecto
de los tampones sobre la actividad de las enzimas, pero los estudios sobre la estabilidad
enzimática son escasos. Debido a la importancia de la inmovilización de lipasas en soportes
hidrofóbicos en el contexto de esta tesis doctoral, a lo largo del Capítulo I.II se ha estudiado
cómo la presencia de distintas sales o glicerol pueden afectar a la estabilidad de varias lipasas
(CALA, CALB, CRL, RML y EVT) inmovilizadas (en octil agarosa y amino-glutaraldehído
agarosa (glutaraldehído-lipasa)) y cómo influyen ciertas condiciones, como la concentración del
aditivo o el pH de inactivación, en dicho efecto. Al utilizarlas de forma inmovilizada, se
previenen los riesgos de agregación enzimática que podría distorsionar los resultados [72,73].
Además, el uso de dos métodos de inmovilización permite analizar si el efecto sobre la

69
 Discusión

estabilidad enzimática depende de la estrategia de inmovilización o no, como ha ocurrido con

algunos cationes que estabilizan las lipasas inmovilizadas en octil agarosa, pero no cuando están
inmovilizadas sobre otros soportes [106,107], por ejemplo, octil-EVT se estabilizaba en
presencia de cationes calcio, mientras que MANAE-EVT no lo hacía (Figura 5b y c del apartado
3.1.1.2.).
El efecto negativo aparentemente universal de los aniones fosfato sobre la estabilidad de
las lipasas, solamente es verdadero cuando se encuentran inmovilizadas vía activación
interfacial en octil agarosa e inactivadas a pH 7,0. Este efecto que ya se había sido reportado
anteriormente usando soportes heterofuncionales octil-glioxil agarosa [110,213] y con CALB,
EVT y TLL inmovilizadas en octil agarosa durante el desarrollo de esta tesis doctoral, de hecho,
este anión no tuvo ningún efecto sobre la estabilidad de TLL libre, pero es negativo para la
estabilidad de la enzima inmovilizada en octil (Figura 5a del apartado 3.1.1.3.). La explicación
de este fenómeno es compleja, ya que 1 M de NaCl debería reducir cualquier interacción
específica de los aniones fosfato con las enzimas inmovilizadas por mera competencia, sin
embargo, esto no ocurrió en la mayoría de los casos, incluso siendo la presencia de esta sal
negativa para algunas preparaciones, como para octil-CALA y octil-CRL (Figura 4 del apartado
3.1.2.1.). Además, pese a que la ionización de la molécula de fosfato será diferente a diferentes
valores de pH, pues los pKa de los 3 grupos ionizables de este compuesto son 2,1, 7,2 y superior
a 12,0; las diferencias en la carga del fosfato a los distintos valores de pH estudiados (a pH 5,0
el fosfato presenta sólo un grupo cargado, a pH 7,0 posee poco menos de 1,5 grupos aniónicos y
a pH 9,0 el fosfato tiene dos cargas), no son tan grandes como para explicar los resultados por
esta causa: el efecto negativo de los aniones fosfato sobre la estabilidad de las lipasas
inmovilizadas mediante activación interfacial en octil agarosa disminuye a pH 5,0 (solo siendo
significativo para CALB) y desaparece a pH 9,0 (Figuras 2 y 3 del apartado 3.1.2.1.).
Por último, las grandes diferencias en la estabilidad de las lipasas según el método de
inmovilización, siendo el efecto de los iones fosfato sobre la estabilidad de la enzima mucho
menor o incluso inexistente para las lipasas inmovilizadas covalentemente en el soporte
heterofuncional amino-glutaraldehído agarosa (Figura 5 del apartado 3.1.2.1.), pueden ser
debidas a que la estabilidad de las octil-lipasa está más influenciada por cambios en la
composición del ambiente que las enzimas inmovilizadas por unión covalente [106,107,110].
Esto puede estar relacionado con que ambas estrategias siguen mecanismos de inmovilización
completamente diferentes, donde la forma final de la lipasa difiere. Como se ha explicado
anteriormente, las lipasas inmovilizadas vía activación interfacial en octil u octil-glioxil agarosa
(donde se dan posteriormente algunos enlaces covalentes [99,100]) se encuentra en su forma
abierta, estabilizada por las interacciones con la superficie hidrofóbica [75–79], mientras que la
enzima inmovilizada en amino-glutaraldehído agarosa, primero por intercambio iónico y
posteriormente generándose la unión covalente [104,130], puede mantener el equilibrio
conformacional de la forma abierta y cerrada de la lipasa [60,61,68–71].
Por lo tanto, pese a que no podemos concluir qué mecanismo es el implicado en esta
desestabilización de las lipasas inmovilizadas en octil agarosa por la presencia de iones fosfato a
pH 7,0, lo más probable es que este efecto este relacionados con alguna peculiaridad de la
estructura de la lipasa inmovilizada vía activación interfacial. Esta estructura podría sufrir
cambios en función de las condiciones del medio, volviéndose más o menos susceptible a las
interacciones con los iones fosfato. De hecho, el efecto negativo de los aniones fosfato sobre la
estabilidad de las enzimas inmovilizadas, tampoco es extensible a otras enzimas inmovilizadas
en otros soportes [214], siendo solo universal para lipasas y solamente cuando se encuentran
inmovilizadas vía activación interfacial y a pH 7,0.
La presencia de una alta fuerza iónica (1 o 3 M de (NH4)2SO4; 1 M de Na2SO4 y 1 o 3
M de NaCl), la cual suele utilizarse para conservar, purificar o incluso como medio de reacción
para las enzimas [215–218], ejerce un fuerte efecto sobre la estabilidad de las enzimas

70
 Discusión

inmovilizadas, el cual puede ser positivo o negativo, en función de la lipasa, la naturaleza y

