U . >: ¢ O=0020 @O SHOT ON REDMI9 (aoe (eel ly tener Vt -68 Harpbitsts intravascular Ho “™ tems || Metahemogiotina Dimerzs \ Ps MB 0-20-PAOTDr Fm 2m# Diagnéstice a de los Globulos Rojos * Determinacién de ta Fragilidad Osm is de SP y Prueba * ie Células Falcifomes de Sodio) a oglobinopat!as: + ie la Anemia Ferropenica, Sideroblastica y jadas. (Determipacion de Hierro serice de la Anemia Megaioblastica (Dasificacion ficas y Entrocitarios oducidas por alteraciones > Electroforesis de Hemogiobina de Frotis ® Descripcione: > Ejercicios @0 Els Pee ee euro iainANEMIA DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE LAS ANEMIAS ion de Laanemia se define como la disminucion ee eae del hemogiebina en sangre penténca, acompafiade de eritrocitos No valor hematecrito y casi siempre del PUMEI At cxpresion obstante, !a anemia no es una enfermedad sino mas ina, marcadot de un trastomo subyacente. constituyéndose como complejo. La © que puede ser basico o en ocasiones mas een edition nizacion Mundial de la Salud (OMS) considera oad 213 grid cuando ta concentracion de hemogtobina es inferior beta wieres inferior a 12 grfdl. En nifios e! valor de la ae an varia segun la edad, pe fterias no. SON) apHCATOS & elios estos c Al iniciar ev estudio del Sindrome anemico, & cual, es una de las as la consi je hematologia, y previo nto de las. ci e hamaties, hamoglobina, hematocrito e hematimétrices se debe considerar la cifra absoluta de permite diferenciar las anemias regenerativas de las s. En las anemias regenerativas el mecanismo causante mia es periférica, y la médula ésea en un intento de compensacién, produce gran cantidad de reticulocitos (reticulocitosis) anemias arregeneralivas, por el contrario, son aquellas de origen central (medu! en las que el organo hematopoyetico no puede umero suficiente de glébulos. rojos, observandose una ulocitos disminuida o nula (Vives, J y Aguilar J; 1997) @O© SHOT ON REDMI9 ese feet) -me ir airyPRUEBAS DE LABORATORIO QUE ORIENTAN EN EL DIAGNOSTICO DE LAS ANEMIAS: recueritos eritrocitarios hematoc! ) © indic = Reticulocitos. = Est © Estudio de ia morfologi * Patron de que tiene una importats 2] sindrome anemico. La presencia de anulares puede orientar el diagndstico por déficit de fac Ciertas alteraciones linfocitarias pueden sugerir una Mononucleosis. infecciosa o un sindrome linfoprotiferativo y la presencia de células inmaduras o eritroblastos orienta hacia una Infiltracién medular par blastos leucémx (Leucemia aguda), tejido fibreso (Mielofibrosis) 0 células neopla s de diverso origen (Sindrome leucoeritrobiastico) En @! frotis. buscaremos si existen anormalidades de jos entrocitos ya estudiacos en sus alteraciones. En Ja practica diaria las anemias de causa extrahematologica son las mas frecuentes; éstas suelen cursar con un sindrome anémica: sin participacién de los elementos leucocitanos o plaquetarios. El hallazgo de alteraciones morfoldgicas leucocitanias o plaquetanas indica por sl solo participacién medular o-mielopatia P eeu ame ey levee mel tne tac1 Wa ~scompane de alleraciones se pospone la puncion i hemogre: leucoplaquetarias cualitativas y cuantitativas, “ medular y se realizan ottas exploraciones clinico-diagnosticas, pero 5! @stas estin presentes 56 debe practicar enseguida el estudio meduila que en la mayoria de los casos sera diagnostco Para la ofentacién diagnéstica en Anemias Carenciales, @s indispensable acompariar el estudio con la evaluac én de las rosaivas férricas mediante tincidén de fos frotis medular in tincion de Perls y ademas. realizar la cuantificacion de vitamine B12 y folato La evaluacién del hierro'medular es imprescindibie en ja evaluaciin del sindrome anémico, y no se debe emir un informe medular sin considerar el patron de hierro. La & mminacién dei hiero medular es técnicamente muy sencilla al Oratone, ¥ no esta: suj / presencia de! hierro contaminante del hierro med: En la evaiuacion se reportar e! ndmero y tipo de los siderobiastos, as! como la cantidad de hemosiderina atesorad macréfagos. En algunos casos no se observe hierro en Spirade medular debido @ que esia depleccionado pero este puede observarse en la biopsia, por lo que se sobre diagnestican estados de jo se valora él hierro del sspirado, (Vives, Jy Aguilar J @© SHOT ON REDMI9 [eso ue leet) -me raidCLASIFICACION DE LAS ANE! ANEMIAS POR AUMENTO DE LA PERDIDA O DESTRUCCION bE HEMATIES (ANEMIAS REGENERATIVAS) o Hemoragias agud b) Anemias hemoliticas « Enzimopati « Anormalidades de una alteracién extravascular « Ongen mecanico: microanglopatias, protesis vasculares « Debidas 2 microorganismos: ‘bacterias, parasitos, etc Debidas a una agresién quimica: plomo u otro toxicos: ANEMIA POR DISMINUCION DE LA PRODUCCION GLOBAL ({ANEMIAS ARREGENATIVAS). encia