concentración de la sal, el protocolo de inmovilización y las condiciones de inactivación, pero
no es universal. Esta diversidad en los resultados explicaría las diferentes conclusiones
encontradas en estudios previos [218–221], los cuales son escasos y mayormente teóricos
[222,223] debido, entre otras razones, a que los cambios en la fuerza iónica pueden forzar
agregaciones enzimáticas cuando se usan enzimas solubles, que podrían interferir en los
resultados [224,225]. En base a la idea global de estos estudios, el efecto que pueden producir
las diferentes sales sobre la estabilidad de las enzimas podría depender de diferentes factores y
las interacciones entre estos.
Este efecto podría encontrarse fuertemente condicionado por diferencias en la estructura
específica de cada enzima. Por ejemplo, una mayor fuerza iónica puede reducir la intensidad de
los puentes iónicos de las proteínas, los cuales pueden estabilizar estructuras activas o
parcialmente inactivas. Esto puede ser positivo para la estabilidad de la enzima en aquellos
casos en los que los puentes iónicos estabilizan con mayor intensidad su forma parcialmente
inactivada [218].
La naturaleza de la sal también influye en gran medida en los efectos ocasionados por la
presencia de una alta fuerza iónica, pudiendo promover los diversos cationes y aniones
diferentes efectos sobre la estabilidad enzimática. Ya en anteriores publicaciones se había
observado que la lipasa de TLL inmovilizada en octil agarosa se estabilizaba en presencia de
concentraciones elevadas de NaCl [108], pero se desestabilizaba con aniones fosfato [110]. Así,
como regla general, pero no universal, la presencia de (NH4)2SO4 estabiliza las lipasas
inmovilizadas, siendo una concentración de 3 M de esta sal la condición que promovió la mayor
estabilización en la mayoría de los casos. Sin embargo, el efecto negativo producido por la
presencia de NaCl sobre la estabilidad de algunas de las enzimas inmovilizadas (en
determinadas condiciones), como, por ejemplo, en todas las preparaciones de CALA salvo octil-
CALA a pH 5,0 (Figura 1 del apartado 3.1.2.2.), no siempre se explica por la presencia de
cationes sodio, ya que en algunos casos el NaCl desestabiliza mientras que el Na2SO4 estabiliza
el biocatalizador, incluso más que la misma concentración de (NH4)2SO4, como con octil-RML
a pH 7,0 (Figura 4b del apartado 3.1.2.2.).
La búsqueda de una explicación general es más compleja si se tiene en cuenta que el
efecto de una sal específica sobre la estabilidad de una enzima depende de su concentración,
pudiendo ser positivo o negativo en función de la misma. La disminución del efecto negativo de
la sal al aumentar su concentración, como ocurre con glutaraldehído-RML en presencia de NaCl
a pH 9,0 dónde el efecto llega a ser positivo (Figura 4f del apartado 3.1.2.2.), puede deberse a
un múltiple efecto de las sales sobre la estabilidad enzimática. Un efecto negativo, debido a que
una elevada fuerza iónica podría alterar las interacciones iónicas o hidrofóbicas de los grupos
superficiales de la enzima, produciendo su desestabilización. Y un efecto positivo para la
estabilidad de la enzima, quizás relacionado con que la exposición de grupos hidrofóbicos
internos al medio sea menos favorable (disminuyendo la presencia de enzimas parcialmente
distorsionadas e inestables) y/o con el mayor ordenamiento en las moléculas de agua a estas
elevadas concentraciones de sal (lo cual puede reducir la movilidad de la enzima y, en
consecuencia, incrementar su estabilidad) [220–225]. Además, la posible liberación de las
lipasas inmovilizadas mediante activación interfacial debido a altas temperatura [99–101] (y su
consecuente inactivación), debería disminuir al aumentar la fuerza iónica, ya que incrementará
la fuerza de las interacciones hidrofóbicas entre la enzima y el soporte [75–79]. Sin embargo,
en muchos casos se detectó un efecto negativo de la presencia de sales sobre la estabilidad de la
enzima que aumenta con la concentración de sal como en el caso de CRL en presencia de NaCl
a pH 7,0 (Figura 3 b y e del apartado 3.1.2.2.), lo que sugiere que algunos fenómenos son más
relevantes que otros, dependiendo de las condiciones y de la enzima [218–221].

71
 Discusión

Al igual que ocurría con la presencia de iones fosfato, o de cationes calcio [106,107],
el protocolo de inmovilización influye en el efecto que ejerce una alta fuerza iónica sobre la
estabilidad. Esto puede estar relacionado con que la estabilidad de las lipasa inmovilizadas en
octil agarosa es más sensible al medio, como hemos comentado anteriormente [106,107,110].
Además, como se ha explicado anteriormente, el aumento en la fuerza iónica disminuye la
liberación de las lipasas del soporte hidrofóbico y su posterior inactivación [75–79], hecho que
no ocurre en las enzimas unidas covalentemente cuya liberación no se da bajo ninguna
circunstancia [104,130]. Sin embargo, una vez más, y a diferencia de lo ocurrido con los
aniones fosfato, no existe una regla clara que indique que un protocolo de inmovilización dará
biocatalizadores más sensibles a la presencia de estas altas concentraciones de sales, lo que
sugiere que otros factores están influyendo.
Por último, tanto la intensidad del efecto de una alta fuerza iónica sobre la estabilidad de
la enzima como el sentido de este efecto, dependen del pH de inactivación, lo que sugiere que el
pH puede alterar la ionización de las enzimas y su conformación, pudiendo exponer grupos
diferentes o generar nuevas interacciones entre grupos de la superficie de la enzima [220–225].
Sin embargo, tampoco se han encontrado reglas generales en la relación del pH de inactivación
con la presencia de sal en los efectos sobre la estabilidad enzimática.
La razón exacta de cada resultado requerirá de un análisis de modelado profundo, e
incluso esto puede ser complejo considerando el efecto del protocolo de inmovilización, que
producirá enzimas con estructuras diferentes y desconocidas. Estos modelos simplificados
pueden explicar lo que ocurre con una sola enzima (otras enzimas se estudiaron en la misma
publicación, sin encontrarse tampoco reglas generales [226]), una sola sal, a un solo pH de
inactivación e inmovilizada siguiendo un protocolo específico, pero la complejidad de los
efectos una alta fuerza iónica en la estabilidad es muy diversa y una sola explicación no puede
justificar las grandes diferencias, por lo que los efectos deberán ser estudiados empíricamente en
cada uno de los casos.
Al analizar el efecto estabilizador enzimático del glicerol se concluyó que este no es
universal para todas las lipasas y condiciones ensayadas, pero las estabiliza en la mayoría de los
casos. Ya se había descrito que este aditivo estabiliza algunas enzimas [227–233], como la
lipasa TLL inmovilizada mediante activación interfacial en octil agarosa [108], o algunas
enzimas a valores de pH alcalino, el cual es necesario para inmovilizar las enzimas a través de la
unión covalente multipuntual en glioxil [234,235]. Gracias a esta investigación se puede sugerir
que este efecto depende en gran medida de la enzima, el protocolo de inmovilización, el pH de
inactivación, la concentración de glicerol y las interacciones entre estos factores. Existen
muchas publicaciones que intentan explicar las causas de estos efectos estabilizadores,
ofreciendo diferentes respuestas [227–233,236–244], sin embargo, la mayoría de los estudios
que explican el efecto estabilizador del glicerol están relacionados con enzimas libres por lo que
no puede excluirse que el efecto estabilizador al que se refieren provenga de la agregación
enzimática, al menos parcialmente [240,245–247]. Pese a ello, el glicerol interactúa
principalmente con los bolsillos hidrofóbicos de las enzimas, actuando como una interfaz
anfifílica entre las superficies hidrofóbicas de la proteína y el disolvente polar. Esto podría
explicar por qué los efectos del glicerol sobre la estabilidad de la enzima dependen de la
naturaleza de la enzima, siendo más significativo en proteínas hidrofóbicas, como las lipasas
[248].
A diferencia de los resultados obtenidos con los iones fosfato, y al igual que ocurre con
la presencia de sales en el medio, no existen un efecto universal del glicerol sobre la estabilidad
de las enzimas inmovilizadas, pero existen ciertas reglas generales para cada factor estudiado.
En la mayoría de los casos la estabilidad tendió a incrementarse al aumentar la concentración de
glicerol (15%, 30%, 45% y 60%), lo cual puede ser explicado por un incremento de la
interacción del aditivo con los bolsillos hidrofóbicos de la lipasa [248]. Sin embargo, no