Medular Cuantitativa (Aplasia medular) 2 Insuficiencia Medular Cualitativa sAnemias carenciales: Ferropénicas, Alleraciones en ta sintesis de hemogiobina, Megaloblasticas. eAnemias Disertropoyelicas: congénitas y adquirdas (Refractaria simple, Sideroblasticas y LMC) Teme am ceeANEMIAS DE CAUSAS MIXTAS Y COMPLEJAS 1 Cancerosas senil, etc Cirréticas: Infecciosas, Renales, Post-parto CLASIFICACION DE LAS ANEMIAS SEGUN LOS INDICES ERITROCITARIOS (de Farreras) Microciticas = y/o Hipocromicas (VCM< 83 fi, ylo>STfh) HCMé 27 pg.) Anemia Ferropénica Talasemia + Algunos casos de Anemia Sideroblastica + Intoxicaciin por plomo jen o¢asiones) Intoxicacién par aluminia (infrecuente) + A veces en enfermedades cronicas T ON REDMI 9 Anemias Maegalobiastica Aleoholismo Insuficiencia hepatica Sindromes Mielodisolasico 5 Reticulocitosis Hipotiroidismo Aplasia Medular (algunos casos) Macrociticas (VCM Normociticas (VCM = Enfermedades cronicas (la mayorla) Hemoliticas (salvo reticulocitosis) Aplasia Medular (la mayoria) Sindtomes Miglodisplasicos. Pérdidas agudas (salvo infrecuente reticulocitosis) invasion MedularPRACTICA N° 08 Lia DE LA FRAGILIDAD OSMOTICA DE LOS LOB S ROJOS O RESISTENCIA GLOBULAR OSMOTICA TODO. VALORES NORMALES. VARIACIONES FISIOLOGICAS Y PATOLGGICAS. OBJETIVO: motica de los clon, nas de fragilided osmdtics. = Explicar to: RAGILIDAD OSMOTICA RESISTENCIA GLOBULAR OSMOTICA 0 F DE LOS GLOBULOS ROJOS a la que presantan los hema’ suspendidos €n 9 al 0 con el plasma), no presentan cambios fn jdgicos significativos por algunas haras, tras que suspendidos én agus destilada se hemolizan rapidamante Cuando se colocan gidpulos rojes en una sdlucion hipatonica o hipertanics, ie! grado de hinchamiento o encogimiento esta en praporcian directa a |a diferencia de presiones osmética entre el glébulo roja'y ba solucion. molisis se produce al ser desinuide e! gidbulo rio, por cualquier agente, quedaf ido liberada su hemogiobina. Entre los agentes que pueden provocar hamdlisis se encuentran EI fenomeno de hen o§: Toxinas dcidas, fenilhidrazina, quininas, saponinas « Agertes Quimico « Agentes Fisicos: Calor, frio, roces, movimientos bruscos. = Factores Biolégicas: Hemotisinas. ae cee) Al QUAD CAMERAEADAS PARA LA EMPLI FUNDAMENTO DE LAS PRUEBAS wOTIGA DE LOS DETERMINACION DE LA FRAGILIDAD OSI GLOBULOS ROJOS. 9 de sodio dé al ilegar a una io Al colocar glébulos ojos ef soluoion congantraciones progresivamente decrecienis, observamos a> determinada concentracien, comic comprueba por liquico, donde es! Que no desaparece por centrifugaci siencia globular minima, y ocurr gre '% de CiNa os adquiere une ¢ denamina hemolises inicis! e las concen de a medida que la presefiarse Una @l fiquido se le denoming a partir de is Luego, la bemdlisis de los globules rojos va aumer in de cloruro de sodio es menos entrada, Pp fa total de la hemioglobina, Io cual sdquiere una coloracién roja intensa y transparente, Hemélisis o Resistencia globular maxima, y coneentracion 4 8 grs % de CINe se denomina La sokicide consefvan su n salina ficl / tamatic jos hematies ae 1a membrana semipermeable que > no la mayoria de las sates disueltas. Cuando na Solucién Hiperténica (mas concentrada que su agua, pera diuir la solucién y sestablece equilibria se deshidrata, se hace pequefio y se arruga, ca llamada gifibulos rojos crenados. La cubierta de co, por bo tanto el gid! indo una forma caract Cuando colecamos gidbulos rojos, en une Solucién Hipoténica (menos Contrada que su media 6.menos concantrada que la salucion salina fisiologica: 0.40 grs% de CINaj, se presenta el fenémeno contrario al explicado jorments. El agua penetra al gidbulo rojo para tratar de diluir. su contenica an es y asi @quilibrar su presidn Gsmdtica, por lo tanto. el glébulo rojo se embeba gua, auments su tamafio, plierde la forma de lente bicdncaya, aumenta de espesor y adquiere el perfil de un lente bicotwera hasta ta farma de esfera, en ta etapa no puede resistir la tension y en consecuencia, se rompe la membrana, libera la hemogiobina y asi tiene lugar la heméilisis. (Ver gréfico 1) , @0 Eide Oi ed [OMe Teor Umer air.GRAFICO 1 foj08 aplanacte a bastante si $ hipotonica. (Ver grafico 2) Talasemia, mostrando dos poblaGones, una con fragiidad aumentada (pane A inferior de la curva), y otra con fragilidad disminuida (parte superior de la curva) B, Normal ° Esferocitosis hereditana, mostrando fragilidad aumentade [ 0 a @O SHOT ON REDMI 9 levee (aetnaMETODOS PARA LA DETERMINACION DE LA RESISTENCIA GLOBULAR 0 FRAGILIDAD OSMOTICA DE LOS ERITROCITOS — —_— ~ METODO PRESUNTIVO: REACTIVOS: so! Soluc . TECNICA Pipetear 0.1 mi de sangre je ensay Pipetear 1 mi de solucion sat a de Uns b) Esta es una prueba poco exacia, y si es positive, debe estudiarse ie fragilidad asmética por un método cuantitativo, pore) Método de Dacie METODOS CUANTITATIVOS: + TECNICA SEGUN SANFORD: 22D »« FUNDAMENTO: Consiste en colocar pequefias cantdades de sangre en soluciones salinas de conctentreciones progresivamente decrecientes y observer a que Concentracion se inicia ja hemdlisis y la primera concentracian donde ja hemdlisis es total « MUESTRA: ¥ Sangre con EDTA o hepannizada, realizar una PuNCION bin Dia rT Ome esis oer iL) DalREACTIVO TECNICA: anda @| N° del tubs Obtencién del factor 0,02 ¥ * y cero gotas de 2 ese ubo entre “ una gota de sangre cbtenida 8 cada tubo: Mezcar unto N&4 con la sangre te # jaf los tubos &n reposa durante Oc! 5B lemperatura ambieme “ ia peacclon INTERPRETACION: Un ligero colar rosado en ur io sobronadante indica el comienzo de la fojo intense con &scaso sediments indica le § Que un coll hemolisis, 7 hemdlisis tote! @© SHOT ON REDMI 9 eve we retusa 8VALORES NORMALES La hemdlisis c enta a 10% de Net jucién Madre Arnortiquada PH PARA 2/7 LITRO LITROS Conservar esta 2. Solucién de Cloruro de Sodio al 1% iro al 10% 40 mi 0 ml 0.10% de NaCCALCULOS PARA PREPARA Hi %. zu R 10 ML DE LA SOLUCION NaCl DIRECTAMENTE DE LA SOLUGION MADRE TAMPONADA AL 40% | NaC! al 105 mi de H, O destilada TECNICA; 0 Klett) y enumérelos. Prepare otro xueoo igual 400 x on en los tubes comenzande a ios | de-cada fila. La solucién al 0. 20% a ee EDTA, heparinizada © dasfibrinada resuspendide 6 diatamenie Hacer lo fnismo con. ka. sangre cariral LK Afada 0,02 de sangre con > inne Pea ee ee ae* El sobrénadante del tubs 0.65% de CING se usa como blat i abi a la ordenada e! una céloulos respectivas paracion de cada FACTORES QUE ALTERAN LAS PRUEBAS DE FRAGILIDAD OSMOTICA: + Preparaciones de las soluciones de trabajo: Les solucionas salinas deben ser preparadas con exactitud Volimenes relatives de sangre y solucién sali Un desvie de ia Proporcién sangre-solucin ‘salina (1/260), trae como consecuehcia une alteracion de! resulace final, si se aflade mayor cantidad de Sangre que le fequenda, el plasma afadidy aumenta ta tonicidad efective de fa solueionmal de jas suspensiones sangre-sol a desyvis de 7 disminuciér 5 hematies « La temperatura a que se realiza la prueba: a en 5°C, is ad de la sc va pero lo paco practicn VALORES NORMALES: (a pti 7,4 y 20°C) 035% 90a " 3 de hemi | 055% ‘ £0 s 4 de hempdlisi Oa 5% de hemélisis 0% da hemdlisis | r emcee) eve ue (eel ne tactstd sumentada, nm concentracion 20.48% g) = Policitemia Vera armadad de Cc os Jove cuando Ia hamolisis se pi enta er concentraciones inferic: % CiNa De tai forma que la fragilided globular esta disminuida o Jc ¢ mo. La resistencia globular esid aumeniada. anemias hemoliti Ge! rango norma! Para detectar asta realiz: e as lo 28 y esterociticas, fa curva no da de: mos (a Famada fragilicad ineubada 7FRAGILIDAD OSMOTICA INCUBADA: Debe usarse sangre desfibninade esténl Se incuban por de de 1 a 2 mi en tubos o bolollas esteriles de 5 mi ‘as por duplicados, por si se infectan como se demuestra po Hb se puede saguir con la prueba: qd horas a 37°C T bien e! co sé continda la prueba, tal como s@ indice an se con la valoracién de la autohemodlisis 8s de fragilidad osmdtica después de la incubacién a horas. (ver grafico 3) ado volumenes e dejar las mafcada nido de ies. ellas tes, Esta prueba puede pantanea. Promedia TC durante 24 at) SomeoneINTERPRETAGION DE uaa .PaURHAG OE: FRAGIMEIAY OSMOTICA EN SANGRE INCUBADA. 6 al menos, uno congénita f Los gidtulos rojos da los enfermos con esferocito> de ios lipos de anemia hemolitica hereditaria 0 s piruvaloquinasa) dasarrollan cuando se incuban, Un ms dudide en fos gidb en ja dleranciacion deINVESTIGAGION DE CELULAS FALCIFORMES. FENOMENO OE SICKLING O OR -PANOCITOS: OBJETIVO: Domini: FUNDAMENTO: 1 + METABISULFITO DE SODIO REACTIVO: Bate) ee ate5: de lel'soluciin, Me si hay euceso de mezcia. © as, obser jos (15) minutos sa obseryar reporter 5, ya 8 5. Artes. i defer RMN ) SB dcte) ee) ND Al QUAD CAMERACURVA DE FRAGILIDAD OSMOTICA A PARTIR DE UNA SOLUCION FISIOLOGICA COMERCIAL (0,9%) tracién | mide mi de mi de mi de Tubo NO Nacl Nac! H2o Nacl H20 destlada para 20 | destilaca | UAE eit | ema iyPRACTICA we 40, METODOS DIAGNOSTICOS DE LA ANEMIA FERROPENICA METABOLISMo DEL HIERRO: la8 y Se uliliza tanto en el metaboism catalasas ’ wien: cal M38 que intervienen en los procesce Lae eee aalzaraeO Nidetas, deshidrogenasas y reductasas ((: jas det ne de le coma el hero ferritina © dat hierro IWIMS en la forma un buen indicade: de lubie que se encuentra lear La formacion de cS elt ensDEFICIENCIA DE HiERRO: Cuadro N" 1. CAUSAS DE LA DEFICIENCIA DE HIERRO HIERRO gastrointestinal debida a Hemorraid umores, Di NECESIDAD AUMENTADA DE HIERRO: de crecimiento de la Infancia