72
 Discusión

siempre se siguió esa tendencia e incluso en algunos casos la presencia de bajas concentraciones
de glicerol promovió una desestabilización de la enzima, por ejemplo, con octil-CALB y octil-
CRL a pH 5,0 (Figuras 2a y 3a del apartado 3.1.2.3.), por lo que la concentración de glicerol
debe optimizarse en cada caso para conseguir efectos positivos en la estabilidad de las enzimas.
La existencia de varios efectos simultáneos al aumentar la concentración de glicerol, positivos
como la ordenación de las moléculas de agua o mixtos como la variación en las interacciones de
los grupos superficiales de las enzimas, es una posible explicación para estos resultados [227–
233,236–244].
El protocolo de inmovilización influye, una vez más, en el efecto de la composición del
medio sobre la estabilidad de las enzimas, por ejemplo, el efecto positivo del glicerol sobre la
estabilidad fue menor para las lipasas inmovilizadas en amino-glutaraldehído agarosa a pH 9,0
en comparación con las preparaciones de octil agarosa como pudo observarse en las
preparaciones de CALA, CALB y CRL inmovilizadas (Figuras 1, 2 y 3 del apartado 3.1.2.3.).
Este fenómeno puede ser explicado, una vez más, por la forma en la que se inmoviliza la lipasa
en cada método de inmovilización [75–79,104,130] y la mayor influencia del medio en la
estabilidad de las lipasas inmovilizadas en octil agarosa [106,107,110].
Por lo tanto, pese a que el efecto estabilizador enzimático del glicerol no es universal,
tiende a estabilizar las lipasas inmovilizadas en la mayoría de los casos y es un compuesto
bastante común, sencillo de usar y económico. Asimismo, otros resultados obtenidos en esta
publicación [249], mostraron que este efecto se extiende a otras enzimas inmovilizadas, por lo
que, si es necesario un estabilizador enzimático para una enzima específica en un conjunto
específico de condiciones, el glicerol puede considerarse como un candidato probable, pero esto
debe confirmarse experimentalmente.
En el Capítulo I.III de la presente tesis doctoral, se ha estudiado si la inmovilización
bajo diferentes condiciones de las lipasas vía activación interfacial sobre soportes hidrofóbicos
puede afectar a las propiedades finales de la enzima. La producción de biocatalizadores con
diferentes propiedades se ha realizado previamente mediante diferentes protocolos de
inmovilización, utilizando diferentes interacciones enzima-soporte (como se ha observado con
EVT inmovilizada en octil agarosa y MANAE agarosa en el apartado 3.1.1.2.), alterando la
posición de la enzima con respecto al soporte, variando el grado de unión covalente
multipuntual, etc. [23,25,85,87–91,103,250]. De hecho, una publicación anterior mostró que las
propiedades de TLL inmovilizada mediante activación interfacial en soportes hidrofóbicos
dependen del valor de pH de inmovilización [111], pero se muestra por primera vez usando octil
agarosa como soporte de inmovilización y únicamente variando las condiciones de
inmovilización. Estas condiciones fueron seleccionadas para asegurar que la lipasa fuera
completamente estable y porque presentan diferentes efectos sobre las enzimas cuando se
encuentran en el medio de inactivación, como se ha mostrado durante el desarrollo de esta tesis
doctoral y en publicaciones anteriores [106–108,110,213]. Además, el uso de una carga baja de
enzima en el soporte evitó que se generasen interacciones enzima-enzima que podrían alterar los
resultados.
Bajo esta premisa, se ha demostrado que un protocolo de inmovilización reversible,
como la inmovilización de lipasas en soportes hidrofóbicos octil agarosa a través de activación
interfacial, permite modular las propiedades de algunas de las lipasas estudiadas mediante la
alteración de las condiciones de inmovilización. Así, mientras que CALA solo mostró ciertas
alteraciones en sus propiedades derivadas de las condiciones de inmovilización cuando se
utilizan los isómeros de metil mandelato como sustratos (Tablas 2 del apartado 3.1.3.3.), las
propiedades de RML, PFL y TLL fueron muy modulables por las condiciones de
inmovilización. Las lipasas inmovilizadas presentaron grandes variaciones en la actividad de los
biocatalizadores frente a todos los sustratos utilizados (incluyendo cambios en la especificidad),
al comparar las actividades enzimáticas de los tres sustratos, e incluso en la enantiopreferencia

73
 Discusión

de la enzima, como en el caso de TLL con los isómeros de metil mandelato (Tabla 3 del
apartado 3.1.3.1.). Sin embargo, lo más sorprendente fueron las grandes diferencias en la
estabilidad de las enzimas inmovilizadas bajo diferentes condiciones, por ejemplo, TLL
presentó diferencias de estabilidad con un factor de 10 veces (Tabla 2 del apartado 3.1.3.1.) en
función de las condiciones de inmovilización. Las altas temperaturas utilizadas durante las
inactivaciones deberían volver aún más reversible la unión de la enzima con el soporte
hidrofóbico, facilitando la liberación de la misma al medio [99–101], y revirtiendo cualquier
posible cambio en su conformación, pero esto no sucedió.
Un hecho interesante, es el efecto que producen algunos agentes sobre la estabilidad de
las enzimas inmovilizadas cuando se utilizan en el medio de inmovilización, el cual es contrario
al que se produce cuando se utilizan en el medio de inactivación. Por ejemplo, el glicerol tiende
a estabilizar las lipasas inmovilizadas en octil agarosa, como se ha demostrado en esta tesis
doctoral (apartado 3.1.2.3. del Capítulo I.II), y también la lipasa libre [87,88]. Sin embargo,
cuando se usa como aditivo en la inmovilización, el efecto que ejerce en la estabilidad de la
enzima inmovilizada puede ser negativo, como ocurre con TLL a pH 7,0 y 9,0 (Tabla 2 del
apartado 3.1.3.1.). Esto también ocurre con la estabilidad de los diferentes biocatalizadores
inmovilizados en presencia de concentraciones crecientes de fosfato. Salvo en el caso de TLL,
la adición de este anión durante la inmovilización produce biocatalizadores con una mayor
estabilidad (como puede verse que ocurre con RML en la Tabla 4 del apartado 3.1.3.3.), aunque
se ha demostrado durante el desarrollo de esta tesis doctoral que su presencia en el medio de
inactivación reduce significativamente la estabilidad de las lipasas inmovilizadas en octil
agarosa a pH 7,0 (apartado 3.1.2.1. del Capítulo I.II). Estos efectos opuestos sugieren que las
diferencias en la estabilidad de las lipasas inmovilizadas bajo distintas condiciones no están
causadas por una adsorción del aditivo a la enzima inmovilizada, el cual podría ser liberado
debido a las altas temperaturas y actuar como estabilizante o desestabilizante en el medio de
inactivación.
Por lo tanto, todas estas diferencias en las propiedades de las lipasas inmovilizadas bajo
diferentes condiciones pueden ser debidas a que la conformación de las moléculas de lipasa es
muy flexible, por lo que estas enzimas son sensibles a pequeños cambios en el medio que
pueden generar grandes cambios en su estructura terciaria o la estructura del centro activo,
alterando sus propiedades [23,85]. La posterior inmovilización de la lipasa, vía activación
interfacial sobre un soporte hidrofóbico en dichas condiciones, permite que una conformación
específica se mantenga incluso al incubarse la enzima inmovilizada en otro medio y a elevada
temperatura. Esto es posible gracias a que este método de inmovilización involucra muchos
grupos del gran bolsillo hidrofóbico de la lipasa, que interaccionan con la superficie del soporte
provocando una adsorción difícilmente reversible [75–79]. Esta idea queda representada en el
Esquema 1 del apartado 3.1.3.2.
Se puede intentar explicar algunas de estas diferencias por el efecto que ejercen algunos
aditivos durante la inmovilización. Por ejemplo, el aumento de la concentración de NaCl genera
un efecto mixto en la inmovilización, desplazando el equilibrio de la molécula de lipasa libre a
su forma cerrada, forma en la cual no se puede inmovilizar, pero fortaleciendo las interacciones
hidrofóbicas entre la enzima y el soporte [75–79]. Además, puede alterar la estructura de la
enzima, al dificultar la exposición de los grupos hidrofóbicos internos al medio. Por otro lado, la
adición de glicerol durante la inmovilización genera el efecto opuesto, favoreciendo la forma
abierta de la lipasa, ya que es más hidrofóbico que el agua, pero a su vez disminuyendo la fuerza
de adsorción de la enzima sobre el soporte hidrofóbico [75–79]. Esto puede explicar por qué con
PFL, la inmovilización fue más rápida en ausencia de glicerol (Figura 1 del apartado 3.1.3.2.),
aunque esto no ocurre con las otras lipasas estudiadas. Además, el glicerol también puede
ejercer algunos efectos sobre la estructura de la enzima [228,229]. Sin embargo, no existe una
tendencia clara en el efecto que ejercen las distintas condiciones de inmovilización sobre las