nalDi = _ DISMINUCION DE La DISPONIBILIDAD DE HiERRO: La deéficiencta distintas (Cuadro hipoorimica (hombres) y <11 gi HOM, VCM y el hi seguida de FASES DE LA EVOLUCION DE LA ANEMIA FERROPENICA err Beurecisn Ferrin Absorelin mcstelogia de Memogiatian areca le fet 5 GR aay eer ea, Ener nn N Nast " ‘ 115% 4 : ‘ 1 1 4 1 roa L 1 1 b _ t0:20% Th . = cde Bids iam |= oo moMo | 8% 6518S 2ed-aN0 @© SHOT ON REDMI9 levee veel!) tome tn acr9TAM tes] a0 ove ge tae!) ion:BC; tot nbindin fibre: en orculack 5 af t@ 1/8 de la trans! slurads con hiero (2050 %) y o vaior ¢s- inferis Probablemente hay defo) 4, Farritina sérica: La cuantificecidn de fe &n la valora ne de los depos sfica normal no necesa i sumenta * Protoporfirina eritrocitaria: protoporfirina en Ics entrocins, resultande d ham. por ausencia de < método; Médula Osea: + MINACION DE HIERRO SERICO (V gnostics. ING) FUNDAMENTO: ar Mero onado de de los lone fidroxilamina REACTIVOS: auffer Hierro’ 0 m Se ae eee eee ateSTRA: Usar sue MUE moidl. Para valores s lineal haste itade se multiphes por salinay el re Jl ORES REFERENCIALES: © eum CO Al quan cDETERS! TERMINACION DE TIBC (CAPACIDAN TOTAL DE FUACION DE (World Diagnostics, IN FUNDAMENTO: sists 6n ad @ conn Paciente a pH aicalir ro (sin hemdlisis) obtenico en ay eed diuido al HIERRO) stiada,PROCEDIMIENTO ed PaO mr tua eBeton BE PERLS GEL aspinar HEMOSIDERIN sNOSTICO DE 00 MEDULAR PARA EL DIAGNOSTIC PRINGIPIO; ‘al 6 mina ntasico al 2% 0.2 N durante 10 minutos a Come cre) e) SR yurINTERPRETAGION DE LOS RESULTADOS ais sa obser 14 jor del niicleo de! siderol los -déenominad denominamos ao aM i Te) ewe Teer O nyA ANEMIA la piel omina ertablastos nuclec de madurativa tambiér ariocitica acompafia de s que desaparecen de apoy nenio del ‘C.M) macrocitosis.fo comtenide en s JY Aguilar J: 4 im EMIOLOGIA DE LA ANEMIA MEGALOBLASTICA * SIGNOS CLINICOS: ja anemia per la marcha, hiperrefl fL). con eventuales inglusiones Oe enCy eso bestos (asincronla madurativ dé jos : @bundante hareginn a Mielocitos yo metamielocitos +) gant tes. " Megacarioc cursa con clinica y signos orcién intestinal de e confiirmar é! una dos!s ioistope a misma vitamina, no ranscobalamina II). En minada por no detectars: @ sido absorbida y que se ba de Schilling positiva ia prueba de Schilling nde Fl, siempre que no exista io de la propia mucosa intestinal secundario al déficit En @ caso, la prueba de Schilling puede ser negativa aistencia de un déficit de vitamina B.2. La prueba de ling tiene la ventaja de que puede realizarse aun después de r iniciado el tratamiento del enfermo con vitamina B.2. Vives J. ¥ Cuando se sospecha un trastorno d vitamina B:2 la llamada prueba de Sc Esta prueba consis nl dstico DOSIFICACION DE LA VITAMINA By: SERICA Y FOLATOS SERICOS Y ERITROCITARIOS: PRINGIPIO La dosificacion de la Vitamina B.» sérica asi como de los folatos SericOs © intraeritrocitarios, puede realizarse mediante dos tipas aie meétodas: a) microbioldgicos, y b radioisotépicosimiento de ur ctor que hay que dosificar El de la opacidad del medio o del pH, debido a la produccién de acido lactico. El Nido con un muestra de suero control o del paciente in patron obtenido a partir de diluciones conocidas sérica o de écido folico. Los gérmenes mas JiMizados Son para la determinacién de vitamina 8.2 sénea la Euglena gracilis, e! Lactobacillus lelchmannii o la Escherichia coll, y 0) para la del acido folico el Lactobacillus casei. 68 apreciado por lam minucion Vitamina B, Métodos radicisotépicos: Estan basados én el principio de union competitiva por los lugares de fijacion de u°na sustancia aceptadora 0 ligante (generalmente una proteina) especifica de la sustancia ir, Para ja determinacién de Vitamina 6,2 se utiliza como ligante factor intrinseco porcino purificade, que elimina las posibles interferencias de las proteinas R, pudiendo calificarse de ifico para la cobalamina blolégicamente activa. Para él folato se utiliza fa B-lactoglobulina come proteina de union. La competicién por un nUmero limitado de lugares de fijacién del ligante se establece entre lato o Vitamina B.2 presentes én la muestra que hay que analizar ), y una cantidad fija de folato o Vitamina B,2 (0 analogos de los smos), marcados con un isétopo radioactivo. Los isdtopos mas utilizados para la determinacion de vitamina B,2 han sido el "Coy *Co y para el “Hy *l, La utlizacion conjunta de acido folico. y vitamina By, “Co permite la determinacién simultanea de ambas substancias en la misma muestra, debido a las diferentes energias de radiacion, pe ‘amente separables y sin interferencias. Cuando en la muestra problema existe una pequefia concentracian de analito, el ligante fijara mayor concentracién de sustancia radio marcada que cuando e/ analito se encuentre en elevada concentracién. Existiré, por lo tanto, mayor radioactividad en el complejo analito ligante para bajas concentraciones de analito y menor para altas concentraciones de! mismo, una vez separado de la fraccién unida a la fraccién libre Simultaneamente a los sueros problema se procesan una serie de muestras de concentracion conocida de vitamina Bz y folato (estandares), que nos penmitiran obtener las concentraciones de ambas substancias en la muestra problema, al poder construir las curvas de radioactividad/concentracion (Vives J. ¥ Aguilar J; 1987)MEIQDOS DIAGNOSTICOS DE LAS ANEMIAS PRODUCIDAS POR ALTERACIONES EN LA MEMBRANA (ANEMIAS HEMOLITICAS) alteracién estructural del hematie tanto de causa Intrinseca repercute, sobre la membrana dando ent una alteracién de la forma eritrocitaria y, por tanto, de su capacidac de deformacién. Por ello, la membrana eritrocitaria, ademas de SU funci6n intrinseca, tiene una gran importancia en la fisiopatologla de las anemias hemoliticas en general Estas pertenecen al grupo de las anemias regenerativas, por lo Que cursan con una citra de reticulocites elevada. Se deben a una aparece cuando el proceso 2s muy eareay ha agotado dad compensadora medular. La reaccién medular se expresa er troblastica, en todos sus egtacios llegar a superar seis u ochos veces su jones normales. hipeiplasia de jurativos, que pu estudio de la sangre periférica permite apreciar un cierto grado tosis y policromasia debido a la intensa reticulocitosis. datos morfologicos ayudan a sospechar algunos tipos de hemolitica. (Asi la presencia de un punteado basdéfilo intenso una f-talasemia en su forma menor o una intoxicacién por ploma En los procesos hemoliticos graves aparecen cuerpos de Howel Jolly y algunos eritroblastos. La presencia de hematies hipocromicos en un estado hemolitico indicara un trastomo de la sintesis de la hemoglobina, tal como sucede en las talasemias e intoxicacion por plomo. La presencia de células en diana se observard especialmente en jas talasemias graves y en las hemoglobinopatias C, £ ys Esquistocitosis es tipica de anemias microangiopaticas y de las anemias hemoliticas en pacientes portadores de prétesis CardiacasOraves de fi-talasemia y aro. superior al 50-90%, 5! ia. Los hematies espiculados €n numerosos estados hemoliticos, fundamentalmente la$ microangiopaticas, deficit de piruvato- quinasa, uremia y ie a esplenectomia La macrocitosis y los pernuciearcs hipersegmentados aparecen en estados hemoliticos crénicos cuando 8@ asocia un déficit de Acido félico, Los esferocitos haran pensar en la esferocitosis hereditaria, aunque un cierto grado de esferocitos puede = @sente en las anemias hemoliticas auto Inmunes. El estudio de la médula 6sea muestra en todos los casos, une celularidad muy aumentada a expensas de una hiperplasia de la serie eritroblastica en todos sus estadios madurativos, incluso €n SUS formas mas inmaduras. Las series granulociticas, megacanocitica y ©! istema fagocitico mononuclear no ofrecen alteraciones morfolégicas de una frecuente eritrofagocitosis, El estudio det hierro @ manifiesto un excesivo numero de sideroblastos y un do al incremento del recambio cia de] proceso hemolitice cons: a que, en la actualidad, los métodos aplicados al estudio os componentes de la membrana eritrocitaria no pueden en la practica diaria, el diagnéstico de las alteraciones de asarse en el empleo de métodos indirectos que pongan de manifiesto modificaciones de algunas de sus propiedades como, por ejemplo, su capacidad para resistir a la medio (resistencia osmdlica), o a su Sensibilidad a la accidn litica de! complemento (hemélisis en media acido y prueba de la sacarosa), (Vives J. Y Aguilar J; 1987) AUTOHEMOLISIS A 37°C (1) PRINCIPIO: Los hematies mantienen su integridad molecular (estructural y funcién hemoglobinica) gracias a Su escaso, pero suficiente. contenido en ATP, que obtienen exciusivamente @ través de la glucdlisis, 65cosa a piruvato. Si p foenximopatia) disminuye la de: del ATP pi Su Supervivencia o vida media y, por tanto litica. La prueba de autohemblisis a 37 *C tien cidad de los hematies pare un fo tiempo (24 horas, plasma, Esta incubaci a estériles de 5 mi con tapdn de rosca se afladen 1 6 total. A dos de los frascos se afade 0,05 mi (0 0,1 ja solucion estéril de glucosa (100 g/l), de tal forma que la i6n de glucosa en la sangre contenida en los frascos sea minima dé 3 mmol/L LECTURA DE LA HEMOLISIS EN LA PRUEB, AUTOHEMOLISIS eee TABLA 4 REACTIVOS TUBO |TUBO |TUBO ]TUBO 1 2 | | 4omi_ [49 mi [4.9m = | Sol de hidréxido aménico (NH,OH) |4 9 mjpranadante del tubo con! \Bla 0 frascos en una estufa a 37°C durante 24 horas: este ampo se agita SUAV! ,ente e| contenido dé 10% sy se dejan a 37°C durante otras 24 