74
 Discusión

propiedades de las lipasas, por lo que este puede estar relacionado con las interacciones de los
efectos de estos aditivos con los efectos del pH u otras variables.
El espectro de fluorescencia de los residuos triptófano de las distintas preparaciones de
TLL confirma que realmente existen grandes diferencias estructurales en las lipasas
inmovilizadas bajo distintas condiciones, que pueden relacionarse con las grandes variaciones
encontradas en la estabilidad. Sin embargo, el grado de compacidad/flexibilidad de las
moléculas que sugiere este experimento, no explica adecuadamente todos los resultados. Por
ejemplo, la presencia de una alta fuerza iónica durante la inmovilización parece mitigar los
cambios conformacionales sufridos por TLL cuando se inmoviliza bajo valores de pH drásticos
(pH 5,0 o 9,0) (Figura 4 del apartado 3.1.3.1.). Esta información estructural explica la mayor
estabilidad de TLL inmovilizada a pH 5,0 y alta fuerza iónica, ya que, como hemos visto, la
fuerza iónica podría generar una enzima más compactada [75–79]. Sin embargo, la misma
explicación no es válida para aquellas enzimas inmovilizadas a pH 9,0 donde la fuerza iónica
apenas mejoró, o incluso disminuyó la estabilidad de la enzima. Por ejemplo, la presencia de
cationes calcio durante la inmovilización, produjo una estructura más compacta, pero la
estabilidad se redujo.
Las interacciones enzima-enzima, generadas por la proximidad de las enzimas
inmovilizadas, cuando se utilizaron preparaciones altamente cargadas de PFL, pueden producir
cambios conformacionales que afectan a las propiedades de la enzima, cambios que son
modulados por las condiciones de inmovilización. Esta idea se encuentra representada en el
Esquema 2 del apartado 3.1.3.2. Las fuertes discrepancias en la actividad y estabilidad, cuando
se comparan los biocatalizadores de baja carga y alta carga sugieren que las interacciones
enzima-enzima son lo suficientemente fuertes como para modificar el efecto de las condiciones
de inmovilización sobre las propiedades de la enzima inmovilizada simplemente alterando las
características de las moléculas enzimáticas individuales.
En la mayor parte de los casos, los efectos observados en la actividad y estabilidad de
los biocatalizadores (inmovilizados bajo distintas condiciones), usando preparaciones de alta
carga, fueron opuestos a los obtenidos con baja carga. Por ejemplo, al comparar el efecto del pH
utilizando triacetina como sustrato, las preparaciones poco cargadas de enzima dieron la
actividad más alta al inmovilizar la enzima en pH 9,0, mientras que, con alta carga, la actividad
al inmovilizar la enzima a pH 9,0 dio lugar al biocatalizador menos activo con esta carga
(Tablas 1 y 3 del apartado 3.1.3.2.). Aunque las cargas enzimáticas de los biocatalizadores de
alta carga no eran idénticas (debido a que los biocatalizadores tuvieron diferentes rendimientos
de inmovilización según las condiciones de inmovilización (Tabla 2 del apartado 3.1.3.2.)),
estas diferencias no explican el efecto sobre la actividad del biocatalizador, por lo que los
cambios se deben a cambios reales en las características intrínsecas de las enzimas. Además,
cabe destacar que la estabilidad enzimática de las preparaciones con alta carga y la diferencia
entre estas, fueron mucho mayores que las de baja carga, presentando preparaciones de alta
carga que se inactivaron casi por completo, mientras que la condición que dio la preparación
más estable (inmovilización en presencia de cationes calcio) mantuvo más del 80% de la
actividad inicial (Tabla 3 del apartado 3.1.3.2.). Este efecto de las interacciones enzima-enzima
sobre la estabilidad enzimática habían sido previamente descrito [108,109], pero es claramente
visible usando PFL. Además, es posible que la aceleración o la ralentización del proceso de
inmovilización por la presencia de diferentes aditivos, pueda producir diferentes distancias entre
moléculas enzimáticas inmovilizadas que alteren la relevancia de las interacciones enzima-
enzima [108,109].
Esta gran modulación de las propiedades de RML, PFL y TLL, por las condiciones de
inmovilización al inmovilizarse vía activación interfacial sobre soportes hidrofóbicos octil
agarosa, permite incrementar la biblioteca de biocatalizadores disponible para una misma lipasa
y usando el mismo soporte, solo modificando las condiciones de inmovilización. Sin embargo,