horas on mezclar el contenido de los frascos que i valor hematécrito (VH) de cada uno 9 de obtener el sobrenadante herdlisis espontanea presente en cada muestra 4 siguiendo la sistematica indicada en la Tabla N° 4 jecturas pueden realizarse mediante un colorimetro (filtro verde o un espectrofotometro (540 nm) y el porcentaje de lisis Se ando la siguiente formula A (tubo 26 3) X 400-VH (TUBO 2 63) 400 A (tubo 4) x 20 A= absorbancia VWH= valor natocrito Ocasionaimente puede completarse esta prueba afadiendo ATP a uno de los tubos, al igual que $© hace con la glucosa en un frasco de 5 ml se afade de sangre total ¥ 0.1 mi de ATP 0,230 mol / | (121 mg / mi de ATP esteril neutralizado" as 46 Los valores de referencia obtenidos para la hemodlisis a las 46 horas de incuba 7*C) varian entre los siguientes limites * Sin adicion de glucosa o ATP = 0.2-2 % osa o ATP = 0-0,9 * Con adicion de g! Hasta la implantacién en la practica clinica de la determinacion cua ade ia actividad de Jas enzimas entrocitarias glucosa-6- jato-deshidrogenasa (GOPD) y piruvatocinasa (PK), la prueba de la ohemolisis se empleo en el escrutinio de entroenz imopatias En la alidad tiene un interés diagnéstico escaso y limilado a la hereditaria, especialmente cuando la ROE tanto de ang como incubada no aporta resultados concluyentes. Con todo, debe tenerse en cuenta que esta prueba puede salir positiva en L T tipo 7 compafiada de esferocitosis. Los resultados patologicos de la prueba de autohemblisis a 37°C pueden Lewis en tres lipos, cada uno de los cuales determinado proceso patolégice Tipo normal. La hemdlisis es esca: nexiste incluso después de las 48 horas de incubacion Corresponde a la autohemolisis en los sujetos normales y en los afectos de déficit sdlo con la adicion de glucosa y no de ATP. Es el eristico de la esferocitosis hereditaria * Tipo Il. La hemolisis se halla muy aumentada y no se corrige con la adicién de glucosa, sino sdélo parcialmente con la de ATP fresponde a la forma de autohemdlisis observada en el déficit congénito de piruvatocinasa (PK) eritocitaria y en las formas de esferocitosis hereditaria muy intensa> J ‘= a J Ld ley, is ss! =} 4 FI in cy HEMOLISIS EN PRESENGIA DE SUERO. ACIDIFICADO (PRUEBA DE HAM-DACIE). (1) PRINCIPIO: a que los ando son incubados ef e del propi a compatible previamente acidificados. Esta d se conoce can nombre de hamoglobinuns paroxistica (HPN) y en ella & una alteracion adquirida de la ocitaria, por lo que las hematies (hematies HPN) nsibilidad anormaimente aumentada a la accion de! es una proteina del plasma que se uno po. Favoreciendo Ja lisis celular cuando dicho col i vel de su superficie. Esta accion litica del plemento resulta favorecida por un descenso del pH del medio yo de la fuerza lonica. En los hematies normaies, le accion del termed (6,5 compiemento no © desarralla ni a acidificado, pero en los hematies HPN basta una pequefia disminuci6n del pH del medio para que dicha accion 5& desarrolia ¥ sobrevenga |a hemdl En su forma clasica la HPN se caracteriza por hemélisis aguda con anemia ¥ hemoglobinuria (orinas oscures) pero puede aparecer también como fenomeno asociado a otras hemopatias tales como la aplasia medular, la mielofiprosis idiopatica y 'es jeucemias agudas o cronicasEn una muy rara de enfermedad congénita (disentopoyesis la de los hemat se os sé incuban en presencia de! suefo norm ificado, pero no en presencia del suero propio En este Mecanismo de la hemédlisis en medio acido difiere del de la HPN, ya que obedece a la presencia, en un porcentaje de sueros mpatibles (= 30 %), de un anticuerpo conta un antigeno HEMPAS) presente en la membrana eritrocitana de itropoyesis congenita MATERIAL: on oxalate o ACD se ha mantenido a 4°C en ACD, la prueba puece después de algunos dias dé la extraccion y de un sujeto control isogrupo. Los sueros ntes, aunque pueden conservarse a -70°C sin que pierdan su poder litico en el curso de varios meses. 1)Ham, T.M. y Dingle, G. M. Studies on destruction of red blood cells ronic Hemolitic anemia with paroxysmal nocturnal hemoglobin. immunologic aspects of hemoytic mechanism with special to J. Clin. Invest 18:657, 1938 METODO: Para la realizaci6n de la prueba de Ham-Dacie se disponen cinco lubos de hemdlisis que se enumeran del 1 al 5 (tabla N° 2) + En los tubos numerados 1 y 2 se introducen 0,5 mi de suero de! Paciente y en los tubos 3.4 y 5, 0.5 mi de suero control ISOgrupo. + El tubo 3 se introduce en un Bafio Maria a 56° "C durante 3) al objeto de inactivar el complemento O minutosaden 0,0 nal 50% (en SISTEMATICA PARA LA REALIZACION DE LA PRUEBA DE HAM- DACIE TABLA N'2 4 mn TUBOS 1 2 3 4 (0,05 _- 0.05 (0.05 (0.05 0,05 NOTA. E} * indica los tubos en que aparece hemdlisis en un paciente 1 de HPN VALORES DE NORMALIDAD E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS no debe observarse hemdlisis en cuando exisie HPN, se observara el grado de hembdlisis se debe al catacter sidn eritrocitaria en el curso de fa HPN, ya que q minimo de dos poblaciones patolagicas de esa enfermedad, una de las cuales serian ogeneo de a la exis matte) atlutivo. Incluso mente en que es HPN es muy escasa. Asi mismo S§ pueden presentar un menor grado ncia de hematles. normales en la cuenta al realizar esa $ que los 2 Qué hay que tene muchos mas sensibl del métode empleado para su la correspondiente a la parte del paquete eritrocitario centrifugado, debido a su mayor cuando sé enfrentan los propio suero acidificado, es @ HPN, p Su negatividad no aS razones antes déscritas la presencia de esta alteracion En la diseritropayesis congénita tipo fl o HEMPAS, |a é la prueba Ham-Dacie aparece sdlo cuando los hematies se enfrentan con un determinado ngmero ie 30 %) de sueros isogrupados acidificados pero Wo SuerO (tubo 2). (Vives J. '¥ Aguilar J: 1987) inca con el p @0 Eile cay aD J eo onesPRUEBAS DIAGNOSTICAS EN HEMOGLOBINOPATIAS ECTROFORESIS DE HB INTRODUCCION 5 son un grupo nas oxigeno dé los pulmar os tej y¥ de ireccion reversa. Estas estan compuestas 3 lamad globinas; a cada una de estas un anil tetrapirrbliec 1 centro de! aniito En un adultc nas de glabina jy 7. Un par una par de caden f Ge la Hb del adulto, la Hb A; encuentra en una pequefia proporcién (2:5 %) y puede estar minuida en tas condiciones palolégicas que de Hb (taiasemia); y la Hb fetal (Hb F) esta roporcién mayor dei 60 % en el recien nacido pero e casi completamente en la infancia (<1 %) en condiciones La persistencia de niveles mas elevados de Hb fetal en la cia y en la vida adulta representa generalmente la expresion de Sn patologic gfectando la produccién.de hemaglobina see Sere ume airystencia Hereditaria de Hb, Hemogtobi @5 Vetes en procesos pataldgicos diferent 8 embrionarias GOWERS 1 y 2 esian En fa molécula de hemoglobina c: cadena polipeptidica constit. cuendia de aminoacides (AA) constantes pare Ut dicha cadena, de tal manera que cuando ocurre una variacian de ese ncia, (un aminoacide sustituide por otro en la cadena) se tiene hemoglobina anormal io que conduce a enfermedades conocidas como Hemoglobinopatias. nopatias resultan da una anormatdad genéticamente iructura o sintesis. de la molecila ce alidad puede ser debida a dos tipos de a de giobina, donde se den producir sustituciones de aminodcidas en la cadena Hamogio inopatieas estructurales) y defectos cuantitatives que esultan de una disminucién en la sintesis de cadenas de globinas ales (Talasemias) Existen muchas variantes de hemoglabinas anormales pero las mas comul s san la Hemogiobinopatia S, que origina la Anemia por células Falciformes, la Hemoglobinopatia C y las Talasemias. La Hb S, 82 produce por una mutacion en la cadena f; el AA acide glutamico, que ocupa normalimente la posicién N° 6 de la hélice A, de esa cadena esta sustituido por AA valina; en la Hb C el mismo acido: glutamico de la posicion 6 deta cadena, 68 sustituida por Ia lisina @0 Las Ps ed [eee (ee! me airyene atectada de Hemoglobine Ahora, con de las Hbs 2 : mayor ayuda e! repre co cuando una solucion de oca en un medio con pH por encima de teina ando' una p a cargads negativamente y isoeléctrico, la molécula qu un campo eléctrico migra hacia el anode (polo positive), lo entonces.en es inferior al punto isoeléotrico La ra si el pH del med de Hb a pH 8,6 (alcalino) adquirira cargaS negativas y con acetato de celulosa), por el al anodo, contrario migrara al cAtodo (polo negative) a pH 6.2 (acide) come Lae es eR ee erate® Agar citrato)/a ase pH que la sustitocién de aminoacides en las cadenas dé la la mayorla de las veces cambi de la cadena, ja molécula complete adquinré también una carga migra diferente. Las hemoglobinas anormales nigran mas rapido que la Hb A son llamadas Hbs ‘répidas’” y las igran entre e! punto de origen y la Hb A son Hbs “| jentas® | acetate de celulosa y el gel de agar, existen otras medios jose es & ica, sin embargo, el = usado debido a la facilidad y rapiiez de su manejo, @ las fracciones de Hb en un tiempo elativamente corto al hecno de permitir la cuantiicacion por la dé las fracciones separadas y la conservac relice ECTROFORESIS DE HB EN ACETATO DE CELULOSA pH 8.6 REACTIVOS. a) Tampén Tris-EDTA-Horato pH 8,6 Trizma Base 1,859 Acido bérico 30,82 g @0 Lae Pt) ed een One aie250 ™ También puede ser obtenida (peckman Co 15 cc maximo por io de voltaje reguiado, co jos y uN comente de 50 mA + Celda de electroforesis » Aplicador de '@ muestra « Membrafia d& acetato de celulosa (Beckman, Gelman, Titan Il Fle e Envolturas piasticas » Papel secante + Estufa e ete | ee