75
 Discusión

esto también implica la necesidad de un fuerte control de dichas condiciones ya que cualquier
pequeño cambio no conocido en la composición del medio (por ejemplo, algún aditivo en el
extracto comercial) puede alterar completamente las características de la enzima inmovilizada y
dificultar la reproducibilidad. Además, predecir el efecto de una variable sobre las propiedades
finales de la enzima inmovilizada es bastante complicado, por lo que será necesario realizar un
estudio específico en cada caso.
En contraposición con estas lipasas, la inmovilización de CALB y CRL sobre soportes
hidrofóbicos se presenta como un método de inmovilización muy reproducible y robusto (con
los sustratos y condiciones estudiadas), en el cual los cambios en las condiciones de
inmovilización no afectan significativamente a las propiedades de los biocatalizadores
inmovilizados siempre que no inactiven la enzima libre (como cuando se incubó CRL a pH 9,0
en ausencia de glicerol (Figura 3 del apartado 3.1.3.3.)). Las posibles causas de este
comportamiento son que los cambios en la estructura de la lipasa, inducidos por las diferentes
condiciones, no sean tan grandes o que dichos cambios puedan revertirse después de la
inmovilización (en el caso de CALB, esto podría ser debido al pequeño tamaño del lid [64,65],
que presentaría una unión menos intensa con el soporte). Esto es una ventaja, principalmente si
la composición de la preparación cruda de partida se puede alterar sin el conocimiento del
investigador, agregando o eliminando algunos de los componentes del medio estudiados.
Algunas de las ventajas de la inmovilización han sido ampliamente analizadas durante
el desarrollo del Capítulo I de esta tesis doctoral, como la mejora en las propiedades de la
enzima (actividad, especificidad y estabilidad) al inmovilizarse. Sin embargo, el uso de soportes
preexistentes supone un coste extra en la aplicación de los biocatalizadores [80,91]. En el
Capítulo II de la presente tesis doctoral se ha desarrollado una estrategia que puede permitir
mejorar la capacidad de carga y la actividad volumétrica de soportes porosos (y con ello reducir
el impacto del soporte en el costo total de los biocatalizadores), mediante la formación de
multicapas de enzima, inmovilizando una capa de enzima sobre la anterior para multiplicar la
capacidad de carga final del soporte.
Durante la implementación de esta estrategia, la liberación de un alto porcentaje de las
enzimas inmovilizadas por intercambio iónico sobre la PEI (se utilizaron cargas máximas en
cada capa), por su recubrimiento con el polímero policatiónico, pudo deberse a la existencia de
cierta competencia entre las moléculas de PEI libres e inmovilizadas, por las moléculas de
enzima inmovilizada sobre el octil-enzima-PEI. Esto sucedió con todas las lipasas estudiadas,
CALA, CALB, RML y TLL, salvo con LEU, pese a que esta estrategia ya había sido utilizada
en otras publicaciones para co-inmovilizar enzimas [120,121] o enzimas y cofactores [122] e
incluso para hacer multicapas de enzimas [137–141,210] ya que genera una superficie de
intercambio aniónico, en soportes o en proteínas [105,114]. El tratamiento de los
biocatalizadores octil-enzima-PEI-enzima con una solución de glutaraldehído al 1% (v / v), un
compuesto con una gran eficacia como agente entrecruzante [125–127], evitó por completo la
liberación de moléculas de lipasa del compuesto octil-enzima-PEI-enzima-glutaraldehído
cuando se realizó un nuevo recubrimiento con PEI, al entrecruzar las moléculas de PEI con
ambas capas de lipasa (capas inferior y superior). El entrecruzamiento pudo darse gracias a la
alta reactividad del amino-glutaraldehído con otros grupos amino-glutaraldehído [121,135,210].
Esta estrategia se utilizó con todas las enzimas para producir los biocatalizadores de tres
capas de manera exitosa y permitió demostrar que el uso de PEI y glutaraldehído como agentes
conectores para la construcción de biocatalizadores de multicapas de enzima (con una gran
carga enzimática), es completamente funcional y puede ser de uso universal.
El hecho de que los biocatalizadores de 3 capas no siempre fueron los más activos
frente a todos los sustratos y bajo algunas condiciones específicas, puede deberse en parte, al
efecto negativo del entrecruzamiento de la enzima y la PEI con glutaraldehído sobre la actividad

76
 Discusión

enzimática. Sin embargo, el principal motivo por el cual se minimiza el aumento en la actividad
tras la inmovilización de una nueva capa de enzima, pudiendo incluso darse una disminución en
la actividad volumétrica, es la disminución de la tasa de difusión del sustrato desde el medio al
interior de los biocatalizadores. Este fenómeno deriva de la disminución del tamaño de los
poros, que provoca una menor disponibilidad de sustrato para las enzimas de las capas inferiores
y queda claramente ejemplificado en el caso de TLL frente a triacetina (Tabla 9 del apartado
3.2.1.). Una mayor carga enzimática y el mayor rendimiento de inmovilización (de casi todas las
enzimas) al inmovilizarse por intercambio iónico en comparación con el de las enzimas
inmovilizadas por activación interfacial (Figura 3 del apartado 3.2.1.), puede contribuir a este
aumento en los problemas de difusión. Además, se da un incremento en la tortuosidad del
camino que debe seguir el sustrato para llegar a las capas internas de enzima, debido a las
moléculas de PEI y moléculas de enzima inmovilizada [146–149]. Esto será más relevante, en
los casos en que la actividad de una enzima inmovilizada mediante activación interfacial frente
a un sustrato determinado, sea mucho mayor que la actividad de esa misma enzima
inmovilizada mediante intercambio iónico, como por ejemplo CALB frente a (S)- metil
mandelato (Tabla 7 del apartado 3.2.1.), debido a que la enzima inmovilizada vía activación
interfacial se encuentra en la capa más interna. Solo la presencia de un sustrato o unas
condiciones experimentales que permiten una baja actividad, generarán un incremento en la
actividad al incrementar el número de capas, como le sucede a CALA frente a los isómeros de
mandelato (Tabla 8 del apartado 3.2.1.) o a RML frente a triacetina, en presencia de 30% de
acetonitrilo y 4 ºC para reducir la velocidad de reacción (Tabla 6 del apartado 3.2.1.).
Un punto a destacar es que esta estrategia produjo tres formas de lipasa en función del
tipo de inmovilización y del tratamiento físico o químico al que fue sometida. Una primera capa
de enzima inmovilizada mediante activación interfacial sobre octil agarosa y orientada hacia la
superficie del soporte, recubierta con PEI y entrecruzada con glutaraldehído, una segunda capa
(y todas las posibles capas intermedias) de enzima inmovilizada por intercambio iónico,
también entrecruzada con glutaraldehído y recubierta con PEI, y una última capa de enzima
inmovilizada mediante intercambio iónico sin ninguna modificación adicional. Además, las
enzimas inmovilizadas en PEI y recubiertas con nuevas moléculas de polímero pueden poseer
diferentes orientaciones, al encontrarse inmovilizadas en una cama polimérica tridimensional
[251]. Los diferentes efectos sobre la actividad y especificidad de las lipasas generados por la
modificación con PEI o glutaraldehído, dependieron de la enzima, del método de
inmovilización, del sustrato utilizado y de las condiciones de reacción. Este hecho se puede
observar claramente al comparar las actividades de LEU con y sin glutaraldehído (Tablas 4 y 10
del apartado 3.2.1.), y ya se había observado en publicaciones anteriores [105,210,252,253]. Por
lo tanto, esta estrategia de inmovilización de enzimas en multicapas no tiene sentido si se desea
una alta especificidad o selectividad, pero es interesante para modificar completamente sustratos
heterogéneos, ya que cada forma de la lipasa con sus propiedades específicas puede actuar como
una lipasa diferente, siendo un caso particular de combilipasas. De hecho, se ha publicado
anteriormente que la mezcla de biocatalizadores individuales de la misma lipasa inmovilizada
siguiendo diferentes protocolos producía mejores resultados que el uso de cada biocatalizador
inmovilizado independientemente [181].
La co-inmovilización de las diferentes lipasas utilizando esta estrategia de
inmovilización en multicapas, evita la competencia en la carga entre enzimas co-inmovilizadas
en la misma partícula y permite controlar estrictamente la distribución espacial de las diferentes
lipasas gracias al orden de inmovilización, al estar cada capa de enzima completamente cubierta
de PEI y la siguiente enzima. Esta estrategia de inmovilización de combilipasas en multicapas
se ha desarrollado en el Capítulo III de la presente tesis doctoral y queda esquematizada en la
Figura 4 del apartado 3.3.1. La distribución espacial de las enzimas influye en la actividad y
especificidad de los biocatalizadores de varias lipasas co-inmovilizadas (combi-
biocatalizadores), sumándose a los factores mencionados anteriormente, ya que una distribución

77
 Discusión

adecuada de las diferentes enzimas en el biocatalizador permite que la reacción se produzca de

manera óptima [182,194–197]. Esto quedó demostrado al comparar las diferencias en la
actividad de dos combi-biocatalizadores compuestos por las mismas lipasas con distinto orden
de inmovilización, dónde una distribución espacial inadecuada impidió que la actividad se
incrementase progresivamente al añadir una nueva capa de enzima frente a la mayoría de
sustratos estudiados. Esto puede ser debido a un incremento en los problemas de difusión del
sustrato y en la tortuosidad del camino que debe seguir el sustrato para alcanzar las primeras
capas de enzimas cuando las enzimas de las capas inferiores son más activas que la nueva capa,
sobre todo si la primera capa, con el centro activo orientado hacia la superficie del soporte, es la
más activa [146–149]. Así, la distribución espacial de las enzimas en el combi-biocatalizador,
puede producir un incremento progresivo de la actividad cuando las enzimas menos activas
frente a un determinado sustrato se sitúen en las capas inferiores, como ocurre con el
biocatalizador con LEU inmovilizado en la primera capa (Tabla 2 del apartado 3.3.1.) o bien
una actividad muy alta en la primera capa, que no aumenta e incluso decrece al incrementarse el
número de capas, cuando las enzimas más activas frente a un sustrato se encuentren en las capas
inferiores, como ocurre con el biocatalizador con CALB en la primera capa (Tabla 3 del
apartado 3.3.1.). Por tanto, se puede esperar que la actividad de las enzimas en las capas internas
de los biocatalizadores pueda estar infrautilizada, poniendo de manifiesto la importancia de una
distribución adecuada cuando se utilizan enzimas co-inmovilizadas [182,194–197].
Esta estrategia de inmovilización de enzimas en multicapas puede ser compatible con
muchos protocolos de inmovilización enzimática para la primera capa (por ejemplo, covalente,
intercambio iónico), y puede extrapolarse a otras enzimas, siempre que sean resistentes a la
modificación con PEI y glutaraldehído (de lo contrario, deben emplearse otros agentes de
conexión). Utilizando soportes porosos, el límite será el tamaño de poro remanente en la
partícula, que debe ser lo suficientemente grande para permitir inmovilizar la nueva capa de
enzima, pero, el número de capas de un biocatalizador y el orden de las mismas deberá decidirse
como una respuesta específica a una reacción.
Como se ha mencionado a lo largo de esta tesis doctoral, la inmovilización de las
lipasas en soportes hidrofóbicos mediante activación interfacial es un protocolo de
inmovilización casi universal de las lipasas que puede mejorar enormemente sus propiedades
[75–79]. Debido a esto, tiene un gran potencial para co-inmovilizar lipasas, solventando uno de
los principales problemas que surge de co-inmovilizar enzimas en la misma partícula, la
necesidad de inmovilizar las diferentes enzimas siguiendo el mismo protocolo y en las mismas
condiciones [24,33,182]. Sin embargo, cuando se analizaron las estabilidades de CALA, CALB,
LEU, RML y TLL inmovilizadas en octil agarosa mediante activación interfacial, se
encontraron grandes diferencias en su estabilidad y, de hecho, algunas lipasas permanecieron
completamente activas en condiciones en las que otras lipasas estaban completamente
inactivadas (Figura 2 del apartado 3.4.2.1.). Así, se clasificaron estas lipasas en 2 grupos
diferentes en función de su estabilidad a pH 7,0: las lipasas más estables, las cuales permanecen
completamente activas en las condiciones de inactivación (CALA, CALB y TLL), y las lipasas
menos estables, las cuales se inactivan en esas condiciones (RML, LEU). Si se co-inmovilizasen
estas lipasas en octil agarosa se tendrían parte de las enzimas completamente inactivadas cuando
las otras permanecerían completamente estables, pero las 5 deberían descartarse. Al ser un
método reversible, permite la recuperación del soporte, pero las lipasas más estables se liberarán
a la vez que las enzimas inactivas. Este es el gran problema derivado de la co-inmovilización de
enzimas en la misma partícula, la posibilidad de que existan grandes diferencias entre las
estabilidades de las enzimas involucradas [24,33,182], que impliquen que todas las enzimas
inmovilizadas deben descartarse después de la inactivación de la enzima menos estable incluso
cuando las otras enzimas mantienen sus actividades iniciales intactas. La posible reutilización
de la enzima más estable suele ignorarse en la mayoría de los trabajos, sin embargo, el problema