RO eatPROCEDIMIENTO semanas o ” ty aguante Sin embargo echa la presencia de una Hb inestable (Ej) Hb Koln) Ia oresis debe realizarse dentro de 24 horas fo] do toda la noche remover e| plasma rpm. durante 10 minutes rarel plasma « Lavar los eritrocitos con soiucién salina fisiolégica, centnfugar 2 durante 10. minutos, descartar el sobrenadante * Agregar agua destilada (igual volumen de eritrocitos) agitar fuertemente * Agregar tetracioruro de carbone (igual volumen de eritrocitos) agitar fuertemente « Gentrifugar la muestra.a 3.000 rpm. durante 30 minutos * Extreer la solucion de-hemoglobina (parte superior) con pipeta ir, culdando de no extraer estroma = Cuantificar la hemogicbina. Si fese necesario, ajusiar ta concentracién a'10 qr/dl con agua destilada Seectin, eRe Gee) ome ont.est sa, sumergiéndola oresis, se retira la membrana de la solucién colorante por solucién de acide acético al 5% hasta ana esté claro,a5 60 alcohol metilico.por)1 im sroirle en la Solt 3 on le > montaje de la membrana * Coioque ja membrana en una toalla absorbente {acetate hacia Tiba) para que el buffer remane se evapore 7 minutos. Retirarla y « Coloque la membrana en estufa 50-8 dejaria enfriar a temperatura ambiente: « Goloque la membrana en fa envollura plastica RESULTADOS: de! catodo al anodo, el siguiente (1) DyG, (4) HDF, (6) HbA © Hb H Las una movilidad anodal intermedia entre la COMENTARIOS Y PRECAUCIONES. En-este medio, las Hbs A, C, O y E tienen la misma movilidad elactroforética, igualmente las Hbs $ D, Gy Lepore muestran similar nigracién que la Hb F'se diferencia escasamente dela A Las Hbs He | son indeterenciables. Sin embargo, la proporcion de Hb A, muy tatamente es mayor del 10% 2 la Hb total, por lo tanto si se observa que una banda de movimiento lente constituye mas del 20% dela Hb total se sospecha que sea ina Hb C, OOF, Las Hbs Cy Q se encuentran en descendientes de negros, mientras que la Hb E esia limitado a de endientes de Sureste Asiatico. La hemoglobina E . 2) Sa Ud ee eaeximadamente representa @! 2 jensitometr gen étnicc ELECTROFORESIS DE HEMOGI OBINA EN GEL DE AGAR pH 6,2 >ja C Las Hbs D, G y Lepe de similar goul Io hacen con te asi un facil reconocimiente de pequenes cantidades G& permitiendc F) en presencia da grandes: stas hemoglobinas (Ao Finalmente, es de gran val lor para. le cantidades de una © de la otra y ja combinacién de Hb Sy jon entre Hb SS (hi macigota S. Talasemia) cuando los niveres de Hb on muy pequefios, igual consideracion-s& ib © homocigoto y la -combinacion © A en ésta ult raea sido usado previamen den tener efecta sobre la movilidac de-una protelra. La celulosa o del agar, son igualmente factores Muy , de los resulted t I I migracién. ten n ae { t s a tener en cuenta en la evalua ellos pueden también infiuénciar ta posicion final de \ re la comparadion REACTIVOS: n madre: de Sodic 0,5M. Disalver 1479 de Citrato de Sodio dihidratado son. aproximadamente 600 m/ de agua destilada, ajustar e) pHa 6,2 Scido citrico al 2 % y completar hasta 400 / mi con agua destilade ,erse a 40°C para retardar €! crecim lento de hongas. e man n dé trabajo: Solucior de Sodio 0,5M. Diluir la solucion madre a le proporcién 1:10 Medir elipH y si es necesario ajustara 6 2con acido citrico al 2%. Praparacién de! agar « Usar agar de-alta calidad para obtener un gel transparente @O SHOT i pista) Teed CO Al QUAD CAMERAa hasta que se Maria hasta que se licue gelifique CICN DE LA MUESTRA | un soporte para evitar desizamientos superficie del gel mediante un dispositive para disminulr generada durante la coma on el gel hacia abajo, de modo que haga contacto sumergidos en tampon » Correr a intensidad consiante. 50 miliamperios (aproximadamente oltios), durante 30 ~§0 minutosCAUSAS DE ERROR fia de separacion de A —§: pH muy alto Pobre migracion y poca seperacion: gel muy dalgade « AS y SC migran igual: muestras muy diluidas * Distorsién de las bandas de hemaglobinas: corriente muy alta o.ge) muy delg Por otra parte, existen pruebas adicionales que son necesailas pare jes confirmar el diagnéstico de las haemoglobinapatias efitre las cuales S€ encuentran © Prueba de solublilidad: esta se realiza para establecer fa cigoto U cantidad de HbS sea demasiado escasa para dar opacidad, pero si 5e aumenta de la cantidad de sangre en la prueba puede superarse el problema. Es posible que las Hemoglobinas inestables den pruebas falsas positivas cuando eslan presentes muchos cuerpos de Heinz. Otras variantes ce hemoglobina puetien dar résultados positives (C, Harlem |). Altos niveles de proteinas y lipidos en el plasma también pueden producir falsos positives Pei 22 ed Lo [eo me Veer ne arsa Ge Lermoestabilidad para estudiar Hbs inestables Cuantificacién de la hemogiobina Fetal La OL eat