78
 Discusión

quedo claramente ejemplificado cuando CALB inmovilizada en octil agarosa se recubrió con
PEI y la lactasa de Aspergillus niger se co-inmovilizó mediante intercambio iónico [120,121].
La solución a este problema se ha planteado en el Capítulo IV de la tesis doctoral,
mediante el desarrollo de dos estrategias para co-inmovilizar las diferentes lipasas. Estas
estrategias combinan diferentes métodos de inmovilización (mediante el uso de soportes acil
heterofuncionales desarrollados en el laboratorio), que permiten que las enzimas más y menos
estables puedan co-inmovilizarse y las enzimas más estables puedan reutilizarse después de la
inactivación y liberación de las menos estables (inmovilizadas reversiblemente).
La primera estrategia, desarrollada en el Capítulo IV.I, muestra una solución simple
para superar el problema de la co-inmovilización de enzimas con diferentes estabilidades,
aprovechando las ventajas de la inmovilización de lipasas mediante activación interfacial para
todas las enzimas involucradas [75–79]. Esta estrategia, basada en el uso de soportes
hterofuncionales octil-glioxil agarosa [99,107] y una inmovilización enzima a enzima [254], fue
un éxito. La reducción de los grupos glioxil genera un soporte muy inerte, lo cual evita
adsorciones excesivamente fuertes de las enzimas menos estables (RML y LEU) y permitió
reusar la enzima más estable (CALB) inmovilizada covalentemente durante varios ciclos de
inactivación, desorción con detergente e inmovilización de las enzimas menos estables (vía
activación interfacial), recuperándose la actividad del combi-biocatalizador y sin verse afectada
la actividad ni estabilidad de las enzimas más estables (Figuras 7 y 10 del apartado 3.4.1.1.).
Un punto a destacar, es la menor estabilidad y mayor actividad de los combi-
biocatalizadores en el segundo ciclo (y sucesivos) en comparación con el primer ciclo, muy
probablemente causada por la liberación de alrededor del 5-10% de moléculas de CALB no
inmovilizadas covalentemente durante el primer lavado y la inmovilización de un mayor
porcentaje de la enzima menos estable, que es más activa (LEU no se inmovilizó por completo
en el primer ciclo). Este porcentaje de lipasa, no queda unida covalentemente al soporte y solo
lo está mediante adsorción interfacial, se debe a que los grupos glioxil se encuentran bajo una
capa de grupos octil más largos y las lipasas generalmente no son muy ricas en residuos lisina
[99,100], lo que dificulta la unión covalente entre ambos [110,213].
El uso de detergentes permitió liberar las enzimas menos estables del soporte, sin
afectar a la actividad de CALB inmovilizada. Sin embargo, la presencia de detergente en el
combi-biocatalizador ejercía un efecto negativo en la estabilidad de las lipasas, por lo que se
requerían lavados exhaustivos con agua para eliminarlo. De hecho, el CTAB tuvo que
descartarse debido a que permanecía adsorbido al soporte incluso después de realizar estos
lavados, siendo liberado al incrementar la temperatura en las inactivaciones térmicas y
desestabilizando las enzimas (Figura 4b y c del apartado 3.4.1.1.). Esta fuerte adsorción puede
ser debida a su carácter mixto, involucrando los grupos octil (adsorción vía activación
interfacial) y carboxilo del soporte (adsorción vía intercambio iónico).
Como el uso de lavados exhaustivos para eliminar el detergente del combi-
biocatalizador puede ser un problema a nivel industrial [80], y dado que esta estrategia de co-
inmovilización enzima a enzima sobre soportes heterofuncionales octil-glioxil supone reducir
las cargas de las diferentes enzimas para co-inmovilizarlas en la misma superficie, se planteó la
co-inmovilización de lipasas recubriendo con PEI la enzima más estable inmovilizada e
inmovilizar la enzima menos estable sobre el polímero, para posteriormente liberarla utilizando
una alta fuerza iónica. Esta segunda estrategia, desarrollada en el Capítulo IV.II de la presente
tesis doctoral, ha permitido reutilizar las enzimas más estables (CALA, CALB y TLL)
inmovilizadas primero por activación interfacial y luego covalentemente en el soporte
heterofuncional octil-vinilsulfona agarosa (para evitar cualquier posible liberación de la enzima)
[99,100], durante al menos 5 ciclos de inactivación y desorción con altas concentraciones de sal
de las lipasas menos estables (RML y LEU), recubrimiento con PEI del combi-biocatalizador

79
 Discusión

con las lipasas más estables inmovilizadas e inmovilización de las enzimas menos estables vía
intercambio iónico sobre la PEI, recuperando valores similares de actividad y sin verse afectada
la actividad ni estabilidad de las enzimas más estables (Figura 10 del apartado 3.4.2.1.). Por lo
que la estrategia fue exitosa y solventó los problemas derivados de la estrategia presentada en el
Capítulo IV.I.
La variación de la actividad de las lipasas frente a distintos sustratos, cuando se
inmovilizan utilizando los distintos métodos de inmovilización, muestra, al igual que muchas
publicaciones anteriores [23,25,85,88,90], cómo diferentes protocolos de inmovilización
pueden alterar la especificidad enzimática. De hecho, la inmovilización de RML y LEU sobre
PEI fue una buena alternativa a su inmovilización en soportes hidrofóbicos considerando tanto
la actividad (Figura del apartado 3.4.2.1.) como la estabilidad de las enzimas inmovilizadas
(Figura 4 del apartado 3.4.2.1.), pese a los buenos resultados obtenidos con dichos soportes.
Además, las diferencias en la actividades finales de las dos configuraciones de los
combi-biocatalizadores frente a diferentes sustratos, sugieren que las enzimas podrían estar
distribuidas espacialmente en el poro siguiendo el orden de inmovilización [182,194–197] y
alterando los problemas de difusión de sustrato [108,146–148]. Esto puede ser posible gracias
a la rápida inmovilización de las enzimas sobre octil agarosa y sobre PEI, lo cual provocaría que
la primera enzima inmovilizada se encontrará en las áreas externas de los poros del soporte y la
última se encontrará más cerca del núcleo de la partícula de soporte formando diferentes
coronas enzimáticas [182,195]. Sin embargo, las diferencias en la actividad no fueron muy
grandes (Tablas 3 y 4 del apartado 3.4.2.1.).
El uso de alta fuerza iónica para liberar las enzimas menos estables no afectó a la
estabilidad de las enzimas más estables, lo cual concuerda con los resultados obtenidos en el
apartado 3.1.2.2. de la presente tesis doctoral, donde el uso de (NH4)2SO4 es positivo para la
estabilidad de las lipasas utilizadas. Además, la fuerte adsorción de las enzimas menos estables
inmovilizadas en PEI tras su incubación en concentraciones elevadas de sal (2 molar en
adelante) (Figuras 6 y 7 del apartado 3.4.2.1.), sugiere que la presencia de una alta fuerza iónica,
fortalece las interacciones hidrofóbicas entre la enzima y el soporte [75–79], produciéndose una
unión mixta: por intercambio iónico y activación interfacial. Por lo tanto, se seleccionó una
fuerza iónica intermedia para asegurar la desorción total de las lipasas menos estables. Sin
embargo, la incubación y lavado con alta fuerza iónica produjeron cierta desorción de las
moléculas de PEI del soporte (Tabla 1 del apartado 3.4.2.1.). Por lo que se decidió que los
biocatalizadores fuesen incubados nuevamente con PEI en cada ciclo para asegurar un
recubrimiento similar de los biocatalizadores con PEI.
De esa manera, ambas estrategias pueden considerarse exitosas, ya que las enzimas más
estables podrían reutilizarse después de la inactivación de las enzimas menos estables,
solventando el problema derivado de las diferentes estabilidades de las lipasas. Estas estrategias
podrían extenderse a cualquier número de lipasas, siempre que las enzimas se puedan clasificar
en dos rangos de estabilidad. Si el rango de estabilidades enzimáticas se puede dividir en tres
grupos claramente diferentes, estas estrategias no serán suficiente para evitar el problema del
descarte de enzimas completamente activas, ya que algunas enzimas permanecerán activas con
los otros dos grupos inactivos. Es decir, será necesario el desarrollo de estrategias que permitan
tener varios niveles de liberación selectiva de enzimas.

80
 Conclusiones

5. Conclusiones
1. Todas las lipasas estudiadas en esta tesis doctoral pudieron inmovilizarse en octil agarosa,
mejorando su estabilidad térmica y otras propiedades enzimáticas.

2. El uso de soportes hidrofóbicos permite comparar las propiedades de diferentes lipasas

inmovilizadas en similar conformación (forma monomérica y abierta), estabilizada sobre la
superficie del soporte. Esto ha permitido clasificar las lipasas según su estabilidad: CALA,
CALB, EVT y TLL se clasificaron como enzimas muy estables mientras que RML y LEU
se clasificaron como las enzimas poco estables. Por lo tanto, los soportes octil agarosa
permiten co-inmovilizar múltiples lipasas, pero muestran de forma clara el problema de la
diferente estabilidad de las lipasas.

3. El mismo componente del medio de inactivación puede ser un agente estabilizador o

desestabilizador para una lipasa dependiendo de su concentración, del pH de inactivación,
del protocolo de inmovilización, etc. Existe un efecto negativo universal de los aniones
fosfato a pH 7,0 para la estabilidad de todas las lipasas estudiadas inmovilizadas en octil
agarosa (pero no en otros soportes). Otros agentes como la glicerina, sulfato amónico,
sulfato sódico o cloruro sódico mostraban efectos complejos, sugiriendo que había varios
efectos simultáneos (algunos positivos, otros negativos) sobre la estabilidad de las lipasas.

4. La variación de las condiciones del medio de inmovilización cuando se inmovilizan lipasas

por activación interfacial sobre octil agarosa, produce biocatalizadores con propiedades muy
diferentes en algunos casos (RML, PFL y TLL), mientras en otros (CALB y CRL) apenas
tiene efecto en las propiedades finales de los biocatalizadores. Esto permite generar una
biblioteca de biocatalizadores inmovilizados de la misma lipasa utilizando el mismo soporte
de inmovilización, únicamente cambiando las condiciones y la composición del medio de
inmovilización, pero también obliga a controlarlos cuidadosamente para tener resultados
reproducibles.

5. La inmovilización de lipasas vía activación interfacial en octil agarosa utilizando cargas

cercanas al máximo de la capacidad del soporte es muy rápida, lo que provoca que las
moléculas de enzimas estén tan próximas como para que se produzcan interacciones
intermoleculares entre las enzimas. Estas interacciones enzima-enzima, generan en algunos
casos cambios en las propiedades de la enzima, los cuales pueden variar en función de las
condiciones de inmovilización.

6. La estrategia de producción de multicapas de lipasas utilizando PEI como agente conector

entre las capas de lipasa y glutaraldehído como agente entrecruzante, para evitar la
liberación de enzima durante el recubrimiento con PEI de las moléculas de enzima
inmovilizadas por intercambio iónico, permitió aumentar la actividad volumétrica (frente
algunos sustratos y en algunas condiciones) y la capacidad de carga de estos soportes
hidrofóbicos porosos.

7. En la preparación de multicapas de diferentes lipasas co-inmovilizadas en soportes

hidrofóbicos porosos, la distribución espacial de las lipasas está estrictamente controlada
por el orden de inmovilización de las capas de enzima. Se ha demostrado que el orden de
inmovilización altera en gran medida la actividad final del catalizador. Sin embargo, esto no
soluciona el problema de la co-inmovilización de lipasas con diferente estabilidad.

8. Tras la inmovilización de una nueva capa de lipasa en el biocatalizador en multicapas,

aumentan los problemas de difusión del sustrato y la tortuosidad del camino que debe de
recorrer el sustrato para alcanzar el centro activo de la enzima que esta inmovilizada por

81
 Conclusiones

activación interfacial, lo que puede provocar incluso una caída de actividad. El problema es
especialmente importante cuando una lipasa es mucho más activa frente a un sustrato
específico al inmovilizarse vía activación interfacial que al inmovilizarse por intercambio
iónico o cuando la lipasa más activa se encuentra en la primera capa en los combi-
biocatalizadores.

9. La co-inmovilización enzima a enzima sobre soportes heterofuncionales octil-glioxil

agarosa, basada en la inmovilización de las lipasas más estables (CALB) vía activación
interfacial, seguida de su unión covalente y la inmovilización únicamente vía activación
interfacial de las enzimas menos estables (LEU, RML) tras la reducción del soporte, permite
reutilizar las enzimas inmovilizadas más estables en la preparación de nuevos combilipasas
después de la inactivación, desorción por incubación con soluciones de detergentes e
inmovilización de un nuevo lote de las enzimas menos estables. Estos ciclos pudieron
realizarse hasta 4-5 veces manteniendo la actividad de las enzimas más estables e
inmovilizadas casi intacta.

10. La estrategia de co-inmovilización de lipasas basada en la inmovilización de las lipasas más

estables (CALA, CALB y TLL) en soportes octil-vinilsulfona agarosa vía activación
interfacial seguida de su unión covalente, el bloqueo del soporte con aspártico, el
recubrimiento con PEI y la inmovilización por intercambio iónico de las lipasas menos
estables (RML, LEU) sobre esta cama polimérica, permite reutilizar las enzimas
inmovilizadas más estables para preparar nuevos combi-biocatalizadores después de la
inactivación, desorción por incubación a elevada fuerza iónica de las enzimas menos
estables, recubrimiento con PEI e inmovilización de un nuevo lote de RML y LEU. Este
proceso pudo repetirse durante al menos 5 ciclos manteniendo la actividad de las enzimas
más estables.

82
 Bibliografía

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Fernandez-Lafuente, R. Reuse of lipase from Pseudomonas fluorescens via its step-by-
step coimmobilization on glyoxyl-octyl agarose beads with least stable lipases. Catalysts
2019, 9, 487.

99
 Anexos

Anexos
I. Revisiones relacionadas con la tesis doctoral
i. Uso de combilipasas en un solo recipiente para la modificación completa de aceites y
grasas: Sustratos multifuncionales y heterogéneos
Sara Arana-Peña, Diego Carballares, Ángel Berenguer-Murcia, Andrés R. Alcántara,
Rafael C. Rodrigues y Roberto Fernández-Lafuente
ii. Co-inmovilización de enzimas: Siempre la elección de los diseñadores de
biocatalizadores ... ¿o no?
Sara Arana-Peña, Diego Carballares, Roberto Morellón-Sterling, Ángel Berenguer-
Murcia, Andrés R. Alcántara, Rafael C. Rodrigues y Roberto Fernández-Lafuente
iii. Preparaciones líquidas de lipasa diseñadas para la producción industrial de biodiésel.
¿Es realmente una solución óptima?
Rodolpho R. C. Monteiro, Sara Arana-Peña, Thays N. da Rocha, Letícia P. Miranda,
Ángel Berenguer-Murcia, Paulo W. Tardioli, José C.S. dos Santos, Roberto Fernandez-
Lafuente

100
 Anexos

101
Anexos

102
 Anexos

103
 Anexos

II. Otros artículos publicados durante el desarrollo de la tesis doctoral

i. Reutilización de la lipasa de Pseudomonas fluorescens mediante su co-inmovilización
paso a paso en perlas de octil-glioxil agarosa con lipasas menos estables
Nathalia S. Rios, Sara Arana-Peña, Carmen Méndez-Sánchez, Claudia Ortiz, Luciana
R.B. Gonçalves y Roberto Fernández-Lafuente
ii. Inmovilización de lipasa de Pseudomonas fluorescens en partículas de octil-glioxil
agarosa: Estabilidad mejorada y reutilización
Nathalia S. Rios, Carmen Méndez-Sánchez, Sara Arana-Peña, Nazzoly Rueda, Claudia
Ortiz, Luciana R.B. Gonçalves y Roberto Fernández-Lafuente
iii. Aumentando la capacidad de carga enzimática de los soportes porosos mediante una
estrategia de inmovilización capa por capa utilizando pei como pegamento
Nathalia S. Rios, Sara Arana-Peña, Carmen Méndez-Sánchez, Yuliya Lokha, Vicente
Cortés-Corberán, Luciana R.B. Gonçalves y Roberto Fernández-Lafuente

104
 Anexos

105
Anexos

106
 Anexos

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